Rongeurs

2 588 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à trente administrations de composés thérapeutiques, jusqu'à trente injections d'un produit qui rend les tumeurs visibles et quatre prélèvements de sang, et développent une gêne respiratoire au stade avancé du cancer du poumon. Une partie a 78 semaines, âge que le porteur rapporte à 56 ans chez l'humain, pour comparer le développement tumoral entre individus jeunes et âgés. Le bénéfice tient en une phrase, proposer à terme de nouvelles options aux malades, et le porteur conclut que l'étude du cancer chez la souris reste "indispensable".

Objectifs

Les cellules produisent l’énergie dont elles ont besoin grâce aux mitochondries, de véritables « centrales énergétiques ». Lorsqu’elles sont endommagées, ces structures peuvent provoquer la mort des cellules. Les cellules cancéreuses, en revanche, ont développé un système de tri et de recyclage appelé mitophagie, qui leur permet d’éliminer les mitochondries défectueuses et ainsi de survivre, même face aux traitements. Nos travaux ont montré que ce mécanisme est activé tout au long du développement du cancer du poumon et qu’une protéine clé joue un rôle central dans ce processus. La bloquer rend les tumeurs plus sensibles aux traitements. Ce projet vise à mieux comprendre ce mécanisme afin d’améliorer l’efficacité des thérapies actuelles, notamment la chimiothérapie, les thérapies ciblées et l’immunothérapie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à terme de proposer de nouvelles options thérapeutiques pour les patients souffrants de cancer du poumon.

Procédures

Dans ce projet les souris seront soumises à différentes types d’interventions comme : -des contentions : pour les anesthésier (30 secondes, 1 fois), pour les traiter (30 secondes, de 1 fois à 30 fois), pour leur administrer des composés pour la visualisation des tumeurs (30 secondes, nombre voir ci-après), -des administrations de composés thérapeutiques (10 secondes, 30 fois au maximum), d’un produit pour visualiser les tumeurs (10 secondes, 30 fois au maximum) -de prélèvements sanguins (30 secondes, maximum 4).

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux seront du stress lors des contentions et des administrations, une gêne respiratoire uniquement pour le groupe de souris représentant le cas de stade avancé de tumeurs pulmonaires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour réaliser les analyses in vitro nécessaires à notre étude.

Remplacement

Le développement d’un cancer ne dépend pas seulement de la transformation d’une cellule normale en cellule cancéreuse. Il repose aussi sur l’environnement qui entoure la tumeur, composé d’autres cellules, de signaux liés au métabolisme et de phénomènes inflammatoires. Tous ces éléments interagissent et collaborent pour permettre à la tumeur de se développer. La croissance d’une tumeur résulte donc d’un dialogue constant entre les cellules cancéreuses et leur environnement, en particulier avec le système immunitaire. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode globale capable de reproduire toutes ces interactions complexes en laboratoire. C’est pourquoi l’utilisation de modèles animaux, comme la souris, reste indispensable pour étudier le développement du cancer dans un organisme vivant.

Réduction

Dans un but de réduction, nous utiliserons indifféremment les mâles et les femelles, ce qui nous permettra d’utiliser la grande majorité des animaux générés dans les élevages. Des études préalables in vitro permettent de sélectionner des gènes d’intérêt afin de réduire le nombre tester in vivo, et l’ordre de réalisation des procédures servira à comparer différentes conditions afin de sélectionner la plus efficace pour réduire le nombre d’animaux utilisé dans certaines expériences.

