Rongeurs
Évaluation de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques pour traiter la sclérose en plaques dans un modèle d’induction de la pathologie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une encéphalomyélite est provoquée par une injection sous la peau accompagnée de deux injections intrapéritonéales, puis 1 750 souris subissent gavages, prélèvements sanguins répétés et ponctions de liquide céphalorachidien, toutes tuées à l'issue par ponction cardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objectif est de tester des molécules candidates contre la sclérose en plaques, dont l'arrivée en clinique reste renvoyée à un "terme" non daté. Le porteur décrit des déficits moteurs progressifs et une perte de poids qui "pourra être importante", l'incapacité complète à se déplacer constituant un point limite, et prévoit de réhydrater par injection sous-cutanée les souris qui n'atteignent plus l'eau. Il affirme dans le même temps que ces déficits moteurs ne comportent aucune douleur associée.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans la recherche d’une nouvelle approche diagnostique ou d’un nouveau traitement pour la sclérose en plaques, une maladie qui touche le système nerveux central, en particulier le cerveau, les nerfs optiques et la moelle épinière. Dans cette pathologie, la transmission des influx nerveux est altérée, ce qui se manifeste par des symptômes très variables : engourdissement d’un membre, troubles de la vision, sensations de décharge électrique dans un membre ou le dos, troubles des mouvements. La sclérose en plaques évolue par poussées au cours desquelles les symptômes réapparaissent, mais aussi accompagnés de nouveaux symptômes. Au bout de quelques années, les poussées laissent des séquelles qui peuvent devenir très invalidantes (altération du contrôle des mouvements, de la perception sensorielle, de la mémoire, de la parole).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur la sclérose en plaques. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour lesquelles les options sont pour le moment limitées.
Procédures
Induction de la maladie : au maximum 1 administration sous cutanée et deux administrations intrapéritonéale (
Impact sur les animaux
Une petite plaie pourra apparaître au niveau du site d’injection du CFA. Dans ce projet nous nous attendons à des déficits moteurs progressifs chez les animaux, sans douleur associée. Cependant les déficits moteurs empêchant complètement le déplacement seront des points limites. Une paralysie des sphincters n’est en général pas observée à part dans des cas très rares. Les animaux présenteront une perte de poids qui pourra être importante. Les administrations de produit et prélèvements et contentions associées pourront induire un stress léger de quelques minutes. Du fait de leur difficulté à se déplacer, les animaux pourront présenter de la déshydratation qui sera gérée par des injections sous cutanée de fluides de réhydratation.
Devenir
Après la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront, dans la mesure du possible, été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité apparente. Elles auront si possible aussi été sélectionnées sur leurs propriétés pharmacocinétiques in vivo. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
Sur la base de nos expériences préalables et d’analyse des résultats par un test ANOVA, nous avons conclu qu’un nombre de 15 animaux par groupe est nécessaire si des paramètres variables sont mesurés (dosage de composé, scores cliniques). On pourra réduire jusqu’à 8 animaux pour une étude préliminaire. En moyenne, nous utilisons 10 animaux par groupe.
Raffinement
Dans le cadre de ce modèle, les animaux induits présenteront des déficits moteurs et de la perte de poids. Le poids sera suivi tous les jours et les pertes de poids persistantes ou importantes seront des points limites justifiant une euthanasie. Une déshydratation pourra résulter des déficits moteurs et de l’inflammation. Les animaux déshydratés seront réhydratés (NaCl ou RL SC). Les déficits moteurs seront quantifiés quotidiennement, afin de procéder à l’euthanasie des animaux dont l’état ne leur permettra plus d’aller chercher de l’eau et de la nourriture. La grille de scoring est détaillée dans la procédure. Des croquettes seront déposées en fond de cage ainsi que de la nourriture gélifiée. Des bâtons à ronger sont présents dans toutes les cages. Une paralysie des sphincters n’est pas attendue dans la plupart des cas mais ce point sera surveillé et une incapacité à uriner constituera un point limite.
Choix des espèces
La souris est l’espèce utilisée pour étudier la démyélinisation des neurones. Différents modèles induits de sclérose en plaques ont été décrits avec leurs avantages respectifs (Methods Mol Biol – 2012; 900: 381-401). Sur des souris de fond génétique SJL/J ou C57BL/6, l’induction de la sclérose en plaques par injection de protéines ou peptides provoquant une encéphalomyélite est considérée prédictive de la maladie humaine, car les altérations observées dans le système nerveux central ont une très grande similitude avec celles observées chez les patients atteints de sclérose en plaques. Des animaux sevrés (jeunes adultes de plus de 6 semaines) seront utilisés, ces modèles étant bien décrits chez les animaux adultes. Les adultes de plus de 10 semaines répondent mieux à l’induction, et seront privilégiés.
analyse de la biodistribution de vaccins ARNm par imagerie IRM
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour suivre par IRM où se logent les vaccins à ARN messager après injection dans le muscle, 90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est anesthésiée jusqu'à neuf fois, dont quatre fois une heure pour l'imagerie, et subit cinq prélèvements sanguins submandibulaires entre le jour 0 et le jour 28. Le porteur reconnaît que les ponctions répétées peuvent blesser, et alterne les côtés de prélèvement pour cette raison. La méthode est présentée comme un progrès parce qu'elle évite la mise à mort et les biopsies de ganglions, alors que toutes les souris du projet sont tuées à la fin pour vérifier la distribution du vaccin dans ces mêmes ganglions.
Objectifs
Le projet consiste à suivre la biodistribution de vaccins ARNm après injection intramusculaire dans un modèle murin. Plus particulièrement, nous voulons connaître la cinétique d'accumulation dans les ganglions drainants qui est cruciale pour l'effet vaccinal. A cette fin, nous allons ajouter des propriétés d'imagerie IRM à des formulations d'ARNm de composition similaire aux vaccins COVID19. Nous mesurerons également les taux sériques d'anticorps pour établir un lien entre signal IRM dans les ganglions et activité immunologique. L’intérêt est que nous allons doser les anticorps anti-Spike (protéine du COVID19) et pour avoir une relation entre signal IRM dans les ganglions et anticorps circulants.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les cinétiques de distribution des vaccins dans les ganglions après injection intramusculaire et d'établir des relations entre présence des formulations ARNm dans les ganglions et activité vaccinale. En effet, les méthodes existantes nécessitent la mise à mort ou des biopsies de ganglions pour quantifier la présence de vaccins dans les ganglions. La méthode proposée permettra un suivi non invasif et sans biopsies de la biodistribution des vaccins dans les ganglions.
Procédures
Nous prélèverons le sang à J0, J7, J14, J21 et J28 pour quantifier les anticorps induits par test ELISA. Chaque souris sera anesthésiée au maximum 9 fois: 5 fois pour les prélèvements submandibulaires, 2 fois pour les injections intramusculaires et 4 fois pour l'IRM. Les anesthésies dureront 5 minutes maximum pour les injections et prélèvements et une heure pour l'imagerie IRM.
Impact sur les animaux
Nous ne nous attendons pas à une douleur suite à l’injection des formulations mis à part la douleur induite lors de l'injection liée à l'aiguille. L'injection de formulations ARNm par voie intramusculaire peut entraîner une réaction inflammatoire. Nous avons déjà administré des vaccins ARNm sans 19F chez la souris sans observer de réactions allergiques ou de douleur. Les ponctions de sang répétées peuvent être aussi à l’origine de blessures.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques notamment de confirmer la distribution des formulations dans les ganglions.
Remplacement
Des études sur l'animal entier sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations ARNm et établir un lien entre accumulation dans les ganglions et activité immunologique. Etant donné la complexité des processus mis en jeu, aucune méthode de remplacement fiable n’est disponible. Les méthodes existantes utilisent la radioactivité avec une résolution spatiale inférieure à l'IRM et une toxicité cumulative des radioélements qui limite la généralisation de ces approches pour un suivi chronique par exemple.
Réduction
L’effectif des souris mis en oeuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Les mêmes souris seront utilisées pour l'imagerie IRM et prélèvements de sérum ce qui permettra de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests statistiques (ANOVA). L’imagerie permet un suivi longitudinal et donc de réduire l’utilisation d’animaux
Raffinement
Des points limites prédictifs avec une grille de scoring seront mis en place. Les animaux seront suivis quotidiennement dès leur arrivée. les souris seront anestésiées durant les injections, durant l'imagerie IRM et durant les prélèvements de sang. Pour les injections intramusculaires, les souris recevront une injection sous cutanée d'antalgique 10 minutes avant l'injection intramusculaire. Nous alternerons le côté de prélèvement submandibulaire pour éviter les blessures dues aux ponctions répétées de sang.
Choix des espèces
Le modèle souris permet d'évaluer les capacités des formulations ARNm dans une espèce à cycle de vie court où les mécanismes immunitaires sont les mêmes que chez l'Homme mais à des échelles de temps compatibles avec un criblage des formulations ARNm. Nous utiliserons des souris Balb/c car c'est ce modèle qui a été utilisé dans nos expériences précédentes de vaccination ARNm et dans les expériences publiées avec les vaccins ARNm de référence. Les souris BALB/c sont un modèle standard crucial dans la recherche immunologique en raison de leur système immunitaire bien caractérisé et de leur réponse régulière aux antigènes, ce qui permet de tester efficacement l’immunogénicité et la sécurité des vaccins ARNm avant les phases cliniques humaines. Des souris adultes (à partir de 8 semaines) ayant un système immunitaire mature seront utilisées.
Evaluation de l’activité antitumoral de thérapies cellulaires sur la croissance tumorale ovarienne chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
Les souris utilisées sont sévèrement immunodéficientes, condition sans laquelle les cellules tumorales et immunitaires humaines qu'on leur injecte seraient rejetées. 40 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules cancéreuses humaines dans l'abdomen, y développe une tumeur suivie deux fois par semaine par imagerie sous anesthésie, avec jusqu'à 17 administrations d'un réactif de détection, quatre injections intraveineuses dans la queue et 24 injections sous-cutanées. Toutes sont tuées à la fin pour le prélèvement d'organes, le porteur n'excluant pas une dissémination tumorale et une gêne respiratoire en cas de métastases pulmonaires.
