Rongeurs

Pour mesurer si de la poudre de pomme et une infusion de fausse marjolaine corrigent les effets d'une alimentation grasse, 72 souris mâles vont être rendues obèses pendant douze semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent deux prises de sang par incision de la queue, un perçage des oreilles pour l'identification, deux gavages, une injection intrapéritonéale d'insuline, des mises à jeun de quatre à six heures et trois isolements d'une demi-heure pour recueillir les fèces. Aucune analgésie n'est prévue. Le porteur rattache l'ensemble à un programme visant à caractériser et valoriser les effets santé de ces aliments, dans une perspective de pratiques agricoles plus durables.

Objectifs

L’un des objectifs de ce projet est de mieux comprendre l’impact des traitements appliqués au cours de la récolte et en post-récolte sur la qualité nutritionnelle des fruits, ainsi que les effets santé associés chez la souris. De nombreux travaux ont mis en évidence un effet protecteur des fruits sur le maintient du métabolisme du glucose, effet attribué en partie à la présence de sucres complexes et, très probablement, à une modulation bénéfique du microbiote intestinal. Afin d’évaluer les effets santé et de déterminer l’impact du traitement par UV au cours de la récolte et en post-récolte, nous comparerons des poudres de pomme obtenues à partir de fruits cultivés en plein champ ), et traitées avant ou durant la période de stockage selon plusieurs modalités. Parallèlement, l’étude inclura l’administration d’une infusion de Satureja nepeta (fausse marjolaine), plante médicinale traditionnellement utilisée pour ses propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et métaboliques, afin d’évaluer son effet sur le métabolisme de la souris et son microbiote intestinal. Les différentes modalités de fruits et de la plante seront administrées à des souris males durant 12 semaines, dans le cadre d'une alimentation riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9ème semaine et un test de tolérance au glucose à la 10ème semaine. Les fèces seront également récoltées et le microbiote des animaux sera analysé.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’impact de traitements lors de la récolte et en post-récolte sur la pomme, ainsi que leurs effets sur la santé métabolique des souris et sur la composition de leur microbiote intestinal. En parallèle, l’étude inclura l’administration d’un extrait infusé de Satureja nepeta, plante reconnue pour ses propriétés anti-inflammatoires et antioxydantes, afin d’examiner son effet potentiel, sur les paramètres métaboliques et microbiotiques. Ce travail s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche plus large, visant à mieux caractériser et valoriser les effets santé de ces aliments et extraits végétaux, tout en s’insérant dans une perspective de pratiques agricoles plus durables et responsables.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude et après 6 semaines (2 au total). Pour ce faire les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en 9ème et 10ème semaine. Ces tests nécessitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage dans le cas du test de tolérance au glucose, et une injection intrapéritonéale lors du test de tolérance à l'insuline. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en hébergement individuel des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur valeur de glucose dans le sang. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé en semaine 11. Ce test nécessitera une mise en contention d'une minute pour réaliser le gavage avec la solution permettant d'évaluer la perméabilité intestinale. Durant le protocole, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors du test de tolérance à l'insuline (ITT), ou de tolérance au glucose (OGTT) et du recueil de fèces. Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors du gavage avec une dose de glucose (OGTT), ou une dose d'une molécule utilisée pour mesurer la perméabilité intestinale et lors des injections intrapéritonéales d'insuline (ITT). Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles. Lors des tests OGTT et ITT les animaux seront soumis à des restrictions alimentaires afin de réaliser les tests sur animaux à jeun (4h ou 6h). De même, la vielle au soir de l'euthanasie, les animaux seront mis à jeun. Les souris subiront deux gavages durant le protocole, deux prises de sang à la veine caudale et une injection intrapéritonéale, qui pourraient engendrer des douleurs temporaires et reversibles. Contention des animaux à plusieurs reprises lors des tests OGTT et ITT.