Raffinement

Afin de garantir le bien-être des animaux, ceux-ci seront observés chaque semaine à l’aide d’une grille d’évaluation adaptée. Cela permettra de détecter rapidement tout signe de douleur, de stress ou de problème de santé. L’utilisation de modèles génétiques contrôlables permet de maîtriser le développement de la maladie et d’assurer un suivi attentif et régulier des animaux. L’évolution des tumeurs pulmonaires sera suivie au cours du temps grâce à une technique d’imagerie réalisée sous anesthésie, ce qui permet une évaluation précise tout en limitant l’inconfort. Cette approche aide à définir au plus juste le moment d’arrêter l’expérimentation, dans le but de préserver au maximum le bien-être des animaux. Toutes les procédures potentiellement stressantes ou douloureuses, comme certaines injections et les examens d’imagerie, seront réalisées sous anesthésie. Enfin, un gel protecteur sera systématiquement appliqué sur les yeux afin d’éviter leur dessèchement et toute atteinte visuelle.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche phylogénétiquement de l’homme, ce qui pourra permettre d’extrapoler rapidement les résultats obtenus chez la souris vers le développement de traitements chez les patients atteints de cancer du poumon. Le cancer ne se développe pas seulement lorsqu’une cellule normale devient cancéreuse. Il a aussi besoin d’un environnement particulier autour de la tumeur, composé d’autres cellules, de signaux métaboliques et de réactions inflammatoires, qui favorisent sa croissance. Le développement d’une tumeur dépend donc d’une interaction étroite entre les cellules cancéreuses et leur environnement, notamment avec le système immunitaire. Aujourd’hui, il n’existe pas de méthode alternative capable de reproduire toutes ces interactions, c’est pourquoi l’étude du cancer dans des souris reste indispensable. Les souris seront utilisées à l’âge de 8-12 semaines (équivalent âge humain = 16 ans) ou à 78 semaines (équivalent âge humain = 56 ans) afin d’étudier le développement du cancer du poumon chez des individus jeunes et âgés.

800 rongeurs, 400 souris et 400 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leurs organes. Ils reçoivent jusqu'à huit injections d'un composé pharmaceutique, jusqu'à quatre séances d'imagerie sous anesthésie et quatre prélèvements de sang. Le but étant de trouver la dose au-delà de laquelle apparaissent des effets indésirables graves, ils peuvent développer œdèmes, convulsions, tremblements, arythmies cardiaques, difficultés respiratoires et diarrhées. Le porteur conclut que le recours à l'expérimentation animale est "indispensable" pour caractériser la tolérance d'un candidat médicament, le bénéfice final annoncé étant "la mise sur le marché de nouveaux produits pharmaceutiques".

Objectifs

Les études de doses maximales tolérées (résumé sous l’acronyme anglais de MTD, Maximum Tolerated Dose) d’un composé pharmaceutique (médicament, vaccin, agent de contraste..) permettent de définir la dose maximale à laquelle l’administration d’un composé n’induit pas d’effet indésirable grave. Ces études sont conduites en amont des études de toxicologie réglementaires exigées avant une première administration chez l’Homme lors des tests cliniques et, au final, pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (AMM). L’objectif de ce projet est donc de déterminer les doses maximales de différents composés pharmaceutiques / candidats médicaments ou vaccins administrés chez le rongeur (souris ou rat) sans que celles-ci ne provoquent d’effets indésirables sévères ou pouvant remettre en question la survie de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir des doses limites administrables de plusieurs produits. Cela permettra de sélectionner des doses pertinentes pour les études de toxicologie réglementaire. Les études de MTD constituent une étape clé dans le développement et la caractérisation d’un produit permettant d’anticiper les risques cliniques et soutenir l’établissement d’un schéma posologique sûr lors de la transition vers l’homme. Le bénéfice final attendu est la mise sur le marché de nouveaux produits pharmaceutiques.

Procédures

Les animaux recevront le produit testé en dose unique ou répétée en respectant les volumes d’injections recommandés. Lors d’injections répétées, 8 injections maximum par animal pourront être réalisées. Sur animaux vigiles, les injections seront réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute) et la durée sera d’environ 5 minutes sur des animaux anesthésiés. Des examens d'imagerie pourront également être réalisés, avec parfois injection d’un produit de contraste, sous anesthésie générale pendant une durée de 5 à 20 minutes. La fréquence des examens sera au maximum de 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude (soit 4 examens au total). Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit au maximum 4 prélèvements de sang). Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes techniques avec ou sans anesthésie (pesées, suivis cliniques, administration de composés, prélèvement de sang…) ce qui pourra leur engendrer un stress. De plus, lié à l’objectif du projet (recherche de la limite supérieure de sécurité de prise d’un traitement), les animaux pourront développer divers effets indésirables et réactions liés à l’administration du composé d’essai à des doses élevées : inflammation locale ou systémique, œdème, perte de poids, variation de température, léthargie ou au contraire hyperactivité, déshydratation, dyspnée, arythmies cardiaques, tremblements, convulsions, diarrhées, vomissements, modifications de la formulation globale sanguine, etc.). La détermination de points limites précoces et adaptés permettra la bonne prise en charge des animaux présentant des signes cliniques. La sévérité et la durée des signes pourront varier entre les groupes en fonction des produits testés et de leurs concentrations.