Objectifs
L’immunothérapie dans le domaine du cancer est une approche thérapeutique qui vise à stimuler le système immunitaire du patient pour qu’il puisse éliminer les cellules cancéreuses. Parmi les approches disponibles, il est possible de récupérer certaines cellules immunitaires du patient, de les modifier afin qu’elles reconnaissent spécifiquement les cellules cancéreuses avant de les réinjecter au patient. Cette approche, appelée thérapie cellulaire, a démontré son efficacité dans de nombreux essais cliniques pour le traitement de différents cancers. Nous avons réussi à générer des cellules immunitaires modifiées capables de reconnaître différents types de cancers, tels que le cancer de l’ovaire et un sous-type de cancer du sein très agressif. De plus, nous avons démontré que ces cellules immunitaires modifiées sont capables d’éliminer des cellules cancéreuses in vitro. Cependant, il est nécessaire de vérifier leur potentiel thérapeutique in vivo. Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunodéficientes permettant l’étude de la croissance tumorale en présence de cellules immunitaires humaines spécifiques. L’objectif principal est de valider la capacité de ces cellules immunitaires modifiées à éliminer les cellules cancéreuses in vivo, et de déterminer si la version optimisée du produit présente une efficacité supérieure à celle du traitement de référence.
Bénéfices attendus
En cas de résultats positifs, cette étude permettra de valider une nouvelle approche thérapeutique innovante pour les patients atteints de cancer, notamment de cancers de l’ovaire et du sein qui ne répondent pas aux traitements standards. Ceci accélèrera la validation préclinique de cet outil thérapeutique afin d’entamer le transfert vers la clinique.
Procédures
Pour réaliser l’injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses humaines, chaque souris est brièvement maintenue pendant environ 15 secondes. Une seule injection sera effectuée par animal. À la suite de cette injection, les souris développeront une tumeur au niveau de la cavité abdominale. La croissance tumorale sera suivie par imagerie deux fois par semaine durant toute la durée de la procédure. La veille de la première mesure, les animaux seront rasés. Cette intervention, d’une durée d’environ 2 minutes, pourra être répétée une fois au cours de la procédure si nécessaire. Le jour de chaque acquisition, les animaux seront anesthésiés et maintenus brièvement afin de recevoir un réactif permettant la détection du signal tumoral, puis resteront sous anesthésie durant toute la séance d’imagerie (environ 10 minutes). Chaque souris pourra recevoir au maximum 17 administrations de ce réactif. Le traitement expérimental sera administré par voie intraveineuse au niveau de la queue, nécessitant une immobilisation d’environ une minute ; quatre injections intraveineuses seront effectuées par animal. Des injections sous-cutanées de molécules de soutien aux cellules lymphocytaires seront réalisées trois fois par semaine durant toute la procédure, soit un total de 24 injections sous-cutanées, avec une contention d’environ 15 secondes par geste. Les animaux seront également pesés deux fois par semaine durant la procédure, une contention de 15 secondes étant nécessaire pour cette opération.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales dans la cavité abdominale de la souris est susceptible d’entraîner une douleur modérée et temporaire au moment de l’administration. À la suite de cette injection, les animaux développeront des tumeurs localisées principalement dans la cavité péritonéale. Toutefois, une dissémination tumorale ne peut être totalement exclue. En cas de formation de métastases, notamment au niveau des poumons, une gêne respiratoire pourrait survenir. L’injection intraveineuse du traitement dans la queue peut provoquer une gêne modérée et passagère au moment de l’injection. Des inflammations locales légères peuvent également apparaître à la suite de multiples injections. À ce jour, aucun effet indésirable majeur lié au transfert de cellules immunitaires modifiées chez la souris n’a été rapporté dans la littérature. Nous n’envisageons donc pas d’effets secondaires spécifiques liés à ce traitement. L’administration sous-cutanée de protéines solubles pourrait entraîner une douleur légère ou temporaire au site d’injection. De même, les injections intrapéritonéales répétées nécessaires au suivi de la croissance tumorale par imagerie peuvent induire une inflammation locale ou une gêne transitoire, sans conséquence durable sur le bien-être des animaux. Enfin, les manipulations répétées (injections, pesées, surveillances) peuvent occasionner un stress transitoire.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever certains organes dans le but d’analyser leur composition immunitaire.
Remplacement
Des expériences in vitro ont déjà été réalisées afin de confirmer l’efficacité des cellules immunitaires modifiées générées et leur capacité à éliminer des cellules tumorales. Les animaux sévèrement immunodéficientes correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires modifiées puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires murines. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires modifiées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude.
Réduction
Le projet comporte une seule procédure expérimentale, ayant pour objectif principal de démontrer l’effet antitumoral du traitement standard et d’évaluer si la version optimisée de ce traitement présente une efficacité supérieure au produit non optimisé. Dans l’hypothèse où les résultats in vitro montreraient que le traitement optimisé est moins efficace que le prototype initial, aucun test in vivo ne serait réalisé avec ce traitement optimisé. Un outil statistique approprié a été utilisé pour déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaire et suffisant afin de garantir la validité scientifique de l’étude tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, un ensemble optimal de données et d’échantillons sera collecté pour chaque animal, de manière à maximiser les informations obtenues tout en limitant le recours aux animaux au strict minimum requis pour répondre à l’ensemble des objectifs expérimentaux.
Raffinement
L’effet des composés (cellules cancéreuses et réactifs injectés) sur l’état physiologique des souris est suivi par observation clinique, pesée des animaux et mesure des tumeurs par imagerie. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour le projet, incluant des critères d’arrêt de l’expérience en cas de souffrance des animaux. Aucun effet indésirable lié à des molécules de soutien dans le modèle de souris utilisé n’est attendu. Les souris seront anesthésiées pour le suivi longitudinal réalisé par imagerie. Leur réveil est facilité en plaçant la cage sur un tapis chauffant.
Choix des espèces
Les souris utilisées correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires modifiées puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires de souris. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires transférées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude. Les animaux utilisés seront à l’âge de 6-8 semaines afin de pouvoir réaliser les greffes dans l’abdomen et l’injection en intraveineuse des cellules immunitaires dans des conditions optimales.
Test de composés pharmacologiques ciblant le dysfonctionnement d’organelles dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un composé par voie orale six jours sur sept pendant huit semaines, puis passent le rotarod, où elles sont forcées de marcher cinq minutes sur une roue en rotation, le test du gait, et le test de von Frey, qui applique des forces croissantes sur la patte au moyen d'un filament. La lignée utilisée porte une mutation de Mfn2 qui reproduit une dénervation musculaire et des défauts locomoteurs apparaissant après six mois. Le porteur indique que les composés ont déjà montré un effet bénéfique sur un modèle in vitro dérivé de cellules humaines de patients, et qualifie néanmoins le passage chez la souris d'étape "indispensable".
Objectifs
La maladie de Charcot Marie Tooth (CMT) est une maladie génétique touchant le système nerveux périphérique (SNP). Les patients souffrant de CMT présentent une faiblesse et atrophie musculaire prédominante aux membres inférieurs, des déformations squelettiques des extrémités, ce qui entraine une difficulté pour se mouvoir et pour les formes de CMT les plus sévères, la nécessité d'un fauteuil roulant. Contrairement à la maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique), la CMT ne réduit pas l’espérance de vie des patients, mais affecte fortement leur qualité de vie. Une des formes les plus fréquente de CMT est la forme CMT2A. Au niveau cellulaire, nos travaux précédents ont montré que la Mfn2 mutée entraine des défauts d'organelles dans les neurones conduisant à l’activation d’un stress cellulaire . Ce projet a pour but de tester plusieurs composés pharmacologiques, dont l’effet a d’abord été validé dans des modèles cellulaires, permettant d’améliorer le contact entre ces deux organelles et de réduire le stress cellulaire, dans un modèle murin modélisant de la maladie CMT2A.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si ces composés pharmacologiques représentent une possibilité thérapeutique pertinente pour la CMT2A. Si un effet bénéfique est obtenu, cela pourrait dans le futur conduire à un essai clinique chez l’homme. A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT liées à des défauts de stress du réticulum endoplasmique ou à des défauts d’organelles
Procédures
Les animaux seront soumis à : une administration de traitement par voie orale en prise spontanée 6j/7 pendant 8 semaines (léger; quelques minutes); des tests de comportement permettant la mesure de la locomotion et de la sensibilité des pattes (maximum 15 minutes par animal pour chaque test) . Chaque test sera réalisé sur deux jours (entrainement et test) en incluant des moments de récupération pour les animaux entre chaque essais ( 5 minutes) et entre chaque test (au moins deux jours). A la fin de l'expérience, les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les animaux CMT2A présentent un phénotype léger d’apparition tardive (après 6 mois) sans impact sur la qualité de vie et surive des animaux. Dans le cas de l’administration guidée par micropipette, les animaux subiront à l’âge adulte un traitement par voie orale de 6 jours par semaine pendant deux mois. Cela impliquera une légère contention de l'animal une fois par jour au moyen d'une légère pression exercée par la paume de la main de l'expérimentateur. L'administration par micropipette ne créera pas d'inconfort, et les composés ont déjà été testé et sont bien tolérés. Au cours du test rotarod, les souris seront forcées à marcher sur une roue qui tourne pendant 5 min. Pour les souris transgéniques qui présentent des défauts locomoteurs sur ce test, cela pourra conduire à une fatigue musculaire légère. Nous n'anticipons pas de nuisance liée au test du gait. Le test VonFrey, qui a pour but d’analyser la réponse sensitive, entraîne par contre un inconfort de courte durée suite à l’exposition à un filament de 0.5 mm qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Les souris ressentiront ainsi une légère piqûre au niveau de leur paume qui entraine un léger inconfort de quelques secondes.