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de pomme mais aussi les effets anti-inflammatoires des différents extraits de la plantes Satureja nepeta

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en poudre de pomme et de l’extrait infusé de la plante Satureja nepeta sur la santé métabolique et le microbiote ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Il n'existe pas de modèle alternatif à l'heure actuelle permettant d'étudier ces paramètres in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux (9 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test de Student, notamment en ce qui concerne la prise de poids. Deux protocoles indépendants ont été regroupés en un même protocole afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à rétablissement. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

504 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à un régime riche en lipides pouvant durer jusqu'à cinquante-deux semaines, et certaines placées seules pendant soixante-douze heures dans une cage métabolique de 500 cm2. S'y ajoutent sept prélèvements sanguins sur animal vigile, des injections dont une en intra-orbitaire, des mises à jeun de huit à seize heures et, pour une procédure, une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le régime provoque une prise de poids, une accumulation de graisse dans le foie, une inflammation de l'organe ou un cancer du foie. Toutes sont tuées pour prélever un millilitre de sang et des organes, celles qui ont passé soixante-douze heures isolées étant tuées parce que ce stress les rend inutilisables pour une autre procédure.

Objectifs

Les maladies du foie liées au métabolisme, appelées maladies hépatiques métaboliques sont des atteintes du foie qui apparaissent dans le cadre du syndrome métabolique. Ce syndrome correspond à l’association de plusieurs troubles liés à l’obésité, comme une augmentation de la graisse abdominale, un diabète, une hypertension ou des anomalies des graisses dans le sang. Ces maladies du foie peuvent rester longtemps silencieuses, mais elles peuvent aussi évoluer vers des formes graves comme la cirrhose ou le cancer du foie. Dans ce dernier cas, le pronostic est très sombre, avec un taux de survie d’environ 10 % à 5 ans. Atteignant plus de 30 % de la population dans les pays occidentaux, ces maladies hépatiques représentent un véritable enjeu de santé publique. L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) les considère désormais comme la première cause de maladies du foie dans ces pays. Même si ces maladies sont souvent associées à l’obésité et au syndrome métabolique, leur origine exacte varie selon les patients et reste encore mal comprise. Cela rend leur prévention et leur traitement particulièrement difficiles. L’une des questions importantes et encore peu explorées concerne le rôle des plaquettes sanguines. Les plaquettes sont de petites cellules du sang qui permettent d’arrêter les saignements et de maintenir l’intégrité des vaisseaux sanguins. Comprendre comment elles pourraient influencer l’apparition ou l’évolution des maladies hépatiques métaboliques ouvre une nouvelle piste de recherche très prometteuse. Ce travail s’inscrit dans une approche globale en tenant compte de l’ensemble du fonctionnement du corps, des organes et de leurs interactions. Cette vision globale est essentielle pour comprendre ces maladies complexes et multifactorielles. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU) différents (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie hépatique et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour prévenir les maladies métaboliques du foie.

Procédures

La souris sera soumise à différents régimes alimentaires riches en lipides de 1, 8, 12, 16 ou 52 semaines en fonction du régime utilisé et du stade de la maladie étudié. La souris sera soumise à des procédures avec des injections (intra-orbitaire : 1 injection de 15 sec, intra-péritonéale : 1 à 2 injections de 15 sec et sous-cutané : 1 injection de 15 sec). 7 prélèvements sanguins de 15 sec sur souris vigile ou 1 prélèvement sanguin terminal de 1-2 minutes sur souris anesthésiée seront réalisés. La souris sera mise à jeun (8h ou 16h) pour les tests de tolérance. Pour une procédure, la souris sera isolée individuellement en cage métabolique d’une surface de 500cm2 sur une durée de 72h. Pour une procédure, une perfusion intra-cardiaque (1 minute) sera réalisée suite à une anesthésie générale et une antalgie locale.

Impact sur les animaux

La mise en régime riche en lipides chez la souris induit différents effets indésirables telles qu’une prise de poids et une accumulation de graisses dans le foie associée à une inflammation de l’organe ou un cancer du foie. Les animaux utilisés dans ce projet pourront éprouver un stress modéré et un inconfort à cause d'injections, de mise à jeun et de mise en isolement.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement sanguin (1 ml de sang) et d’organes pour les procédures 1 et 3. Pour la procédure 2, tous les animaux seront mis à mort ne pouvant pas etre utilisés pour d’autres procédures dû au stress après isolement de 72h.

