Rongeurs
Prévenir la cardiotoxicité des traitements du cancer du sein par thérapies combinées (anthracycline ou immunothérapie avec radiothérapie) en ciblant Epac1 chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Sept échographies cardiaques sous anesthésie, jusqu'à neuf injections sur animal éveillé et quinze mois de suivi après l'irradiation. 322 souris femelles sont utilisées, 266 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 50 dans des procédures modérées et 6 dans des procédures sévères, toutes tuées pour prélever cœur et poumons. Leur thorax est irradié pour reproduire le traitement d'un cancer du sein droit, avec chimiothérapie ou immunothérapie associée, afin de tester si le blocage d'une protéine protège le cœur. Les femelles ont huit mois au début de l'étude, ce que le porteur rapporte à quarante ans chez l'humain, et l'épirubicine injectée peut provoquer une nécrose de la queue au point de piqûre, traitée par pommade.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont 1) Montrer le rôle d'une protéine spécifique dans les effets négatifs des rayons X sur le cœur, en réalisant des expériences sur des souris n’exprimant pas cette protéine. Puis en testant si un agent chimique inhibant cette même protéine peut protéger le cœur contre les effets cardiotoxiques des traitements du cancer du sein, dans un modèle reproduisant les conditions d’un traitement du cancer du sein droit chez l’humain. Cet inhibiteur a déjà montré qu’il pouvait réduire les effets indésirables d’un autre traitement utilisé contre le cancer (par chimiothérapie). 2) Étudier si cette même protéine joue un rôle dans l’apparition de problèmes cardiovasculaires (comme des troubles du rythme du cœur) lorsque plusieurs traitements sont utilisés en même temps (par exemple, rayons + chimiothérapie, ou rayons + immunothérapie). L’objectif est aussi de vérifier si l’inhibiteur de cette protéine peut prévenir ces effets indésirables. Ce projet est une première étape importante avant de pouvoir envisager une utilisation médicale de cet inhibiteur comme médicament dans le traitement du cancer du sein. Les résultats obtenus aideront à mieux comprendre comment protéger le cœur lors de certains traitements contre le cancer.
Bénéfices attendus
Un dossier préclinique pour une future application médicale de cet inhibiteur spécifique de la protéine d'intéret dans le cadre du cancer du sein avec les conditions de traitements indiquées plus haut. L’ensembles de ces résultats permettront d’améliorer et actualiser les connaissances en termes de radioprotection pour les traitements des cancers du sein.
Procédures
Pour tous les animaux - Irradiation (sous anesthésie, 1 fois, durée max 15 min) - Echographies (sous anesthésie, max 7 fois, espacées de plusieurs semaines, durée max 15 min) Selon les groupes expérimentaux : - Injections sous anesthésie, max 3 fois, durée max 2 min - Injections en vigile avec contention, max 9 fois, durée max 1 min
Impact sur les animaux
Le retour d’expériences sur les précédents projets nous permet de dire qu’il n’y a pas d’effet indésirable majeur de l’irradiation localisée faible dose, ni de l’examen d’écho-doppler. L’irradiation à de faibles doses n’entraine ni douleur ni brulure pour les animaux que ce soit pendant l’irradiation ou après. Seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque ont été observée à long terme. Les irradiations, les échographies se font sous anesthésie. Les anesthésies sont répétées mais éloignées dans le temps évitant l’apparition d’effets secondaires indésirables chez les souris. Certaines injections peuvent déclencher de la nécrose à la queue au point d’injection. Si la queue commence à présenter de la nécrose notamment post injection de l’Epirubicine, nous les traiterons avec de la vétédine ainsi qu’une pommade cicatrisante. Les injections peuvent entrainer une légère douleur transitoire au moment de l’injection.
Devenir
A la fin de la procédure toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.
Remplacement
Aucune méthode de substitution (étude in vitro ou in silico) ne permet le remplacement des études in vivo qui prennent en compte la complexité et la globalité des processus physiologiques (en gardant un environnement potentiellement pro-inflammatoire et la proximité des organes interdépendants) et des mécanismes impliqués dans les pathologies étudiées. Par exemple, le remodelage vasculaire et tissulaire ne peut être évalué qu’in vivo, tout comme l’évaluation de la fonction cardiaque et vasculaire, c'est pourquoi ce projet nécessite des modèles murins.
Réduction
Sur les 266 souris prévues dans la première partie du projet, 28 seront utilisées comme groupes de comparaison pour plusieurs expériences. Le choix d’avoir 7 souris par groupe a été fait pour que les résultats soient statistiques et fiables tout en utilisant le moins d’animaux possible. Ce chiffre a été établi grâce à des calculs statistiques et à notre expérience sur ce type d’étude. Pour analyser les résultats, on comparera les groupes avec des méthodes adaptées selon le nombre de groupes testés. Ces méthodes permettent de savoir si les différences observées sont dues au hasard ou non. Les 7 souris par groupe suffisent pour voir les effets attendus sur les paramètres fonctionnels cardiaques, même si ces mesures peuvent varier d’un individu à l’autre. On a aussi pris en compte le fait que certaines souris pourraient ne pas survivre jusqu’à la fin de l’étude, car elles seront suivies pendant 15 mois après le traitement et elles auront déjà 8 mois au début de l’étude. Ce nombre permet donc de s’assurer qu’il restera assez d’animaux pour analyser les résultats.
Raffinement
Les volumes injectés sont les plus petits possibles en accord avec le poids de l’animal. Les animaux sont pesés en début de procédure et avant la chirurgie. Lors des différents protocoles, un arrêt cardiaque durant l’anesthésie sera traité par massage cardiaque. La profondeur de l'anesthésie sera vérifiée en testant l'absence de réflexe de retrait de la patte (après pincement). Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier, morceau de bois et maison en carton. En cas de bagarres, les animaux pourront être isolés. Les souris seront suivies de façon hebdomadaire. Elles seront pesées régulièrement une fois par mois. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet, permettant l’application des points limites définis.
Choix des espèces
Les précédentes études menées au sein du laboratoire ont été réalisées sur des souris femelles afin de mimer la réalité clinique pour le cancer du sein. Dans cette étude et pour nous rapprocher le plus de l’âge de développement du cancer du sein nous avons choisi des femelles âgées de 8 mois ce qui fait 40 ans à l’échelle humaine.
Etude de l’inflammation systémique en imagerie à particules magnétiques (MPI) dans un modèle de sépticémie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Le cæcum est ligaturé puis perforé chirurgicalement pour provoquer une péritonite à germes multiples, avec douleur post-opératoire, prostration, arrêt de l'alimentation, hypothermie, défaillance de plusieurs organes et risque de mort. 80 souris sont utilisées, 70 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 10 dans des procédures modérées, toutes tuées à l'issue. Elles servent de support à un agent de contraste magnétique développé au laboratoire, avec deux poses de cathéter sous anesthésie profonde et deux séances d'imagerie 24 et 72 heures après la chirurgie. Sur les mesures destinées à limiter la douleur, le porteur annonce une surveillance régulière et des "interventions adaptées", sans nommer d'analgésique, de grille de score ni de point limite.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester une nouvelle méthode d’imagerie médicale permettant de repérer très tôt les signes d’inflammation généralisée causée par une septicémie. La septicémie est une réaction inflammatoire importante de tout l’organisme en réponse à une infection grave, pouvant entraîner des complications vitales si elle n’est pas détectée rapidement. Pour cela, nous utiliserons un agent de contraste expérimental constitué de petites particules capables de se fixer sur certaines structures présentes à la surface des vaisseaux sanguins lorsqu’une inflammation apparaît. Les premiers essais ont montré que cet agent permet d’obtenir des images plus sensibles que les techniques classiques. Il est bien toléré, se dégrade naturellement et cible spécifiquement les zones où les vaisseaux sont activés par l’inflammation. Ainsi, cette approche pourrait devenir un outil précieux pour détecter précocement la septicémie et en suivre l’évolution. Dans ce projet, nous prévoyons de tester cette méthode dans un modèle murin afin d’évaluer sa capacité à identifier rapidement une inflammation généralisée.
Bénéfices attendus
Nous développons dans notre laboratoire un nouvel agent de contraste expérimental qui pourrait améliorer la manière de détecter les inflammations dans le corps. Grâce à ses propriétés magnétiques, il permet d’obtenir des images très précises avec une technologie d’imagerie innovante basée sur la détection directe de particules magnétiques. Nous pensons que cette méthode permettra d’identifier très tôt et avec une grande précision l’inflammation provoquée par la septicémie. La septicémie est une infection grave qui entraîne une réaction inflammatoire généralisée pouvant endommager plusieurs organes si elle n’est pas traitée rapidement. Aujourd’hui, il est difficile pour les médecins d’évaluer rapidement le degré d’inflammation chez un patient sepsique, ce qui complique le choix du traitement et du moment où l’administrer. Cette nouvelle approche d’imagerie pourrait permettre de connaître rapidement l’état inflammatoire d’un patient, facilitant l’adaptation du traitement à chaque situation. À terme, elle pourrait améliorer la prise en charge des personnes atteintes de septicémie et augmenter leurs chances de guérison.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : (i) Induction du modèle inflammatoire par chirurgien (ii) Pesée lors des manipulations (iii) 2 Poses d’un cathéter sous anesthésie profonde (iv) 2 Imageries MPI avec injection de produit de contraste à 24h et 72h post chirurgie.
Impact sur les animaux
Le modèle de septicémie par ligature et ponction cæcale (CLP) peut induire plusieurs effets indésirables sur les animaux. Cette intervention chirurgicale provoque une péritonite polymicrobienne entraînant une réponse inflammatoire systémique importante, qui peut se traduire par de la douleur post-opératoire, de la prostration, une diminution de l’activité spontanée dans la cage, un arrêt ou une réduction de la prise alimentaire et hydrique, ainsi qu’une perte de poids. Dans certains cas, une hypothermie, une déshydratation ou une défaillance multiviscérale peuvent survenir, et le modèle présente un risque de mortalité qui doit être étroitement surveillé. Lors du protocole d’imagerie MPI, celui-ci se déroulera sous anesthésie générale des animaux. La pose du cathéter veineux pour l’administration de l’agent de contraste peut provoquer localement un hématome ou une gêne transitoire.
Devenir
Tous les animaux de cet étude sont mis à mort à l’issue des 2 procédures. Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures en raison de la sévérité du modèle de septicémie induite par CLP, incompatible avec le maintien en vie ou la réutilisation des animaux. La mise à mort est également nécessaire à la réalisation des analyses terminales (perfusion intracardiaque et prélèvements tissulaires) indispensables à la validation des données expérimentales.
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisés avec notre agent de contraste en imagerie à particules magnétiques (utilisation de « fantômes ») et ont permis de montrer que les propriétés magnétiques des microparticules conféraient un signal spécifique en imagerie à particules magnétiques (MPI). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d’estimer l’affinité de notre agent de contraste pour les molécules d’adhésion endothéliales exprimées en conditions inflammatoires ainsi que les temps de ciblage et sa détectabilité de notre agent de contraste en imagerie MPI lorsqu’il est dans un organisme.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures qui avaient employé des protocoles d’imagerie similaires pour évaluer l’inflammation dans d’autres tissus à l’aide de microparticules magnétiques. Ces études ont montré que 5 animaux par groupe permettaient déjà de mettre en évidence une différence significative de signal. Afin de renforcer la robustesse statistique de nos résultats, nous avons retenu un effectif de 10 animaux par groupe.