Devenir
mise à mort et récupération des tissus
Remplacement
l est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann). Les neurones moteurs et sensitifs de patients peuvent être différentiés à partir de cellules pluripotentes humaines induites et constituer ainsi un modèle humain de la pathologie CMT pour les formes axonales. Nos données préliminaires ont déjà montré un effet bénéfique de ces composés sur un modèle in vitro de la CMT2A. Néanmoins le passage in vivo, notamment chez la souris, est une étape indispensable pour établir la preuve de concept et la mise au point de la dose du traitement, sa biodisponibilité, afin d'envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme.
Réduction
Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire (= 15 animaux par groupe) pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion et de sensibilité en se basant sur nos travaux précédents et des tests statistiques. Au total nous utiliserons 420 animaux répartis de la manière suivante : Deux groupes génétiques : contrôles et mutants - Quatre groupes thérapeutiques : 1 solution véhicule (contrôle) et 4 différents composés pharmacologiques.
Raffinement
Nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Afin d’optimiser le bien-être de nos animaux, nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage afin de réduire la douleur et le stress des animaux. Nous avons choisi de privilégier un mode d’administration de notre composé pharmacologique par voie orale via la méthode MDA plutôt que par gavage afin de réduire considérablement le stress des animaux et d’éventuels risques de blessures lors de l’injection.
Choix des espèces
La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, la lignée utilisée pour la CMT2A reproduit une partie des anomalies histologiques et comportementales observés chez ces patients telles qu'une dénervation musculaire, et des défauts locomoteurs tardifs. Pour les trois études, les traitements seront réalisés à 4 mois (proche du début ds symptômes moteurs) pendant 8 semaines. L'ensemble des groupes de souris de ces études seront suivis pendant les deux mois de traitement (soit de 4 à 6 mois).
Impact du métabolisme sur la fonction cardiaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
13 160 souris vont être utilisées, dont 6 320 subissant un rétrécissement chirurgical de l'aorte abdominale puis son rétablissement, et 880 la pose d'un implant de télémétrie. 3 520 d'entre elles sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, les autres relevant de procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le protocole ajoute un régime gras et sucré destiné à installer une maladie du foie, des prélèvements mandibulaires sous anesthésie, des mises à jeun, jusqu'à trois isolements de 24 heures, et une mise à mort à 15 % de perte de poids. Les bénéfices avancés, de nouveaux traitements immunitaires contre l'insuffisance cardiaque, sont au conditionnel et à long terme, quand la maladie hépatique et cardiaque installée chez 13 160 souris est, elle, l'effet indésirable principal reconnu par le porteur.
Objectifs
Comment un foie malade peut rendre votre cœur fragile. Pour bien fonctionner, le coeur a besoin d'un apport d'énergie constant. Quand cet apport se dérègle, le cœur devient vulnérable, facilitant les maladies cardiovasculaires (MCV) mais les mécanismes responsables restent mal connus. L'obésité, le diabète et l'hypertension ne sont pas de simples "risques" pour le cœur ; ce sont des maladies interconnectées qui induisent directement et accélèrent les complications cardiaques. Une maladie du foie appelée MASH (Stéatohépatite associée à un dysfonctionnement métabolique, souvent liée à l'accumulation de graisse) est devenue une préoccupation majeure. Elle touche 15 % de la population mondiale et est fortement liée à une forme grave d'insuffisance cardiaque : l'HFpEF (Insuffisance Cardiaque à Fraction d'Ejection Préservée). L'HFpEF est dangereuse car elle provoque un "remodelage cardiaque" : le cœur se déforme et devient moins souple et moins efficace comme pompe. Comment un problème au foie affecte-t-il le cœur, un organe anatomiquement éloigné ? Nous pensons que l'intermédiaire clé est l'inflammation chronique de bas grade et, surtout, le système immunitaire. Quand le foie est atteint de MASH, les conséquences sont multiples ; non seulement les cellules hépatiques sont atteintes mais aussi les cellules immunitaires dans l’organisme entier et notamment des cellules immunes spécifiques ; les monocytes, et les macrophages. Le foie atteint de MASH produit également des facteurs pro-inflammatoires dans le sang. Ces cellules immunitaires et ces messagers inflammatoires atteignent le cœur y provoquant des dommages, de la fibrose (tissu cicatriciel) et le remodelage cardiaque pathologique. Notre hypothèse Principale : Les changements inflammatoires et immunitaires causés par la MASH déforment le cœur et l'empêchent de se réparer correctement. Notre Projet : Décrypter le Dialogue Foie-Cœur. Nous explorerons ce lien en utilisant des modèles de souris: Nous administrerons un régime induisant le MASH aux souris et étudierons comment les altérations immunitaires de ces souris MASH affectent la déformation et la fonction de leur cœur. Nous évaluerons si le ciblage du système immunitaire permet d’améliorer la fonction cardiaque après une complication. L'objectif final est de trouver de nouvelles pistes de traitement pour l’insuffisance cardiaque pour laquelle les options de soins actuelles sont insuffisantes.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à comprendre comment le "foie gras" sévère (appelé MASH) cause des problèmes cardiaques. Nous pensons que le système immunitaire est un messager entre les deux organes. Les personnes ayant des problèmes de métabolisme (comme le diabète ou le "foie gras" sévère) développent souvent maladies cardiaques. Ce projet explore la façon dont le foie malade envoie des signaux au cœur. Nous faisons l'hypothèse que le système immunitaire, et l'inflammation est un médiateur entre le foie et le cœur. Les résultats nous aideront à identifier précisément ces signaux et ces mécanismes. Si nous confirmons que l'immunité est le moteur de ces complications cardiaques, cela ouvrirait de larges perspectives thérapeutiques. Actuellement, les traitements qui régulent le système immunitaire ne sont pas utilisés dans les pathologies cardiaques consécutives au MASH. Ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements ciblant le système immunitaire pour traiter à la fois le cœur et le foie, des maladies que l'on considérait jusqu'à présent comme événements indépendants. Toutes nos découvertes seront publiées pour la communauté scientifique, présentées dans des conférences, mais aussi expliquées au grand public et aux patients.
Procédures
Les souris seront placées sous régime MASH. Au cours de ce régime, les souris seront soumises des prélèvements mandibulaires sous anesthésie afin de vérifier les paramètres métaboliques. Une partie des souris (304 souris) sera également soumis à un test de tolérance au glucose (gavage oral < 1min) et à une mesure de la fonction rénale (débit de filtration glomérulaire) (IV
Impact sur les animaux
Les animaux pourront être soumis à un régime alimentaire spécifique et à des tests de suivi réguliers (prises de sang de faible volume, mesures cardiaques sous anesthésie). L'effet indésirable principal est le développement d'une pathologie métabolique et cardiaque, surveillée quotidiennement pour s'assurer qu'elle reste dans des limites de sévérité modérée. Certaines procédures peuvent entraîner un stress chez l’animal malgré l’utilisation d’anesthésiques et analgésiques appropriés notamment lors des procédures chirurgicales : - Douleur courte et légère liée à la biopsie pour le génotypage ainsi que le marquage avec une bague - Stress et douleur léger et court le temps de l’injection pour les injections intrapéritonéale et en intra-veineuse - Stress léger et court lors d’un prélèvement sanguin, ou d’un gavage - Stress métabolique léger suite à une alimentation enrichie en graisse et en sucre - Stress léger lié à la mise à jeun des animaux pendant 4h - Douleur légère et de courte durée après les interventions chirurgicales (pour la constriction de l’aorte abdominale et sa suppression ainsi que la pose des implants de télémétrie). Il n’est pas attendu que les procédures décrites causent des pertes de poids, des altérations de l’activité ou de manière générale des altérations comportementales. De tels événements peuvent néanmoins survenir de manière inopinée.
Devenir
A l'issue de de chaque enchaînement de procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer des tissus en vue de réaliser les analyses histologiques cellulaires et moléculaires, lesquelles nous fourniront des informations cruciales sur l’implication du système immunitaire dans le remodelage cardiaque lors d’une MASH.
Remplacement
Dans un contexte de maladie multi-organe, il n'est pas possible de remplacer les modèles animaux pour cette étude. La souris a été choisie en raison de la disponibilité de nombreuses lignées d’animaux génétiquement modifiés nécessaires pour l’élucidation des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant la pathologie. La physiologie du cœur murin est très similaire à celle de l'humain, tout comme le développement de maladies chroniques du foie et les procédures proposées telles que la constriction de l’aorte abdominale sont réalisables. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches de physiologies intégrées.