Remplacement

Les processus qui contrôlent les plaquettes sanguines et les maladies du foie font intervenir de nombreux types de cellules et plusieurs organes, comme le foie, les vaisseaux sanguins, le tissu adipeux ou encore l’intestin. Aujourd’hui, il n’existe pas de modèle en laboratoire capable de reproduire fidèlement toutes ces interactions complexes. A ce jour, aucun système expérimental ne permet d’imiter un foie complet avec ses différents types de cellules et ses vaisseaux et de modéliser ses échanges avec d’autres organes. Notre projet étudie une maladie du foie qui résulte de plusieurs problèmes combinés : des troubles du métabolisme des graisses, de l’inflammation et des anomalies des vaisseaux sanguins. Pour comprendre ces mécanismes, il est nécessaire d’utiliser un modèle vivant capable de reproduire l’ensemble des échanges métaboliques, hormonaux et immunitaires d’un organisme. L’expérimentation animale reste donc, à ce jour, la seule méthode permettant d’étudier cette maladie dans toute sa complexité.

Réduction

Plusieurs résultats seront obtenus à partir d’un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Le nombre de souris utilisées sera réduit au minimum sur la base des études précédentes déjà réalisées au laboratoire et d’analyses statistiques permettant d’obtenir des résultats fiables. Les paramètres mesurés seront analysés à l’aide d’une analyse de variance.

Raffinement

Le suivi des souris sera réalisé 2 fois par jour par les zootechniciens et l’expérimentateur. De l’aliment hydratée pourra être mise à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Si des plaies apparaissent, des soins/désinfections seront prodigués à la souris. En fonction de son état, la souris peut être aussi momentanément séparée de ces congénères. Toutes les procédures invasives utilisent des analgésiques généraux ou locaux. Certains animaux seront transportés à pied selon un tracé bien défini de 5 minutes dans leur cage d’origine placée dans des sacs isotherme de transports à raison de 2 cages par sac de transport. Ceci permet de réduire le stress des animaux car dans l’obscurité et à une température contrôlée. Tout animal faible ou malade ne sera pas transporté et mis à mort avant transport. Les animaux sont ensuite placés dans la salle d’expérimentaion pour une acclimation de 2 h avant l’expérimentation. Si des signes décrits dans la grille de score apparaissent, le zootechnicien ou l’experimentateur doivent se referrer à cette grille de score et agir avec l’accord du responsable du projet. Au bout de 48h si les signes persistentet les points limites atteints, la souris sera mise à mort.

Choix des espèces

Nous utilisons des modèles murins car nous disposons de modèles de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le nombre de plaquettes sanguines chez la souris. Les modèles de drosophiles ou de poissons zèbres ne sont pas utilisables dans le contexte de ce projet de recherche car les plaquettes sanguines sont phénotypiquement et mécanistiquement très différentes de celles de l'Homme, ce qui n'est pas le cas chez les rongeurs. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).

240 souris femelles adultes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur abdomen est ouvert sous anesthésie pour implanter des cellules de cancer colorectal dans la paroi du cæcum, puis elles sont transportées vers un second établissement pour recevoir un traitement trois fois par semaine pendant trois semaines, avec suivi des métastases par imagerie deux fois par semaine. Le porteur signale que la chirurgie peut entraîner souffrance, perte de poids ou infection, et que les métastases hépatiques peuvent causer des gênes, tout en précisant que le foie est un organe "silencieux" qui ne fait pas mal lorsqu'il est colonisé. Sur le remplacement, il indique avoir réalisé les expériences possibles in vitro et devoir maintenant valider ces fonctions dans un "organisme entier".