Raffinement
Des mesures spécifiques seront mises en place tout au long du projet afin de limiter la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière de leur état général, et des interventions adaptées seront réalisées si nécessaire afin de préserver leur bien-être. Lorsque l’état de santé d’un animal se détériore de manière incompatible avec la poursuite de l’étude, des mesures appropriées seront appliquées conformément à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation cérébrale et les caractéristiques de la pathologie sont donc bien connus. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l'inflammation. Le stade de développement des animaux est de 8 à 10 semaines soit un poids de 35-40g. Nous effectuons donc notre modèle sur des jeunes adultes.
Caractérisation des déterminants physiologiques de la circulation intra-parenchymateuse du liquide cérébro-spinal et influence des agents anesthésiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une prothèse posée sur le crâne, une canule enfoncée dans la citerne cérébrale, un cathéter artériel: jusqu'à quatre chirurgies par animal, toutes sous anesthésie générale. 190 souris Swiss sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour une étude histologique du cerveau. Il s'agit de mesurer l'effet de différents anesthésiques sur la circulation du liquide cérébro-spinal, avec des séances d'IRM sur animal éveillé après six jours d'habituation au bruit de l'appareil, bouchons d'oreilles compris, et jusqu'à dix jours d'isolement en cage individuelle pour protéger la prothèse. Le porteur indique que ces implants interdisent toute réutilisation comme toute adoption, et que 148 animaux suffiraient sans échec de procédure, les 42 autres couvrant un taux d'échec estimé à 10 %.
Objectifs
L'hypothèse de travail de ce projet est que les agents anesthésiques ont une influence sur le fonctionnement du glymphatique et que cet effet est dépendant de l'agent hypnotique utilisé et/ou de ces conséquences pharmacodynamiques. Dans ce projet, nous avons pour objectif de déterminer et de quantifier l'effet sur la circulation intra-cérébrale du liquide cérébro-spinal (LCS) de différents agents anesthésiques ayant tous un pouvoir hypnotique mais dont le mode d'action et les cibles cérébrales sont différentes.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus sont un effet non univoque de l'anesthésie générale sur la circulation intra-cérébrale du LCS dépendant de l'agent anesthésique utilisé et de ses conséquences physiologiques. Cet effet étant, selon nous, très dépendant de ces mêmes conséquences pharmacodynamiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont: - sur le plan pré-clinique: une meilleure connaissance des mécanismes influençants la circulation intra-cérébrale du liquide cérébro-spinale. Cette approche fondamentale est essentielle au développement d'hypothèses physiopathologiques qui permettraient le développement d'éventuelles propositions de prévention ou de thérapeutiques. - sur le plan clinique: cette approche pharmacodynamique des agents anesthésiques est inedite et originale. In fine, nos conclusions pourraient jouer un rôle en pratiques cliniques avec la determination de protocoles d'anesthésies dont les agents anesthésiques choisis seraient les moins à risque d'aggraver le pronostic de patients dont le système dit glymphatique semble déjà compromis, comme dans l'hémorragie méningée ou la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Procédures chirurgicales: maximum 4 procédures par animal, toutes réalisées sous anesthésie générale, durée moyenne d'une procédure: 15min. Les procédures: mise en place d'une prothèse crânienne, mise en place d'une canule intra-cisternale, mise en place d'une voie veineuse périphérique, mise en place d'un catheter de pression artérielle invasive (groupe contrôle). Procédure vigile: imagerie vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux sont exposés au risque de douleur en lien avec les procédures chirurgicales, au risque de stress lié aux manipulations et aux examens réalisés en vigile. Ce protocole considère ces risques et prévoit les prises en charge à réaliser en fonction des situations possibles.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à l'issu des procédures en raison d'une étude histologique cérébrale prévue. Tous les animaux de ce projet vont subir des procédures de classe sévère avec notamment la mise en place d'une prothèse crânienne et d'une canule intra-cisternale n'autorisant ni à les réutiliser ni à les replacer ni à les proposer à l'adoption.
Remplacement
Ce projet n'est à l'heure actuelle pas remplaçable par un autre modèle expériemental que l'animal. La complexité des mécanismes sous-tendant la physiologie cérébrale ne peuvent être reproduit par un modèle informatique ni par un modèle in vitro. Le caractère expérimental et invasif rend impossible ce projet sur volontaire humain. La souris est par ailleurs l’animal indiqué pour cette expérimentation. C’est chez cette espèce que l’existence du système glymphatique a été montrée et que son fonctionnement a été le plus étudié. La physiologie cérébrale est également parfaitement connue chez cette espèce et comparable à celle du cerveau humain dans ces grands principes. Enfin, la méthodologie expérimentale requise par ce projet est également parfaitement décrite dans la littérature pour le modèle murin.
Réduction
Ce projet nécessite 190 souris. Des tests statistiques entre les groupes groupes seront réalisés afin de déterminer si les différences observées sont significatives. Nous avons calculé ce nombre de sujet nécessaire qui permettrait l’obtention de résultats significatifs à partir de nos données locales, en y ajoutant des pertes estimées de 10% (échec de la procédure) et en tenant compte du principe de réduction du nombre d'animaux. Il s’agit donc du nombre maximum d’animaux prévus pour ce projet ; en l’absence d’échec le nombre minimum est de 148 animaux.
Raffinement
Ce protocole a été pensé et organisé afin d’optimiser l’expérimentation sans minimiser nos chances d’obtenir des résultats significatifs. Les principes éthiques et les standards de raffinement y sont respectés de la naissance à la mort de l’animal : le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel formé. Ils seront hébergés dans des locaux agréés où température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux) et durée du cycle de lumière inversé (12h/12h) sont maitrisées. La réalisation des procédures sera réalisée durant la phase d'activité physiologique de l'animal. L'alimentation et l'eau seront fournies ad libidum. Le raffinement de nos procédure sera assuré par un souci constant du confort et de l’analgésie des animaux, notamment : l’hébergement de tous les animaux dans des cages standards aux normes européennes. L’habituation à la manipulation sera engagée précocement afin de réduire le stress lié au contact avec l’homme avant le début du protocole. Une anesthésie est réalisée lors de la pose de la prothèse. Une analgésie efficace sera garantie avec le recours à un antalgique morphinique de durée d’action longue associé à un antalgique non morphinique, le paracétamol, et à des mesures non pharmacologiques telles qu’un environnement enrichi avec de la ouate en post-opératoire. L’hébergement post-opératoire sera réalisé en cage individuelle après la pose de la prothèse crânienne afin de prévenir tout risque d’arrachement du matériel en lien avec une bagarre entre animaux. Cet hébergement isolé sera enrichi et d’une durée la plus réduite possible avant la procédure (10 jours maximum) afin de prévenir le stress chez un animal isolé. L’accès à l’eau et à la nourriture sera adapté au besoin (croquette dans une coupelle humide). Les souris, préalablement habituées à la manipulation, seront habituées à la contention et au bruit de l’IRM durant 6 jours avec des durées croissantes (de 10 minutes à 60 minutes) afin de diminuer leur stress lié à l’expérimentation. Des bouchons d’oreilles seront placés afin de limiter le bruit de l’appareil. Ajouté à ces précautionsont été défini des points limites adaptés à chaque étape de notre protocole avec une escalade des prises en charge aboutissant à la mise à mort de l’animal en cas de détresse ou souffrance ne pouvant être soulagée dans des délais brefs.
Choix des espèces
La souris Swiss est le meilleur compromis entre remplacement et pertinence. Sans reprendre les agruments avancés plus haut, ses caractéristiques physiologiques et anatomiques parfaitement connues, son poids et sa taille classiquement supérieurs à ceux d'autre souche, la facilité d'un abord vasculaire et trachéal et son hétérogénéité génétique en fond un candidat de choix pour ce projet. Les expériences seront réalisées chez des animaux de 8 semaines, ce qui correspond à un stade jeune adulte, âge auquel le système glymphatique est considéré mature et pleinement efficient. Ils seront commandés à 6 semaines pour anticiper les étapes d'habituation à la manipulation et à la contention.
Etude de l’implication des voies de régulation immunitaire de l’hépatite auto-immune dans un modèle murin préclinique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections destinées à faire exprimer un auto-antigène dans le foie, une vaccination dans les deux pattes arrière qui gonfle le muscle pendant douze à vingt-quatre heures, cinq injections en deux semaines sur animal éveillé et deux prélèvements de sang sous anesthésie. Le modèle actuel ne produit qu'une hépatite minime qui se résorbe vite, loin de la maladie humaine, et l'équipe veut donc invalider dans les cellules du foie les gènes de molécules immunitaires inhibitrices pour obtenir une auto-immunité qui dure. Foie, rate et sang sont prélevés après la mise à mort, le porteur affirmant qu'aucun système de remplacement pertinent n'existe et que les biopsies humaines sont rares et de petite taille.
Objectifs
L’hépatite auto-immune est une pathologie dont les causes restent méconnues. L’ L’hépatite auto-immune est caractérisée par une attaque immunitaire du foie conduisant à des niveaux élevés des enzymes hépatiques et des anticorps notamment des auto-antigènes. Les patients répondent pour la plupart bien aux traitements immunosuppresseurs non spécifiques; Toutefois, ces traitements à long terme ne sont pas sans effets délétères. Les cellules immunitaires sont classiquement considérées comme responsables des lésions hépatiques, mais les mécanismes cellulaires, notamment les antigène-spécifiques impliqués restent largement incompris. Notre équipe a mis en place des modèles murins ressemblant à l’hépatite auto-immune qui permettent d’étudier le rôle des cellules immunitaires spécifiques d’un antigène exprimé dans le foie. De nombreux outils sont disponibles pour l’expression et l’étude de cet antigène, permettant ainsi de suivre les réponses immunitaires spécifiques associée à l’antigène après expression de celui-ci dans le foie. Avec ce système, notre équipe a pu montrer que l’expression de l’antigène dans le foie des souris est tolérée et n’induit pas de réponse spécifique contre celui-ci, de plus que l’accumulation de cellules immunitaires dans le foie des souris dépend d’une immunisation préalable contre l’antigène et l’expression de celui-ci au niveau du foie. Nous avons également montré que les cellules immunitaires spécifiques de l’antigène ressemblaient aux cellules immunitaires auto-réactives chez les patients et que le blocage transitoire des molécules immunitaires inhibitrices perturbe le contrôle de cette réponse . Cependant, l’hépatite induite est peu détectable/minime et se résorbe rapidement ce qui diffère de la maladie chez l’homme. Notre hypothèse est que l’évolution chronique d’une auto-immunité dans le foie dépend d’une dérégulation de ces voies immunitaires inhibitrices sur le long terme. Dans cette mesure, nous souhaitons invalider, spécifiquement dans les hépatocytes, les gènes codant pour ces molécules inhibitrices et évaluer leur impact à court et long terme, ce qui permettrait une compréhension des mécanismes impliquées dans la maladie chez l’humain.
Bénéfices attendus
Nos travaux permettront de mettre en évidence comment l’environnement hépatique joue un rôle dans les réponses inflammatoires locales contre un auto-antigène hépatique, en identifiant des voies de signalisations essentielles au contrôle de ces réponses sur le long terme. Les résultats de nos travaux devraient apporter de nouvelles pistes thérapeutiques plus spécifiques contre la pathologie.