Réduction
Le nombre maximal d’animaux nécessaire pour ce projet d’une durée de 5 ans à venir est estimé à 13 160 souris. Cette utilisation maximise les données obtenues pour chaque animal, ce qui permet de limiter ou d’éviter l’utilisation subséquente d’animaux supplémentaires, et ce sans compromettre le bien-être animal. La réduction du nombre d’animaux utilisés est obtenue par trois moyens principaux : - Optimisation des groupes expérimentaux : Le nombre d’animaux par groupe est déterminé sur base de notre expérience antérieure et du nombre d’animaux nécessaires pour la mesure de chaque paramètre ou groupe de paramètres. Un nombre maximal de paramètres est mesuré sur chaque animal en tenant compte du fait que la taille des cœurs de souris (150-200 mg) impose des contraintes : la plupart des analyses nécessitent un demi cœur pour obtenir une quantité suffisante de matériel biologique. De plus, un maximum d'organes sera prélevé sur chaque animal afin d'obtenir un maximum de paramètres pour chaque expérience et ainsi éviter la répétition d'expériences pour l'obtention d'organes non initialement ciblés. - Optimisation des élevages : Nous éviterons la production d'animaux inutiles notamment en utilisant des animaux contrôle issus des mêmes portées que les animaux présentant les altérations souhaitées. Formation adéquate : Assurer une formation optimale des personnes manipulant les animaux afin de maîtriser les gestes techniques et minimiser le stress des animaux. La maîtrise technique permet de réduire la variabilité inter-individuelle et, par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires pour confirmer statistiquement un effet biologique. Une prévision du nombre d’animaux total nécessaire par groupe est réalisée pour respecter le principe des 3R basée sur notre expérience au laboratoire, sur la littérature.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans des conditions optimales pour minimiser la douleur et la souffrance, avec l'utilisation systématique d'anesthésie et d'analgésie.Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi et leur bien-être surveillé régulièrement. Les souris seront hébergées par groupe de 6, dans des cages ventilées avec de l’enrichissement (maison rouge, coton pour nidification) pour réduire le stress des animaux et aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. Lors de la mise sous régime des souris, la fréquence de change de la litière et de la cage est augmentée. L’utilisation de techniques non invasives, des produits anesthésiques et analgésiques optimaux, et la dextérité du personnel contribuent à réduire le stress des animaux durant l’expérimentation. La définition précise des points limites précoces associés à chaque procédure, ainsi qu’une surveillance pendant tout le protocole permettront de limiter l’apparition d’une souffrance ou d’une atteinte de l’état général de l’animal. Nous remplirons une feuille d'évaluation des points limites dans laquelle chacun des points critiques sera évalué de 0 (aucun signe) à 3 (signes graves de malaise). Si ces limites sont atteintes, diverses mesures seront prises. Exemple : Suite à une perte de poids supérieure à 10 %, du gel nutritif sera mis à disposition dans les cages et un suivi individuel plus fréquent sera fait pour voir si l'animal reprend ou maintient ce poids. Si la limite de 15 % de perte de poids est observée, l'animal sera exclu de l'expérience et il sera euthanasié. En cas d’atteinte d’un point limite de niveau 3 ou si le score total des points limites ≥6, les animaux seront sortis de l’étude et seront mis à mort.Concernant les modèles de chirurgie, le raffinement est crucial pour la survie et la réduction de la souffrance. Les souris sont maintenues dans un environnement sanitaire de haute protection pour garantir leur santé et la fiabilité des résultats. Nous utiliserons systématiquement des champs stériles, gants stériles et instruments autoclavés pour minimiser les risques d’infection post-opératoires. Nous utiliserons également des fils résorbables pour le plan musculaire et la peau, réduisant la nécessité de manipulation et le stress de retraits des sutures.Après chirurgie, les souris seront ensuite remises dans leur groupe social (si toutes les souris ont été opérées), et nous utiliserons des techniques de contention douces pour minimiser la douleur.
Choix des espèces
Pour étudier les dysfonctions cardiaques et la communication inter-organe, il est essentiel d'utiliser un modèle animal. C'est le seul moyen de reproduire de manière fidèle et globale les modifications métaboliques et immunitaires qui sous-tendent ces pathologies, ainsi que les symptômes observés chez l'humain. Les souris peuvent développer des pathologies telles que l’obésité, la MASH et les maladies cardio-vasculaires. La physiologie de leur cœur est très similaire à celle de l'humain, ce qui en fait un modèle fiable pour l'étude des maladies cardiaques. La souris est le modèle de mammifère dans lequel les modifications génétiques sont les plus simples à réaliser et pour lequel il existe déjà un grand nombre de lignées génétiquement modifiées. De plus, il existe une vaste base de données scientifiques sur cette espèce. Cela nous permet de croiser nos résultats avec la littérature existante et, par conséquent, de réduire le nombre d'animaux nécessaires à notre projet. Le régime MASHogène est un modèle de maladie chronique de l'adulte, souvent associée au syndrome métabolique, au vieillissement ou à des facteurs génétiques qui se manifestent pleinement à l'âge adulte. L'utilisation de souris adultes permet de : - Reproduire la physiopathologie humaine : Les souris juvéniles n'auraient pas le temps de développer les lésions hépatiques et les complications métaboliques (résistance à l'insuline, diabète, fibrose) caractéristiques de la MASH ou du syndrome métabolique. - Stabiliser le métabolisme : Le métabolisme des souris juvéniles est en pleine croissance et est extrêmement variable, ce qui compromettrait la fidélité du modèle. - Fonction cardiaque stable : Les mesures ECG et de pression artérielle sont destinées à évaluer une physiologie cardiaque mature ou des changements pathologiques. La fréquence cardiaque, la pression artérielle, et le développement cardiaque changent rapidement pendant la croissance. L'utilisation de souris adultes garantit un état de base stable pour les enregistrements télémétriques. - Récupération chirurgicale : Les souris adultes ont une meilleure capacité à gérer le stress chirurgical majeur et le long processus de récupération nécessaire. En résumé, nous utiliserons des souris adultes car elles sont les seules à remplir les critères de validité scientifique pour nos études
Modélisation de l’hidradénite suppurée par inactivation conditionnelle de la nicastrine dans les cellules souches du follicule pileux.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Épilées sous anesthésie, badigeonnées trois jours de suite d'un produit sur le dos, puis exposées quatre fois à des bactéries appliquées au coton-tige, 2 352 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent aussi cinq prélèvements sanguins étalés sur soixante jours, une injection abdominale et cinq semaines de régime hyperlipidique. Le but est de construire un modèle d'hidradénite suppurée par inactivation d'un gène dans les cellules souches du follicule pileux, ce qui provoque hyperprolifération folliculaire et inflammation cutanée massive. Le porteur présente ce nouveau modèle comme une amélioration du bien-être des animaux non-humains et une limitation de leur nombre, tout en annonçant 2 352 souris toutes tuées pour l'analyse de leurs tissus.
Objectifs
L'hidradénite suppurée (HS) est une maladie inflammatoire chronique de la peau affectant le follicule pileux. Notre équipe étudie le rôle de certaines cellules et a mis en évidence une altération de leur homéostasie chez les patients. Des mutations d’un gène de la protéine nicastrine ont été identifiées chez environ 10 % des patients HS. Un modèle de souris avec une délétion spécifique de la nicastrine dans certaines cellules développent des lésions cutanées associant hyperprolifération des follicules et une inflammation massive. Nous proposons un nouveau modèle murin qui permettra une meilleure compréhension des mécanismes à l'origine de l'HS et pourrait aboutir à de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le développement d'un modèle murin amélioré est essentiel pour comprendre la physiopathologie de l'HS et identifier de nouveaux traitements pour cette maladie actuellement sans solution curative. Ce modèle permettra aussi d'améliorer le bien-être animal en ciblant plus précisément les cellules d'intérêt, réduisant ainsi les effets secondaires indésirables et limitant le nombre d'animaux nécessaires. En effet, l’animal pourra servir de contrôle pour lui-même, minimisant la variabilité interindividuelle et optimisant la pertinence des résultats.
Procédures
Préparation des souris et traitement initial : Les souris seront épilées sous anesthésie afin de garantir une application homogène des traitements. Pendant trois jours consécutifs, une application cutanée de produit sera réalisée sur la région dorsale. Des prélèvements sanguins seront effectués à intervalles réguliers (J0, J14, J30, J45, J60) une méthode rapide (< quelques secondes). Une injection dans l’abdomen sera réalisée en quelques secondes. Application topique cutanée avec des bactéries à l’aide d’un coton-tige sur la surface cutanée sans nécessité de raser la fourrure. Cette application topique sera répétée de manière quotidienne un total de 4 fois (quelques minutes à chaque fois). Introduction d’un régime hyperlipidique sur une période de cinq semaines.
Impact sur les animaux
L'administration d’un des produits par voie cutanée pourrait induire des effets secondaires locaux tels qu'une irritation cutanée, une sécheresse excessive ou une inflammation transitoire au site d'application. Ces effets seront surveillés et atténués par une application contrôlée du traitement et l'utilisation éventuelle d'agents apaisants. De plus, l'inactivation de la nicastrine dans notre modèle pourrait provoquer une altération de la structure des follicules et une inflammation cutanée, ce qui sera évalué régulièrement afin d'adapter les conditions expérimentales si nécessaire.
Devenir
L'ensemble des animaux est mis à mort afin de déterminer sur les tissus isolés l'évolution de la réponse immunitaire sur la totalité de la cinétique expérimentale.
Remplacement
Nous avons évalué les alternatives existantes, notamment les modèles in vitro (cultures cellulaires, organoïdes, folliculoïdes) Toutefois, l’HS est une maladie complexe et multifactorielle, impliquant des interactions entre les cellules épithéliales du follicule pileux, le microbiote cutané et le système immunitaire inné et adaptatif. À ce jour, aucun modèle in vitro ne permet de reproduire cette complexité de manière fidèle. Modèles in vitro et limites : Les folliculoïdes que nous développons offrent une plateforme intéressante pour étudier certains aspects précoces de la maladie, mais ils ne permettent pas d’analyser l’infiltration immunitaire ni les interactions systémiques entre les cellules de l’hôte et le microenvironnement inflammatoire. Les cultures isolées ne permettent pas de reconstituer l’architecture folliculaire ni les phénomènes de rupture folliculaire, caractéristiques clés de l’HS. Ainsi, l’utilisation de notre modèle murin est nécessaire pour explorer les mécanismes précoces de l’HS, notamment : le rôle de certaine scellules dans l’initiation de la maladie ; les interactions entre diffrérents types scellulaires ; et la formation des lésions caractéristiques. En complément, nous continuerons à développer et affiner des modèles alternatifs, notamment les folliculoïdes, afin de limiter le recours aux modèles animaux lorsque cela est possible
Réduction
Nous avons optimisé notre approche expérimentale afin de limiter autant que possible le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique de nos résultats. 1. Optimisation de la taille des cohortes: Nos calculs de puissance statistique ont été réalisés en amont afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs tout en évitant une surutilisation. 2. Maximisation des données obtenues par animal: nous utilisons plusieurs approches/réalisons plusieurs analyses sur un même animal, ce qui permet d’exploiter pleinement chaque individu et d’éviter la nécessité de cohortes supplémentaires pour différentes analyses. Nous avons développé un modèle fluorescent qui permet un traçage précis des cellules étudiées facilitant l’interprétation des résultats tout en réduisant le besoin d’animaux supplémentaires. 3. Intégration de modèles in vitro pour réduire la dépendance au modèle murin: Nous avons mis en place des modèles de folliculoïdes, qui permettent d’explorer certains aspects de la physiopathologie de l’HS et de tester des candidats thérapeutiques en amont, avant de valider les résultats dans le modèle murin. Ces modèles in vitro nous permettent également d’affiner nos hypothèses expérimentales et d’orienter nos analyses in vivo, réduisant ainsi le nombre d’animaux requis. 4. Standardisation et harmonisation des protocoles : L’homogénéisation de nos procédures (croisements génétiques optimisés, conditions expérimentales rigoureusement contrôlées) permet de minimiser la variabilité et donc de limiter le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique. En combinant ces stratégies, nous nous engageons à minimiser le recours au modèle murin tout en garantissant la pertinence scientifique de nos travaux sur l’HS.