Objectifs

Le cancer colorectal (CCR) est le troisième cancer le plus fréquent et la troisième cause de décès par cancer. Bien que la plupart des patients atteints de CCR survivent à une chirurgie de la tumeur primitive, la principale cause de décès est la dissémination des cellules cancéreuses dans l’organisme. Lorsque le CCR est détecté à un stade précoce et localisé, le taux de survie à cinq ans est d'environ 90 % ; cependant, après l'apparition de métastases, ce taux chute à moins de 12 %. Le principal organe cible est le foie. Environ 20 à 25 % des patients atteints de CCR présentent des métastases hépatiques au moment du diagnostic, et au moment du décès, jusqu'à 70 % des patients atteints de CCR présentaient des métastases hépatiques. L’objectif de notre recherche est de comprendre les mécanismes métastatiques dans le CCR. Nous nous intéressons en particulier au rôle d’une protéine de choc thermique, HSP110. HSP110 possède un rôle essentiel dans la prolifération des cellules cancéreuses de CCR et leur résistance aux agents chimiothérapeutiques, cependant son rôle dans le développement des métastases hépatiques n’est pas connu. Nous utiliserons un composé chimique inhibiteur spécifique de HSP110 ayant déjà montré son efficacité sur le ralentissement de la croissance tumorale de CCR lors de greffes sous-cutanées non-métastatique. Nous envisageons de tester l’efficacité de ce composé sur l’inhibition de la formation des métastases de CCR, seul et en association avec la chimiothérapie standard et des traitements plus novateurs appelés immunothérapie. Cela constituera une étape préclinique supplémentaire pour ce candidat médicament. En résumé, nous souhaitons explorer dans ce projet le rôle de HSP110 dans la formation des métastases et étudier l’impact de son inhibiteur seul ou associé aux traitements chimiothérapeutiques standards et aux immunothérapies sur ces métastases. Le projet se déroulera entre 2 etablissemnts utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les mécanismes moléculaires mis en jeu par la protéine HSP110 dans la croissance tumorale sont maintenant bien connus in vitro. Cependant, il est nécessaire d’étudier le rôle de HSP110 dans un contexte in vivo pour évaluer son impact dans la formation de métastases hépatiques. Ce projet nous permettra d’évaluer l’efficacité de l’inhibiteur spécifique de HSP110 in vivo dans la prévention des métastases et d’identifier la meilleure combinaison thérapeutique avec une immunothérapie innovante. A terme, ce projet est une condition de la validation pré-clinique de l’utilisation de cet inhibiteur d’HSP110 dans le cancer colorectal dans une perspective d’essai clinique à long terme

Procédures

Les modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (15 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2 (5 minutes de trajet) pour réaliser les traitements (1 minutes par souris) 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. La progression tumorale sera alors suivie par imagerie (sous anesthésie gazeuse) après injection intrapéritonéale de l’agent imageant (1-2 min/souris) deux fois par semaine. Les souris seront conservées encore 2 mois si régression totale de la tumeur qui sera vérifiée 1X par semaine par imagerie.

Impact sur les animaux

Les modèles animaux mimant la formation de tumeurs primaires coliques et métastatiques d’origine colique nécessitent un acte chirurgical. L’ouverture de la cavité abdominale des souris, l’injection des cellules tumorales dans la paroi du caecum sont des interventions pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. L’apparition des métastases peuvent également être à l’origine de souffrance et de gênes, principalement en raison de la perturbation de la fonction hépatique. A noter que le foie est un organe « silencieux » qui ne fait pas mal lorsqu’il est colonisé par des métastases.

Devenir

Les souris ayant été porteuses de tumeurs, elles seront toutes mises à mort à la fin de l’expérience.

Remplacement

Nous avons réalisé les expériences possibles in vitro (capacité de migration en présence ou absence de HSP110 et mécanisme d’action de HSP110) et nous devons valider ces fonctions maintenant dans un organisme entier. Nous continuerons à explorer les mécanismes moléculaires dans le modèle in vivo.

Réduction

Nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possibles. Pour chacune des combinaisons thérapeutiques réalisées lors de nos expérimentations in vivo, nous utiliserons des groupes de 5 souris ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à nos tests statistiques. Les expériences seront réalisées 3x pour contrer la variabilité inter-individus et la possible non prise métastatique. De plus, nous étudierons plusieurs éléments sur un même groupe de souris dès que cela est possible (réduction) et nous réaliserons seulement les expériences les plus indispensables sur les modèles murins.