Procédures
Les animaux subiront plusieurs actes en fonction du protocole appliqué. Acte 1 : Les animaux recevront, des injections (durée de l’acte : 1 minute, animal anesthésié et analgésié localement). Cette injection sera réalisée dans tous les groupes une fois et un seul groupe recevra 3 injections supplémentaires une semaine après (1 jour d’intervalle/injection). Acte 2 : Les animaux recevront 5 injections (durée : 30 secondes, animal vigile), à 2 ou 3 jours d’intervalle. Acte 3 : Prélèvement sanguin (durée : 2 minutes, animal anesthésié et analgésié localement) une première fois durant le protocole et une dernière fois en fin de protocole.Acte 4 : Les animaux recevront, 1 injection / patte soit deux injections par souris (1 minute, animal anesthésié).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront des gestes plus ou moins douloureux au cours des différentes procédures. Une procédure d’injection répétée cinq fois en deux semaines pourra entrainer un inconfort local et transitoire au moment de l’injection dû au passage de l’aiguille dans la peau qui s’estompera 5 min après la procédure. . La vaccination des souris sera réalisée au niveau des deux pattes arrière qui entrainera un étirement local du muscle. Cette gêne temporaire associée à un gonflement du muscle durera entre 12h et 24h. La gêne disparait généralement 24h post injection. Lors des prélèvements sanguins un inconfort durant ces gestes est estimé à 1min correspondant au temps nécessaire à la réalisation du prélèvement. L’animal pourra également ressentir pendant 30 secondes une gêne lors de la réalisation du geste de compression pour arrêter le saignement éventuel post prélèvement. Les prélèvements et injections sont réalisées sous anesthésie gazeuse pouvant entrainer une phase de stress pour l’animal pendant environ 30 secondes avant la phase d’endormissement . De plus la phase de réveil avec le reprise de conscience sera également un facteur de stress qui durera environ 1min pour l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de récupérer différents tissus (sang, foie et rate) indispensables pour mener diverses analyses d’histologie, de biologie cellulaire, de biologie moléculaire, de biochimie et d’immunologie.
Remplacement
Dans ce projet, nous interrogeons les voies de régulations de l’auto-immunité dans le foie. Cet aspect ne peut être étudié chez le patient humain car le diagnostic de l’hépatite auto-immune est très tardif et les échantillons (biopsies) sont rares et de petites tailles. Par ailleurs, l’étude des mécanismes immunologiques dictant le développement de la pathologie n’est pas réalisable à l’échelle cellulaire et, à nos connaissances, il n’existe pas de système pertinent de remplacement. Ainsi, dans notre projet l’étude in vivo chez l’animal est indispensable car cela permet d’avoir accès à des échantillons de l’organe cible de la pathologie, le foie. Cela permet d’une part de mesurer les dommages hépatiques et d’autre part d’étudier l’environnement immunologique dans l’organe.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet 1536 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Pour cela, le calcul des effectifs a été réalisée par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Durant le projet, une réduction du nombre d’animaux pourra être envisagée en fonction des résultats expérimentaux obtenus. Nous pourrons être amenés à manipuler moins d’animaux si l’effet de certains composés s’avère significatif au cours des premières expériences. A l’inverse, si l’effet d’un composé rejette l’hypothèse émise dès les premières expériences, le composé sera exclu des prochaines expérimentations afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Dans le but d’extraire le maximum de données de chaque animal, plusieurs tissues seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire).
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les utilisateurs passeront régulièrement du temps avec les animaux avant les procédures et en dehors des jours d’expérimentation pour limiter leur stress et les habituer à être manipulés. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toute manipulation, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse et d’une analgésie locale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un symptôme réversible sera signalé, l’animal recevra les soins nécessaires. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
L’étude chez l’animal étant indispensable dans notre projet, nous travaillerons avec la souris (Mus musculus) qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. A nos connaissances, il n’existe pas de modèle pertinent pour étudier le développement de l’auto-immunité dans le foie utilisant une autre espèce animale. De plus, le modèle murin utilisé au cours de ce projet, et développé au sein du laboratoire, a déjà démontré sa pertinence pour étudier une réponse spécifique d’un antigène hépatique. Nous travaillerons avec des souris adultes de 8 à 12 semaines, car la croissance hépatique est achevée et le système immunitaire mature. A des âges plus avancés le système immunitaire ainsi que la capacité de prolifération du tissu hépatique peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité au cours des expérimentations.
(MODIFICATION) Etudes d’efficacité d’un médicament vétérinaire par suivi de la réponse immune : évaluation chez des espèces alternatives (MODIFICATION 2)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Cochons d'Inde : 300
Hamsters dorés : 50
Utiliser des rongeurs comme substituts du chien, du chat et du cheval pour mesurer la réponse immunitaire à un vaccin vétérinaire, et produire chez la souris des anticorps monoclonaux ou du sérum servant de réactifs de laboratoire. 300 cobayes, 250 souris et 50 hamsters dorés sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, tous tués en fin d'étude après un prélèvement de sang terminal. Cette version du projet relève l'effectif de souris à 250 pour un nouveau vaccin à tester. Le porteur affirme que le nombre minimal d'animaux est "très souvent une exigence réglementaire" et présente le recours aux rongeurs plutôt qu'aux carnivores domestiques et aux équidés comme une application des 3R.
Objectifs
Dans le cadre du développement d’un nouveau vaccin à tester, le nombre de souris doit être augmenté à 250 individus. Le projet consiste à immuniser des rongeurs (espèces modèles) avec un vaccin dans le but de : - Evaluer l’efficacité d’un vaccin par suivi de la réponse immune chez l’animal. - Produire, chez la souris, des anticorps monoclonaux ou du sérum polyclonal en tant que réactifs de laboratoire
Bénéfices attendus
Les études d’efficacité permettent de connaitre le niveau de réponse immunitaire induit par le vaccin chez l’animal grâce à des paramètres évalués par des analyses de laboratoires.
Procédures
Après l’administration du produit selon les recommandations établies, les paramètres cliniques (état général, poids, température…) et la réponse immune sont suivis (prélèvements sanguins). En fonction de la bibliographie et des connaissances acquises sur les produits, les conditions d’administration du produit (site et voie d’administration, doses, nombre d’injection, et intervalle entre les injections) sont optimisées. Ces études sont encadrées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de guidelines (dont VICH, EMEA) et d’autres exigences spécifiques à chaque pays. La finalité de ce projet est de mettre sur le marché des médicaments vétérinaires présentant un risque minimal et de permettre aux propriétaires de disposer des meilleurs traitements pour leurs animaux tout en réduisant l’impact des maladies infectieuses sur les populations. La durée des études peut aller jusqu’à 5 mois et dépend de l’objectif de l’étude, du type de produit étudié et de l’avancement du projet (étapes de recherche amont ou développement).
Impact sur les animaux
La contention peut être une contrainte pour l'animal. Celle-ci doit être adaptée pour que la technique soit la plus rapide et moins douloureuse et traumatisante possible. L’administration du produit et les prélèvements sanguins peuvent occasionner un stress et une douleur légère de quelques minutes
Devenir
Les animaux font l’objet d’un prélèvement sanguin terminal et sont euthanasiés en fin d’étude. Dans des cas exceptionnels, pendant l’étude, si l’animal atteint les points limites, il est euthanasié.
Remplacement
Il est nécessaire d’utiliser des animaux vivants car l’efficacité par suivie de la réponse immune doit être évaluée sur l’animal. De même, la production de sérum polyclonal ou d’anticorps monoclonaux nécessitent l’utilisation de l’animal. Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un produit consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux à inclure est très souvent une exigence réglementaire. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (analyse statistique, historique, définition des objectifs…) de façon à minimiser le nombre d’animaux utilisés en limitant le risque d’études non conclusives.
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Une anesthésie de l’animal est réalisée lors de certains prélèvements. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux.
Choix des espèces
Ces études sur rongeurs sont des modèles alternatifs pour les études sur chien, chat et cheval. Les chiffres sont donc basés sur l’expérience (études antérieures et bibliographie) et les référentiels du modèle canin, félin et équin. Cette utilisation s’applique dans le cadre des 3R afin d’utiliser les espèces les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l’angoisse ou de subir des dommages durables en préservant l’objectif scientifique et la qualité du résultat. D’autant que l’efficacité d’un produit par suivi de la réponse immune ne peut pas être testées in vitro. La production de sérum polyclonal ou d’anticorps monoclonaux chez la souris est un modèle de référence largement reconnu dans la bibliographie. Les procédures utilisant des rongeurs sont réalisées après le sevrage (dès 21 jours). Les caractéristiques de ces animaux sont bien connues à cet âge ; il s’agit de l’âge qui offre une meilleure sensibilité pour le modèle. Ces animaux sont communément utilisés à cet âge (bibliographie, données fournisseurs agréés).
Rôle de l’hyperglycémie et des additifs alimentaires dans le développement de l’athérosclérose chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Jusqu'à vingt-quatre gavages, sept injections dans l'abdomen et dix-sept prélèvements de sang à la queue par animal, plus un prélèvement dans l'orbite de l'œil sous anesthésie. 1 929 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier comment une glycémie élevée et des additifs alimentaires favorisent l'athérosclérose en passant par le microbiote intestinal. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, le maximum de tissus étant prélevé sur chacune. Le porteur n'annonce, comme effets pour les animaux, qu'un stress et une douleur légère de courte durée liés aux injections, aux administrations orales et à l'anesthésie gazeuse.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires, comme l’infarctus ou l’AVC, sont la première cause de mortalité dans les pays développés. L’athérosclérose, à l’origine de ces événements, est liée à une inflammation des artères. Ce projet vise à mieux comprendre comment certains facteurs — comme une glycémie élevée ou des additifs alimentaires— favorisent cette inflammation via l’intestin et le microbiote. Nous étudierons notamment le rôle de deux gènes intestinaux dans ce processus. Grâce à des modèles de souris et à des transferts de microbiote, nous chercherons à identifier de nouvelles pistes de prévention ou de traitement des maladies cardiovasculaires.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à comprendre comment certains facteurs de notre mode de vie, comme un excès de sucre dans le sang ou la consommation d’aliments ultra-transformés contenant des additifs alimentaires, peuvent perturber notre microbiote intestinal et favoriser l’apparition de maladies cardiovasculaires comme l’athérosclérose. En étudiant deux acteurs clés de l’intestin, nous explorerons les liens entre alimentation, inflammation et santé du cœur. Ces recherches pourraient permettre de développer, à terme, de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter ces maladies en ciblant le microbiote intestinal.
Procédures
- Prélèvement de sang à la queue pour suivie de glycémie sur souris vigile : 9 prélèvements maximum pour les protocoles de 9 semaines et 17 prélèvements maximums pour les protocoles de 16 semaines. Le prélèvement prend moins de 30 secondes par animal. - Test de tolérance au glucose : gavage 1 fois/15 secondes ; individualisation durant environ 2h ; analgésie locale 1 fois ; 10 prélèvements maximum de sang à la queue, quelques secondes - Test de sensibilité à l’insuline : injection intrapéritonéale 1 fois/10 secondes ; individualisation durant environ 90min ; analgésie locale 1 fois ; 9 prélèvements maximum de sang à la queue. - Test FITC-dextran : gavage 1 fois/15 secondes ; prélèvement sanguin rétro-orbital sous anesthésie gazeuse et analgésique locale 1 fois, quelques secondes. - Injection intrapéritonéales sur animaux vigiles : 7 injections maximum/souris. Une injection prend moins de 10 secondes. - Gavages par voie orale (procédure 5) sur animaux vigiles : 24 gavages maximum/souris. Les gavages prennent moins de 15 secondes par animal. - Administration d’un mélange d’antibiotiques dans l’eau de boisson durant 5 jours.