Raffinement
Nous avons choisi un modèle murin permettant une perte spécifique de nicastrine dans les cellules souches du follicule pileux sans affecter d’autres tissus. Cette approche ciblée réduit les effets secondaires systémiques et limite la sévérité des phénotypes, garantissant un impact minimal sur le bien-être général des animaux. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Les points limites précoces définis sont : diminution de l’activité spontanée, grooming excessif, posture légèrement courbée, ainsi que l’apparition de rougeur ou perte de poils débutante. En cas de détection, la surveillance sera intensifiée et un avis vétérinaire sera sollicité. Les procédures nécessitant une manipulation potentiellement inconfortable seront realisés sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, permettant de limiter la douleur, le stress et la durée d’immobilisation. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive pendant et après l’anesthésie, avec mise en place de mesures de soutien appropriées, notamment le maintien de la température corporelle. L’hébergement intègre plusieurs mesures de raffinement supplémentaire au cours de l’expérimentation: • enrichissement optimisé avec litière douce en cellulose ; • apport de gel nutritif en cas de baisse transitoire d’appétit ou pour limiter le stress post-manipulation ; • contrôle strict de la température. Nous collaborerons étroitement avec les vétérinaires et référents en expérimentation animale pour garantir l’application des meilleures pratiques en matière de raffinement.
Choix des espèces
1. Homologie génétique avec l'humain : La souris partage environ 85 % de son génome avec l’humain, permettant une extrapolation fiable des résultats. 2. Modèle précliniquement validé : Les souris sont couramment utilisées pour étudier les maladies dermatologiques, y compris les pathologies inflammatoires du follicule pileux, garantissant une base de comparaison avec des études antérieures. 3. Manipulation génétique avancée : La disponibilité de lignées transgéniques permettent une étude fine des mécanismes moléculaires impliqués. 4. Facilité d’élevage et de suivi : Leur cycle de reproduction court et leur coût relativement bas permettent une étude efficace et reproductible sur plusieurs générations. 5. Ainsi, l'utilisation de la souris comme modèle animal est essentielle pour élucider les mécanismes sous-jacents à l’hidradénite suppurée et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques avant d'envisager des études cliniques. L'étude portera sur des souris adultes entre 3 à 24 semaines. L'hidradénite suppurée atteint principalement les adultes.
L’implantation sous-cutanée chez le rat : un modèle pour évaluer la biocompatibilité de matériaux destinés à la régénération osseuse MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Huit échantillons de matériau implantés sous la peau du dos d'un même animal, en une chirurgie de trente minutes : 20 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour les analyses histologiques. Une douleur modérée est annoncée après l'implantation, ainsi qu'un risque d'infection en cas de rejet du matériau ou de réouverture de la plaie. L'objet est de vérifier la biocompatibilité de membranes destinées à la régénération osseuse, avant une éventuelle mise sur le marché. Le rat est présenté comme la première étape de validation, le porteur annonçant qu'en cas de résultats satisfaisants une validation sur "gros animal" sera "nécessaire".
Objectifs
Les pertes de substances osseuses représentent un défi en chirurgie orale et orthopédique. En clinique, l'utilisation de greffe autologue est très répandue mais présente certains inconvénients (chirurgie additionnelle, morbidité du site donneur...). Ainsi, le développement de biomatériaux en régénération osseuse est indispensable pour pallier ces limitations. Pour évaluer la biocompatibilité des biomatériaux étudiés, nous souhaiterions avoir recours à un modèle animal déjà développé et maîtrisé au sein de notre unité. Ce modèle est facile à mettre en œuvre et reproductible. Le modèle sous-cutané chez le rat adulte réalisé au niveau dorsal est le modèle choisi afin d’évaluer la bicompatibilité des biomatériaux implantés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (membranes pour la régénération osseuse guidée) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse dans la perspective d’une utilisation en clinique.
Procédures
Les animaux auront une chirurgie cutanée au niveau dorsal (implantation sous-cutanée de conditions expérimentales). L’intervention a lieu une seule fois et dure environ 30 mn par animal.
Impact sur les animaux
L'implantation en site sous-cutané peut entraîner une douleur modérée. Des complications post-opératoires sont à envisager : infection, notamment en cas de rejet du matériel implanté, ou réouverture de la plaie.
Devenir
Après l'implantation, les animaux de chaque lot correspondant à un temps expérimental donné seront mis à mort à l’issu du temps expérimental. Des analyses histologiques seront ensuite réalisées sur ces animaux.
Remplacement
La cytotoxicité des matériaux utilisés aura au préalable était évaluée in vitro selon les recommandations de la norme NF EN ISO 10993. En suivant, les produits destinés à être implantés chez l'humain doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Les matériaux doivent être d'abord testés dans modèle de rat, et si les résultats obtenus sont satisfaisants, d'autres essais seront envisagés permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.
Réduction
Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré une absence de cytotoxicité in vitro , et une seule lignée de rats sera utilisée. De plus, afin de réduire le nombre de rat, 8 échantillons seront implantés par animal. Enfin, la même lignée de rats que celle déjà utilisée au sein de notre unité est choisie, afin de diminuer le nombre de conditions à évaluer et d'éviter l'ajout de rats supplémentaires pour cette évaluation.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse : une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront des analgésiques afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite anesthésiés dans une chambre à induction puis maintenue anesthésiés au masque avec de l'isoflurane. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, le rat sera réintégré à sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur une semaine. Toutes les modifications de comportement et d’aspect seront consignées dans un fichier informatique par les personnes impliquées directement dans ce projet. Une grille de score basée sur des critères significatifs sera mise en place et des points limites adaptés seront utilisés. Un arbre décisionnel sera suivi pour déterminer la conduite à tenir, incluant la mise à mort en fonction de critères d'arrêt de souffrance définis. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères, en présence de litière en copeaux de peupliers AVEC ENRICHISSEMENT EN TUNNEL DE POLYPROPYLENE, ainsi que des bâtons à ronger qui sont régulièrement mis dans les cages.
Choix des espèces
Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. Le rat permet de valider la biocompatibilité du produit. De plus, il est utilisé dans de nombreuses études. En cas de résultats satisfaisant et supérieurs à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, une validation chez le gros animal sera nécessaire. Des rats adultes de 9 à 10 semaines, d'un poids d'environ 350 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.
Caractérisation Multimodale de Modèles Animaux par IRM
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 100
Immobilisés la tête maintenue dans un dispositif de contention, sous anesthésie gazeuse ou injectable pendant des séances allant jusqu'à deux heures et demie, 200 souris et 100 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Environ la moitié reçoit en plus un cathéter sous-cutané, dont le porteur reconnaît qu'il peut provoquer des douleurs. Le même document qualifie l'IRM de méthode "indolore et non invasive" et en fait un argument de réduction, alors que tous les animaux sont tués après la dernière séance pour que leur cerveau soit analysé ex vivo. L'effectif ne vient d'aucun calcul de puissance mais d'une prévision d'activité de plateforme, deux projets souris et un projet rat par an, deux groupes de dix animaux chacun.
Objectifs
En neurosciences, les études précliniques menées avec des modèles rongeurs sont souvent réalisées pour identifier des « signatures » - des biomarqueurs – des mécanismes cérébraux sains ou pathologiques pour envisager un transfert vers une recherche clinique. L’Imagerie par résonance magnétique (IRM) préclinique constitue un outil majeur pour l’étude des pathologies neurodéveloppementales, neurologiques et psychiatriques, car elle offre une exploration non invasive de multiples paramètres fonctionnels et anatomiques du cerveau des modèles étudiés. Il existe plusieurs modalités d’IRM, chacune ayant ses spécificités et permettant la caractérisation de paramètres précis mais restreints et une modalité utilisée seule ne permet souvent pas d’identifier un biomarqueur. Afin d’optimiser la découverte de biomarqueurs d’intérêt et de favoriser des translations vers la clinique à partir de modèles de pathologies cérébrales, nous proposons de combiner plusieurs modalités d’IRM – on parle d’IRM multimodale – pour offrir une vue d’ensemble détaillée et dynamique des processus biologiques au sein du cerveau d’un modèle rongeur : en multipliant les grilles de lecture, nous sommes capables, pour un modèle rongeur donné, d’évaluer la structure cérébrale, la connectivité fonctionnelle et les profils métaboliques. Nous pouvons ainsi identifier et comparer des biomarqueurs d’intérêt et suivre leur évolution longitudinale. Les modalités d’IRM utilisées dans ce protocole sont multiples et complémentaires : - IRM anatomique pour visualiser les structures cérébrales, offrant ainsi une vue détaillée de l’intégrité structurale du cerveau. - IRM fonctionnelle (IRMf) pour étudier l’activité neuronale et la connectivité fonctionnelle et ainsi obtenir des informations sur les réseaux neuronaux et leurs interactions en réponse à des stimuli. - Spectroscopie par résonance magnétique (MRS) pour étudier le métabolisme cérébral et donc comprendre les mécanismes sous-jacents aux maladies neurologiques et psychiatriques. - Imagerie par transfert de saturation d’échange chimique (CEST) pour détecter des biomarqueurs moléculaires spécifiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont nombreux et couvrent plusieurs domaines de la recherche en neurosciences et en imagerie médicale. Nous pouvons identifier notamment : - L’amélioration de la compréhension des maladies neurologiques et psychiatriques. - L’identification de biomarqueurs. - Le suivi longitudinal des maladies. - L’optimisation des modèles animaux. - La translation vers l’imagerie clinique.