Raffinement

Limitation du stress. Pour limiter le stress, les souris sont placées par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en plastique leur permettant de se regrouper (nid). Elles seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée. Les séances d’imagerie seront réalisées sous anesthésie. Les animaux seront transférés rapidement pour éviter un stress de l’EU1 à l’EU2 dans un sac de transport (temps de trajet de 5 minutes). Procédures d’étude non invasives (imagerie) : Le gène de la luciférase exprimée par les cellules tumorales injectées permettra d’évaluer par émission de lumière la présence de métastases sur animaux vivants. Procédure d’injection des cellules tumorales : Les souris seront anesthésiées. Elles recevront du gel ophtalmique (évite le dessèchement des yeux) et injection de burpénorphine et application lidocaine. L’imagerie et la chirurgie abdominale sont réalisées sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante ou couveuse (réduction inconfort pour raffinement de l’étude). Au cours d’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Des tapis chauffants seront utilisés pendant l’expérimentation afin de prévenir l’hypothermie. Un suivi (réveil et post anesthésique) sera mis en place après injection des cellules tumorales pour vérifier le retour à une activité normale (confort, vivacité). Les injections de molécules d’intérêt thérapeutique se feront sur animaux vigiles. Surveillance de l’état général des animaux : Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire et une prise en charge antalgique adaptée en pré- et post-opératoire 2X/jour pendant 3 jours. Un système facilitant la prise alimentaire et la prise de boisson sera installé (nourriture gélifiée). Nous avons une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence après injection de luciférine. Au cours des différentes étapes de la procédure et pour chaque animal, la masse pondérale des animaux ne devra pas dépasser ± 20 pour cent de leur poids initial. En cas de dépassement de cette limite de poids, ils seront sacrifiés.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour faire de la chirurgie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines possédant le même fond génétique. Ces souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée ou orthotopique de ces cellules cancéreuses. Nous utiliserons des souris femelles de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adulte. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel. Les souris seront hébergées en groupe afin de diminuer le stress induit par l’isolement.

285 souris âgées de quatre semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une greffe de tumeur osseuse directement dans le tibia, puis des séances de compression du membre trois fois par semaine sous anesthésie. Entre le septième et le dix-huitième jour s'ajoutent deux injections hebdomadaires de doxorubicine ou d'un agoniste TLR4, et trois poses de cathéter dans la veine de la queue pour l'IRM. Toutes sont tuées pour récupérer tumeurs et poumons. Le porteur chiffre à moins de 2 % le risque de douleur lié aux compressions, renvoie les retombées pour les patients à des biomarqueurs d'imagerie encore à identifier, et fixe les points limites sur le volume tumoral, les troubles de la marche et l'apparition de métastases pulmonaires.

Objectifs

L'ostéosarcome est un cancer des os dont le pronostic reste sombre, avec une survie à 5 ans qui chute à 25% chez les patients résistants à la chimiothérapie. Actuellement, les médecins classent les patients comme "bons" ou "mauvais répondeurs" selon l'analyse de la tumeur après chirurgie, mais cette classification ne prédit pas toujours l'évolution réelle de la maladie. Notre hypothèse est que les contraintes mécaniques subies par le membre malade, comme le port d'un plâtre ou la marche, modifient la structure de la tumeur et sa résistance aux traitements. L'objectif principal de ce projet est donc de déterminer si les sollicitations mécaniques appliquées sur une tumeur d'ostéosarcome modifient sa structure, sa vascularisation et sa réponse aux traitements de chimiothérapie. Pour atteindre cet objectif, notre étude se décompose en plusieurs étapes complémentaires. Dans un premier temps, nous développerons les outils d'analyse nécessaires en mettant au point des séquences d'IRM adaptées au suivi de l'ostéosarcome murin et en identifiant les moments clés du développement tumoral. Nous optimiserons ensuite notre dispositif de sollicitation mécanique en déterminant les paramètres optimaux - force, fréquence et durée - pour modifier efficacement la tumeur, puis nous validerons l'efficacité de ce dispositif par un suivi longitudinal. Enfin, nous évaluerons l'impact thérapeutique de ces sollicitations mécaniques en comparant l'efficacité de la doxorubicine et d'un inhibiteur TLR4 sur des tumeurs sollicitées versus non sollicitées. Cette approche nous permettra d'identifier de nouveaux marqueurs d'imagerie prédictifs de la réponse au traitement. Cette étude vise ainsi à améliorer la prise en charge des patients en proposant de nouveaux biomarqueurs non-invasifs et en apportant une meilleure compréhension de l'influence des contraintes mécaniques sur l'évolution tumorale.

