Rongeurs
Gestion de la production de modèles souris immunodéficients pour l’étude de maladies inflammatoires chroniques et des cancers associés.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Toutes les souris de ce projet naissent immunodéficientes, privées d'une partie de leur système immunitaire, donc exposées aux infections toute leur vie. 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, le projet consistant à les faire naître et à les élever plutôt qu'à leur infliger des expériences. Les reproductrices et les petits qui n'ont pas le génotype recherché sont tués à la fin de la période d'accouplement, leurs organes partant vers d'autres projets, tandis que les petits porteurs du bon génotype sont gardés en vie pour des expériences ultérieures. Le porteur ne dit pas quelle part des 2 880 animaux passe dans cette seconde catégorie, ni ce que ces projets ultérieurs leur feront subir.
Objectifs
L’inflammation est une hyperréactivité de notre système de défense, le système immunitaire. Elle peut être aiguë c’est-à-dire sur une courte période (type piqûre de moustique) ou chronique c’est-à-dire s’établir sur plusieurs années voire toute la vie. Ce type d’inflammation regroupe un grand nombre de pathologies de la peau et de l’intestin telles que le psoriasis, les colites, la maladie Crohn ou cœliaque. Le nombre de personnes atteintes de ces inflammations chroniques ne cesse de croître. Par ailleurs, les inflammations chroniques sont connues pour faire le lit du cancer. Pour l’heure il n’existe aucun traitement curatif. La mise en place d’un traitement impose de comprendre ces pathologies et donc les modifications de notre système immunitaire qui y sont associées afin d’identifier des cibles thérapeutiques. La souris récapitulant fidèlement les pathologies inflammatoires cutanées et intestinales de l’Homme y compris le développement de cancers associés, notre objectif est d’étudier le système immunitaire et particulièrement les globules blancs appelés lymphocytes T qui semblent responsables de la pathologie. Pour cela, notre laboratoire prévoit de générer et d’élever des souris génétiquement modifiées avec une déficience en lymphocytes T et en molécule qui contrôlerait l’hyperréactivité des lymphocytes dans les inflammations chroniques.
Bénéfices attendus
Face au manque de traitement curatif et à la recrudescence des sujets atteints d’inflammations chroniques, il y a une vraie urgence à comprendre les altérations du système immunitaire responsables de la pathologie pour les contrecarrer et proposer enfin un traitement curatif.
Procédures
L’ensemble des souris produites dans ce projet sont immunodéficientes. Cette immunodéficience est causée par l’absence d’une partie du système immunitaire rendant les souris plus susceptibles aux infections par des pathogènes. Nos souris sont hébergées dans des conditions sanitaires strictes et contrôlées par des examen sanitaires réguliers et sont manipulées sous hotte garantissant le statut sanitaire. Tout ceci permet d’éviter l’apparition d’infection chez ces souris tout au long de leur vie.
Impact sur les animaux
Bien que ce soit peu probable dans nos conditions d’hébergement et de statut sanitaire stricts, l’apparition d’infections par pathogènes opportunistes du fait d’un système immunitaire défaillant peut générer un stress, un mal-être et une souffrance.
Devenir
Les souris reproductrices ainsi que les petits non porteurs du génotype recherché seront mis à mort à la fin de la période d’accouplement. Les petits porteurs du génotype recherché seront gardés en vie dans le cadre d’une utilisation continue dans des projets ultérieurs.
Remplacement
Si nos résultats in vitro et in silico sont en accord avec notre hypothèse sur les molécules à cibler pour contrecarrer l’inflammation chronique, celles-ci faisant partie d’un processus physiologique complexe il nous est impossible de formuler des conclusions sans une étude dans un organisme entier qui présente les mêmes caractéristiques pathologiques que l’Homme.
Réduction
Le nombre d’accouplements décrits dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir les souris nécessaires à nos expérimentations. Par ailleurs, les organes des animaux qui n’auront pas les bons génotypes seront étudiés pour d’autres projets. Le cas échéant, les accouplements pourront être modulés à la baisse pour limiter le nombre de souris générées si un projet ne nécessite pas ou peu de souris pour une lignée donnée pendant une période définie.
Raffinement
La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi quotidien avec l’établissement de points limites précoces et la manipulation des animaux limitant le stress au minimum possible par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur, stress ou souffrance des souris. L'environnement sera enrichi avec du coton pour tous les animaux et des maisons rouges seront ajoutées dans les cages d'accouplement. Les souris immunodéficientes étant hébergées dans un environnement sanitaire contrôlé, très peu sont susceptibles de développer une infection.
Choix des espèces
La complexité du système immunitaire ainsi que son contrôle et sa régulation font que l’étude ne peut se faire que dans un système intégré et donc à l’échelle de l’organisme entier. La souris (mus musculus) correspond à ces critères dans le cadre ce projet car c’est non seulement un mammifère dont le système immunitaire est similaire à celui de l’Homme mais aussi parce qu’elle développe des pathologies inflammatoires chroniques cutanées et intestinales en tout point similaires aux pathologies humaines. Nous disposons de l’ensemble des outils nécessaires à l’étude, développés sur le modèle murin depuis plus de 20 ans et maitrisés par le laboratoire. Les modèles transgéniques utilisés dans ce projet n’existent que chez la souris. La mise en accouplement se fera à partir de 8 semaines lorsque les souris atteignent leur maturité sexuelle. Les souris seront utilisées à partir de 8 semaines et jusqu’à 6 mois pour les projets actuels et futurs de l’équipe.
Dysrégulation des réseaux neuroendocriniens dans des modèles précliniques de sclérose latérale amyotrophique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
1 792 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur cerveau, dont 1 280 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Modifiées génétiquement pour développer une sclérose latérale amyotrophique, elles perdent l'usage des pattes arrière puis des pattes avant et peuvent perdre jusqu'à 20 % de leur poids. Une partie subit une chirurgie cérébrale d'une heure puis des sessions d'enregistrement en isolement pouvant durer sept jours d'affilée, cinq à huit fois, avec des injections quotidiennes pendant trente jours, l'autre partie passant des tests de motricité et d'interactions sociales. Le porteur teste des somnifères déjà utilisés chez l'humain et affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un modèle animal doté d'une structure hypothalamique bien caractérisée.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie grave qui touche les nerfs contrôlant les muscles. Elle provoque une paralysie progressive et entraîne le décès en quelques années. Les traitements actuels ne permettent que de ralentir légèrement son évolution. Des travaux récents ont montré que, bien avant les premiers signes de paralysie, les personnes atteintes peuvent présenter d’autres symptômes : perte de poids, modification du métabolisme et troubles du sommeil. Ces problèmes apparaissent parfois plusieurs années avant les difficultés motrices. Notre groupe de recherche a observé, chez des patients et chez des souris modèles de la maladie, que ces signes précoces sont liés à des anomalies dans une zone du cerveau qui régule l’appétit, l’énergie du corps et l’alternance veille-sommeil. Dans ce projet, nous cherchons à mieux comprendre comment ces circuits du cerveau sont perturbés au début de la maladie. Pour cela, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées reproduisant certains aspects de la sclérose latérale amyotrophique. L’objectif est d’identifier des cibles thérapeutiques très précoces pour tenter de ralentir l’évolution de la maladie avant l’apparition des symptômes moteurs. Nous testerons notamment l’effet de traitements déjà utilisés chez l’humain pour améliorer le sommeil, afin de voir s’ils peuvent aussi agir sur l’évolution de la sclérose latérale amyotrophique. Mieux comprendre et traiter ces signes précoces pourrait, à terme, contribuer à améliorer la qualité de vie et l’espérance de vie des patients.
Bénéfices attendus
Ces expériences permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et génétiques impliqués dans la voie de signalisation de l’orexine dans les modèles de sclérose latérale amyotrophique. Elles pourraient conduire à l’identification de nouvelles voies ou cibles thérapeutiques potentielles, tout en apportant un éclairage sur les effets bénéfiques que pourrait avoir la modulation de cette voie chez les patients atteints de sclérose latérale amyotrophique. Le sommeil, dont les altérations précèdent les symptômes moteurs, constitue un déficit prodromal de la maladie en partie dépendant de la signalisation à l’orexine. Agir sur cette voie pourrait ainsi contribuer à ralentir la progression de la sclérose latérale amyotrophique.
Procédures
Toutes les souris subiront un prélèvement tissulaire sur animal vigile, d’une durée inférieure à une minute, pour leur identification génétique. Un premier lot sera soumis à une intervention chirurgicale unique sous anesthésie générale, d’une durée d’environ une heure. Après récupération, ces animaux seront temporairement isolés à plusieurs reprises pour réaliser des mesures physiologiques, comprenant des enregistrements cérébraux (EEG) et métaboliques. Chaque session pourra durer jusqu’à sept jours, avec un total de cinq à huit sessions, espacées de dix jours à un mois selon le groupe. Une partie de ces animaux recevra un traitement comprenant une injection quotidienne pendant trente jours, tandis que l’autre partie recevra deux injections espacées d’un jour. La manipulation, incluant la contention, ne dépassera pas quinze secondes par injection. Un second lot ne subira pas de chirurgie mais sera suivi du point de vue comportemental. Ce suivi comprendra des évaluations courtes, d’environ trois minutes chacune, permettant d’apprécier la capacité motrice, la motricité fine et les interactions sociales. Ces évaluations seront réalisées à intervalles réguliers, tous les quinze à vingt jours ou selon la nature du test. Ces animaux recevront également, selon le groupe, soit un traitement quotidien de trente jours, soit deux injections espacées d’un jour, avec une durée totale de manipulation inférieure à quinze secondes. En résumé, les interventions prévues incluent : un prélèvement bref sur animal vigile pour tous les individus ; une chirurgie unique suivie de sessions de mesures physiologiques pour un premier lot ; des évaluations comportementales pour un second lot ; et, pour l’ensemble des animaux traités, des injections ponctuelles ou répétées de très courte durée.