Impact sur les animaux
Les injections peuvent causer un stress et une douleur légère de courte durée. Les administrations orales peuvent causer une douleur légère et un stress de courte durée. L’anesthésie gazeuse peut induire un stress de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour analyses des tissus.
Remplacement
Les modèles de souris sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes impliqués dans l'athérosclérose. En effet, actuellement il n'y a pas de systèmes en culture cellulaire qui reproduisent, imitent ou permettent la modélisation des interactions cellulaires et moléculaires qui conduisent au développement de l’athérosclérose. L’expérimentation in vivo est également le seul modèle permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans une même pathologie.
Réduction
Les effectifs sont déterminés à partir des données de la littérature et avec des tests statistiques adaptés. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation d’anesthésie adaptée durant les procédures. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et de points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L'atteinte d'un point limite qui ne pourra pas être soulagé entrainera une mise à mort anticipée de l'animal avant la fin du protocole.
Choix des espèces
L’utilisation des animaux est nécessaire car il n’existe pas, à ce jour, de modèles d’athérosclérose en culture cellulaire permettant de reproduire la physiopathologie de la maladie. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre la souris et l’humain, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation des résultats. Seules des souris adultes de plus de 8 semaines seront utilisées pour ces études pour rester cohérents avec les conditions cliniques, l’athérosclérose étant une maladie touchant les adultes chez l’humain.
Evaluation de l’expression de transgènes issus de vecteurs herpétiques non réplicatifs et de leur distribution chez la souris immunocompétente en vue de développer des outils de médecine génomique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Injection d'un vecteur viral dérivé de l'herpès dans le coussinet plantaire sous anesthésie gazeuse, anti-inflammatoire et antalgique le jour même puis le lendemain, gêne pour se déplacer pendant les deux heures qui suivent. 239 souris immunocompétentes sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Sur les études d'un an, chaque animal reçoit dix-sept administrations de luciférine suivies d'autant de séances d'imagerie sous anesthésie, que le porteur qualifie de non invasives et indolores, plus jusqu'à quatorze prélèvements de sang. Toutes sont tuées à l'issue pour quantifier l'expression du transgène dans les ganglions de la racine dorsale, la moelle épinière, le coussinet plantaire et le foie.
Objectifs
Le système nerveux périphérique fonctionne comme un réseau reliant le cerveau et la moelle épinière aux muscles, organes et tissus. Il contrôle les mouvements, les sensations (comme la chaleur ou le froid) et les réactions aux stimuli externes. Les troubles de ce système peuvent entraîner des altérations sensitives et motrices, responsables de pathologies telles des polyneuropathies, des douleurs chroniques, ainsi que des dysfonctionnements organiques comme la vessie neurogène, des troubles gastro-intestinaux (constipation ou diarrhée), des anomalies cardiovasculaires (hypotension orthostatique) ou des perturbations de la sudation. Une approche thérapeutique innovante consiste à utiliser des vecteurs viraux dérivés de l’herpès, modifiés pour être non pathogènes et non réplicatifs. Ces vecteurs modifiés exploitent la capacité naturelle du virus à remonter le long des nerfs, permettant une administration localisée au niveau des zones affectées. Ils sont conçus pour délivrer des gènes spécifiques aux neurones périphériques, notamment ceux situés dans les ganglions dorsaux, centres majeurs de ce réseau. Le projet vise à établir un modèle murin permettant d’analyser la distribution et l’expression d’un transgène transporté par ces vecteurs dans différents organes et sur des périodes prolongées. Pour suivre la localisation et l’efficacité des vecteurs, ceux-ci exprimeront un gène produisant une enzyme générant de la bioluminescence, détectable par imagerie non invasive chez la souris simplement anesthésiée. Cette méthode permettra de visualiser la présence et l’activité des vecteurs sans recourir à des techniques invasives. Ce projet inclut également l’évaluation de versions optimisées des vecteurs ainsi que la corrélation entre la bioluminescence et des marqueurs potentiellement détectables dans le sang. Si cette corrélation est confirmée, le suivi pourra être réalisé par prélèvements sanguins sans nécessiter de bioluminescence dans des projets ultérieurs.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de développer un modèle chez la souris permettant de suivre et d’analyser la pharmacocinétique des vecteurs viraux tout au long de la vie d’un même animal, en ciblant les neurones sensoriels ainsi que certains organes d’intérêt. Ce modèle vise à fournir des données essentielles pour comprendre la distribution, la durée d’action et l’efficacité de ces vecteurs en vue de futurs développements chez l'homme comme approche de thérapie génique contre des pathologies touchant le système nerveux périphérique. À court terme, le projet poursuit deux objectifs majeurs. Le premier consiste à définir les conditions optimales d’administration des vecteurs viraux afin d’obtenir une expression efficace et stable du transgène dans les organes cibles. Le second vise à évaluer l’impact de différents sites et modalités d’injection. Cette comparaison permettra de mieux comprendre le transport rétrograde des vecteurs, leur biodistribution dans les organes cibles tels que les ganglions dorsaux et la moelle épinière, ainsi que dans des organes non-cibles comme le foie. À long terme, ce modèle offrira la possibilité de prédire la durée d’action des traitements basés sur ces vecteurs viraux chez l’humain. Une meilleure compréhension de la pharmacocinétique et de la distribution des vecteurs tout au long de la vie d’un animal constituera ainsi un atout majeur pour le développement de thérapies géniques ciblées, plus efficaces et plus sûres chez l’homme Le projet donne l’opportunité d’évaluer l’activité des vecteurs par la mesure de biomarqueurs circulants en remplacement de la bioluminescence. Si cette approche s’avère concluante, ces analyses contribueront également à réduire le nombre d’animaux utilisés. Il permettra enfin l’identification de nouvelles cibles biologiques et d’ouvrir la voie à des indications supplémentaires pour lesquelles ces vecteurs pourraient être utilisés comme produits thérapeutiques, notamment dans le traitement de maladies chroniques.
Procédures
Administration de vecteur viraux dans le coussinet plantaire (unique ou double à 24h d’intervalle) ou dans le muscle de la patte (deux administrations contemporaines), chaque administration dure environ 30s sous anesthésie générale gazeuse. Administration d’anti-inflammatoire et d’antalgique en couverture de la ou des deux administrations de vecteur (20 minutes pré-administration, en fin de journée post-administration, suivies de deux administrations d’anti-inflammatoire le lendemain de l’injection) (contention de 30s et injection d’environ 10s). Administrations de luciférine (agent nécessaire à l’imagerie par bioluminescence) chez les souris vigiles, préalables aux imageries par bioluminescence (imagerie d’une durée de 20 min maximum par session réalisée sous anesthésie à l’isoflurane) : 7 fois sur la durée d’une étude de 28 jours et 17 fois sur une étude de longue durée (1 an). Prélèvements de sang chez la souris vigile avec contention d’une durée maximale de 2 min (moins de 30s) au maximum 14 fois (pour une étude d’une durée d’1 an) et dans le respect des volémies physiologiques et délais de récupérations.
Impact sur les animaux
− l’administration du vecteur viral (une ou deux fois maximum) sous anesthésie générale peut générer du stress et une douleur légère au réveil. − des prélèvements de sang au niveau de la veine marginale de la patte peuvent générer du stress et une douleur légère de courte durée. − des signes cliniques modérés observables associés à l’injection des virus (gène transitoire (moins de 2h) pour se mouvoir occasionnée par la localisation de l’injection dans le coussinet plantaire, inflammation potentielle autour du site d’injection (moins de 2h). - selon la voie d’administration du vecteur viral, les injections d’anti-inflammatoire et antalgique en aval et en couverture peuvent également générer du stress et une douleur légère. - stress et douleur légère liés aux mesures pour l’évaluation de la localisation des vecteurs viraux par de l’imagerie (répétées 7 fois pendant les études de 28 jours et 17 fois pendant les études de 1 an selon les procédures) et incluant l’administration de l’agent de bioluminescence préalable à chaque mesure - et l’anesthésie gazeuse d’une durée de 20 min maximum.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue des études puisqu’il est nécessaire d’évaluer et de quantifier l’expression des vecteurs viraux dans les organes cibles comme les ganglions dorsaux, la moelle épinière, le coussinet plantaire et le foie. Des prélèvements d’organes d’intérêt et de sang seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, transcriptomique ou protéomique…).
Remplacement
Les méthodes in vitro ou in silico actuelles ne permettent pas de vérifier la migration des vecteurs viraux sur de longues distances dans les nerfs (plusieurs centimètres) ni de localiser précisément les vecteurs. En injectant le vecteur dans la patte de la souris, on peut suivre son trajet des terminaisons nerveuses localisées dans le site d’injection jusqu'aux noyaux de ces neurones localisés dans les ganglions de la racine dorsale (appelé transport rétrograde). Avant de tester sur les souris, des essais ont été faits en laboratoire sur des modèles de culture cellulaire. Les résultats en laboratoire sur des modèles de culture cellulaire ont montré des résultats encourageants mais il est maintenant indispensable de poursuivre ces recherches en utilisant un organisme complexe et entier pour pouvoir évaluer le transport rétrograde de ces vecteurs d’un organe donné jusqu’à un autre localisé à plusieurs centimètres de distance, ce qui est impossible dans les modèles in vitro car aucun dispositif in vitro ne mime à ce jour ce type de modèle.
Réduction
Un vecteur rapporteur utilisant la bioluminescence permet de suivre l'expression d'un gène d'intérêt qui lui est intégré. La création d'un modèle avec vecteur rapporteur facilite la vérification de la localisation de l'expression du transgène dans des organes cibles, comme les ganglions dorsaux, grâce à des techniques d'imagerie non invasive. Cela évite l'euthanasie des souris pour des mesures post-mortem à différents temps, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Cette méthode permet d'analyser la distribution et la pharmacocinétique sur une période prolongée chez un même animal, ce qui améliore la compréhension de la présence et de l'expression du transgène dérivé de vecteurs au fil du temps. À la fin de l'étude, tous les organes pertinents et des échantillons de sang sont collectés pour des analyses in vitro des gènes ou protéines cibles, optimisant ainsi les études et diminuant l’utilisation de souris supplémentaires pour obtenir des échantillons. Des études préliminaires sur des modèles animaux ont validé les conditions expérimentales, y compris les doses et les voies d'administration, nécessaires pour atteindre les objectifs du projet. La taille des groupes expérimentaux a été déterminée au strict minimum en fonction de ces données, pour permettre une analyse correcte des données d’étude, fixant le nombre final à huit souris par groupe traité et une souris par groupe témoin. Le nombre de souris par groupe pourra être réévalué au cours du projet si la variabilité observée est faible grâce aux conditions expérimentales établies. Les temps de cinétique pour l'euthanasie des groupes de souris, afin de corréler les données in vivo de bioluminescence et/ou de biomarqueurs sanguins avec les données ex vivo des organes cibles, ont été définis au minimum pour obtenir des données exploitables, contribuant à réduire le nombre d'animaux nécessaires. L'imagerie constitue une méthode non invasive et indolore, permettant un suivi régulier et longitudinal d'un même animal tout au long de l'étude. Un des objectifs de ce projet est de diminuer le nombre d'animaux requis pour les études futures en explorant la possibilité de suivre l'expression du vecteur viral sur de longues périodes uniquement par bioluminescence et/ou détection de l'activité du vecteur dans le sang, sans nécessiter l'euthanasie à différents temps pour des évaluations post-mortem.