Devenir

Le projet ayant pour but l’évaluation de la dose maximale tolérée d’un composé pharmaceutique, il nécessite des prélèvements d’organes en fin d’étude donc tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire de manière fiable la complexité physiologique (métabolisme, système immunitaire, fonction respiratoire, cardiaque, neurologique…) d’un organisme vivant. L’étude de la tolérance d’un candidat médicament nécessitant une évaluation de l’impact de ce traitement sur l’ensemble de ces différentes fonctions physiologiques, le recours à l’expérimentation animale est indispensable pour pouvoir caractériser la tolérance du traitement de manière exhaustive.

Réduction

Pour obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur une réelle tolérance du traitement testé, des groupes de 6 animaux minimum seront utilisés. Dans le cas d’utilisation de composés marqué (compatible avec les objectifs du projet), l’évaluation de la tolérance d’un produit et de son impact sur la physiologie d’un animal pourra être complété par de l’imagerie. L’avantage de l’imagerie médicale est de plus facilement corréler un effet observé à l’injection d’un composé mais aussi de suivre un même animal au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux intégrés au projet.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’au moins 5 jours sera respectée, portée à 7 jours en cas de transport aérien. Les animaux seront hébergés collectivement en cage tout au long du projet (de l’acclimatation à la fin de l’étude), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. Ils feront l’objet d’une observation quotidienne afin de détecter tout signe clinique anormal et d’appliquer, dès que nécessaire, les mesures appropriées pour garantir leur bien-être : mesures de soutien (désinfection de plaies, isolement, réchauffement, etc.) ou mise à mort humanitaire si l’état clinique est jugé moribond. Le poids des animaux sera mesuré quotidiennement après administration des produits testés. Un scoring clinique sera réalisé parallèlement à l’aide d’une grille d’évaluation. Les critères examineront à la fois l’état général (comportement, pelage, écoulements nasaux ou oculaires…) et des atteintes plus spécifiques d’un système physiologique (détresse respiratoire, troubles gastro intestinaux…), directement ou indirectement liés à la voie d’administration du composé. L’ensemble de ces éléments permettra d’attribuer un score global reflétant l’état de santé général des animaux et d’orienter la prise de décision. Des examens cliniques approfondis pourront également être réalisés. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. Lors des anesthésies, une attention particulière sera portée pour éviter l’hypothermie : animal sur tapis chauffant ou sous lampe chauffante pendant toute la durée de l’anesthésie.

Choix des espèces

Les rongeurs (souris et rats) ont été choisis car ce sont des modèles standards, polyvalents (multiplicité des souches disponibles dont certaines sans poil) et couramment utilisés dans les études de tolérance en raison de leur facilité à obtenir des lots homogènes (âge et sexe fixés). Le choix entre la souris et le rat sera directement lié aux contraintes de volumes d’administration ou de prélèvements (plus faible chez la souris). De plus, leur taille réduite permet l’utilisation de technique d’imagerie optique corps entier pouvant être un atout non négligeable pour le suivi d’un composé à l’échelle systémique. Des souches de souris sans poil seront privilégiées dans le cas d’utilisation de composés bioluminescents ou fluorescents pour obtenir les résultats les plus pertinents (absence de la bioluminescence naturelle des poils donc augmentation de la sensibilité). Des souris et des rats de minimum 6 semaines seront utilisées au cours de ce projet (stade jeune adulte - adulte) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal et d’avoir des animaux présentant un poids d’environ 20g pour les souris et 250g pour les rats.

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, respirent vite ou portent une plaie non guérie après deux jours sont mises à mort. 468 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs poumons. Elles inhalent sous anesthésie des molécules qui déclenchent un cancer du poumon, puis reçoivent jusqu'à vingt injections réparties sur six semaines, avec perte de poids et gêne respiratoire liées aux tumeurs. Le porteur écrit qu'aucune médication n'est prévue pour ne pas interférer avec les expériences, alors que les molécules testées seront selon lui "bientôt proposées en routine aux patients".