Impact sur les animaux
Chez les souris SOD1 G86R, des altérations motrices progressives des pattes arrière peuvent apparaître à partir de 90 jours, évoluant ensuite vers les pattes avant, accompagnées d’une perte de poids pouvant atteindre 20 %. Ces signes seront suivis de près à l’aide de points limites prédéfinis pour anticiper toute souffrance et décider d’une euthanasie si nécessaire. Les animaux subiront également un stress lié à la contention et à l’isolement temporaire, notamment lors des mesures physiologiques (EEG et calorimétrie). Bien que les animaux soient progressivement habitués à la manipulation, un stress de courte durée est inévitable mais maîtrisé grâce à l’enregistrement en temps réel de paramètres physiologiques permettant de détecter toute détresse. La chirurgie d’implantation peut induire une inflammation locale et une douleur post-opératoire. Ces effets sont limités par la formation expérimentale, la prise en charge adaptée et l’utilisation systématique d’analgésiques et d’antalgique conformément aux protocoles en vigueur. D’autres nuisances possibles incluent une altération temporaire du comportement liée à la manipulation, à l’isolement et aux interventions expérimentales. Ces effets sont surveillés quotidiennement et des mesures correctives seront appliquées si nécessaire, afin de garantir le bien-être des animaux tout au long de l’étude
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever leurs cerveaux ainsi que leurs tissus.
Remplacement
La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative complexe qui touche divers types de neurones le long de l’axe moteur et implique l’interaction de plusieurs types cellulaires, neuronaux et non neuronaux, comme les cellules gliales et les muscles striés. Notre projet vise à étudier les mécanismes neuronaux du sommeil dans les modèles expérimentaux de sclérose latérale amyotrophique, ainsi que les effets d'un traitement chronique par un somnifère. Cette approche ne peut être menée qu’in vivo, sur l’organisme entier.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux, les animaux de comparaison issus des mêmes portées seront utilisés. Le nombre de souris a été calculé à partir de données préliminaires pour garantir que les résultats soient fiables, sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées par une personne déjà formée, donc aucun animal supplémentaire ne sera utilisé pour l’apprentissage. Les opérations se feront progressivement, par petits groupes, ce qui permet d’ajuster le protocole selon les premiers résultats. Si aucun effet n’est observé, le nombre d’animaux pourra être réduit, voire l’expérimentation arrêtée. Les mêmes animaux serviront à plusieurs mesures, comme l’étude du sommeil et des paramètres métaboliques, ce qui limite encore le nombre total d’animaux utilisés. Ainsi, chaque étape a été pensée pour obtenir des résultats fiables tout en réduisant au maximum l’utilisation d’animaux.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera assuré par un environnement enrichi répondant à leurs besoins naturels. Les enrichissements fournis incluront des bâtonnets à ronger pour satisfaire leur comportement naturel de mastication, du coton compressé et des frisures de papier pour la construction de nids, favorisant le confort thermique et réduisant le stress, ainsi qu’un tunnel de transfert pour faciliter une manipulation douce. Les animaux seront hébergés en groupes compatibles, sauf contraintes expérimentales, et feront l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter tout signe de souffrance ou de changement comportemental. La nourriture pourra être placée au sol si nécessaire. Avant les injections répétées et certains tests comportementaux, les animaux seront progressivement habitués à la manipulation et à une contention douce pour réduire le stress. Une période d’habituation est également prévue avant les mesures physiologiques. Les animaux subissant une chirurgie recevront une thermorégulation appropriée et des analgésiques avant, pendant et après l’intervention. Des points-limites préalablement définis permettront d’arrêter toute manipulation ou procédure si un animal montre des signes de souffrance, garantissant ainsi que leur confort et leur sécurité soient prioritaires tout au long de l’étude.
Choix des espèces
La souris est un modèle important et pertinent dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique. Pour intégrer la complexité de la pathologie, et notamment des implications du dysfonctionnement de hypothalamus, il est indispensable de travailler avec un modèle animal possédant une structure hypothalamique bien caractérisée. De plus, les modèles transgéniques de souris sont des modèles expérimentaux très puissants (génétique connue, commercialisation d’outils moléculaires, etc.). En conséquence, dans le cadre de la question biologique posée, le modèle animal choisi ne saurait être remplacé par un autre. Dans toutes les procédures expérimentales, un de nos modèles sera utilisées à un âge compris entre 50 et environ 120 jours et l’autre entre 3 mois et 10 mois. Pour chaque modèle, cette période correspond à la fenêtre temporelle durant laquelle les troubles caractéristiques de la maladie se manifestent. Elle permet ainsi d’évaluer les effets du traitement à la fois en phase présymptomatique, en débutant l’intervention à 60 jours ou 3 mois, et en phase post-symptomatique, avec un traitement initié à 75 jours ou 7 mois. Cette approche garantit une analyse complète de la progression pathologique.
Etude du développement érythrocytaire du paludisme et évaluation pré-clinique d’un vaccin dans des modèles de souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Vérifier qu'un modèle de souris prédit l'efficacité d'un futur vaccin contre le paludisme, avant qu'un essai chez des volontaires humains ne le dise: 1 500 souris immunodéprimées et greffées de globules rouges humains ou de singe vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur foie. Chacune reçoit jusqu'à vingt injections de globules rouges en vingt et un jours et subit jusqu'à dix-neuf prélèvements de sang sur animal vigile, puis une infection par Plasmodium vivax. Le porteur signale un risque de péritonite lié aux injections répétées, une anémie liée à la fréquence des prélèvements et une sensibilité accrue aux infections du fait de l'immunodépression. Il écrit qu'un test in vitro développé en parallèle pourrait, à terme, permettre de ne plus recourir à ce modèle murin.
Objectifs
Le paludisme reste un défi majeur en santé publique, avec environ 250 millions de cas cliniques chaque année et près de 600 000 décès. Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax sont les deux espèces de parasites les plus répandues. Bien que P.vivax soit moins mortel que P.falciparum, il touche plus d'un tiers de la population mondiale à cause de sa capacité à former des hypnozoïtes, des formes dormantes dans le foie. En effet, les formes sporozoïtes injectées par les moustiques gagnent le foie puis, certaines infectent rapidement les globules rouges (paludisme) alors que d'autres restent inactives pendant des mois ou des années dans le foie. Leur réactivation provoque des rechutes de la maladie, compliquant ainsi la lutte contre l'infection. Actuellement, il n'existe aucun vaccin contre P. vivax. Une grande initiative Européenne vise à développer des vaccins de nouvelle génération offrant une protection contre ce parasite. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer la protection apportée par les anticorps produits après vaccination chez un modèle spécifique de souris et chez les volontaires humains. Ce projet représente une opportunité précieuse de déterminer si ce modèle de souris peut prédire l'efficacité des futurs vaccins avant qu'elle ne soit évaluée chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Ce projet offrira une occasion unique d’évaluer la pertinence prédictive de modèles de souris humanisées/simianisées pour les globules rouges en comparant directement la protection conférée par les anticorps générés par le vaccin chez les participants humains et dans ces modèles animaux. Les résultats permettront de mieux apprécier la fiabilité et les limites de ces modèles comme référence pour l’évaluation préclinique de futurs candidats vaccinaux.
Procédures
Pour ce projet, certains animaux recevront des injections pour moduler leur statut immunitaire (animal vigile, 7 fois, 1 minute). Tous les animaux recevront une injection de globules rouges (animal vigile, 20 fois maximum sur 21 jours, 1 minute) qui servira également de compensation des fluides prélevés. Tous les animaux auront des prélèvements sanguins de petit volume (animal vigile, 19 fois maximum, 5 minutes). Un lot d'animaux recevra un sérum par deux voies différentes (animal anesthésie 45 minutes,1 fois, 5 minutes par acte OU animal vigile, 1 fois, 1 minute). Tous les animaux seront infectés (animal anesthésié 45 minutes ou animal vigile suivant le site d'injection, 1 fois, 5 minutes par acte). Tous les animaux auront un prélèvement sanguin de volume plus élevé (animal anesthésié, 1 fois, 1 minute) qui interviendra juste avant l'euthanasie des animaux par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les animaux sont immunodéprimés, par conséquent ils sont plus sensibles aux infections. L'infection avec le parasite du Plasmodium au stade sanguin uniquement pourra engendrer une réponse inflammatoire et une perte de poids. Les animaux pourront avoir des administrations qui pourront engendrer une douleur légère de courte durée au point d'injection et des douleurs abdominales ou une péritonite pour les injections répétées. Les animaux seront soumis à des administrations et à un prélèvement sanguin sous anesthésie : l’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Plusieurs prélèvements sanguins seront effectués sur animal vigile, cela pourra engendrer une douleur légère de courte durée lors du prélèvement et dans de rares cas un hématome. La fréquence des prélèvements pourrait engendrer une anémie et une perte de poids. Les animaux étant immunodéprimés, il y a un risque d'infection lors des injections et des prélèvements. Les différentes manipulations des animaux pourront engendrer un léger stress.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés par une méthode réglementaire car il est nécessaire de prélever différents organes et principalement le foie afin de vérifier la présence et le stade de développement du parasite.
Remplacement
Plasmodium vivax étant un parasite strictement specifique à l'homme, il n'est pas possible, à l'heure actuelle, de remplacer les modèles de souris. Cependant, pour ce qui est de la prediction de protection, la réalisation d'expériences in vitro en parallele avec celles in vivo nous permettra de determiner si le modèle in vitro que nous developpons est tout aussi efficace que le modele in vivo de souris humanisée pour prédire la protection. En conséquence, ces études pourraient éventuellement permettre de ne plus avoir recours à ce modèle murin dans ce contexte spécifique à l'avenir.