Raffinement
La procédure d’injection dans le coussinet plantaire est réalisée selon les bonnes pratiques sous anesthésie générale gazeuse et sous couverture anti-inflammatoire et antalgique, avec un maintien de la température corporelle dès l’anesthésie jusqu’au réveil total de la souris. Une vigilance sera apportée sur la reprise de la marche et l’absence de signes de douleur pour l’animal post injection (suivi d’une potentielle gène). Des études en amont de ce projet déjà réalisées chez l’animal ont permis de confirmer l’absence de toxicité ou effets adverses liés à l’injection de ces virus. Les animaux font l’objet d’une observation clinique spécifiquement en post injection sur une durée de 24h puis tout au long des études, par les expérimentateurs et par les zootechniciens, pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. Le suivi de la localisation de l’expression du transgène à partir des vecteurs herpétiques non-réplicatifs par l’imagerie sous anesthésie gazeuse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur qui permet de suivre un même animal tout au long de l’étude. Pour la seconde partie du projet, des prélèvements sanguins de petit volume vont être réalisés pour obtenir des informations supplémentaires, comme le profil d'exposition plasmatique et l’analyse de l’expression du vecteur rapporteur dans le sang. La validation de cette opportunité de mesure du vecteur rapporteur dans le sang permettra d’émettre l’hypothèse d’une expression du vecteur dans les organes cibles. Dans ce contexte, cela permettra de raffiner la procédure expérimentale en ne nécessitant plus le recours à des anesthésies répétées (une fois par mois/1 an) pour les études de longue durée.
Choix des espèces
Dans le cadre du projet, les souris seront utilisées. Il est crucial d'évaluer la pharmacocinétique du vecteur chez un animal doté d'un système immunitaire compétent. Le choix de cette espèce est basé sur des études antérieures qui ont permis de comprendre la biodistribution de premières générations du vecteur chez la souris immunocompétente et d’établir une transposabilité avec l’homme. En effet, tout comme chez l’homme, le système immunitaire de la souris permet le même comportement du vecteur dans l’organisme, incluant l’entrée en latence du vecteur et l’expression du transgène qu’il comporte. Dans le modèle murin, les mécanismes de transport rétrograde du vecteur viral sont conservés. Il est nécessaire de continuer à approfondir les connaissances sur cette même espèce et souche immunocompétente. Ainsi, dans le cadre de ce projet la souris constitue un modèle prédictif de l’homme. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 8 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans ce cas. L’innervation du coussinet plantaire par les neurones sensoriels provenant des ganglions de la racine dorsale est considérée bien établie et homogène entre les souris lorsqu’elles ont atteint l’âge de 8 semaines.
Rôle de l’alternance des cycles de sommeil sur la consolidation mnésique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une partie des rats utilisés est porteuse d'une narcolepsie de lignée, avec un éveil et un sommeil fragmentés. 240 rats Long Evans sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 180 d'entre eux et modéré pour 60. Tous subissent une biopsie du bout de la queue à quinze jours pour le génotypage, et les 60 retenus une chirurgie de trois heures sous anesthésie générale pour implanter des électrodes intracérébrales, avant des tests de labyrinthe surélevé, de reconnaissance d'objet, de piscine de Morris et de labyrinthe en double H. Les rats au mauvais génotype ou du mauvais sexe sont tués, 90 d'entre eux repartant vers l'élevage ou vers d'autres projets, et les 60 porteurs d'un implant cérébral ne peuvent être ni réutilisés ni adoptés.
Objectifs
Parmi les multiples fonctions du sommeil, son rôle dans l'établissement des souvenirs semble particulièrement important. C’est en particulier l’architecture du sommeil, c’est-à-dire l’alternance de ses différents stades (sommeil lent-sommeil paradoxal) dans une nuit de sommeil qui joue un rôle primordial dans la consolidation des souvenirs. Si les modèles rongeurs ont été largement utilisés pour démontrer ce lien, la plupart des travaux ont été menées dans des conditions standardisées d’élevage, loin de leur condition naturelle de vie. L’idée originale de ce projet est de replacer cette question dans une perspective plus naturaliste en plaçant l’animal dans un milieu de vie seminaturalistique lui permettant d’exprimer le répertoire comportemental propre à son espèce, en particulier les interactions sociales et le choix de son territoire. Cet environnement est constitué de nombreux modules reliés par des tunnels sur une surface de plusieurs mètres carrés. La force de ce projet est de bénéficier d’un modèle de rats narcoleptiques caractérisés par une forte fragmentation de l'éveil et du sommeil modifiant l’architecture du sommeil. Chez le sujet humain souffrant de narcolepsie, on observe des passages directs de l’éveil au sommeil paradoxal sans passer par le stade de sommeil lent. Certains patients narcoleptiques montrent des déficits de mémoire confortant l'hypothèse d'un lien entre l’organisation du sommeil et de bonnes performances de consolidation mnésique. Nous proposons une approche longitudinale (avec un suivi des mêmes animaux pendant plusieurs mois) permettant de suivre l’évolution de la qualité de leur sommeil en fonction de leurs comportements individuels dans l’environnement de vie (activité physique, interactions sociales). Tout au long de cette étude, des tests comportementaux permettront d’évaluer les capacités de mémoire de ces animaux afin de les mettre en lien avec la qualité de leur sommeil. En comparant les animaux contrôles et les animaux narcoleptiques nous espérons en premier lieu pouvoir préciser les liens qui existent entre l'organisation du sommeil et les performances cognitives des animaux dans un cadre plus écologique. Nous faisons l'hypothèse que les facteurs liés à l'environnement de vie (activité physique, interactions sociales) permettront d'identifier les éléments les plus à même de garantir une évolution positive du fonctionnement cognitif et une limitation des crises de narcolepsie.
Bénéfices attendus
Le premier bénéfice attendu concerne l’apport aux connaissance fondamentales sur les interactions sommeil/mémoire. En effet, si actuellement le lien entre la structure du sommeil (c’est-à-dire l’alternance de ses différents stades au cours d’une nuit) et la qualité de la consolidation en mémoire des souvenirs fait l’objet de nombreuses hypothèses, il n’est pas encore démontré. Notre projet a deux objectifs. D’une part évaluer le rôle de l’environnement de vie, et en particulier des interactions sociales, sur la qualité du sommeil et son impact sur la mémoire. D’autre part, ce projet permettra de mieux comprendre comment la fragmentation du sommeil, caractéristique de la narcolepsie, affecte la mémoire et les fonctions cognitives en fournissant des données causale (c’est-à-dire un lien direct entre structure du sommeil et consolidation des souvenirs). L’étude de rats narcoleptiques et sauvages dans un environnement plus écologique favorisera l’identification de marqueurs comportementaux plus représentatifs des situations quotidiennes. Ainsi, on peut espérer améliorer la pertinence translationnelle de ces résultats pour la compréhension des troubles humains du sommeil et de la mémoire. Chez les rats narcoleptiques, nous pourrons détecter d’éventuels mécanismes compensatoires permettant de mieux cibler les stratégies diagnostiques et thérapeutiques, ainsi que des recommandations d’adaptation pour améliorer la qualité de vie des patients narcoleptiques.
Procédures
Tous les animaux feront d’abord l’objet d’une biopsie du bout de la queue à l’âge de 15 jours post naissance afin d'établir leur génotype. Les rats sélectionnés ayant le bon génotype subiront à l’âge adulte une chirurgie pour implanter les électrodes intra-cérébrales permettant de caractériser et de quantifier les différentes phases de leur sommeil. Cette intervention d'une durée de 3h00 aura lieu sous anesthésie générale. Au cours de la procédure, les animaux seront soumis à plusieurs tests comportementaux ou mnésiques impliquant chacun des circuits cérébraux différents. Les tests d’anxiété ont pour but de comparer le niveau d’anxiété de différents groupes d’animaux et d’en suivre l’évolution dans le temps. Le test du labyrinthe elevé consiste à placer le rat dans un labyrinthe circulaire dont la plateforme est surélevée et dont la moitié est pourvue de murs. Plus l’animal passe du temps dans la partie protégée par les murs et plus il est considéré comme anxieux. La durée du test est de 5 minutes. Les tests de mémoire de reconnaissance d’objet sont basés sur la tendance naturelle des rats à explorer plus longtemps un nouvel objet qu’un objet déjà connu. Cette diminution de l’exploration lors d’une seconde présentation de l’objet est interprétée comme une reconnaissance (et donc une mémorisation) de cet objet. Les phases d'encodage des objets et la phase de test (avec un nouvel objet) ont une durée respective de 10 et 5 minutes. Les tests de navigation spatiale : Dans le test dit de la piscine de Morris, le rat doit apprendre à retrouver une plateforme immergée en utilisant les indices spatiaux présents dans la pièce expérimentale. Le deuxième test est celui du labyrinthe en double H dans lequel les animaux doivent apprendre à retrouver une récompense placée à l’extrémité d’un des 6 bras constituant le labyrinthe. Ces tests se déroulent sur 5 jours consécutifs avec chaque jours 4 essais d’une minute. Tous ces tests seront réalisés sans aucune restriction ni alimentaire, ni hydrique. Ils ne sont basés que sur un comportement naturel de l’animal ou sur des renforcements positifs (eau sucrée, friandise)
Impact sur les animaux
La biopsie peut induire un stress lié à la manipulation de l’animal, et une douleur brève du fait qu’un petit bout de queue est coupé. Toutefois, la souffrance est légère et de très courte durée. Lors de la chirurgie, les nuisances attendues sont le stress modéré lié à la manipulation de l’animal avant la chirurgie et un état vaseux en sortie de chirurgie due à la récupération de l’anesthésie générale. Il peut y avoir une douleur postopératoire due à la plaie mais traitée par des anti-douleurs. Les infections de la plaie suite à la chirurgie sont extrêmement rares. Bien qu’elles ne soient pas attendues, elles ne sont pas exclues. Concernant les test comportementaux, l’animal sera sorti de l’enceinte d’hébergement et déplacé jusqu’à la pièce contenant le dispositif expérimental. Ceci peut engendré un stress qui sera limité par une manipulation régulière des animaux et par une phase d’habituation au transport et à l’enceinte expérimentale pendant les trois jours précédents le test.