Objectifs

Les cancers du poumon sont la première cause de mortalité par cancer en France et dans le monde. Malgré les avancées thérapeutiques récentes, principalement basées sur les thérapies ciblées et les immunothérapies, de nombreuses tumeurs restent résistantes aux traitements et le taux de survie global à cinq ans ne dépasse pas 26 %. Il y a maintenant des nouvelles molécules qui bloquent un gène très important dans la survenue des tumeurs du poumon. Dans ce projet nous souhaitons caractériser l’apport de ces nouvelles molécules sur les thérapies classiques (chimiothérapie combinée à l’immunothérapie), identifier les potentiels mécanismes qui bloqueraient l'efficacité de ces traitements combinés et définir des stratégies pour contourner ces blocages.

Bénéfices attendus

Ces expériences pré-cliniques nous permettront de mieux appréhender l’efficacité des nouveaux traitements pour bloquer la progression des cancers du poumon. Ces traitements, qui incluent de nouvelles molécules qui suppriment l'activité d’un gène impliqué dans la progression des cancers, seront bientôt proposés en routine aux patients .

Procédures

- Les souris seront soumises à l'inhalation de molécules stimulant l’initiation du cancer. Cet acte dure moins de 30 secondes. Il est réalisé sous anesthésie pour diminuer le stress de l'animal. - Injections: 20 secondes x nombre d’injection, au maximum 20 injections par animal réparties sur 6 semaines. - Manipulation pour prise de poids : 15 secondes par animal, ce qui est le temps nécessaire pour prendre la souris, la poser sur la balance, reporter son poids et la reposer dans sa cage.

Impact sur les animaux

- Stress à la préhension. – Stress lié à l’injection.- Perte de poids liée à la présence de tumeurs. – gene respiratoire liée la présence de tumeurs.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tissus pulmonaires et l’analyse post mortem des échantillons. Les poumons seront prélevées pour des analyses histologiques et biochimiques afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Les critères d’analyse incluront : 1. La taille et le nombre des lésions cancéreuses pour évaluer la progression tumorale. 2. La présence de cellules immunitaires dans les lésions tumorales, afin de confirmer leur implication dans le développement des cancers. Ces analyses permettront de valider ou d’infirmer les hypothèses du projet, notamment en ce qui concerne l’efficacité des nouveaux inhibiteurs pour ralentir ou stopper la progression des tumeurs. En résumé, la mise à mort des animaux est essentielle pour atteindre les objectifs expérimentaux, tout en garantissant que les animaux ne subissent aucune souffrance inutile à l’issue de la procédure.

Remplacement

Nous avons utilisé des approches de culture cellulaire et analyses informatiques dans les étapes préliminaires qui ont permis le financement de ce projet. Les concentrations actives des molécules que nous testerons ont été validées sur des cultures cellulaires et/ou grâce à une étude exhaustive de la littérature. A ce jour il n'existe pas de méthode de remplacement (co culture de cellules associée à une modélisation informatique ou modèles invertébrés) qui permettent de caractériser chez les mammifères la dynamique des interactions cellulaires et moléculaires mises en jeu dans les pathologies telle le cancer du tissu pulmonaire résistants aux traitements. De ce fait, le recours à l’animal vivant est requis.

Réduction

Une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. De plus, nous avons réalisé une étude statistique prévisionnelle qui nous permet de prédire le nombre minimal d’animaux qu’il faut inclure par groupe expérimental afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les expériences seront arrêtées dès que nous aurons obtenu les résultats permettant de valider nos hypothèses de travail.