Procédures
Pendant les sessions d’IRM, un système de contention adapté sera employé pour assurer l’immobilisation des animaux indispensable à la qualité des acquisitions. les animaux seront placés sous anesthésie gazeuse . Chaque animal pourra subir de 1 à 4 séances d’imagerie selon le projet et le type de modèle : les modèles neurodéveloppementaux ou neurodégénératifs nécessitent généralement des suivis longitudinales, tandis que les autres projets prévoient une seule séance. Un intervalle d’au moins deux semaines sera respecté entre les séances pour limiter le stress. Pour les animaux destinés aux sessions d’IRM fonctionnelle un cathéter en sous-cutané sera placé pour l’administration d’un anesthésique ou d’un tranquillisant médicamenteux, l’anesthésie gazeuse n’étant pas adaptée à ce type d’examen. Cela concernera environ la moitié des animaux. Chaque session IRM n’excédera pas 2 heures et demi.
Impact sur les animaux
La pose d’un cathéter en sous-cutané pourra entraîner des douleurs. Le positionnement nécessaire pour l’imagerie peut être inconfortable. L’IRM peut induire un stress lié à la manipulation et à l'immobilisation prolongée sous anesthésie. L’examen lui-même n’est pas douloureux, mais la préparation et le maintien immobile de l’animal peuvent entraîner un léger stress. . Une anesthésie prolongée présente un risque d’hypothermie.
Devenir
A l’issue de la dernière session IRM, tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer leur cerveau pour des études ex vivo indispensables pour confirmer la validité des biomarqueurs qui seront identifiés au cours de l’étude
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques et tester de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
L’application combinée d’imageries anatomiques, fonctionnelles et métaboliques permet une caractérisation plus complète que chaque technique isolée. Le recours à l’IRM multimodale contribue également à la réduction du nombre d’animaux utilisés, en multipliant les mesures obtenues sur un même individu. Nous avons déterminé le nombre d’animaux en fonction des nécessités d’effectifs pour réaliser des statistiques significatives. Cela a été possible grâce aux expériences réalisées précédemment sur les modèles de souris et de rat. L’IRM qui est une méthode indolore et non invasive, permet d’examiner de nombreux paramètres sur un même animal, réduisant ainsi considérablement le nombre d’animaux et d’expériences nécessaires pour obtenir ces informations. Dans le cadre du présent projet plateforme, chaque projet utilisateur accueilli comprend plusieurs groupes expérimentaux, par exemple des animaux modèles et des animaux contrôles, éventuellement différenciés par âge, sexe ou type de modification génétique. Sur une année, la plateforme prévoyoit d’accueillir environ deux projets impliquant la souris et un projet impliquant le rat, chacun comportant 2 groupes de 10 animaux. Sur cinq ans cela correspond à un maximum de 200 souris et 100 rats. En tenant compte des différents groupes expérimentaux ainsi que des acquisitions longitudinales prévues, ce nombre d’animaux est justifié. Il permet de couvrir l’ensemble des besoins liés aux conditions expérimentales, d’assurer la robustesse des résultats obtenus et de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés, tout en maximisant les informations recueillies pour chaque individu.
Raffinement
Raffinement Le raffinement repose sur des procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, l’observation des signes cliniques et des points limites, ainsi que des soins post-anesthésiques adaptés. Anesthésie Avant chaque examen, les animaux seront anesthésiés par un opérateur qualifié afin d’éviter toute douleur ou stress. Selon le type de session, l’anesthésie sera réalisée sous forme gazeuse ou injectable. Pendant l’examen, les animaux resteront sous anesthésie et leur fréquence respiratoire sera surveillée en continu pour garantir leur sécurité. Chaque session d’IRM durera au maximum 2,5 heures. Après l’examen, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil complet dans un environnement calme et chauffé. Immobilisation et réduction de l’inconfort Lors des séances d’IRM, la tête des animaux sera stabilisée à l’aide d’un dispositif de maintien adapté, afin d’éviter les mouvements pendant l’enregistrement des images. Pour limiter tout inconfort, une anesthésie locale sera appliquée avant la mise en place du dispositif. Maintien de la température corporelle Les animaux seront maintenus au chaud grâce à un tapis chauffant adapté, afin de prévenir toute hypothermie pendant la procédure.
Choix des espèces
Les fonctions cérébrales des rongeurs sont bien documentées, ce qui en fait des modèles de référence pour l’étude du cerveau. L’utilisation de rats et de souris adultes permet de reproduire plus fidèlement les mécanismes cérébraux observés chez l’adulte, notamment dans le cadre de modèles de pathologies neurologiques ou psychiatriques. Les expériences seront donc réalisées sur des souris adultes (18–35 g) et des rats adultes (150–250 g).
Caractérisation de nouveaux traceurs radioactifs ciblant le système nerveux central chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Réutilisés d'une procédure à l'autre au sein du même projet, y compris pour tester un autre traceur quand le premier échoue, 360 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une ou deux injections de composé radioactif dans la veine de la queue, sous anesthésie gazeuse, puis reste immobilisé jusqu'à trois heures par séance d'imagerie, avec jusqu'à quatre séances. Le porteur signale une douleur au point d'injection et un hématome possible après cathétérisation de la veine caudale. Aucun rat ne sort vivant du projet, tous sont tués pour que leur cerveau soit récupéré et que la fixation des radiotraceurs y soit vérifiée.
Objectifs
Dans les pathologies du système nerveux central, divers processus métaboliques sont impliqués et entraînent des variations d’expression ou d’activation de protéines, de transporteurs ou encore de récepteurs. Ces éléments constituent alors des cibles d’intérêt pour la prise en charge thérapeutique et/ou le diagnostic de ces pathologies. Nous menons des recherches visant à développer de nouveaux traceurs radioactifs d’imagerie de Tomographie par Emissions de Positons (TEP) marqués au fluor-18 destinés, à explorer in vivo le système nerveux central dans ses états physiologiques (normaux) ou altérés (pathologiques). La création de ces nouveaux radiotraceurs, à visée diagnostique ou thérapeutique, constitue un enjeu majeur compte tenu de la diversité des processus rencontrés dans les pathologies du système nerveux central. Ce projet a donc plusieurs objectifs : 1- Caractériser le devenir de ces composés radioactifs dans l’organisme et vérifier leur passage jusqu’au cerveau passage de la barrière hémato-encéphalique. 2- S’assurer in vivo que nos radiotraceurs atteignent bien leur cible. Pour répondre à ces objectifs, il est nécessaire de tester nos radiotraceurs sur l’animal vivant (organisme entier) pour valider leur potentiel en clinique humaine.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier de nouveaux radiotraceurs TEP capables de se lier à des cibles d’intérêt majeures du système nerveux central, dans le but d’améliorer la prise en charge thérapeutique et/ou le diagnostic des pathologies du système nerveux central. Après une caractérisation de leurs propriétés et de leurs devenirs dans l’organisme, ces traceurs pourront être proposés en clinique humaine pour le diagnostic, le suivi ou le traitement de nombreuses affections neurologiques.
Procédures
Les animaux de la procédure 1 auront une injection d’un radiotraceur (< 1min) prolongée par une imagerie (de 60 à 180 min) sous anesthésie gazeuse et seront ré-utilisés en procédures 1, 2 et/ou 3. Les animaux de la procédure 2 auront deux injections (< 1min) espacées de 5 à 30 min sous anesthésie gazeuse puis ils seront euthanasiés. Les animaux de la procédure 3 auront 4 séances d’imagerie (60 à 180 min) avec deux injections (< 1 min) espacées de 5 à 30 min par séance d’imagerie puis ils seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
La manipulation et l’induction de l’anesthésie entraine un léger stress chez l’animal. Une douleur (moins de 5 min) au point d’injection du radiotraceur et/ou du compétiteur peut être ressentie et un hématome peut se former suite à la cathéterisation de la veine caudale de l'animal.
Devenir
Afin de caractériser nos radiotraceurs et d’avoir des résultats robustes, nous devons récupérer en fin d'expérience les cerveaux de l’ensemble des animaux. Nous devons pour cela procéder a euthanasie de l'ensemble des animaux du projet.
Remplacement
Cette étude menée sur l’animal vivant intervient après de nombreuses étapes de développement et de tests réalisés en laboratoire. Pour valider un radiotraceur et vérifier qu’il fonctionne réellement dans l’organisme, il est indispensable d’utiliser des modèles animaux. En effet, des éléments essentiels — comme la capacité de la molécule à atteindre les organes ciblés, à traverser la barrière protectrice du cerveau, ou à interagir avec les différents mécanismes biologiques du système nerveux — ne peuvent pas être reproduits de façon fiable uniquement en laboratoire ou avec des simulations informatiques.
Réduction
Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données préliminaires. La procédure 1 permet, grâce à l’imagerie, d’évaluer la distribution du traceur radioactif après injection intraveineuse, sans avoir à sacrifier différents groupes d’animaux à différents temps post-injection. Dès cette étape, nous vérifierons sur 6 animaux (3 mâles et 3 femelles) si le traceur atteint le cerveau et sa cible d’intérêt. Si c’est le cas, alors les mêmes animaux seront utilisés pour les procédures 2 ou 3. Si ce n’est pas le cas, alors les expérimentations avec ce traceur seront arrêtées et les animaux seront ré-utilisés dans cette même procédure pour tester un autre traceur radioactif. La procédure 2 permettra de comparer les résultats obtenus entre 6 animaux qui recevront le radiotraceur seul et 6 autres animaux (3 mâles + 3 femelles) qui recevront le radiotraceur et une molécule compétitrice dont on sait qu’elle va se fixer à la même cible d’intérêt et ainsi empêcher ou non la fixation du radiotraceur. Cette comparaison avec la molécule compétitrice nous permettra de confirmer la validité de notre radiotraceur. Cette procédure 2 ainsi que la procédure 3 seront réalisées si et seulement si la procédure 1 a montré des résultats concluants. La 3ème procédure est réalisée avec 2 groupes de 6 animaux (3 mâles et 3 femelles. Ces animaux seront répartis en 2 groupes car nous souhaitons caractériser notre radiotraceur avec 2 molécules compétitrices différentes. La première qui peut empêcher ou non la fixation de notre traceur radioactif et la seconde qui peut être déplacée ou non par notre radiotraceur. Ces tests permettent de vérifier de manière très précise la qualité et la spécificité du radiotraceur.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement. Toutes les stratégies d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront sous anesthésie gazeuse et ils seront placés sur un tapis chauffant. Pour les imageries, une protection oculaire sera appliquée et la fréquence respiratoire et la température corporelle seront surveillées. Dès leur réveil, les animaux seront remis dans leur cage d’hébergement et une récompense leur sera donnée. Pour les animaux de la procédure 1et 3, des points limites suffisamment prédictifs seront appliqués selon une grille d’évaluation avec utilisation d’un antalgique si nécessaire.