Devenir
Après l’étape de génotypage, les animaux ne possédant ni le bon génotype, ni le bon sexe seront euthanasiés, sauf 90 d'entre eux qui seront replacés dans l'élevage pour le maintien de la colonie ou proposés pour être utilisés dans d’autres projets. Les 60 animaux utilisés pour l’étude du lien sommeil/mémoire seront mis à mort à la fin de la procédure. Ces animaux ayant un implant cérébral, ils ne peuvent ni être réutilisés ni être adoptés.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. L’impact du sommeil, en particulier celui de l’alternance de ses phases (sommeil lent/sommeil paradoxal) sur la consolidation des souvenirs, est un processus complexe mettant en jeu un grand réseau de structures cérébrales mais également plusieurs organes (cerveau, muscles). Ainsi, cette étude de l’interaction sommeil/mémoire combine des enregistrements cérébraux et des tâches comportementales complexes qu’il n’est pas possible de mimer sur des modèles in vitro.
Réduction
En premier lieu, nous avons fait le choix d’une approche longitudinale afin de suivre l’évolution des paramètres mesurés dans chaque groupe de rat. Outre l’intérêt scientifique d’une telle approche, elle permet d'augmenter la puissance statistique en limitant le nombre d'animaux par groupes car ceux-ci seront leur propre témoin et que nous utiliserons les tests statistiques adaptés à ce type d'approche. Le nombre de rats pour chaque groupe a été ramené au minimum sur la bases d'études antérieures. Les enregistrements de sommeil des rats ainsi que les données comportementales seront organisés et archivés sur notre serveur central. Nous générerons ainsi une base de données qui permettra à terme de réduire le nombre d’animaux puisqu’elle sera utilisée comme référence et contrôle pour les projets suivants sur ce même type d’animaux et de problématique.
Raffinement
Dès le sevrage, les animaux seront hébergés dans une enceinte semi-naturalistique. Cette dernière, constituée de cages reliées par des tunnels, a une dimension totale de 2,7x2,1 m avec une surface utile au sol de plus de 2,5 m² pour les rats. Dans cette enceinte, les animaux disposent de 2 cages surélevées et de 2 nids à l’abri de la lumière. Ainsi, les rats peuvent exprimer la majeure partie de leur répertoire comportemental en particulier les interactions sociales, le choix du territoire ou encore la recherche active de nourriture. Une étude préliminaire menée sur des rats hébergés dans cette enceinte a montré une forte réduction de l’anxiété de ces animaux par rapport à ceux hébergés en cages standard. De plus, nous n’avons noté aucune agressivité interindividuelle même après plusieurs mois, tant chez les femelles que chez les mâles. Cela vient du fait que les rats peuvent s’approprier ce territoire et choisir de s’isoler si besoin et d’éviter tout conflit. Des enrichissements systématiques seront également mis en place. Les animaux seront suivis quotidiennement soit par une visite dans la salle d’hébergement, soit à l’aide des caméras couvrant l’ensemble du dispositif. De plus, les animaux seront manipulés régulièrement afin de limiter le stress lors du branchement du dispositif d’enregistrement. Lors des jours suivant la phase post-opératoire, les animaux seront suivis régulièrement au cours de la journée et l’optimisation de la récupération est assurée grâce à l’utilisation d’une grille de score post-opératoire. Cette grille permet de suivre l’évolution des paramètres physiologiques afin de détecter toute dégradation de l’état de santé général et de mettre en place les solutions médicamenteuses appropriées. Celle-ci permettent également de fixer le point limite des expérimentations avec mise à mort des animaux pour prévenir l’apparition d’une quelconque souffrance. L’utilisation d’un dispositif d’enregistrement du sommeil sans fil permettra, contrairement aux dispositifs filaires habituellement utilisés pour ce genre d’étude, de ne plus isoler les animaux durant les phases d’enregistrement de sommeil. L’interaction sociale sera donc maintenue chez les animaux durant toute la procédure. Enfin, les tests mnésiques utilisés dans la procédure ne nécessitent ni restriction hydrique, ni restriction alimentaire. Ils sont basés soit sur un comportement naturel du rat soit sur des renforcements positifs.
Choix des espèces
Les rongeurs sont l'une des espèces de mammifères qui a été largement utilisée pour étudier le sommeil d’une part et les processus mnésiques d’autre part. Ils sont donc parfaitement adaptés à une étude de la relation entre l’organisation du sommeil et la mémoire. Le rat est un modèle approprié car il possède une taille cérébrale permettant d’étudier l’activité de nombreuses aires cérébrales retrouvées chez l’Homme. Pour notre projet, le rat, contrairement à la souris, a une taille et un poids suffisant pour lui permettre de supporter les systèmes d’enregistrements autonomes qui ne sont actuellement pas encore assez miniaturisés pour être utilisés chez la souris Les rats de souche Long Evans sont particulièrement adaptés à notre étude car : - ils peuvent réaliser des tâches comportementales sophistiquées d’autant plus qu’il possède une très bonne vision - ils ont servi de bases pour le développement de la lignée narcoleptique Les animaux seront placés dès le sevrage dans l’enceinte d’hébergement semi-naturalistique. A l’âge de 12 semaines, ayant atteint leur maturité cérébrale, les rats seront inclus dans les différentes tâches cognitives et leur sommeil sera enregistré. A cet âge, ils possèdent un cycle circadien et ultradien veille-sommeil stabilisé et consolidé.
Importance de la délétion spécifique d’Ezh2 dans les cardiomyocytes ou les cellules endothéliales ou les cellules myéloïdes au cours du développement des maladies cardiovasculaires
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
436 souris vont être utilisées, chacune passant jusqu'à quinze échocardiographies étalées entre l'âge de deux mois et un an. 156 d'entre elles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 280 dans des procédures modérées, toutes tuées par exsanguination pour prélever cœur, foie, intestin, poumon, tibia et aorte. Au sevrage, chaque animal reçoit une puce électronique sous la peau et perd deux millimètres de cartilage de l'oreille pour le génotypage, puis vient une série de trois injections quotidiennes et trois prélèvements de sang. Le porteur justifie l'emploi des deux sexes par la neutralisation d'un effet du sexe et par la volonté d'"exploiter l'intégralité des animaux génétiquement modifiés produits" dans son animalerie.
Objectifs
L’objectif du projet est de comprendre le rôle de l’expression d'une enzyme épigénétique dans différents types cellulaires au cours du développement des pathologies cardiovasculaires in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra, dans un premier temps, de définir les conditions optimales pour induire la délétion du gène codant pour l'enzyme épigénétique d'intérêt dans les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les cellules myéloïdes, ainsi que d’en déterminer la durée optimale. Dans un second temps, il permettra d’évaluer l’impact de cette délétion sur le développement d’une dysfonction cardiaque chez la souris.
Procédures
Une injection quotidienne pendant 3 jours consécutifs (3 injections au total). Identification individuellement à l’aide d’une puce électronique injectée par voie sous-cutanée et biopsie auriculaire de 2 mm sera à des fin de génotypage 1 seule fois au moment du sevrage. A partir de l’âge de 8 à 12 semainesne des échocardiographies non invasives seront réalisée tous les mois jusqu’au 6ᵉ mois, puis toutes les deux semaines jusqu’au 12ᵉ mois (15 échorcardiographies en tout).
Impact sur les animaux
Des prélèvements sanguins et des injections d’une molécule seront réalisés trois fois au cours de l’étude. Le prélèvements sanguins et les injection durerons moins de 5 min. Nous nous attendons, si notre modèle fonctionne, à observer des signes de dysfonction cardiaque chronique évalués par échocardiographie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de cette étude par exsanguination afin permettre le prélèvement des organes d’intérêt (sang, cœur, foie, intestin, poumon, tibia, aorte) nécessaires aux analyses moléculaires et histologiques.
Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro car nous avons pour but dans cette étude d’évaluer la fonction cardiaque pour laquelle il n’existe aucune alternative ex vivo à l’heure actuelle.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons séquentiellement des mesures non invasives de la fonction cardiaque (échocardiographie). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements nécessaires aux analyses ex vivo au moment de la mise à mort. La procédure de mise au point et d’optimisation des conditions de délétion du gène codant pour l'enzyme épigénétique dans les cardiomyocytes, les cellules endothéliales ou les cellules myéloïdes permettra de limiter le nombre de groupes expérimentaux nécessaires. Nous ajusterons également le nombre d’animaux requis pour les procédures suivantes grâce à l’évaluation de l’efficacité de cette délétion à l’aide d'un calcul de puissance statistique. Des animaux des deux sexes seront utilisés afin de neutraliser tout effet du sexe et d’exploiter l’intégralité des animaux génétiquement modifiés produits dans notre animalerie.
Raffinement
Les animaux sont hébergés conformément aux normes requises, avec un enrichissement des cages adapté. Des points limites ont été définis (absence de réaction au stimulus, inactivité de l’animal dans sa cage pendant plus de 6 heures, manifestation de signes de détresse), et une stratégie d’anesthésie et d’analgésie sera mise en place, accompagnée d’un suivi quotidien des signes cliniques et d’une pesée hebdomadaire. Par ailleurs, les expérimentateurs auront des contacts plurihebdomadaires avec les animaux afin de favoriser leur habituation. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans cette étude seront identifiées individuellement à l’aide d’une puce électronique injectée sous anesthésie gazeuse. Lors de cette même procédure, une biopsie du cartilage auriculaire de 2 mm sera réalisée afin de confirmer le génotype de chaque animal.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage indéniable de permettre l’utilisation d’outils de biologie moléculaire, tels que l’invalidation d’un gène de manière spécifique et inductible dans un type cellulaire d’intérêt, comme c’est le cas dans cette étude concernant la délétion d’Ezh2 dans les cardiomyocytes, les cellules endothéliales ou les cellules myéloïdes. Ces modèles sont particulièrement utiles pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de maladies cardiovasculaires, telles que l’insuffisance cardiaque. Dans notre laboratoire, nous possédons depuis de nombreuses années une solide expérience dans les évaluations fonctionnelles et structurelles du cœur, in vivo et ex vivo, chez la souris. Utilisation d’animaux adultes de 8-12 semaines et pesant 20-24g pour cette étude afin de pouvoir suivre l'éventuel développement d'une dysfonction cardiaque.
Rôle de la sécrétion des plaquettes sanguines dans les maladies métaboliques hépatiques (EU (1/2))
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Cinquante-deux semaines de régime riche en graisses pour une partie des animaux, 72 heures d'isolement en cage métabolique de 500 cm2 pour une autre: 504 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'orbite de l'œil, sous la peau et dans l'abdomen, jusqu'à sept prélèvements sanguins sur animal éveillé et des périodes de jeûne de 8 ou 16 heures. Le régime provoque une prise de poids et une accumulation de graisse dans le foie, avec inflammation de l'organe ou cancer, pour étudier le rôle des plaquettes sanguines dans les maladies hépatiques liées à l'obésité. Toutes sont tuées, le porteur précisant que les souris isolées 72 heures ne peuvent servir à aucune autre procédure en raison du stress subi.