Bénéfices attendus

Cette étude apportera une compréhension nouvelle de l'influence des contraintes mécaniques sur le développement des tumeurs osseuses. Elle établira pour la première fois un lien direct entre sollicitations biomécaniques et évolution tumorale dans l'ostéosarcome, comblant un manque important dans la littérature scientifique. L'identification de nouveaux biomarqueurs prédictifs de la réponse aux traitements permettra aux cliniciens de mieux personnaliser les thérapies. Cette approche pourrait améliorer le taux de survie des 2000 nouveaux cas d'ostéosarcome diagnostiqués chaque année en Europe, particulièrement les 75% de patients actuellement classés comme "mauvais répondeurs". La compréhension des mécanismes biomécaniques ouvrira la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques intégrant la dimension mécanique dans la prise en charge. Cela pourrait conduire au développement de protocoles de rééducation ou de dispositifs médicaux innovants pour optimiser la réponse aux traitements.

Procédures

Jour 0 : Analgésie préventive par administration sous-cutanée (buprénorphine), greffe tumorale orthotopique intratibiale sous anesthésie (isoflurane) (total 10 minutes) Entre J7 et J18 : Test de sollicitation mécanique (3x/semaine) sous anesthésie (isoflurane) (total 10-15 minutes) Traitement agoniste TLR4 (2x/semaine) sous anesthésie (isoflurane) (total 10 minutes) + contrôle Traitement sérum physiologique sous anesthésie. Traitement doxorubicine (2x/semaine) sur animal vigile, injection intrapéritonéale (total 5 minutes) Jours 14, 16, 18 : Un cathéter intraveineux sera placé au niveau de la veine caudale permettant l’injection d’un produit de contraste : une détersion ainsi qu'une application de xylocaïne sont préalablement réalisées sur la queue, puis le cathéter intravéneux

Impact sur les animaux

Nuisances liées aux anesthésies et aux imageries Les anesthésies répétées à l'isoflurane (3 fois par semaine pour les sollicitations mécaniques plus séances d'IRM) peuvent provoquer un stress physique et thermique temporaire. Le risque d'hypothermie pendant l'anesthésie est faible (moins de 5%) grâce aux tapis chauffants utilisés. Les IRM nécessiteront la pose d’un cathéter veineux caudal qui peut engendrer une légère douleur au réveil. Nuisances spécifiques aux sollicitations mécaniques Bien que calibrées pour reproduire le poids physiologique de l'animal, les compressions répétées peuvent induire une fatigue musculaire temporaire ou un inconfort mineur. Le risque de douleur ou de lésion est très faible (estimé à moins de 2%) car les forces appliquées restent dans les limites physiologiques. Nuisances liées au développement tumoral Le développement de l'ostéosarcome peut provoquer une douleur liée à la lyse osseuse, se manifestant par une claudication. En cas d'apparition de métastases pulmonaires, une gêne respiratoire peut survenir avec une fréquence respiratoire irrégulière.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour la récupération et l’analyse de tumeurs et poumons. Ces analyses sont indispensables pour apprécier l’influence des sollicitations mécaniques sur la formation des tissus et les populations cellulaires.

Remplacement

Nous avons analysé des tumeurs d’ostéosarcome de souris d’études précédentes pour confirmer l’efficacité de nos logiciels de traitement d’image. Tout le matériel de sollicitations mécaniques, ainsi que les techniques d’analyse des tissus ont été testé sur des pattes de souris imprimées en 3D ou bien des pattes greffées de souris surnuméraires. La modélisation numérique a été utilisée pour confirmer l’intérêt de la bague de serrage et pour tenter d’anticiper le comportement in vivo d’une patte compressée. Le maximum a été donc fait en amont n’utiliser des animaux qu’au moment crucial de préciser nos protocoles et de tester les traitements.

Réduction

Notre méthode est divisée en plusieurs étapes : d'abord, nous mettons au point les techniques d'IRM, ensuite, nous paramétrons les aspects mécaniques, et enfin, nous affinons ces choix en étudiant le développement de la tumeur sous ces conditions et sur le temps. Cette approche nous permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs à chaque étape, en ajustant les étapes suivantes en fonction des résultats intermédiaires. Tous les animaux utilisés dans ces procédures contribueront à nos résultats, car toutes les tumeurs seront collectées et analysées, et tous les individus seront suivis par IRM. Les jours où les animaux seront sacrifiés correspondent à trois moments clés identifiés dans des études précédentes, que nous souhaitons approfondir avec notre étude mécanique, ainsi qu'à deux jours intermédiaires choisis pour leur intérêt dans le développement tumoral. Le nombre d'animaux sacrifiés à chacun de ces jours est le minimum nécessaire pour obtenir des statistiques pertinentes à un instant donné de l'étude.