Choix des espèces
Nous utiliserons le rat qui présente des similitudes avec le cerveau humain en termes de circuits cérébraux et processus neurobiologiques et neurochimiques. Des rats adultes seront utilisés afin d'avoir une taille de cerveau compatible avec la technique d'imagerie utilisée dans ce protocole.
Rôle de la pollution atmosphérique dans les anomalies de résolution de l’inflammation dans la mucoviscidose
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 100 souris reproduisant l'atteinte pulmonaire de la mucoviscidose vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par le nez, sous anesthésie, une molécule bactérienne qui déclenche une inflammation des poumons, subissent des injections dans la veine de la queue sur animal éveillé, et une canule est placée dans leur trachée pour mesurer le flux d'air. Pendant 72 heures, l'air de leurs cages est modifié pour reproduire un pic de pollution parisien. Le porteur écrit que "seule l'expérimentation sur des animaux vivants" permet d'étudier ces interactions entre organes, tout en indiquant que les travaux préalables du laboratoire ont porté sur des cellules in vitro.
Objectifs
La mucoviscidose est une maladie génétique caractérisée par une vulnérabilité à l’infection par les microbes de l’environnement qui induisent une forte inflammation des poumons, dégradant progressivement cet organe et conduisant à l’insuffisance respiratoire. Une des raisons pouvant participer à la gravité de la réponse inflammatoire est une mauvaise production par ces patients de molécules aidant à résoudre l’inflammation et qui sont appelées SPMs. Une autre possibilité est que l’exposition à la pollution de l’air aggrave l’inflammation. Nous étudierons la production des SPMs dans un contexte de pollution de l’air sur un modèle murin mimant l’infection pulmonaire des patients atteints de mucoviscidose. Nous évaluerons aussi si les SPMs peuvent être utilisés pour traiter l’inflammation. Nous utiliserons ici des souris qui reproduisent des symptômes proches des patients vivant avec la mucoviscidose au niveau du poumon pour que notre modèle soit réaliste. Nous nous intéresserons aussi aux différences d’inflammation et de production des SPMs chez les souris mâles et femelles car il existe des différences de l’atteinte respiratoire entre patients et patientes encore inexpliquées.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme de ce projet sont : - une meilleure compréhension de l’impact de la pollution de l’air sur des souris dont l’atteinte mime la mucoviscidose des êtres humains, - une preuve de concept que les SPM pourrait traiter l’inflammation des poumons dans la mucoviscidose. - mieux comprendre les différences de gravité de la maladie respiratoire selon le sexe A long terme, les résultats de cette étude pourront être utilisés pour développer de nouvelles recommandations et de nouveaux traitements de l’inflammation des poumons pour les patients vivant avec la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux seront soumis à des traitements administrés en moins d’une minute soit par injection dans la veine de la queue soit par aspiration de gouttes de solution par le nez. Conformément aux normes éthiques en vigueur, l’injection dans la veine de la queue sera réalisée sur souris éveillées, et l’administration intranasale sur les souris anesthésiées. Enfin pour mesurer la fonction pulmonaire des souris, celles-ci seront complètement anesthésiées et une canule sera placée (geste prenant moins d’une minute) dans leur trachée pour mesurer le flux d’air (la durée de la mesure est d’une dizaine de minutes). Pour induire un environnement pollué, l’air circulant dans les cages des souris sera modifié pour avoir une composition similaire à celle de Paris au cours d’un pic de pollution, cette exposition durera 72 heures.
Impact sur les animaux
Les souris exposées 3 jours à la pollution atmosphérique peuvent présenter des signes de stress liés au changement de lieu d’hébergement et au bruit environnant. Les animaux seront hébergés par 2 à 5 dans une cage identique à celle de leur environnement habituel afin de limiter leur stress. Les SPM sont des molécules produites par notre corps de façon naturelle. Elles ne sont pas toxiques et, à ce jour, aucun effet secondaire n’a été observé chez les souris qui en ont reçus. Nous ne prévoyons donc pas d’effets indésirables suite à l’utilisation de SPM. De plus, certaines études montrent que les SPM pourraient avoir un effet anti-douleur. Pour provoquer l’inflammation des poumons, nous administrons une solution d’une molécule produite par les bactéries. Cette molécule ne peut pas causer d’infection du poumon mais elle agit comme un signal qui alerte les défenses du corps. Le résultat est une réaction inflammatoire dans le poumon. Cela peut entraîner une perte de poids chez la souris ainsi qu’un inconfort temporaire et une diminution de l’activité. Cependant, aucune douleur importante ou stress fort n’est attendu. Les animaux seront tout de même suivis quotidiennement pour s’assurer de l’absence d’effet néfaste inattendu. Ils seront pesés et observés chaque jour pour détecter tout signe de malaise. Si nécessaire, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage des souris pour faciliter leur alimentation et leur hydratation. Si un animal se trouve dans un état grave imprévu, celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés ici sera mis à mort à la fin des protocoles pour un prélèvement et une analyse de la réponse inflammatoire dans le poumon.
Remplacement
Nous étudions ici un modèle complexe qui repose sur l’interaction entre plusieurs types de cellules, entre différents organes, et le déplacement de cellules d’un organe à un autre. Nous voulons aussi regarder des différences entre mâles et femelles. Malheureusement, à l’heure actuelle seule l’expérimentation sur des animaux vivants permet l’étude de ces différents éléments. Cette étude vient compléter les études préalables de notre laboratoire qui ont été réalisées sur des modèles de cellules in vitro.
Réduction
Afin d’utiliser le moins d’animaux possible, nous avons étudié les publications préexistantes et pris en compte leurs résultats pour construire notre projet. Un certain nombre d’expériences ont aussi été effectuées au préalable sur des modèles de cellules pour sélectionner un nombre réduit de SPM à tester dans notre projet sur la souris. Enfin, une étude statistique a été menée pour choisir le nombre minimal de souris à utiliser tout en étant sûr de pouvoir observer toute différence pertinente entre nos groupes de souris.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans un environnement adapté où elles disposeront de nourriture et eau à volonté. Les éléments nécessaires pour former un nid et une maisonnette seront fournis dans la cage pour assurer le bien-être des souris. Autant que possible, les souris seront au contact d’une seule personne pour leur permettre de s’habituer à elle et de diminuer leur stress. Le personnel qui manipule les souris est formé pour assurer leur bien-être et leur éviter toute souffrance. Au cours des expériences, les souris seront pesées et observées pour détecter tout mal-être le plus tôt possible et agir en conséquence. Si besoin de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage de la souris. Si un animal se trouve dans un état grave imprévu, celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour plusieurs raisons : Les souris se reproduisent rapidement, ce qui permet d’avoir assez d’animaux pour l’étude en peu de temps. Le fonctionnement des poumons et du système immunitaire chez la souris est proche de celui de l’humain, ce qui rend les résultats plus utiles pour la recherche médicale. Notre équipe est déjà formée et expérimentée dans le travail avec les souris de laboratoire. C’est l’animal pour lequel on dispose du plus grand nombre d’outils scientifiques pour étudier les tissus, l’inflammation et les SPMs. Cette lignée de souris génétiquement modifiées est la seule à reproduire le phénotype pulmonaire des personnes atteintes de mucoviscidose.
Caractérisation d’une lignée murine pour étudier le développement des neurones précérébelleux.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Un gavage unique ou une injection intrapéritonéale unique, moins d'une minute par animal sur souris vigile : 36 femelles gestantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes sont tuées pour que leurs embryons soient prélevés. Le projet vise à caractériser le rôle d'un gène dans la migration des neurones précérébelleux, en lien avec le syndrome de Joubert, dont le porteur rappelle la prévalence d'un cas pour 100 000 personnes. Rien n'est dit du nombre d'embryons prélevés ni du nombre de gestations conduites par femelle, alors que le risque de fausse route et de microlésions lié à la canule de gavage est décrit par ailleurs.
Objectifs
Les neurones précérébelleux sont des neurones localisés au niveau du tronc cérébral dans le cerveau. Ces neurones projettent leurs axones dans le cervelet. Les neurones précérébelleux naissent au cours du développement embryonnaire. Tous ces neurones migrent ensuite de différentes façons dans la partie basse de cette structure. Chez l’homme, plusieurs pathologies perturbent la migration des neurones précérébelleux, notamment le syndrome de Joubert et le syndrome HGPPS (associant une paralysie des mouvements oculaires à une scoliose). Les neurones précérébelleux participent au contrôle de la motricité et la planification des mouvements. Des analyses transcriptomiques (analyses sur l'expression des gènes dans différents organes) nous ont permis d'identifier un gène qui est exprimé dans cette population neuronale. L’objectif de notre projet est de caractériser l’implication de ce gène dans le développement et la migration des neurones précérébelleux.
Bénéfices attendus
Le syndrome de Joubert a une prévalence d'un cas pour 100000 personnes. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de développement des neurones qui vont former les différentes régions du cerveau et permettra de mieux comprendre le développement de cette maladie.
Procédures
Une partie des animaux recevra un traitement par gavage (réalisé une seule fois, sur animal vigile, l'acte dure moins de 1 min par animal). L’autre partie des animaux recevra une injection unique (sur animal vigile, l'acte dure moins de 1 min par animal).