Réduction
1500 animaux au maximum seront utilisés dans ce projet dont 420 pour valider le modèle de souris et 1080 pour tester 12 sérums et anticorps sur les 5 ans du projet. Les tests d'efficacité des vaccins seront réalisés uniquement si le modèle murin est validé. Sur la base d'autres études réalisées avec le même type de modèle de souris, des groupes expérimentaux de 5 souris sont suffisants pour répondre aux questions posées. A la fin du projet, différents organes seront prélevés afin de valoriser au maximum l'utilisation des animaux.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Pour limiter l'expression du phénotype dommageable des animaux qui sont immunodéprimés, tout le matériel en contact avec eux est stérilisé. Les administrations qui pourraient stresser modérément les animaux sont réalisés sous anesthésie. Lors des anesthésies, les animaux sont maintenus sur tapis chauffant pour limiter l'hypothermie. Le réveil des animaux est réalisé dans un environnement chaud avec un accès facilité à l'eau et la nourriture. Les yeux sont protégés avec un gel ophtalmique jusqu'au réveil. Les prélèvements sanguins seront compensés par les administrations de globules rouges. Le poids des animaux sera controlé régulièrement pour limiter la perte de poids par la mise en place d'actions. Par ailleurs, le personnel impliqué est formé et expérimenté, les actes techniques et le matériel utilisé pour chaque type d'injection sera toujours le plus adapté afin de réduire au maximum l’inconfort des animaux. Ainsi, la douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
La souris est le modèle le mieux développé et connu pour les greffes de cellules hétérologues. Les lignées immunodéficientes et transgéniques pour les gènes d'intérêt permettant la greffe de globules rouges hétérologues n'existent que chez la souris. Les souris sont utilisées à partir de 2 mois car elles doivent être adultes pour supporter la transplantation des globules rouges nécessaire au projet.
Etude du rôle d’une famille de protéines intracellulaires dans la progression du mélanome chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Flanc rasé sous anesthésie, injection de cellules de mélanome sous la peau, puis deux à trois injections de traitement dans l'abdomen et des mesures de la tumeur trois fois par semaine: 224 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que la croissance de la tumeur sur le flanc peut provoquer une douleur modérée et que les tumeurs peuvent, rarement, nécroser. Le projet cible deux protéines soupçonnées de soutenir la progression du mélanome et la résistance aux immunothérapies, près de la moitié des patients développant de telles résistances. Toutes les souris sont tuées pour prélever tumeurs, rates et ganglions lymphatiques.
Objectifs
Le mélanome, cancer de la peau le plus agressif, a causé la mort de plus de 60.000 patients dans le monde en 2022. Malgré les progrès récents dans le domaine des immunothérapies du cancer, près de la moitié des patients développent des résistances, dont les mécanismes sont encore mal compris. Nous avons identifié deux protéines susceptibles de soutenir la progression du mélanome et de la résistance aux immunothérapies. Les objectifs de ce projet sont de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires médiés par ces deux protéines, d’évaluer l’impact de leur inhibition sur la pousse tumorale, et de valider nos observations dans un second modèle de mélanome cutané.
Bénéfices attendus
Ces travaux pourraient permettre d’identifier de nouveaux mécanismes permettant la progression du mélanome, et l’échappement au système immunitaire, constituant de fait des cibles thérapeutiques potentielles.
Procédures
- Rasage du flanc des souris sous anesthésie (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc de cellules tumorales, sous anesthésie (1x 2 minute/souris) – Injections intrapéritonéales de médicaments (2 ou 3x 5 secondes/souris) – Pesées (30 secondes, une fois par semaine) – Mesure des volumes tumoraux (30 secondes, 3 fois par semaine)
Impact sur les animaux
L’évaluation des volumes tumoraux et les pesées nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection au niveau de l'abdomen pour l'administration des traitements, et sur le flanc pour l'injection des cellules tumorales. -La progression des tumeurs sur le flanc des souris peut induire une douleur modérée. Dans de très rares cas, les tumeurs peuvent nécroser.
Devenir
Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines d’intérêt non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.
Remplacement
Nous avons effectué une série d’expériences in vitro et d’analyses in silico pour établir le rôle des deux protéines d’intérêt dans la croissance tumorale et l’échappement immunitaire, et pour dresser des hypothèses de mécanisme. Néanmoins à notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de l’informatique, les interactions entre les cellules tumorales, immunitaires et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.
Raffinement
Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Le rasage et les injections sous-cutanées seront faites sous anesthésie gazeuse. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide, de l’eau gélifiée et une solution de réhydratation, pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.
Choix des espèces
Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles de mélanomes, de souris transgéniques, et de protocoles bien établis dans la littérature, nous permettant de mesurer le rôle de la molécule d’intérêt dans l’efficacité des immunothérapies. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure. Les animaux seront distribués à 50/50 entre mâles et femelles, sauf dans une procédure où seules des femelles seront utilisées.
Validation en modèle murin de l’effet thérapeutique d’un vaccin muqueux anti-SARS-CoV2 contre les symptômes du covid-long (MODIFICATION)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Une perte de poids de 15 % ou l'apparition de difficultés respiratoires déclenchent la mise à mort immédiate. 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous la peau, huit prises de sang à la veine submandibulaire, deux à dix administrations nasales du vaccin sans anesthésie, puis une inoculation du virus par le nez, le porteur indiquant que l'infection provoque une léthargie et des difficultés respiratoires pouvant entraîner la mort huit jours plus tard. L'enjeu déclaré est d'appuyer une demande d'essai clinique pour un candidat vaccin contre les symptômes du covid long, déjà évalué chez l'humain en prophylaxie.
Objectifs
Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.
Bénéfices attendus
Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.
Procédures
Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sans anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 2 à 10 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).
Impact sur les animaux
Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. MODIFICATION : Les administrations en voie SOUS-CUTANEE pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection ET SONT MOINS NOCIVE QUE LA VOIE INTRAPERITONEALE, TOUT EN MAINTENANT UNE EFFICACITE COMPARABLE. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pour le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Après chaque prise de sang et chaque instillation nasale sur animaux vigiles, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruitée ou rondelle de banane séchée ou popcorn ou graines de tournesol sera réalisée.
Choix des espèces
Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.
Exploration de la réponse immunitaire dirigée contre un virus dans le contexte de la transplantation cardiaque
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à vingt-sept injections dans le ventre et neuf prélèvements de sang par animal après une greffe de cœur cousue au niveau du cou: 1 226 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Près de la moitié sont utilisées comme donneuses, infectées par un cytomégalovirus, l'autre moitié recevant leur cœur sous traitement anti-rejet. Donneuses et receveuses sont génétiquement différentes pour reproduire l'incompatibilité entre un donneur d'organe et son receveur, et le porteur indique qu'amplifier le virus dans les glandes salivaires de souris vivantes reste "nécessaire", la culture cellulaire l'affaiblissant. Toutes sont tuées pour prélever poumons, foie, cœur, reins, rate et glandes salivaires.
Objectifs
Lorsqu’un patient subit une transplantation d’organe et qu’il reçoit un organe provenant d’un donneur, son système immunitaire peut alors reconnaître cet organe comme étranger et provoque son rejet. Pour l’éviter, les patients doivent prendre des traitements immnosuppresseurs (anti-rejet). Ces médicaments visent à réduire l’activité de l’ensemble du système immunitaire et protègent l’organe transplanté mais ils rendent aussi les patients plus vulnérables aux infections. L’infection virale la plus fréquente après une transplantation est celle causée par le cytomégalovirus. Ce virus est très répandu dans la population générale. Chez une personne en bonne santé qui s’infecte pour la première fois, les symptômes sont souvent légers voire absents, car le système immunitaire contrôle rapidement l’infection. Le virus reste ensuite dormant, en « latence », dans différents organes (les reins, le foie, le cœur, les poumons…). Le problème apparaît lorsqu’un patient receveur, n’ayant jamais été en contact avec ce virus, reçoit un organe provenant d’un donneur porteur du virus. Sous traitements anti-rejet, le receveur ne peut pas développer une réponse immunitaire efficace contre le virus. L’infection peut alors se réactiver et entraîner des complications graves, compromettant la santé du patient et la survie de l’organe transplanté. L’objectif de ce projet est d’étudier la manière dont le système immunitaire réagit contre le cytomégalovirus après transplantation, en particulier sous traitement anti-rejet. Nous analyserons aussi l’impact des différences génétiques entre donneur et receveur. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental de transplantation cardiaque chez la souris dans lequel le cœur de souris donneuses infectées de manière latente au cytomégalovirus sera transplanté à des souris receveuses n’ayant jamais été en contact avec le virus et traitées avec différents médicaments anti-rejet. Le choix du modèle de transplantation cardiaque se justifie par la taille plus importante des vaisseaux, rendant la procédure chirurgicale plus simple que pour d’autres organes. Les souris donneuses et receveuses seront génétiquement différentes afin de reproduire ce qui se passe lorsqu’un patient reçoit un organe infecté par le cytomégalovirus provenant d’un donneur génétiquement différent. La réactivation et la propagation du virus seront analysés dans les différents organes des souris receveuses, ainsi que la réponse immunitaire développée par ces souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cytomégalovirus est transmis au receveur lors d’une transplantation d’organe, ainsi que le rôle des principales cellules immunitaires impliquées dans le contrôle et la résolution de cette infection chez les patients transplantés. Les résultats obtenus permettront de également de préciser l’impact des traitements anti-rejet sur la réactivation et la dissémination du cytomégalovirus et de savoir comment moduler la réponse immunitaire du receveur afin de la rendre efficace contre le cytomégalovirus tout en limitant le risque de rejet, avec pour objectif de réduire la morbi-mortalité liée à ce virus et de prolonger la durée de vie des greffons.