Raffinement

Avant de commencer l'étude, les souris auront une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement (pièce, cage, etc.). Elles seront placées ensemble pour maintenir un environnement social et réduire le stress. Les souris ne seront déplacées de leur cage que pour les procédures sous anesthésie (comme l'IRM, les tests mécaniques, la mesure du volume tumoral, la coupe des griffes, la pesée, etc.), qui se dérouleront dans une salle spécialement prévue à cet effet. Les cages utilisées sont standard, avec de la nourriture et de l'eau disponibles à volonté, de la litière, du matériel de nidification, ainsi que des tunnels, des promontoires et des bûchettes pour enrichir leur environnement. Toutes les précautions seront prises lors de la manipulation des souris, et des interactions fréquentes avec le personnel aideront à réduire leur stress pendant les procédures. Les tests seront espacés d'au moins une journée de repos. Bien que les tests mécaniques soient légers, de l'ordre du poids de l'animal sur une patte et réalisés sous anesthésie, de la nourriture sera placée dans la cage pour limiter la fatigue et le stress. Les souris testées seront surveillées plus particulièrement après leur réveil. L'anesthésie se fera sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Les procédures susceptibles d'induire douleur, stress ou immobilisation prolongée sont réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie, avec des mesures de soutien et une surveillance adaptée afin de limiter l'inconfort des animaux. Des points limites précoces sont définis sur la base de l'évolution du volume tumoral, de l'apparition de troubles de la marche, de changements de comportement et de signes de douleur, ainsi que de la présence de métastases. Les animaux bénéficient d'un suivi clinique renforcé qui permet une prose en charge précoce et adaptée de tout mal être des animaux.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé combiné au modèle de cellules tumorales que nous greffons permettent d’avoir des résultats répétables et déjà renseignés dans la littérature et par nos études précédentes. Cela permet par ailleurs la validation de protocoles répétables à l’avenir sur des souris communément utilisées dans les études précliniques sur des modèles vivants. Ces souris maintiennent de plus un système immunitaire fonctionnel pendant le développement tumoral, ce qui permet de reproduire fidèlement l’évolution naturelle de l’ostéosarcome humain, incluant le développement de métastases pulmonaires. L'anatomie des pattes de souris, avec un tibia facilement accessible et une taille compatible avec notre dispositif de compression, permet l'application contrôlée de contraintes mécaniques reproductibles. Le rapport poids/taille de la souris facilite la calibration des forces appliquées en équivalent du poids corporel, transposable aux contraintes physiologiques humaines. Les souris sont utilisées à l'âge de 4 semaines, correspondant à une phase de croissance osseuse active. A ce stade, le tissus osseux présente des propriétés mécaniques suffisantes pour les procédures expérimentales tout en conservant une capacité de remodelage. Ce stade de développement est pertinent pour l'étude de la croissance tumorale osseuse et permet un suivi expérimental complet sur la durée des procédures.

Les souris utilisées portent un phénotype dommageable, avec perte de poids, déficits olfactifs et cognitifs, risque accru de crise d'épilepsie et mortalité précoce. 1 560 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées. Chacune reçoit une injection dans les jours qui suivent sa naissance, une partie subit ensuite une injection dans le cerveau d'une heure, une autre une seconde injection suivie de la mise à mort avant tout réveil, l'ensemble s'étalant selon les lots de un mois à un an. La mise à mort sert à vider les vaisseaux de leur sang, qui gênerait l'immunofluorescence, et le porteur signale que manipuler les souriceaux avant le sevrage peut conduire la mère à les rejeter.