Raffinement

Nous avons montré l’absence de toxicité de nos composés et de leur véhicule sur des cellules en culture et sur des animaux vigiles. Nous avons choisi une technique basée sur l’instillation. L’instillation est réalisée sous anesthésie gazeuse sous une lampe chauffante pour limiter la perte de température. Le temps d’anesthésie a été adaptée pour limiter le risque de fausse route. Les animaux seront mis à mort avant l'apparition de signes cliniques extérieur. Pour limiter au maximum la souffrance des souris nous avons établi une fiche d’observation qui liste les mesures que nous prenons pour assurer le bien-être et nous avons défini des points limites (non guérison de plaie après traitement, manque de soin associé à un isolement pendant plus de 2j, suintement au site d’injection, respiration rapide, blessure étendue ou surinfectée, perte de poids >20%) à partir desquels l’expérience sera arrêtée. Aucune médication n’est prévue pour ne pas interférer avec nos expériences. Dans le cas de blessures légères, nous appliquerons un antiseptique pour nettoyer la plaie et réaliserons un suivi spécifique des animaux et si la blessure n’est pas en cours de guérison pas après 2j, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, il existe beaucoup d’outils (Anticorps, imagerie) qui permettent de travailler avec les souris. Le modèle génétiquement modifié que nous utilisons est bien caractérisé dans la littérature comme dans notre centre de recherche. Il est particulièrement adapté à notre projet avec un développement de cancer du poumon après l’expression de la forme active d'un gène promoteur de tumeur. Les souris femelles et mâles seront mises en expérimentation à un âge minimum de 8 semaines, soit à l’âge adulte. A cet âge, le système immunitaire des souris est mature. Les souris seront mises à mort au maximum 4 mois après le début de l’expérience pour permettre le prélèvement des tissus et leur analyse.

Quarante heures d'isolement en cage individuelle sans enrichissement, vingt heures sur grille pour récolter urines et selles, un jeûne avant chacun des huit prélèvements de sang : 3 450 souris subissent ces procédures, classées en souffrance modérée, toutes tuées pour prélever tissus et sang. Un régime enrichi en cholestérol et en acides biliaires leur fait développer des calculs biliaires, avec inflammation du foie, sensibilité accrue à la douleur abdominale et jaunisse possibles, chez des souris génétiquement modifiées qui développent déjà spontanément la maladie. Le porteur qualifie ces complications hépatiques et intestinales de modérées tout en choisissant ce modèle pour étudier des stades plus avancés et plus sévères de la maladie. Il revendique le nombre minimal d'animaux, et cette version du projet en ajoute 1 650 à l'autorisation initiale.

Objectifs

La formation de calculs biliaires peut entrainer des dysfonctions biliaires, hépatiques et intestinales importantes, notamment une inflammation sévère du foie qui peut elle-même entrainer un hépatocarcinome ou autrement appelé cancer du foie. Le but de ce projet est de modéliser ces dysfonctions en provoquant la formation de calculs biliaires et ainsi pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments. L'AJOUT D'UNE PROC2DURE NECESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISE AVEC AJOUT DE 1650 SOURIS.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de valider ou non des traitements limitants le développement de calculs biliaires et donc l’apparition des complications hépatiques et intestinales associées.

Procédures

Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles sur animal vigile ou anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile. 8 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 4h maximum avant le prélèvement. A maximum 4 étapes, nous mesurerons divers paramètres urinaires et fécaux (récolte pendant 20h par l’intermédiaire de cages à métabolisme). A maximum 2 étapes, nous mesurerons la composition corporelle (2 min sur animal vigile), la consommation énergétique (40h en cage individuelle sans enrichissement sur animal vigile), la force musculaire (5 minutes sur animal vigile).

Impact sur les animaux

1) La mise sous régime enrichi en cholestérol et en acide biliaire, va accentuer la formation de calculs biliaires. 2)Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3) Les mises à jeun (4h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress. 4)Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 20h. 5)Les mesures de consommation énergétiques impliquent un isolement pendant 40h, ce qui induit un stress à l'animal. 6)Les souris génétiquement modifiées développent spontanément une pathologie chronique. Ces évolutions de la maladie peuvent entrainer des modifications du comportement général, telles que : baisse d’activité, poil terne, diminution de la prise alimentaire ou perte de poids, augmentation possible de la sensibilité à la douleur abdominale ou à l’inconfort lié à l’inflammation chronique, une jaunice dans le sang.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno-marquages et expression de gènes, paramètres métaboliques...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développés pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions associées à la formation de calculs biliaires notamment au niveau du foie et de l’intestin ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. Une analyse statistique permettra d'utiliser le nombre minimal d'animaux tout en assurant la robustesse des résultats.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux. L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une rougeur ou plaies cutanées, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront.