Procédures
Toutes les souris donneuses de greffon cardiaque (soit près de la moitié du nombre total des animaux prévue pour ce projet) recevront une injection (du virus) dans le ventre sur animal vigile en début de procédure. 3 prélèvements sanguins sous anesthésie locale seront réalisés sur les souris donneuses (avant infection, une semaine après infection et quelques jours avant la chirurgie pour confirmer l’état de latence du virus). En fin de procédure, les souris donneuses recevront une injection d’anesthésiques (anesthésie générale profonde) dans le ventre et une injection d’analgésique morphinique dans le ventre avant la chirurgie. La peau sera désinfectée et incisée afin de prélever le cœur des souris donneuses. Durée de l’opération chirurgicale : 1h. Toutes les souris receveuses de greffon cardiaque (l’autre moitié des animaux de ce projet) seront anesthésiées profondément via une injection d’anesthésiques dans le ventre et recevront au total 4 injections sous la peau d’analgésique morphinique sur une période de 2 jours. Ainsi, sous anesthésie profonde générale et analgésie, la peau sera désinfectée et incisée afin de greffer le cœur de la souris donneuse au niveau du cou, puis suturée. L’opération chirurgicale durera 2h maximum. De plus, elles seront également soumises à des injections dans le ventre répétées 3 fois par semaine sur animal vigile (soit au maximum 27 injections sur 63 jours maximum), et à des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie locale (soit jusqu’à 9 prélèvements maximum). Les injections dans le ventre et les prélèvements sanguins dureront 30 secondes (contention comprise).
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements de sang répétés sont susceptibles d’entrainer un stress (lors de la contention) et une légère douleur lors de l’acte. La greffe de cœur correspond à une procédure bien documentée, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. L’intervention chirurgicale entrainera une gêne lors du réveil et une douleur malgré les analgésiques et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. L'infection à cytomégalovirus, aux doses utilisées ici, n'engendre pas de symptômes chez les animaux immunocompétents (c’est-à-dire non traités avec les traitements anti-rejet). Pour les souris traitées avec le traitement anti-rejet, l'infection peut causer l'apparition de signes généraux telles qu'une perte de poids ou une prostration, ou encore une hépatite (inflammation hépatique non douloureuse), ou une colite (associée à des diarrhées). L’infection durera 4 mois (pour les souris donneuses immunocompétentes) ou 2 mois (pour les souris receveuses sous traitement anti-rejet) au maximum. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux. Les points cliniques généraux (aspect du poil, comportement, pesée) seront observés selon une fréquence déterminée pour chaque procédure ou étape au sein d’une même procédure. Les points limites propres à chaque procédure ont été décrits pour éviter toute souffrance.
Devenir
Les souris seront mises à mort avec une méthode réglementaire en fin de procédure afin de récupérer différents organes (poumons, foie, coeur, reins, rate et glandes salivaires). La mise à mort des animaux est donc nécessaire pour toutes les analyses biologiques et biochimiques. Toutes les souris ayant atteint un point limite avant la fin de la procédure seront également mises à mort avec une méthode réglementaire.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe et les interactions cellulaires aboutissant à la réponse dirigée contre le cytomégalovirus font intervenir de multiples acteurs immunitaires présents dans différents tissus ou organes lymphoïdes, ce qui est impossible à reproduire in vitro. De plus, le phénomène d’ischémie-reperfusion (lésions dues à l’arrêt puis retour du flux sanguin) est impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés, nous avons donc besoin de toute la complexité vasculaire et inflammatoire de l’organisme vivant pour reproduire ce phénomène observé en transplantation d’organe. Dans certains cas, la génération du stock de virus peut être réalisée par amplification sur lignées de cellules in vitro. Cependant, ceci a pour effet de dimiuner la virulence du virus, contrairement au virus amplifié in vivo et isolé à partir de glandes salivaires. Etant donné que, dans notre cas, nous devons utiliser la souche non modifiée et peu virulente afin d’étudier la réponse physiologique de certaines cellules immunitaires en particulier (ce qui n’est pas possible avec les autres souches de virus modifiées plus virulentes), et que le virus doit être suffisamment virulent afin d’infecter des hôtes immunocompétents et d’obtenir une infection latente (virus en état de dormance), une amplification initiale du virus in vivo (au niveau des glandes salivaires de la souris) est donc une étape nécessaire et non remplaçable par une amplification in vitro.
Réduction
Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe afin d’assurer la robustesse des analyses. Afin d’atteindre un effectif de 5-6 animaux par expérience, sachant que 2 types de protocoles expérimentaux incompatibles seront réalisés (soit 10-12 animaux par groupe), en prenant en compte le taux de réussite de 80-90% pour les greffes cardiaques, nous prévoyons 14 animaux par groupe. Au total, le nombre d’animaux prévus pour ce projet est de 1226 souris (mus musculus). Néanmoins, ce nombre est suceptible d’être revu à la baisse au cours du projet. L’étape de génération du stock de virus in vivo étant redondante avec un autre projet (déjà validé par le ministère), si la quantité de virus générée dans ce premier projet est également suffisante pour ce nouveau projet, nous ne réaliserons pas cette procédure. De même, le nombre d’animaux prévus pour l’entrainement technique à la greffe cardique correspond à un nombre maximal : ainsi, dès validation de la technique, nous passerons à l’étape suivante. Les différentes étapes de ce projet se feront séquentiellement afin de sélectionner au mieux les groupes les plus pertinents au fur et à mesure de l’avancée du projet, et ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le maximum d’échantillons biologiques sera extrait de chaque animal, et plusieurs expériences seront réalisées sur les mêmes échantillons, afin d’éviter d’avoir à reproduire ultérieurement l’expérience par manque de matériel biologique.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera évalué et pris en compte tout au long du protocole grâce un suivi rigoureux, incluant l’observation de leur poids, de leur comportement et de leur état général. Des points limites spécifiques à chaque acte ont été définis afin d’assurer une prise en charge adaptée. Afin de limiter les nuisances et douleurs liées aux injections et aux prélèvements sanguins réguliers, nous alternerons régulièrement des sites d’injection et les sites de prélèvement. Des traitements anesthésiques et analgésiques seront administrés afin de garantir le confort des animaux lors des interventions chirurgicales et des prélèvements sanguins. Bien que la douleur lors des injections ou des prélèvements dans ce protocole sera réduite grâce à l'administration d'analgésiques/anesthésiques, des points limites ont tout de même été définis pour les différentes procédures afin d'intervenir en cas de nécessité et de limiter la souffrance de l'animal. Après chaque chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant et un suivi rapproché sera effectué. Le protocole chirurgical a été établi de façon à ce que le cœur de la souris receveuse est conservé et fonctionnel, ainsi, la perte du greffon cardiaque (issu de la souris donneuse) ne peut entrainer la mort et la souffrance de l’animal en soi. L'infection au cytomégalovirus des animaux traités sous traitement anti-rejet est susceptible de causer des symptômes spécifiques comme une inflammation du foie ou du côlon. Un suivi quotidien de leur état général sera effectué, et la survenue de diarrhées sera contrôlée. À cela s'ajoute un monitoring spécifique permettant de doser les enzymes du foie grâce aux prélèvement sanguins réalisés de façon hebdomadaire. Ces prélèvements sanguins réguliers sont donc nécessaires afin de suivre l’état de santé des animaux et de réagir plus précocément en cas de résultats insatisfaisants. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.
Choix des espèces
Du fait de sa similarité avec l’Homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire anti-virale dans le contexte allogénique. Pour les expériences de transplantation, des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées afin de garantir un système immunitaire pleinement mature capable de répondre à l’infection. Pour la production virale in vivo, des souris immunocompétentes agées de 6 semaines, déjà sevrées, seront utilisées afin d’optimiser le rendement, tout en préservant leur bien-être.
Labyrinthe en T – Rat juvéniles
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Le test consiste à faire choisir des ratons entre une petite récompense immédiate et une plus grosse récompense qui suppose d'attendre, pour le compte de donneurs d'ordre qui font évaluer leurs candidats médicaments contre le TDAH. 2 000 rats juvéniles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Dès leur arrivée, ils sont privés d'enrichissement dans des cages blanches translucides et soumis à une restriction alimentaire intermittente commencée deux jours après le sevrage, avec des jeûnes pouvant atteindre vingt-quatre heures, puis reçoivent jusqu'à deux injections par jour. Cette privation est qualifiée d'"indispensable" pour maintenir le niveau d'impulsivité qui fait la validité du modèle, et le porteur rappelle que le projet précédent a mené un médicament jusqu'au marché européen, non remboursé en France faute de service médical rendu suffisant.