Impact sur les animaux
Les animaux recevront un traitement unique par gavage ou par injection. La contention au moment de sa réalisation peut être source de stress chez les animaux. L'introduction de la canule de gavage peut quelques fois provoquer des microlésions. Lors de l'introduction de la canule, il existe également un risque de fausse route. Pour les animaux qui recevront le traitement par injection intrapéritonéale, l'introduction de l'aiguille peut être source de stress et une légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille peut aussi être ressentie. Un faible risque d'infection existe également lors de l'introduction de l'aiguille.
Devenir
L'ensemble des 36 femelles utilisés dans le projet seront euthanasiés afin de prélever les embryons.
Remplacement
Du fait de la complexité de tissus, de la cinétique de développement et de migration de cette population neuronale, il n'est pas possible de modéliser les mécanismes que nous étudions par des modèles in vitro. L'utilisation de l'animal nous est donc indispensable pour étudier de façon complète et précise ces mécanismes développementaux.
Réduction
Ce projet impliquera au maximum 36 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Le nombre minimal d'animaux requis a été déterminé par un test de puissance et en fonction de nos expériences précédentes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (bâtons en bois, coton), avec un cycle jour-nuit de 12h. La température des cages (20-24degrés) et l’hygrométrie (45-55 pourcent) sont contrôlées, le cycle jour-nuit est de 12h. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Des points limites ont été définis et des étiquettes de surveillance indiquant l’acte subi permettent une surveillance adaptée de l’animal par le personnel qualifié de l'animalerie et/ou l'expérimentateur. Nous les considérons en bonne santé si leur pelage est brillant, et que leur comportement est normal. S'il s'avérait qu'un animal présente des signes de souffrance, il sera immédiatement euthanasié. Les critères sont l'absence de locomotion, le pelage hérissé et/ou terne, présence de comportement d'évitement, prostration, dos vouté, identification d'une grosseur pouvant révéler la présence d'une tumeur.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet plus de 98 pourcent de son génome est homologue à celui de l’Homme. Par ailleurs, ce modèle permet la transgénèse et donc de pouvoir étudier in vivo les conséquences de la délétion d’un gène. La souris est un modèle utilisé depuis de très nombreuses années pour l’étude du système nerveux. De ce fait de nombreuses données sont déjà disponibles sur lesquelles notre étude peut se reposer. Les lignées que nous utilisons ont déjà été publiées car utilisées dans d'autres système. Nous utiliserons des animaux matures sexuellement et en âge de reproduction (entre 8 semaines et 6 mois).
Évaluation d’un traitement pour le Syndrome de Rett chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Les souris utilisées portent une mutation du gène Mecp2 qui installe chez les mâles, dès trente jours, apnées, hyperventilation, réduction de la mobilité, sensibilité accrue au stress et perte de poids. 454 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une biopsie d'identification, une injection de thérapie génique sous anesthésie gazeuse, puis des tests comportementaux dont certains durent jusqu'à 48 heures. Toutes sont tuées sous anesthésie profonde pour le prélèvement des organes, l'objet réel du projet étant de mesurer si un nouveau vecteur viral atteint le cerveau sans toucher le foie.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie génétique rare qui touche le développement du cerveau. Elle affecte presque exclusivement les filles et entraîne un handicap intellectuel sévère et progressif. Dans la grande majorité des cas, la maladie est causée par une anomalie d’un gène appelé MECP2. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de guérir le syndrome de Rett. Les prises en charge actuelles visent surtout à réduire les symptômes afin d’améliorer la qualité de vie des patientes. Ces symptômes incluent notamment des difficultés à bouger volontairement, des troubles de la respiration, du sommeil et de l’alimentation. En 2007, des chercheurs ont montré qu’il était possible de corriger la maladie chez des souris atteintes, même à un stade avancé. Cette découverte a suscité beaucoup d’espoir et a ouvert la voie au développement de thérapies géniques, qui consistent à apporter une version saine du gène défectueux dans les cellules à l’aide d’un virus modifié. Cependant, traiter le cerveau reste difficile en raison d’une barrière naturelle qui le protège des substances étrangères. Les virus utilisés jusqu’à présent atteignent peu efficacement le cerveau et peuvent provoquer des effets indésirables, notamment au niveau du foie. Récemment, un nouveau type de virus a été développé pour cibler plus efficacement le cerveau tout en limitant les effets ailleurs dans l’organisme. Cette étude a pour objectif d’évaluer ce nouveau virus, appelé AAV.Cap-B10, comme traitement potentiel du syndrome de Rett chez des souris, en analysant à la fois son efficacité et sa sécurité.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à tester l’efficacité d’un nouveau virus conçu pour agir uniquement sur le cerveau, sans affecter les autres organes. Ce virus est utilisé comme outil pour apporter un gène thérapeutique dans le cadre d’un traitement par thérapie génique d’une maladie du système nerveux. Si le virus se révèle capable d’atteindre le cerveau de manière efficace et uniforme, ces résultats pourront être utiles à d’autres équipes travaillant sur le traitement de différentes maladies du cerveau. Par ailleurs, si le traitement montre des effets positifs, cette étude constituera une étape clé avant de poursuivre les recherches sur un modèle plus proche de la maladie humaine, puis d’envisager des essais cliniques chez les patientes.
Procédures
Les animaux seront soumis à: - une biopsie pour identification et classement des animaux (une dizaine de secondes – 1 fois) - une anesthésie générale gazeuse au cours de laquelle sera réalisée l'injection pour la thérapie génique (durée environ 10min - 1 fois) - des tests comportementaux non invasifs (durée variable selon les tests de 5minutes à 48h – 1 à 3 fois par tests selon les groupes) - une anesthésie générale profonde pour la mise à mort (durée 30min – 1 fois)
Impact sur les animaux
Dans ce modèle de souris, les mâles et les femelles déclarent plusieurs symptômes mimant ceux présents dans le syndrome de Rett. Les mâles montrent une apparition sévère des symptômes de manière précoce (environ 30 jours après la naissance). Chez les femelles les symptômes apparaissent plus tardivement (vers 5mois) et sont moins sévères, la souris est progressivement atteinte. Les effets indésirables attendus chez ces souris comprennent : - une altération des fonctions respiratoires conduisant à des apnées ou de l’hyperventilation - une altération des fonctions motrices conduisant à une réduction de la mobilité - une sensibilité accrue au stress et une perte de poids seulement chez les mâles (les femelles présentent à l’inverse une prise de poids). La manipulation des animaux pour les tests de comportement peut induire du stress chez les animaux.
Devenir
Les animaux de l’étude sont mis à mort en fin de procédure afin de prélever les différents organes nécessaires à la suite de l’étude.
Remplacement
La pathologie nécessite l’étude du cerveau et se caractérise par un polyhandicap sévère. Pour l’étudier sous toutes ses dimensions un modèle de culture cellulaire n’est pas envisageable. Il est donc nécessaire d'avoir recours à un modèle animal de la pathologie pour espérer produire des résultats qui seront transférables chez l’homme. L'expérimentation sur l'animal permettra d'acquérir le recul et les compétences requises à une recherche translationnelle, c’est-à-dire que l’on souhaite que les résultats soient directement applicables à l’homme.
Réduction
Les différences entre les animaux sont limitées grâce à l’utilisation de souris génétiquement identiques. Le nombre de souris utilisées a été choisi à partir de nos études précédentes et de calculs statistiques, afin d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le moins d’animaux possible. En première intention, les procédures seront réalisées sur la moitié des animaux prévue. Les résultats seront analysés de manière statistique. Si une différence claire et significative est observée entre les groupes, il ne sera pas nécessaire d’augmenter le nombre d’animaux dans l’étude.
Raffinement
L’hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux et permet l’expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées au maximum par 5 dans des cages enrichies (litière, dôme et bandelettes en carton) avec nourriture et eau à volonté, dans une pièce thermo-contrôlée en alternance jour/nuit. Les souris étant particulièrement sujettes au stress, la manipulation des animaux et le change des cages seront faits par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress (approches qui visent à réduire au maximum le stress) et à la fragilité de la lignée. Une période d’habituation à l’expérimentateur et aux tests de comportements est prévue le cas échéant. L’anesthésie, sous forme gazeuse, suit les protocoles standards et sera accompagnée d’une analgésie et d’un suivi post-opératoire approprié. Des points limites clairs sont définis et évalués via une grille de suivi du phénotype des animaux afin de mettre en place les soins adaptés le plus précocement possible (antiseptiques, antalgique, anti inflammatoire). En parallèle, l'état général de nos animaux ainsi que l'état de la cage, de la nourriture et de l'eau seront surveillés quotidiennement. Une période d’habituation avec l’expérimentateur et aux tests comportementaux le cas échéants est prévue afin de réduire le stress de nos animaux.
Choix des espèces
La souris permet actuellement de disposer facilement et rapidement d’un modèle mammifère de maladie génétique par manipulation du génome. L'intérêt général du modèle souris, utilisé comme modèle pré-clinique, repose essentiellement sur la proximité physiologique et pathologique avec l'espèce humaine. Utiliser ce modèle augmente les chances de réussite vers le passage à l’Homme. La souris génétiquement modifiée sur le gène Mecp2 est le modèle le plus largement utilisé par les laboratoires de recherche dans les études sur le Syndrome de Rett. Il est largement caractérisé dans la littérature ce qui permet une bonne compréhension des animaux. Les souris seront incluses dans l’essai préclinique à 30 jours. Période à laquelle apparaissent les premiers symptômes chez les mâles et donc est plus proche de ce qui se passerait chez l’homme. L’apparition des premiers symptômes étant nécessaire au diagnostic de la pathologie. Les femelles et mâles utilisés pour la reproduction seront mis en contact durant la période de fertilité optimale respectivement de 2 à 8 mois et de 2 mois à 1 an afin d’obtenir des mâles et des femelles malades nécessaires à l’étude. Les deux premiers mois correspondent au temps nécessaire à l’acquisition de la maturité sexuelle.