Choix des espèces

La souris développe des calculs biliaires sous régime lithogénique entrainant des complications hépatiques et intestinales de façon modérée. La souris génétiquement modifiée est dépourvue de certains transporteurs, ce qui engendre une accumulation de lipides dans le foie et une accumulation d’acides biliaires dans la circulation sanguine et dans la bile. En utilisant ce modèle génétiquement modifié et prône à développer des calculs biliaires, cela nous permet d’exacerber l’effet du régime lithogénique et donc d’étudier des stades plus avancés et plus sévères de la maladie. Les animaux sont mis sous régime à l’âge de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge de maturité sexuelle.

Toutes tuées pour prélever rate, ganglions, foie et muscles, 632 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une forme de la maladie de Pompe qui provoque une faiblesse musculaire progressive, une toxicité cardiaque et une espérance de vie raccourcie. Elles reçoivent un produit de thérapie génique, jusqu'à quatorze prélèvements de sang, des injections d'immunosuppresseurs et des tests mensuels de force musculaire, celles qui perdent plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Le porteur affirme que "seuls les animaux sont capables de mimer la complexité de la réponse immune" et qu'aucune méthode substitutive n'existe.

Objectifs

L’émergence des produits de thérapie génique basés sur l’utilisation de vecteur viraux apporte aux patients un espoir de traitement pour les maladies génétique. Cependant, les réponses immunitaires dirigées contre le vecteur ou la protéine qu’il exprime représentent un obstacle majeur qui limite l’efficacité thérapeutique, nécessitant ainsi la mise en place de stratégies d’immunosuppression adaptées. La maladie de Pompe est une affection génétique héréditaire causée par un déficit en alpha-glucosidase acide (GAA) entrainant une accumulation pathologique du glycogène (forme de stockage du sucre) dans les cellules et provoque une faiblesse musculaire et des problèmes respiratoires. L’unique traitement actuel, l’injection de GAA produite en laboratoire, est limité par l’apparition d’anticorps et ne permet pas d’éviter la mortalité chez les patients les plus atteints. La thérapie génique utilisant des vecteurs a montré son efficacité pour traiter cette pathologie. Toutefois, la réponse immunitaire induite par ce traitement pourrait compromettre son efficacité. En effet, notre système immunitaire a pour fonction de préserver l’intégrité de notre organisme en neutralisant les éléments qui viendraient perturber trop fortement l’équilibre maintenu avec notre environnement. Il est ainsi logique que l’administration d’un vecteur viral puisse pâtir d’une réponse immunitaire qui tente de contrôler voire d’éliminer les éléments nouveaux qui sont produits, telle la GAA. Notre objectif est d’analyser dans un modèle de souris malade comment certaines caractéristiques des vecteurs influent sur la réponse immune, quelles sont les conséquences de cette réponse en termes d’efficacité thérapeutique et d’effets indésirables et enfin de déterminer comment la co-administration d’immunosuppresseurs pourrait permettre de mieux contrôler cette réponse immune délétère.

Bénéfices attendus

Des médicaments à base de vecteurs viraux arrivent sur le marché et/ou sont en test clinique pour traiter la maladie de pompe. Cependant, quelques rares effets indésirables et graves sont apparus, dont la cause serait une réponse immune. L’objectif de ce projet est d’analyser l’influence de divers éléments du vecteur modifiés en laboratoire sur la réponse immune et l’efficacité thérapeutique. Cela permettra de déterminer les règles qui déterminent pourquoi le système immunitaire se met à répondre au vecteur dans telle ou telle condition. Outre l’aspect scientifique novateur, deux bénéfices principaux sont attendus : 1) la conception de médicaments de thérapie génique plus sûrs pour les patients, moins susceptibles de générer des effets indésirables, 2) des approches d’immunosuppression plus adaptées et moins lourdes pour les patients.