Objectifs
Les maladies du foie liées au métabolisme, appelées maladies hépatiques métaboliques sont des atteintes du foie qui apparaissent dans le cadre du syndrome métabolique. Ce syndrome correspond à l’association de plusieurs troubles liés à l’obésité, comme une augmentation de la graisse abdominale, un diabète, une hypertension ou des anomalies des graisses dans le sang. Ces maladies du foie peuvent rester longtemps silencieuses, mais elles peuvent aussi évoluer vers des formes graves comme la cirrhose ou le cancer du foie. Dans ce dernier cas, le pronostic est très sombre, avec un taux de survie d’environ 10 % à 5 ans. Atteignant plus de 30 % de la population dans les pays occidentaux, ces maladies hépatiques représentent un véritable enjeu de santé publique. L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) les considère désormais comme la première cause de maladies du foie dans ces pays. Même si ces maladies sont souvent associées à l’obésité et au syndrome métabolique, leur origine exacte varie selon les patients et reste encore mal comprise. Cela rend leur prévention et leur traitement particulièrement difficiles. L’une des questions importantes et encore peu explorées concerne le rôle des plaquettes sanguines. Les plaquettes sont de petites cellules du sang qui permettent d’arrêter les saignements et de maintenir l’intégrité des vaisseaux sanguins. Comprendre comment elles pourraient influencer l’apparition ou l’évolution des maladies hépatiques métaboliques ouvre une nouvelle piste de recherche très prometteuse. Ce travail s’inscrit dans une approche globale en tenant compte de l’ensemble du fonctionnement du corps, des organes et de leurs interactions. Cette vision globale est essentielle pour comprendre ces maladies complexes et multifactorielles. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU) différents (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie hépatique et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour prévenir les maladies métaboliques du foie.
Procédures
La souris sera soumise à différents régimes alimentaires riches en lipides de 1, 8, 12, 16 ou 52 semaines en fonction du régime utilisé et du stade de la maladie étudié. La souris sera soumise à des procédures avec des injections (intra-orbitaire : 1 injection de 15 sec, intra-péritonéale : 1 à 2 injections de 15 sec et sous-cutané : 1 injection de 15 sec). 7 prélèvements sanguins de 15 sec sur souris vigile ou 1 prélèvement sanguin terminal de 1-2 minutes sur souris anesthésiée seront réalisés. La souris sera mise à jeun (8h ou 16h) pour les tests de tolérance. Pour une procédure, la souris sera isolée individuellement en cage métabolique d’une surface de 500cm2 sur une durée de 72h. Pour une procédure, une perfusion intra-cardiaque (1 minute) sera réalisée suite à une anesthésie générale et une antalgie locale.
Impact sur les animaux
La mise en régime riche en lipides chez la souris induit différents effets indésirables telles qu’une prise de poids et une accumulation de graisses dans le foie associée à une inflammation de l’organe ou un cancer du foie. Les animaux utilisés dans ce projet pourront éprouver un stress modéré et un inconfort à cause d'injections, de mise à jeun et de mise en isolement.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement sanguin (1 ml de sang) et d’organes pour les procédures 1 et 3. Pour la procédure 2, tous les animaux seront mis à mort ne pouvant pas etre utilisés pour d’autres procédures dû au stress après isolement de 72h.
Remplacement
Les processus qui contrôlent les plaquettes sanguines et les maladies du foie font intervenir de nombreux types de cellules et plusieurs organes, comme le foie, les vaisseaux sanguins, le tissu adipeux ou encore l’intestin. Aujourd’hui, il n’existe pas de modèle en laboratoire capable de reproduire fidèlement toutes ces interactions complexes. A ce jour, aucun système expérimental ne permet d’imiter un foie complet avec ses différents types de cellules et ses vaisseaux et de modéliser ses échanges avec d’autres organes. Notre projet étudie une maladie du foie qui résulte de plusieurs problèmes combinés : des troubles du métabolisme des graisses, de l’inflammation et des anomalies des vaisseaux sanguins. Pour comprendre ces mécanismes, il est nécessaire d’utiliser un modèle vivant capable de reproduire l’ensemble des échanges métaboliques, hormonaux et immunitaires d’un organisme. L’expérimentation animale reste donc, à ce jour, la seule méthode permettant d’étudier cette maladie dans toute sa complexité.
Réduction
Plusieurs résultats seront obtenus à partir d’un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Le nombre de souris utilisées sera réduit au minimum sur la base des études précédentes déjà réalisées au laboratoire et d’analyses statistiques permettant d’obtenir des résultats fiables. Les paramètres mesurés seront analysés à l’aide d’une analyse de variance.
Raffinement
Le suivi des souris sera réalisé 2 fois par jour par les zootechniciens et l’expérimentateur. De l’aliment hydratée pourra être mise à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Si des plaies apparaissent, des soins/désinfections seront prodigués à la souris. En fonction de son état, la souris peut être aussi momentanément séparée de ces congénères. Toutes les procédures invasives utilisent des analgésiques généraux ou locaux. Certains animaux seront transportés à pied selon un tracé bien défini de 5 minutes dans leur cage d’origine placée dans des sacs isotherme de transports à raison de 2 cages par sac de transport. Ceci permet de réduire le stress des animaux car dans l’obscurité et à une température contrôlée. Tout animal faible ou malade ne sera pas transporté et mis à mort avant transport. Les animaux sont ensuite placés dans la salle d’expérimentaion pour une acclimation de 2 h avant l’expérimentation. Si des signes décrits dans la grille de score apparaissent, le zootechnicien ou l’experimentateur doivent se referrer à cette grille de score et agir avec l’accord du responsable du projet. Au bout de 48h si les signes persistentet les points limites atteints, la souris sera mise à mort.
Choix des espèces
Nous utilisons des modèles murins car nous disposons de modèles de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le nombre de plaquettes sanguines chez la souris. Les modèles de drosophiles ou de poissons zèbres ne sont pas utilisables dans le contexte de ce projet de recherche car les plaquettes sanguines sont phénotypiquement et mécanistiquement très différentes de celles de l'Homme, ce qui n'est pas le cas chez les rongeurs. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).
Impact de la température corporelle sur la réponse inflammatoire dans des modèles stériles d’infection dans un modèle murin 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tuées à la fin de la procédure pour prélever cœur, poumons, foie, reins et cerveau, 500 souris subissent une inflammation généralisée déclenchée par une injection dans l'abdomen. 428 d'entre elles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 72 dans des procédures légères. Placées dans des environnements chauds ou froids pour reproduire fièvre et hypothermie, une puce glissée sous la peau, elles passent une échographie cardiaque et un prélèvement de sang sous anesthésie à 6, 24 et 48 heures. Le porteur décrit une baisse d'activité, une perte d'appétit, un amaigrissement et une respiration ralentie, et affirme que les cellules en culture ne reproduisent pas un "organisme vivant entier", ce qui rendrait le recours à la souris "nécessaire".
Objectifs
Quand une personne est gravement malade, comme lors d’une infection sévère, son corps peut réagir par une forte inflammation et un changement de température (fièvre ou hypothermie). Ce projet cherche à comprendre si le fait d’avoir trop chaud ou trop froid influence la façon dont le corps réagit à cette situation critique. Pour cela, nous allons provoquer une inflammation contrôlée chez des souris, puis les placer dans des environnements plus ou moins chauds. Nous suivrons leur état général, leur température corporelle, et la santé de leur cœur. L’objectif est de savoir si la température du corps aggrave ou améliore la réaction du corps à l’inflammation, pour aider à mieux soigner les patients à l’hôpital. Le projet se déroule dans les 2 établissements utilisateurs: EU570 et EU0543 (uniquement les échographies).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment la température du corps influence la réaction du système immunitaire lors d’une inflammation sévère, comme on en observe chez les patients en réanimation. En identifiant si le fait d’avoir de la fièvre ou au contraire d’être en hypothermie aggrave ou améliore l’état général, nous pourrons mieux adapter les soins, en particulier le contrôle de la température corporelle dans les situations critiques. À long terme, ces résultats pourraient contribuer à améliorer la prise en charge des patients atteints d'infections graves ou de chocs inflammatoires, en évitant des traitements inutiles ou contre-productifs, et en guidant des stratégies plus ciblées.
Procédures
Les souris reçoivent une injection au niveau de l’abdomen pour déclencher une réaction inflammatoire contrôlée (5 secondes). Elles sont ensuite placées dans des environnements plus ou moins chauds, pour simuler différents états : hypothermie (corps froid), température normale, ou fièvre. Elles portent une petite puce sous la peau permettant de suivre leur température corporelle sans les manipuler. À plusieurs moments (6h, 24h, 48h), leur état général est suivi, une échographie du cœur est réalisée sous anesthésie, et un petit prélèvement de sang est effectué sous anesthésie pour analyser leur réaction (10 secondes). L’ensemble des interventions est conçu pour être le moins stressant possible, avec des soins attentifs, des médicaments contre la douleur, et un hébergement adapté à leur confort. L'ensemble de ces interventions se déroulera dans l'unité du chercheur, sauf les échographies qui auront lieu dans une unité voisine (durée 5 minute par animal).
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent présenter des signes de malaise temporaire à la suite de l’injection et de la réaction inflammatoire : baisse d’activité, perte d’appétit, amaigrissement, respiration ralentie, ou poils hérissés. Ces effets sont attendus et suivis de près. Ils varient selon la température ambiante et la sensibilité individuelle de chaque animal. Tous les signes sont évalués plusieurs fois par jour, à l’aide d’une grille d’observation clinique standardisée. Les procédures (injection, prélèvements, examens) sont conçues pour minimiser le stress et la douleur, grâce à l’anesthésie et à des soins de soutien adaptés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure ou en cas de signes de souffrance dépassant les seuils définis. Un prélèvement sanguin ainsi que des organes (cœur, poumons, foie, reins, cerveau) seront réalisés immédiatement après l’euthanasie, à des fins d’analyse.
Remplacement
Des expériences sur cellules isolées en laboratoire (par exemple des cellules qui tapissent l’intérieur des vaisseaux sanguins, appelées cellules endothéliales) sont réalisées en parallèle pour mieux comprendre certaines réactions inflammatoires. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier ce qui se passe dans un organisme vivant entier, où plusieurs organes interagissent en permanence. Ils ne reproduisent pas la complexité du fonctionnement global du corps (appelé homéostasie), en particulier la régulation de la température, les réactions immunitaires, ou les effets sur le cœur et les autres organes. C’est pourquoi le recours à l’animal reste nécessaire dans ce projet pour étudier ces mécanismes de manière intégrée.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé pour obtenir des résultats fiables, tout en limitant l’utilisation d’animaux au strict nécessaire. Les expériences sont conçues pour recueillir un maximum d’informations sur chaque souris (par exemple : température, sang, échographie, organes), ce qui évite de multiplier les groupes. Les conditions expérimentales sont réparties dans le temps pour permettre la réutilisation des équipements et limiter les pertes. Si les résultats sont clairs avant d’avoir utilisé tous les animaux prévus, les expériences seront arrêtées plus tôt. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique
Raffinement
Tout est mis en œuvre pour limiter la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout au long de l’expérience. Les souris reçoivent des médicaments contre la douleur de manière préventive et régulière. Elles sont surveillées plusieurs fois par jour avec une grille d’observation précise (état général, comportement, respiration, apparence). Si une souris montre des signes de souffrance trop importants, elle est immédiatement retirée de l’étude. Les souris vivent en groupe, dans des cages enrichies avec de la nourriture adaptée, du matériel pour faire leur nid, et des conditions de température contrôlées. Les manipulations sont faites par du personnel formé et expérimenté, avec un souci constant du bien-être animal. Les animaux seront transportés entre les deux unités (5 minutes) dans une cage de transport homologuée.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris adultes, car elles permettent d'étudier de façon fiable les effets de l’inflammation et de la température sur l’organisme. Elles sont de taille adaptée pour réaliser les examens (température, échographie du cœur, prise de sang) de manière précise, sans stress inutile. De plus, la souris est une espèce bien connue en recherche médicale : on dispose de beaucoup de connaissances et d’outils pour analyser ce qu’il se passe dans son corps, ce qui facilite la compréhension des résultats. Enfin, notre équipe a une solide expérience avec ce modèle, ce qui garantit des manipulations maîtrisées et respectueuses du bien-être animal.