Objectifs
Le trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité (TDAH) est un syndrome dont le diagnostic nécessite d'avoir trois composantes principales qui doivent persister pendant au moins six mois consécutifs: l'inattention, l'hyperactivité et l'impulsivité. La prévalence de ce trouble chez l’enfant de 6 à 12 ans est entre 3 et 6% en France. C’est un trouble du neurodéveloppement multifactoriel causé par de nombreux facteurs génétiques et environnementaux intriqués, intervenant tôt dans le développement du cerveau. La probabilité de transmettre ce trouble à sa descendance est de 75%. La thérapie cognitivo-comportementale (approche psychologique aidant les personnes à modifier leurs schémas de pensée pour améliorer leur comportement et leurs émotions) est particulièrement recommandée chez l’enfant atteint de TDAH mais elle n’est pas suffisante. Le traitement du TDAH nécessite une approche médicamenteuse en complément. Les seuls médicaments indiqués aujourd’hui dans le traitement du TDAH sont les psychostimulants apparentés aux amphétamines ou un inhibiteur sélectif de la noradrénaline utilisé en deuxième intention. Les psychostimulants procurent paradoxalement un effet d’apaisement chez l’enfant atteint de TDAH. L’efficacité de ces traitements médicamenteux est réelle chez certains patients mais néanmoins très perfectibles pour d’autres patients ne répondant pas à celui-ci. De plus, ces composés présentent des effets secondaires chez certains patients, notamment sur le plan du métabolisme, sur le plan cardiaque ou d’ordre psychiatrique. La recherche, encore aujourd’hui, de nouveaux traitements plus efficaces et présentant moins d’effets secondaires est donc une nécessité. Le modèle utilisé dans ce projet, le test du labyrinthe en T chez le rat juvénile, est un modèle qui représente le pendant impulsivité (inaptitude à attendre) chez l’enfant dans le TDAH. Ce modèle possède une bonne validité prédictive puisque les effets des médicaments possédant une autorisation de mise sur le marché pour le TDAH ont déjà été démontrés. Cela fait donc de ce modèle un bon modèle pour tester de nouveaux candidats médicaments. Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments, ayant montré une efficacité potentielle in vitro au préalable, dans un modèle représentatif du symptôme d’impulsivité observé dans le TDAH et qui a largement démontré sa validité, chez le rat.
Bénéfices attendus
Le précédent projet a permis de mettre en évidence des effets positifs d’un médicament qui a poursuivi son développement jusqu’à la mise sur le marché en Europe mais n’est pas remboursé en France car le servi médical rendu a été jugé insuffisant par la haute autorité de santé. A la fin de ce projet, nous espérons que certains candidats médicaments testés démontrent un effet significatif sur l’impulsivité des rats juvéniles comparé à l’administration d’un placébo par une augmentation du pourcentage de forte récompense choisie par les ratons dans notre modèle pour permettre de continuer le développement de potentiels futurs médicaments ayant moins d’effets secondaires et plus d’efficacité sur les patients résistants aux traitements actuels.
Procédures
Les animaux seront stabulés dans des cages opaques translucides (35 jours maximum). Ils seront soumis à un régime alimentaire particulier (18 jours maximum) comprenant des phases de jeun (maximum 24h), de restriction alimentaire et d’accès à l’alimentation ad libitum, en parallèle d’un test comportemental qui implique un choix entre une forte et une faible récompense alimentaire. Le but du projet étant de tester l’efficacité de candidats médicaments, les animaux seront injectés avec ces candidats médicaments, leur placébo ou des références positives de façon répétée (maximum 2 fois par jours sur toute la durée du test, durée d'une administration : moins d’une minute). Un prélèvement de sang pourra être réalisé sous anesthésie générale en fin d'étude et sur tous les ratons inclus dans une étude (5 minutes maximum). Lors de la journée d’habituation, les essais seront de 5 minutes environ et pourront de façon exceptionnelle aller jusqu’à 20 min maximum. Pour le reste du test, les animaux réaliseront 15 essais maximum par jour pour une durée totale maximale de 20 min.
Impact sur les animaux
Afin d’obtenir un niveau d’impulsivité nécessaire à la validité du modèle, les animaux dès leur arrivée dans nos locaux ne disposent pas d’enrichissement dans les cages et sont placés dans des cages blanches translucides laissant passer la lumière jusqu’à la fin de l’étude (à l’âge d’environ 7 semaines). Ils sont également soumis à une restriction alimentaire intermittente débutant deux jours après le sevrage et poursuivie jusqu’à la fin de la procédure de l'étude pour une durée maximum de 3 semaines. Cette restriction alimentaire est indispensable pour maintenir un niveau suffisant de motivation pour la nourriture, mais également un niveau d’impulsivité nécessaire à la validité du modèle. Lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. Dans notre projet, des études in vivo ont déjà été réalisées au préalable avec les candidats médicaments et ne montrent aucune toxicité particulière de ceux-ci. Les futurs candidats médicaments peuvent avoir différents modes d’administration. Une administration d’un candidat médicament entraîne une contention de l’animal qui peut induire un stress particulier. Un stress peut également être présent lors des premières manipulations des animaux dans la procédure comportementale. Des prélèvements de sang seront réalisés si besoin à la fin de l’étude sur animaux anesthésiés.
Devenir
Les animaux en fin d’étude seront mis à mort pour pouvoir réaliser des prélèvements d’organes post-mortem.
Remplacement
Le développement de candidats médicaments, en amont de l’utilisation de l’animal, est réalisé en plusieurs étapes : l’identification de la cible thérapeutique (pathologie), la compréhension des voies neurobiologiques de cette pathologie, la découverte de composés modulant la cible thérapeutique, l’optimisation de ces composés pour améliorer leur spécificité, leur profil pharmacocinétique et leur sécurité, leur validation fonctionnelle in vitro (ex : cultures de neurones) et leur évaluation pharmacocinétique et toxicologique in vitro. Suite à ces étapes et en amont du présent projet, des études in vivo pourront également être réalisées ou sous-traitées par le donneur d’ordre afin de déterminer plus précisément leur pharmacocinétique et leur toxicité. L’ensemble de ces études permettent de choisir les doses dénuées de toxicité, ainsi que la voie et le temps d’administration qui seront optimaux pour notre projet. L’étude comportementale réalisée dans ce projet consiste à évaluer l’impulsivité chez le rat. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, permettant de conclure de manière certaine. Etant donné les nombreuses données internes et la variabilité probable des réponses aux candidats médicaments, 12 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d'assurer une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable. De plus et afin de réduire au maximum les animaux utilisés dans ce projet, nous demandons à notre fournisseur d’effectuer des adoptions en interne pour nous fournir des mamans avec uniquement des ratons mâles.
Raffinement
Les animaux arrivent à 9 jours d’âge avec leur mère pour qu’ils puissent avoir une période d’habituation d’au minimum 12 jours avant leur sevrage et 14 jours avant le début de la procédure. Au sevrage, les ratons de la même fratrie sont regroupés par 4 dans une même cage autant que faire se peut. A partir du début de la restriction alimentaire, les animaux sont pesés quotidiennement (hormis les jours où ils ont un accès à la nourriture ad libitum) pour maintenir une restriction suffisante mais éviter qu’elle soit trop importante, et leur état sanitaire est évalué quotidiennement. Les granulés sont coupés en petits morceaux et un quart est mis au fond de la cage pour faciliter l'accès à la nourriture lors de la restriction. Des points limites spécifiques au projet ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. Le rongeur est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Le rat possède des circuits dopaminergiques, noradrénergiques et fronto-striés comparables à ceux des humains qui sont largement connus pour être centraux dans le TDAH (contrôle attentionnel, impulsivité, motivation). Dans notre modèle, les rats ont montré une aptitude à l’apprentissage et à l’impulsivité plus importante que les souris ce qui permet de diminuer la durée du test. Le but de ce projet est le développement de nouveaux candidats médicaments dans le traitement du TDAH chez l’enfant. Les animaux utilisés seront donc des animaux jeunes (juste après le sevrage). L’étude débutera dans la semaine qui suit le sevrage des animaux.
Déterminants cellulaires et moléculaires des activités pathologiques dans un modèle expérimental murin d’épilepsie.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à six injections pour déclencher une épilepsie, une chirurgie d'implantation d'électrodes dans le cerveau, puis des enregistrements dix heures par jour pendant vingt et un jours et jusqu'à quarante-deux injections: 846 souris vont être utilisées, dont 621 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. À partir de la chirurgie, elles sont hébergées seules jusqu'à sept semaines, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress pour une espèce vivant normalement en groupe. Le projet vise à identifier les cellules cérébrales actives pendant les crises pour les cibler ensuite par optogénétique ou chémogénétique. Le bien-être des animaux non-humains est présenté comme la "priorité" de l'équipe, laquelle indique aussi qu'il arrive que des crises très sévères leur soient fatales.
Objectifs
L'épilepsie est une maladie neurologique courante qui touche près de 1 pourcent de la population mondiale. L'une de ses formes les plus fréquentes chez l'adulte est l'épilepsie du lobe temporal mésial, souvent causée par la sclérose hippocampique, une cicatrice dans une partie du cerveau appelée hippocampe. Pour environ 30 pourcents de ces patients, les médicaments actuels ne parviennent pas à contrôler les crises. On parle alors d'épilepsie pharmacorésistante. Dans ces cas, une chirurgie pour enlever la zone cérébrale responsable des crises est souvent la seule solution. Notre objectif est d'améliorer la compréhension de cette forme d'épilepsie afin de trouver de nouveaux traitements. Pour cela, nous utilisons un modèle expérimental de l'épilepsie chez la souris, qui reproduit les caractéristiques de la maladie humaine. Notre recherche se déroule en plusieurs étapes. Nous allons tout d'abord essayer d’identifier les types de cellules cérébrales qui sont actives pendant les crises d'épilepsie. Puis nous les étudierons ensuite pour comprendre leurs caractéristiques (leur forme, leur activité et les gènes qu'elles expriment). Une fois ces cellules bien identifiées, nous pourrons essayer de moduler spécifiquement leur activité pour voir si cela permet de réduire la fréquence des crises. De plus, en nous basant sur les mécanismes que nous aurons identifiés, nous allons rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques et tester l'efficacité de molécules agissant sur ces mécanismes. Notre but est de trouver de nouveaux médicaments qui pourraient aider les patients dont les crises ne sont pas contrôlées par les traitements actuels. Ce projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes de l'épilepsie du lobe temporal pour développer de nouvelles thérapies. Notre travail, effectué sur un modèle de souris, vise à identifier les cellules à l'origine des crises pour pouvoir les cibler de manière plus précise et ainsi offrir de nouvelles options aux patients dont les crises ne peuvent pas être contrôlées par les médicaments.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à combler un manque de connaissances important : la compréhension précise des réseaux de neurones responsables du déclenchement et de l'évolution des crises d'épilepsie. Les informations que nous allons récolter pourraient aider à identifier avec plus de précision les cellules spécifiques impliquées dans l'activité épileptique. Ce projet pourrait permettre de découvrir de nouvelles pistes pour développer des médicaments plus efficaces, en ciblant directement les mécanismes responsables des crises. Par ailleurs il permettra également d'évaluer des techniques de pointe, comme l'optogénétique et la chémogénétique. Ces méthodes utilisent la lumière ou des molécules pour contrôler l'activité de cellules spécifiques. Elles pourraient, à terme, ouvrir la voie à des thérapies totalement nouvelles pour les patients qui ne répondent pas aux traitements actuels. En résumé, ce projet a pour objectif d'améliorer de manière significative notre compréhension de l'épilepsie, avec l'espoir de développer à plus long terme de nouvelles options de traitement pour les patients dont les crises ne sont pas contrôlées par les médicaments.