Procédures

Les souris recevront une injection du médicament de thérapie génique. Les animaux vigiles seront ensuite suivis sur une période allant de 3 à 12 mois avec : 1) Prélèvements de sang hebdomadaires sur 1 mois, puis mensuels entrainant une douleur légère passagère de 20 secondes (14 fois maximum pour les procédures les plus longues). 2) Tests comportementaux qui permettent d’évaluer la force musculaire, mensuellement à partir de 3 mois. Les tests fonctionnels entrainent un léger stress de quelques minutes. Une seconde injection d’agents déclencheurs de la réponse immune sera également administrée. Le temps de suivi sera choisi en fonction des résultats des premiers points de temps et déterminera le nombre total de prélèvements et tests de force. Les souris recevront X injections additionnelles de molécules immunosuppressives : durée (quelques jours à quelques semaines selon les molécules administrées.). Le temps de suivi sera choisi en fonction des résultats de la partie 1.

Impact sur les animaux

Injections répétées durant 5 secondes maximum entrainant une légère douleur passagère. Les tests fonctionnels entrainent un léger stress de quelques minutes. Le modèle murin de la maladie de pompe entraine une faiblesse musculaire progressive entrainant une toxicité cardiaque et une espérance de vie plus courte (représentatif de la pathologie chez les patients) qui devrait être corrigée grâce aux traitements testés

Devenir

L’étude de la réponse immunitaire passe par l’analyse des cellules du système immunitaire dans différents tissus (sang, rate, ganglions, foie…) et l’analyse de l’efficacité du traitement de thérapie génique (sur les muscles notamment). L’analyse de ces tissus (sauf le sang) ne peut se faire que sur animaux préalablement euthanasiés. De ce fait, dans chaque procédure, les animaux seront tous euthanasiés.

Remplacement

Des expériences en laboratoire ont permis de ne sélectionner que les candidats médicaments fonctionnels les plus prometteurs. De plus, les molécules cibles de la réponse immune seront sélectionnées grâce à des outils informatiques de prédiction adaptés. Néanmoins, les réponses immunes sont la résultante d’interactions complexes impliquant de multiples types cellulaires et se déroulant dans plusieurs organes (rate, ganglions lymphatiques, moelle osseuse, foie, muscle etc…) et avec des cinétiques particulières. Ainsi, seuls les animaux sont capables de mimer la complexité de la réponse immune et il n’existe pour le moment aucune méthode substitutive.

Réduction

(1) Afin d’utiliser un minimum d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée, nous avons utilisé une approche statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir un résultat significatif. Ce nombre est respecté pour chaque procédure. (2) Dès que possible, nous effectuerons un suivi longitudinal de la réponse immune par prélèvement de sang sur les mêmes individus, ainsi que de la force musculaire sur animal vigile. Sur x point de temps, cela réduit le nombre d’animaux utilisés d’un facteur x. (3) De plus, nous analysons le maximum de tissus post-mortem afin de collecter le maximum d’informations sur chaque animal.

Raffinement

Durant les expériences, nous utiliserons des méthodes expérimentales adaptées par exemple lors des prélèvements de sang (anesthésie préalable, application éventuelle d’une compresse pour stopper d’éventuels saignements) ou lors de l’administration des produits (administration d’anesthésiques), suivi vigilant de l’état des animaux. L’endormissement plus ou moins profond de l’animal permet la réalisation du geste expérimental sans que celui-ci ne bouge et puisse se blesser. Après toute intervention, les animaux seront observés avec attention de façon quotidienne. Si des signes d‘inconfort ou de douleur venaient à apparaitre, l’animal sera surveillé plus fréquemment et pesé. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera mise à mort.

Choix des espèces

Le model murin de la maladie de Pompe est un excellent moyen de déterminer l’efficacité thérapeutique de notre candidat puisque les souris n’ayant pas de GAA présente une forme pathologique proche de celui observé chez l’homme : absence de GAA dans l’organisme, accumulation du glycogène, diminution de la force musculaire et une réponse immunitaire contre la GAA est observée en cas d’injection de constructions immunogéniques. Lors de nos précédentes études, nous avons démontré qu’il était possible de traiter ces symptômes via l’injection d’un de nos vecteurs. En fonction des disponibilités, les animaux seront utilisés entre 3 et 8 semaines d’âge, âge auquel le système immunitaire est mature.