Caractérisation des évènements vasculaires précoces par imagerie à ultrasons et de super-résolution au cours de l’AVC ischémique et de l’AVC hémorragique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Un caillot provoqué dans une artère cérébrale par injection de thrombine ou application de chlorure de fer, la rupture d'un vaisseau par éclatement de microbulles: 920 souris subissent l'induction d'un accident vasculaire cérébral. 540 d'entre elles sont anesthésiées puis tuées sans reprise de conscience, 180 sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 200 dans des procédures sévères. L'objet réel du travail est la validation d'une imagerie par ultrasons de super-résolution, avec 800 souris passant deux séances d'échographie de 140 minutes et 80 d'entre elles portant une plaque métallique posée sur le crâne, habituées sept jours d'affilée à l'imagerie sur animal éveillé. Le porteur indique qu'aucun animal ne sera gardé vivant, jugeant qu'il n'est pas concevable de réhabiliter des souris ayant subi une induction d'AVC, et que leurs cerveaux serviront à l'analyse histologique.
Objectifs
Chaque année, environ 17 millions de personnes dans le monde auront un Accident Vasculaire Cérébral (AVC) pouvant entraîner des séquelles plus ou moins graves voir la mort de l’individu. Il existe deux types d’AVC : l’AVC ischémique, le plus courant (80%), est dû à l’obstruction d’une artère cérébrale et l’AVC hémorragique induit par la rupture d’un vaisseau sanguin cérébral. Actuellement, moins de 10% des patients peuvent bénéficier de traitement (injection intraveineuse d’un médicament pour dissoudre le caillot sanguin (l’activateur tissulaire du plasminogène ou tPA) parfois accompagné d’une intervention pour le retirer (thrombectomie)). L’AVC est un problème de santé publique majeur et nécessite le développement de nouvelles techniques d’imagerie pour mieux les comprendre, les diagnostiquer et les traiter efficacement améliorant la prise en charge des patients. Ce projet vise à valider une nouvelle technique d'imagerie par ultrasons superrésolutive qui caractériserait les évènements vasculaires survenant au plus proche de l'AVC, et observer la stabilité de caillots de composition différente et l’efficacité du traitement. Ce projet permettra d’évaluer son potentiel diagnostic pour détecter précocement les AVC (au plus près de la prise en charge du patient) et confirmer rapidement le diagnostic, l’efficacité du traitement et le retour de la circulation sanguine dans la zone atteinte. La comparaison des données obtenues en imagerie et en histologie permettra de mieux comprendre les modifications vasculaires et ces conséquences. Nous allons d’abord tester cette approche d'imagerie chez l’animal anesthésié pour éviter les mouvements qui compliquerait les analyses. Puis une étude où l'imagerie sera réalisée chez l’animal éveillé et l’induction de l’AVC effectuée sous anesthésie. Ce projet inclura également l’AVC hémorragique, plus rare, mais dont il est important d’améliorer le diagnostic et la compréhension. Pour cela, nous mettrons au point un modèle d’AVC hémorragique induit par l’éclatement de microbulles sensibles aux ultrasons dans la circulation sanguine induisant la rupture d’un vaisseau sanguin de manière non invasive et focalisé dans une région cérébrale donnée, reproduisant différents profils observés en clinique. La diversité des modèles employés recréera celle observées en clinique. Ce projet pourrait offrir des perspectives intéressantes pour l’étude du réseau vasculaire et faire progresser la compréhension de l'AVC et des traitements.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre ce qui se passe dans les vaisseaux sanguins survenant très tôt après le début d'un AVC pour comprendre comment cela affectent la formation d’un AVC ischémique (caillot sanguin) ou hémorragique (rupture de vaisseau). Avec de nouvelles approches d'imagerie, nous pourront mieux comprendre les effets à long terme des AVC et aider à améliorer les traitements. Nous utiliserons différents modèles pour simuler les situations réelles rencontrées en clinique. Dans ce but, nous proposons de caractériser les évènements vasculaires survenant au cours d’un AVC ischémique, en créant des caillots sanguins de compositions différentes et présentant une diversité des zones cérébrales atteintes de part une localisation aléatoire des caillots sanguins formés, comme cela est le cas en clinique. Le bénéfice de ce projet serait donc de caractériser et étudier les évènements vasculaires survenant lors d’un AVC ischémique et au plus près de sa survenue par une nouvelle approche d’imagerie. Nous développerons également un modèle d’AVC hémorragique avec une approche peu invasive où la rupture du vaisseau sanguin est induite de manière ciblée par des microbulles. Ceci nous permettrait également de comprendre les changements vasculaires survenant au plus près de l’AVC et amènerait ainsi l’opportunité de déboucher sur des études cliniques et la possibilité d’augmenter le succès de transpositions de résultats précliniques à la clinique humaine. Une des grandes innovations de ce projet est l’utilisation d’une nouvelle technologie d’imagerie à ultrasons, qui offre une meilleure résolution et pourrait être utilisée directement au chevet du patient. Cela permettrait d’étudier les vaisseaux sanguins en 3D, avec une plus grande précision, et de l’appliquer à différents types de maladies. In fine, ce projet offrirait la possibilité d’adapter les pratiques cliniques en modifiant la prise en charge et/ou le traitement de patients et adopter une approche d'imagerie plus accessible en clinique.
Procédures
Les animaux seront soumis a: 1- Pose d’un cathéter intraveineux pour injection de traitements ou agent de contraste (n=920, durée de la procédure : 15 minutes), 2- Pose de plaque métallique crânienne (n=80, durée de la procédure: 60minutes), 3- Approches chirurgicales : (n=680 souris au total): 2.1- Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine (n=220, durée de la procédure: 45 minutes), 2.2- Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par application de FeCl2 (n=220, durée de la procédure :45 minutes) 2.3- Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale par formation d'un caillot périphérique carotidien (n=80, durée de la procédure : 1.5 heures) et 2.4- Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale par formation d'un caillot périphérique carotidien avec sang autologue (n=80, durée de la procédure : 30minutes), 4- Approche d’induction d’hémorragie intracérébrale (n=60, durée de la procédure : 45 minutes), 5- 2 procédures d'imagerie par échographie ultrasonore (n=800, durée de la procédure : 140 minutes), 6- Un protocole d'habituation à l'imagerie éveillée par jour pendant 7jours consécutifs avant et après chirurgie, avec des sessions de durée croissante progressivement (n=80) et 7- Procédure chirurgicale terminale (n= 680, durée de la procédure : 15 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaitre chez les animaux lors de la procédure seraient : - une perte de poids après les anesthésies et l'AVC, - des douleurs per-opératoires lors de la pose du cathéter et la chirurgie d’induction de l’AVC sous anesthésie - des douleurs post-opératoires après l'induction de l'AVC sous anesthésie, - un stress lors des premières sessions d'habituation à l’imagerie éveillée, - des douleurs post-opératoires après la pose de plaque métallique crânienne, - des déficits fonctionnels à la suite de l'AVC hémorragique (diminution ou perte de fonctions motrices (perte de force dans les membres ou démarche peu assurée), de fonctions sensorielles (vision et sensibilité des vibrisses affaiblies)). Ces effets sont connus dans l’expérimentation au laboratoire. Une surveillance accrue sera réalisée à chacune de ces étapes. L’animal sera gardé en vie uniquement si l’état de bien-être de l’animal est correct suite à chaque étape de la procédure
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés dans ce projet (920) seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Il a été décidé de ne garder aucun animal en vie car il n’est pas concevable pour leur bien être de réhabiliter ou réutiliser des souris ayant subi une procédure telle que l’induction d’un AVC ischémique ou hémorragique. De plus, les tissus générés permettront une étude histologique de l’intégrité cérébrale et vasculaire ainsi que les altérations induites par l’AVC (localisation des caillots ou hémorragies notamment).
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, il s’agit d’étudier un modèle in vivo avec tous les mécanismes vasculaires physiopathologiques associés, survenant lors d'un l'AVC. La mise au point de l’imagerie de super-résolution pour comprendre les évènements vasculaires survenant au plus près de l’AVC ne peut être investiguée autrement que via un modèle in vivo dynamique afin d’assurer des résultats les plus proches de la réalité et favoriser le passage en clinique de cette approche d’imagerie. Ce projet concerne les modèles animaux les plus utilisés dans le cadre d’étude sur l’AVC. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes formes d’AVC. De plus, la mise au point de cette nouvelle méthodologie d’imagerie de super-résolution pourra être utilisé dans le cadre d’études d’autres processus physiologiques cérébraux tels que la douleur, le sommeil, la maladie d’Alzheimer ou des malformations artério-veineuses.
Réduction
Conformément à la règle des 3R, avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour obtenir des résultats significatifs en réduisant le plus possible les effectifs. Ainsi, les procédures décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Un nombre minimal d’animaux sera utilisé dans le respect du principe de réduction tout en permettant la fiabilité des résultats. Une partie de mise au point du protocole est indispensable dans ce projet. Afin de limier l’utilisation d’animaux, ceux ayant permis de déterminer le protocole d’anesthésie le plus adapté à la réalisation d’imagerie de superrésolution pourront permettre également de valider le protocole de stimulation sensorielle (moustache et visuelle) non invasif sous anesthésie lors de l’acquisition en imagerie. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages conformes aux normes européennes (type III ; Directive 2010/63/UE) en petits groupes sociaux stables (n=3/5) dans des conditions environnementales contrôlées. Les animaux seront hébergés en groupe de 3 ou 5 et les cages seront enrichies ( papier kraft en quantité pour la fabrication d'un nid, ainsi qu’un tunnel et des morceaux de bois). Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux seront gardés en acclimatation avant expérimentation pendant 1 semaine. Puis ils seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole, afin de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et apprendre aux souris à coopérer. Lors des différentes procédures, les animaux auront une anesthésie quand cela est nécessaire et recevront des anti-douleurs adaptés à la sévérité du geste pour éviter toute douleur avant, pendant et après la réalisation de l'acte.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans les neurosciences, et notamment dans le développement de thérapies et d'outils diagnostiques. C’est également l’espèce de référence pour étudier l’inflammation, l’hémorragie et l’ischémie cérébrale dans la littérature. Les connaissances et acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’AVC ischémique et hémorragique. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L'étude se déroulera sur deux souches de souris présentant des profils de collatérales différentes, et des réponses physiologiques à l'ischémie différentes, comme observé chez l'humain. De plus, ces deux souches sont régulièrement utilisées pour la recherche, d'où l'intérêt de valider ce modèle sur ces dernières. Les souris utilisées seront de jeunes adultes, entre 5 et 9 semaines (5 semaines lors du début du protocole, et 9 semaines arrivées à la fin du protocole). Nous réaliserons nos modèles sur des jeunes adultes soit des animaux de même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC nous permettant ainsi de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données obtenues au laboratoire sur les modèles d’AVC. Les animaux seront commandés à l'âge de 5 semaines afin de leur laisser un temps d'acclimatation à leur nouvel environnement.