Procédures
Une partie des animaux recevra des injections de molécules pour induire la pathologie (vigile, 6 injections maximum, quelques secondes par injection). 4 semaines après ils auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour implanter un dispositif permettant d’enregistrer l’activité cérébrale (1 fois, 1 heure environ). Ils seront ensuite habitués à l’enregistrement de l’activité cérébrale (vigile, branchement du dispositif les laissant libre de se déplacer) pendant 2 à 4h par jour, 5 jours. Pour une partie de ces animaux leur activité cérébrale sera ensuite enregistrée sur 1 journée pendant 10h environ et ils recevront une injection d’un composé pour activer une mutation génétique (vigile, 1 fois, quelques secondes pour l’injection). Pour les autres l’enregistrement sera réalisé en continu pendant 21 jours et ils recevront 1 à 2 injections de composés chaque jour pour évaluer leur effet thérapeutique (vigile, quelques secondes par injection, 42 injections maximum). Une autre partie des animaux aura une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour injecter une molécule au niveau du cerveau afin d’induire la pathologie (1 fois, 1h maximum). 4 semaines après ils auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour implanter un dispositif permettant d’enregistrer et stimuler l’activité cérébrale (1 fois, 1 heure environ). Ils seront ensuite habitués à l’enregistrement de l’activité cérébrale (vigile, branchement du dispositif les laissant libre de se déplacer) pendant 2 à 4h par jour, 5 jours. Leur activité cérébrale sera ensuite enregistrée sur une journée pendant 10h environ au cours de laquelle ils reçoivent une injection d’un composé pour activer une mutation génétique (vigile, durée quelques secondes). 1 semaine après, les enregistrements (vigile) sont réitérés 10h par jour pendant 21 jours consécutifs. Au cours de ces enregistrements certains recevront une stimulation cérébrale (vigile, durée quelques secondes), les autres recevront une molécule modulant l’activité cérébrale dans leur eau de boisson (20 jours). A partir de la chirurgie d’implantation du dispositif tous les animaux seront hébergés seuls jusqu’à la fin de l’étude (7 semaines maximum). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de procédure. Une partie d’entre eux sera euthanasiée au cours d’une chirurgie sans réveil, sous anesthésie générale et analgésie adaptée (durée inférieure à 10 minutes).
Impact sur les animaux
L’induction du modèle d'épilepsie pourra entraîner des effets secondaires comme une perte de poids et une réduction de la mobilité. La survenue des crises engendre un stress et une fatigue significatifs pour l’animal. L’injection des molécules pour mettre en place le modèle peut induire des effets périphériques (accélération du pouls, sudation, saignements). Il arrive que des crises très sévères soient fatales pour les animaux. Les chirurgies seront associées à un risque de douleur et d’inconfort pendant quelques jours, de plus il existe un risque de légère perte de poids, rapidement réversible. Le dispositif d’enregistrement implanté pourra générer un inconfort pour l’animal. Les souris implantées avec ce dispositif seront hébergées seules jusqu’à la fin de la procédure, s’agissant d’animaux vivant normalement en groupe cela génèrera un stress. L’anesthésie générale pour les chirurgies sera associée à un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et un risque rare de difficultés cardiorespiratoires. Les différentes injections pourront induire une légère et brève douleur au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, afin de prélever puis analyser leur cerveau dans le but de répondre à notre question scientifique.
Remplacement
Pour comprendre l'épilepsie et trouver de nouveaux traitements, la recherche sur des modèles vivants est essentielle. Les mécanismes complexes d'une crise d'épilepsie ne peuvent pas être reproduits fidèlement en laboratoire sur des cellules isolées ou à l'aide de simulations informatiques. Nous utilisons déjà des modèles plus simples, comme des cultures de cellules ou des tissus humains obtenus après une chirurgie. Ces méthodes sont utiles pour tester des molécules, mais elles ne permettent pas d'étudier l'impact direct d'un traitement sur l'ensemble du cerveau et sur la survenue d'une crise. C'est pourquoi l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire. Il est le seul à pouvoir nous donner des informations sur la manière dont les crises se déclenchent et se propagent dans un cerveau vivant. Cela nous permet de tester l'efficacité de nouvelles thérapies de manière réaliste et de progresser vers des traitements pour les patients.
Réduction
Le nombre d'animaux que nous utilisons dans notre projet a été défini avec soin pour être le plus juste possible, en se basant sur nos expériences passées et les données de la littérature scientifique. Nous avons travaillé à améliorer notre modèle expérimental. Par exemple, nous avons réduit les doses des substances utilisées pour déclencher les crises, ce qui a permis de diminuer la mortalité et le nombre d'échecs. Cela nous permet d'obtenir les informations nécessaires avec moins d'animaux. Le chiffre total de 846 animaux a été calculé en tenant compte de plusieurs facteurs clés : Nombre de groupes : Chaque expérience nécessite des groupes d'animaux suffisants (entre 5 et 10 animaux par groupe) pour garantir la fiabilité des résultats. Nous avons des groupes de contrôle et des groupes qui reçoivent différents traitements ou sont soumis à des conditions variées (épilepsie vs. non épileptiques, différents médicaments, etc.). Taux d'échec et de perte : Nous devons prévoir les animaux qui ne développeront pas l'épilepsie, ceux qui ne survivront pas au déclenchement des crises, et ceux pour lesquels les données collectées seront inexploitables. Ces taux sont essentiels à prendre en compte pour s'assurer que nous aurons au final un nombre suffisant d'animaux pour obtenir des résultats statistiquement valables. Pour valider nos résultats, nous utiliserons des tests statistiques reconnus afin de nous assurer que nos conclusions sont solides et ne sont pas dues au hasard.
Raffinement
Le bien-être des animaux est notre priorité. Nous nous engageons à respecter des règles très strictes pour garantir qu'ils soient dans les meilleures conditions possibles tout au long de notre étude. Les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation. Elles ont de l'eau et de la nourriture à volonté et bénéficient d’un enrichissement dans leur cage (carré de coton pour faire un nid, bâton de bois à ronger). Pour celles qui auront un dispositif implanté, un hébergement individuel est nécessaire pour éviter toute blessure, dans ce cas une maisonnette sera ajoutée dans leur cage et nous vérifierons que ces animaux ne présentent pas de signes de stress lié à cet hébergement. Les animaux seront observés quotidiennement. Ils sont pesés régulièrement et leur état général est contrôlé. En cas d’anomalie celle-ci sera gérée en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire afin de mettre en place une prise en charge adaptée. Des points limites sont définis et seront appliqués pour éviter toute souffrance. Nous avons perfectionné notre méthode pour déclencher l'épilepsie, nous permettant d’améliorer la récupération et la survie des animaux. Les opérations chirurgies se déroulent sous anesthésie générale et locale, avec des antidouleurs. Nous surveillons la température des animaux et protégeons leurs yeux. Après l'opération, ils sont placés dans une zone de réveil chauffée jusqu'à ce qu'ils soient complètement remis. Pendant leur récupération, nous les surveillons de près, en vérifiant leur poids et leur comportement. Nous leur donnons une nourriture liquide spéciale et veillons à ce qu'ils soient bien hydratés, surtout après le déclenchement des crises. Les animaux sont habitués progressivement à l’enregistrement de l’activité cérébrale. Lors de ces enregistrements nous les surveillons à distance, limitant ainsi les interventions humaines directes. Lors de l’administration de composés nous alternons les zones d'injection pour éviter les risques d’irritation locale. Des critères d'arrêt clairs et éthiques ont été établis pour garantir qu'aucune souffrance inutile ne soit infligée aux animaux. Ces mesures strictes témoignent de notre engagement à mener cette recherche de manière responsable, tout en cherchant à faire progresser la connaissance pour le bien des patients humains.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour notre recherche est le résultat d'une démarche scientifique rigoureuse. C'est un modèle animal standard pour l'étude de l'épilepsie, pour plusieurs raisons clés. Procédures standardisées : Les méthodes d'anesthésie et d'analgésie (gestion de la douleur) chez la souris sont très bien établies et maîtrisées. Cela nous permet de garantir le bien-être des animaux tout au long des expériences. Modèles d'épilepsie bien connus : Les techniques pour déclencher des crises d'épilepsie chez la souris ont été largement étudiées et validées par la communauté scientifique. Cela assure la fiabilité de notre modèle. Outils génétiques uniques : Certaines de nos expériences les plus avancées nécessitent l'utilisation de souris génétiquement modifiées. Ces souris sont conçues pour permettre de marquer ou de contrôler l'activité de cellules spécifiques du cerveau, une méthode impossible à réaliser chez d'autres espèces. Stade de développement pertinent : Nous utiliserons des souris de 8 semaines, un stade de développement qui correspond à l'âge adulte. Cela est important car la forme d'épilepsie que nous étudions est la plus courante chez l'adulte humain. En résumé, la souris est le meilleur modèle pour cette étude car elle nous offre les outils nécessaires pour répondre à nos questions de recherche de manière précise, fiable et en minimisant les procédures invasives.