Objectifs

Parmi les défis actuels en santé publique, la maladie d’Alzheimer (MA) tient une place importante de par sa fréquence et l’absence de traitement. Le rôle des astrocytes, cellules gliales majoritaires du cerveau qui contactent à la fois les neurones et les vaisseaux sanguins, dans la MA a été récemment déterminé. Cependant, l’impact de la maladie d’Alzheimer (MA) et de sa progression sur les contacts entre les astrocytes et les vaisseaux sanguins demeure mal connu, en particulier au niveau de l’interface appelée unité gliovasculaire (UGV). Le rôle éventuel de cette interface dans la physiopathologie de la maladie reste également à déterminer. Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle des astrocytes et de l’unité gliovasculaire dans la maladie d’Alzheimer à différents stades de progression de la pathologie, dans le but d’explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Il nécessite l’utilisation de 1560 animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur la contribution des astrocytes et de l’unité gliovasculaire dans la maladie d’Alzheimer, dans le but d’explorer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux recevront tous une première injection quelques jours après leur naissance durant 1 minute maximum. Puis, un premier lot d’animaux recevra quelque temps plus tard (entre 1mois et 1 an plus tard) une seule injection supplémentaire avant d’être mis à mort juste après celle-ci (temps total 45 min), un second lot subira dans un premier temps une injection dans le cerveau (1h) avant quelque mois plus tard de recevoir eux aussi une seule injection suivit de la mise à mort comme le précédent lot. Enfin un dernier lot d’animaux recevra une injection dans le cerveau (1h).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées pour nos expériences ont un phénotype dommageable, notamment marqué par une perte de poids, des déficits olfactif et cognitif, une augmentation du risque de crise épileptique et une mortalité précoce. Certains lots de souris subiront une injection non douloureuse mais pouvant entraîner une légère irritation au point d'injection pendant quelques heures maximums. Certains lots de souris subiront une seconde injection pouvant entrainer une irritation mais celle-ci est suivie de la mise à mort des animaux avant leur réveil. Certains lots souris subiront une injection dans le cerveau qui peut entrainer des effets modérés liés à la chirurgie pouvant durer 2-3 jours. La manipulation des souriceaux avant sevrage peut entrainer leur rejet par la mère.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour les analyses histologiques. Ces analyses nécessitent que les vaisseaux sanguins ne contiennent plus de sang car sa présence interfère avec l'expérience d'immunofluorescence.

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Après avoir vérifié la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype, les effets entre les différents groupes selon le génotype et les stades de développement seront évalués. En cas de non normalité, les tests non paramétriques seront utilisés. Pour réduire la sur-utilisation des animaux possiblement liée à la chirurgie, les expérimentateurs sont formés et supervisés de façon adéquate. Pour nos questions, il faut obtenir des observations sur 5 animaux indépendant par condition. Ce chiffre est un minimum qui tient compte de la variabilité connue intrinsèque au modèle. En effet, la formation des plaques amyloides peut varier d’une souris à l’autre pour un même stade. Une marge de 5% a été ajouté au nombre total afin de pallier aux potentielles pertes liées au geste chirurgical ou à l’anesthésie.

Raffinement

Les souris subissant une opération feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure de chirurgie et les jours suivants. L'intervention pouvant générer de l'inconfort et de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. Une grille graduée pour la surveillance post opératoire des animaux est mise en place afin de définir des point limites précoces et des points d’intervention intermédiaires. Des analgésiques sont prévus et coadministrés pour limiter la souffrance pendant et après la chirurgie. Les souriceaux sont manipulés au minimum et l'environnement de la cage est enrichi après les manipulations pour éviter le rejet des petits par la mère. Les souris présentant un phénotype dommageable seront surveillés (poids et comportement social) et les animaux présentant des signes d'inconfort (amaigrissement, isolement du groupe) seront euthanasiés sous anesthésie profonde avec une analgésie adaptée.

Choix des espèces

La souris partage 98% de son génome et permet ainsi dans la majorité des cas de pouvoir mimer une pathologie humaine via des modèles génétiquement modifiés. De plus cette espèce de petite taille présente une courte durée de gestation et génère un grand nombre de petits dans ses portées, ce qui en fait un modèle mammifère idéal. Nous souhaitons étudier l’UGV à différents stades de progression de la MA, qui est caractérisée par le dépot progressif d'aggrégats amyloïdes. On utilisera les souris à 1 mois, 3 mois (stades sans dépôts amyloïdes), 6 mois, 9 mois et 1 an (stade présentant des dépôts amyloïdes).