Rôle du circuit de Papez dans la consolidation de la mémoire en sommeil paradoxal
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Après une biopsie de génotypage sur animal conscient, elles subissent une chirurgie d'une à deux heures pour l'injection d'un vecteur dans le cerveau et la pose d'implants d'enregistrement, parfois de fibres lumineuses, puis des tests de mémoire spatiale et une privation ciblée de sommeil paradoxal de quarante-huit heures. Le porteur ramène les effets de cette privation à une "légère fatigue, sans signe de stress objectivable" et conclut qu'aucun effet secondaire majeur n'est attendu. Environ 35 souris sont tuées avant toute expérience, leur génotype ne correspondant pas à celui recherché.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une petite région du cerveau appelée noyau mamillaire médian dans deux fonctions importantes : le sommeil paradoxal (la phase de sommeil liée aux rêves) et la mémoire. Des études récentes suggèrent que cette zone pourrait être active pendant le sommeil paradoxal et participer à la consolidation des souvenirs. Pour explorer cette idée, nous allons manipuler l’activité de certains neurones spécifiques dans cette région chez la souris, en les activant ou en les inhibant grâce à deux techniques modernes : la chémogénétique (une molécule donnée à la souris active ou bloque les neurones ciblés) et l’optogénétique (de la lumière déclenche ou arrête l’activité des neurones à des moments précis). Les souris seront observées pendant leur sommeil et soumises à des tests de mémoire, afin de comprendre si ces neurones jouent un rôle dans l’architecture du sommeil paradoxal et dans le stockage des souvenirs.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à mieux comprendre comment le sommeil paradoxal (REM) – la phase du sommeil où se produisent le plus de rêves – joue un rôle actif dans la consolidation de la mémoire. En identifiant la fonction exacte des neurones du mammilaire médians et de leurs connexions, ce projet pourrait faire émerger de nouvelles cibles thérapeutiques pour des pathologies touchant la mémoire ou le sommeil. Cela concerne notamment des maladies comme la dépression, les troubles du stress post-traumatique, ou encore les affections neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, où les circuits de la mémoire sont perturbés. Enfin, ce projet s’appuie sur des outils de pointe (stimulation cérébrale ciblée, enregistrements du sommeil, suivi comportemental) permettant une analyse fine, réversible et non douloureuse de ces fonctions chez l’animal.
Procédures
Les animaux feront d’abord l’objet d’un petit prélèvement de tissu afin de déterminer leur génotype. Ce prélèvement est réalisé une seule fois et dure quelques secondes, chez des animaux conscients. Les animaux subiront ensuite une intervention chirurgicale unique réalisée sous anesthésie générale. Cette chirurgie comprend l’injection d’un vecteur dans une zone précise du cerveau ainsi que la pose de dispositifs permettant d’enregistrer l’activité cérébrale et musculaire et, selon les groupes, de délivrer une stimulation lumineuse. Cette intervention dure environ 1 à 2 heures. Après leur récupération, les animaux participeront à plusieurs sessions d’enregistrement de l’activité cérébrale et musculaire, réparties sur toute la durée du protocole. Ils seront également soumis à des tests de mémoire spatiale comprenant une phase de découverte, une phase d’apprentissage et une phase de test. Enfin, les animaux seront soumis une seule fois à une privation ciblée du sommeil paradoxal pendant 48 heures, suivie d’une période de récupération.
Impact sur les animaux
Le prélèvement tissulaire réalisé pour le génotypage peut entraîner un inconfort léger et de courte durée au moment de la biopsie. Les animaux peuvent présenter une douleur postopératoire transitoire après la chirurgie, accompagnée éventuellement d’une baisse temporaire de l’appétit ou de l’activité. Une gêne locale temporaire liée aux implants utilisés pour l’enregistrement ou, selon les groupes, à l’implantation de dispositifs lumineux, peut survenir sans altérer la mobilité ni les comportements spontanés. La privation ciblée d’un stade de sommeil peut entraîner une légère fatigue, sans signe de stress objectivable. Aucun effet secondaire majeur n’est attendu durant l’ensemble du protocole. Les animaux font l’objet d’un suivi quotidien permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou de détresse, avec mise en place immédiate des mesures de prise en charge adaptées.
Devenir
À la fin des expérimentations, les animaux 105 seront mise à mort pour permettre le prélèvement des cerveaux pour les analyses nécessaires au projet. Les animaux ne présentant pas le génotype requis (environ 35 animaux) seront également euthanasiés, leur génotype ne permettant pas leur inclusion dans les procédures expérimentales.
Remplacement
Les mécanismes étudiés dans ce projet, à savoir la modulation du sommeil paradoxal et la consolidation mnésique nécessitent un modèle intact, vivant, et capable de dormir. À ce jour, les alternatives in vitro (cultures neuronales, organoïdes) ou in silico (modélisation informatique) ne permettent pas de reproduire la complexité des cycles veille-sommeil ni l'interaction entre les différentes structures du circuit de Papez. Ainsi, aucune méthode de remplacement ne peut actuellement se substituer à l’utilisation de la souris pour répondre aux objectifs de ce projet. L’animal utilisé est le plus pertinent au regard des données disponibles, des outils génétiques existants, et des connaissances déjà acquises dans ce modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’un calcul de puissance statistique, indiquant qu’un minimum de 15 souris par groupe est nécessaire pour détecter un effet biologique significatif avec une puissance suffisante. Ce nombre garantit une interprétation fiable des résultats tout en limitant strictement le nombre d’animaux utilisés, conformément au principe de réduction. Ce nombre permet également de réaliser l’étude sur des souris mâles et femelles.
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, certains traitements sont administrés sans injection, par ingestion volontaire sous forme de gelée, une méthode simple et bien acceptée. Les animaux sont observés chaque jour par l’expérimentateur afin de vérifier leur état général, y compris lorsqu’ils sont hébergés individuellement. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale, ce qui permet d’endormir complètement les animaux pendant l’opération. Des traitements contre la douleur sont systématiquement administrés avant et après la chirurgie afin de réduire l’inconfort lié aux interventions. L’état de santé des animaux est évalué quotidiennement à l’aide d’une grille de suivi prenant en compte leur comportement, leur apparence et leur état général. Des critères précis ont été définis pour identifier toute situation anormale. Si l’un de ces critères est atteint, l’animal est immédiatement retiré de l’étude et mis à mort afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Notre projet repose sur l’utilisation de souris transgéniques associée à un modèle expérimental reconnu permettant d’étudier les liens entre le sommeil et la mémoire. La souris est largement utilisée en neurosciences pour l’étude du sommeil, de la mémoire et des comportements, car son fonctionnement cérébral et ses rythmes veille-sommeil présentent de nombreuses similitudes avec ceux de l’être humain. Ce modèle permet d’étudier des phénomènes complexes tels que la consolidation de la mémoire pendant le sommeil paradoxal. Les régions cérébrales impliquées dans la mémoire et les émotions sont bien conservées entre la souris et l’homme, ce qui rend les résultats pertinents pour une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux du cerveau humain. De plus, la souris offre un large éventail d’outils expérimentaux permettant d’observer et de moduler l’activité cérébrale de manière précise et fiable, ce qui est indispensable pour tester notre hypothèse sur le rôle du sommeil paradoxal dans la mémoire. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), période à laquelle le cerveau est mature et les cycles de sommeil sont stabilisés, condition nécessaire à l’étude du sommeil et des fonctions de mémoire.
Implantation d’organoïdes de peau sur un modèle de souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
660 souris vont être utilisées, chacune recevant deux implants sous la peau du dos avant qu'ils ne soient retirés en deux temps, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les interventions sont brèves: deux injections de vingt secondes sous anesthésie générale, puis un à cinq minutes pour chaque retrait. Toutes les souris sont tuées après récupération des implants, chaque greffon partant en analyse histologique. Le bénéfice annoncé, une "avancée significative" vers de nouveaux bio-pansements pour les grands brûlés, est renvoyé à plus tard, l'objectif immédiat restant de vérifier que le greffon se vascularise.
Objectifs
La restauration permanente de large surface de peau par une greffe cutanée représente une application thérapeutique d’enjeu vital, qui constitue un fer de lance pour le domaine des biothérapies tissulaires notamment dans la prise de greffe des bio-pansements lors de greffes de peaux chez l’Homme (ex : grands brulés). Des études en culture cellulaire ont permis de valider différentes cellules, leur potentiel de croissance à court et long terme et leur capacité à former un bio-pansement cutané. Suite à ces résultats très favorables, il est crucial de valider le potentiel régénératif des cellules cultivées dans ce milieu à savoir leur capacité à reformer une peau fonctionnelle. L’objectif du projet est donc de valider la fonctionnalité de notre bio-pansement cutané.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de la néo-vascularisation d’un greffon cutané, permettant l’obtention d’une bonne prise de greffe, ainsi que la maturation de la peau humaine reconstruite et son auto-renouvèlement. Cette étape permettra une avancée significative vers la conception de nouveaux bio-pansements cutanés vascularisés pouvant faciliter la prise de greffes de peaux chez l’homme (ex : grands brulés).
Procédures
Les souris sous anesthésie générale vont subir : - Une injection 2 fois 20 secondes - Le retrait des implants 2 fois, 1 à 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent avoir une douleur légère et de courte durée au point j'injection et lors du retrait des implants. Elles peuvent avoir un stress lors de l'anesthésie.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort après la récupération des implants., une étude histologique est prévue pour chaque implant.
Remplacement
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée en culture cellulaire, les processus de cicatrisation ne peuvent être répliqués en laboratoire. Les modèles de cicatrisation en culture cellulaire ne peuvent pas reproduire les mécanismes de coagulation, d’inflammation, et de néo-vascularisation. Seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité de la réparation tissulaire à la suite d’une greffe, permettant ainsi d’atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, des premières études en culture cellulaire ont été effectuées pour valider le modele de notre bio-pansement cutané. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de réduire au maximum la douleur et le stress, les animaux disposent d’un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson et d’un environnement enrichi . De plus, l’injection et le retrait des implants seront effectuées sous anesthésie générale et nous donnons un analgésiques adaptés avant le retrait de l'implant. Les animaux seront surveillés trois fois par semaine avec mise en place de points limites qui permettront une prise en charge précoce en cas de douleur ou de souffrance.
Choix des espèces
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée in vitro, les processus de cicatrisation ne peuvent être répliqués en laboratoire. Les modèles de cicatrisation ex vivo ne peuvent pas reproduire les mécanismes physiologiques. Ici seul un modèle animal permet de reproduire ces effets physiologiques à la suite d’une greffe, permettant ainsi d’atteindre les objectifs du projet. Nous utiliserons des souris de 6-9 semaines pour que les animaux aient une taille suffisante pour permettre l'injection de deux implants sur le dos.
Evaluation du potentiel thérapeutique d’une molécule impliquée dans l’homéostasie musculaire dans un modèle murin de dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Quatre-vingt-douze des souris utilisées sont dystrophiques, dépourvues de dystrophine, donc atteintes de dégénérescence musculaire, d'inflammation et de fibrose. Avec 32 souris témoins, 124 animaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent jusqu'à six électrocardiogrammes sur animal vigile et six échocardiographies sous anesthésie, une partie courant en outre sur tapis roulant et passant des mesures de contractilité musculaire, le porteur indiquant qu'elles peuvent ressentir des douleurs musculaires et se déplacer difficilement en fin de vie. Toutes sont tuées pour prélever plusieurs muscles et le cœur.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénérescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, la molécule testée dans ce projet représente un bon candidat car il a déjà été prouvé que ce traitement renforce la structure musculaire, la fonctionnalité des mitochondries et réduit l'inflammation. Le but du projet est d’évaluer l’efficacité de ce traitement dans un modèle murin de dystrophie musculaire de Duchenne.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus à court terme, chez les souris dystrophiques, sont une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris seront traitées avec le candidat médicament. A long terme, cette molécule pourrait être envisagée comme traitement utilisable chez le patient atteint de dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une évaluation de la fonction cardiaque par électrocardiogramme sur animal vigile (3 à 5 minutes, 6 fois maximum) et à une échocardiographie sur animal anesthésié (5 à 10 minutes, 6 fois maximum). Une partie des animaux sera soumis à un régime alimentaire particulier en prise spontanée dans l'alimentation (12 semaines). Une partie des animaux sera soumis à des tests d’endurance sur tapis roulant (20 minutes, 2 fois maximum), à des mesures de contractilité musculaire sur animal anesthésié et sous analgésie (20 minutes, 1 fois) et à un prélèvement de sang sur animal anesthésié et sous analgésie (20 secondes, 1 fois).
Impact sur les animaux
Les souris dystrophiques présentent une atteinte des muscles squelettiques, du diaphragme et du cœur. Elles ont une importante faiblesse musculaire, de l’inflammation, de la fibrose et de l’infiltration de tissu adipeux. Ces animaux peuvent donc ressentir des douleurs musculaires et présenter des difficultés à se déplacer en fin de vie. Les animaux pourront subir un stress de courte durée, lors du transfert d’une cage à une autre et pendant les premiers jours après leur arrivée. Au cours des différentes procédures, les animaux peuvent subir un stress de courte durée au moment des manipulations et lors de l’administration de l’anesthésie gazeuse. Au cours des procédures sous anesthésie, les souris pourraient risquer l’hypothermie. Pour les mesures de performance sur tapis roulant, les animaux peuvent ressentir de la fatigue. Le traitement dans la nourriture pourrait provoquer une diminution de la consommation alimentaire et des dérèglements intestinaux tels que des diarrhées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires.
Remplacement
Le but de ce projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la DMD est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent recréer la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu et ne peuvent rendre compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Le modèle utilisé dans ce projet est un modèle de choix pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.
Réduction
Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Pour tous les groupes expérimentaux et toutes les méthodes d'analyse, 5 à 8 animaux est le nombre d'échantillons nécessaire pour une analyse statistique fiable. Néanmoins, considérant une forte hétérogénéité chez les souris dystrophiques, des groupes de 6 à 10 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable. Nous prévoyons de répéter une deuxième fois les expériences pour confirmation des résultats. De plus, plusieurs muscles ainsi que le coeur seront prélevés. Au total, nous prévoyons d'utiliser 92 souris dystrophiques et 32 souris contrôles soit un total de 124 animaux. La taille des effectifs sera été établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Les animaliers procèdent à un contrôle quotidien des cages et à un changement régulier sous hotte aspirante. Les animaux sont 5 par cage maximum et l'hébergement individuel est évité. Cependant il est possible que certains animaux se retrouvent en hébergement individuel (causes: seul mâle d’une portée, agression entre congénères, dernier animal dans la cage..). Dans ce cas, l’animal bénéficiera d’un enrichissement supplémentaire dans sa cage. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage ou en bouillie dans des coupelles. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Une semaine d’acclimatation sera mise en place lors de l'arrivée dans l'animalerie. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris sera maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante à 37 degrés. Lors des mesures de performance et d'évaluation de la fonction cardiaque, une habituation sera réalisée et les mesures se feront dans un environnement calme et par un manipulateur expérimenté. Dès que les animaux émettront des signes de fatigue, les tests seront interrompus et de l'eau sera proposée aux animaux après l'effort. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de choix pour la caractérisation de l’homéostasie musculaire. Cette espèce permet de combiner les études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé dans ce projet a l’avantage de présenter un phénotype semblable aux patients. Les animaux utilisés seront âgés de 5 à 8 semaines en début de procédure et de 17 à 24 semaines en fin de procédure. L’intérêt est de traiter les animaux à un stade précoce de la maladie. Le démarrage du traitement peu de temps après le sevrage des animaux permettra d’évaluer la capacité de notre molécule à ralentir la progression de la maladie.
greffe d’organoide de peau vascularisé sur un modèle de souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
426 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour que les greffons soient récupérés et analysés. Chacune subit une chirurgie de quinze à vingt minutes sous anesthésie générale puis reçoit neuf injections d'analgésiques, certaines étant hébergées seules. Il s'agit de vérifier qu'un organoïde de peau humaine cultivé en laboratoire reforme une peau fonctionnelle sur le dos d'une souris, avant d'envisager des bio-pansements pour les grands brûlés. Le porteur ramène les atteintes attendues à une douleur modérée de moyenne durée et affirme que seul un modèle animal rend compte de la complexité de la réparation tissulaire.
Objectifs
En raison de sa fonction protectrice, la peau est un organe indispensable à la survie de l’organisme. Lors d’agressions importantes, telles qu’une brûlure du troisième degré, la peau n’est plus capable de cicatriser spontanément et induit un déséquilibre parfois mortel. La prise en charge des victimes de brûlures sévères se base sur l’utilisation de substituts cutanés préparé avec les cellules du patient. Des études en cultures cellulaires ont permis de valider différentes cellules, leur potentiel de croissance à court et long terme et leur capacité à former un organoïde cutané. Suite à ces résultats très favorables, il est crucial de valider le potentiel régénératif de cet organoide cutané à savoir sa capacité à reformer une peau fonctionnelle sur un modèle animal. L’objectif du projet est donc de valider la fonctionnalité d’un organoïde cutané humain, issu d’une culture cellulaire pouvant servir de bio-pansements lors de greffe de peau.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’une part, de sélectionner un milieu de culture chimiquement défini répondant aux exigences règlementaires d’un médicament et d'autre part de valider la capacité d'un organoide de peau à favoriser d’une bonne prise de greffe, la maturation de la peau et son auto-renouvèlement. Cette étape permettra une avancée significative vers la conception de nouveaux substituts cutanés pouvant servir de bio-pansements lors de greffes de peaux chez l’Homme (ex : grands brulés).
Procédures
Les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à 1 chirurgie de 15 minutes à 20 minutes par souris avec 3 injections d'analgésique. Les jours suivant la chirurgie, les animaux recevront 6 injections d'analgésiques.
Impact sur les animaux
L’anesthésie peut provoquer chez les animaux un stress. La chirurgie peut provoquer une douleur modérée de moyenne durée. L'animal peut subir un stress lié à son hébergement individuel.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort, les greffons sont récupérés pour analyse histologique et immunohistochimique
Remplacement
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée en culture cellulaire les mécanismes physiopathologiques mis en jeu lors d’une greffe ne peuvent être répliqués en laboratoire. Par exemple, les modèles de cicatrisation in vitro sont limités par l’absence de mécanismes de coagulation, d’inflammation, de vascularisation et de réponse métabolique. Seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité de la réparation tissulaire permettant ainsi d’atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de réduire au maximum la douleur et le stress, les animaux disposent d’un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson et d’un environnement enrichi. Les animaux seront surveillés avec mise en place de points limites stricts et spécifiques au projet. La greffe sera faite sous anesthesie général avec des analgésiques adaptés.
Choix des espèces
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée impliquant des cultures de cellules et des reconstructions de substituts cutanés en 3D, les mécanismes physiopathologiques mis en jeu lors d’une greffe, de sa maturation et des processus de cicatrisation ne peuvent être répliqués en laboratoire. Nous avons donc choisit comme modèle la souris qui est un modèle connu nous garantissant des résultats homogènes et rapides. Nous avons choisit le modèle d'une souris adulte afin que les animaux aient une taille suffisante pour permettre de faire une greffe de l'organoide cutanée.