Rongeurs
Caractérisation du rôle différentiel de la voie corticospinale issue du cortex moteur ou sensoriel primaire dans la locomotion
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
149 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de deux à trois heures sous anesthésie pour recevoir des injections virales dans le cortex et un dispositif d'enregistrement implanté, puis, une semaine plus tard, des séances de locomotion fine pouvant durer une heure, précédées d'une injection sur animal vigile. Certaines sont isolées vingt-quatre à quarante-huit heures, et le porteur signale une perte de poids ainsi que des démangeaisons aux sutures dans les jours qui suivent l'opération. L'objet est de distinguer le rôle des neurones venus du cortex moteur de ceux venus du cortex sensoriel dans le contrôle de la marche, un circuit que le porteur juge impossible à modéliser numériquement parce que les propriétés des éléments en jeu sont encore méconnues.
Objectifs
Chez les rongeurs, la marche et les mouvements de base peuvent être générés par la moelle épinière seule. Cependant, pour des actions plus complexes, comme franchir des obstacles ou marcher sur une échelle horizontale, le cerveau, et en particulier le cortex sensorimoteur, est indispensable pour ajuster et affiner les mouvements. La voie corticospinale, qui relie directement le cortex à la moelle épinière, joue un rôle central dans cette coordination. Des études précédentes ont montré que cette voie est essentielle pour le mouvement, mais elles ne distinguaient pas les neurones provenant du cortex moteur (M1) de ceux du cortex sensoriel (S1). Or, des travaux récents suggèrent que ces deux populations ciblent des circuits différents dans la moelle épinière et pourraient donc contribuer différemment au contrôle des mouvements et à la perception sensorielle. Notre projet vise à comprendre de manière précise le rôle spécifique des voies corticospinales issues de M1 et de S1.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera plusieurs bénéfices, à court et à long terme. À court terme, il permettra de mieux comprendre comment les différentes parties du cortex contrôlent les mouvements en fonctions de leur difficulté. À long terme, ces avancées pourraient avoir des retombées pour la recherche médicale. En comprenant mieux le fonctionnement de la voie neuronale qui va du cortex jusqu’à la moelle épinière, ce projet pourrait ouvrir la voie à des stratégies thérapeutiques plus ciblées pour traiter certaines affections neurologiques, comme la sclérose amyotrophique latérale, qui affecte particulièrement ces neurones.
Procédures
Les animaux subiront, sous anesthésie, une chirurgie d’environ deux à 3 heures pour injections virales et implantation de dispositif d’enregistrement. Au minimum 1 semaine après la chirurgie, les animaux effectueront des tâches comportementales de locomotion fine. Ces tâches durent une dizaine de secondes et sont répétées pendant un maximum 1h. 30min avant le début de la tache comportementale, vigiles, ils subiront une injection de substance active de quelques secondes. Une à 2 sessions comportementales, espacées d’une semaine, sont prévues.
Impact sur les animaux
Les chirurgies entraînent inévitablement un stress et des douleurs modérées et transitoires chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entraîner une gêne ou des démangeaisons qui disparaît également en quelques jours. Les tests comportementaux envisagés peuvent également être source de stress pour les animaux, ainsi que les contentions et les injections effectuées pendant les tests. Certains animaux devront être isolés pendant 24 à 48h, ce qui est également un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.
Remplacement
Le projet porte sur le rôle de l’inhibition présynaptique dans le contrôle de la locomotion, c’est-à-dire un circuit comprenant une sortie physiologique complexe. Un tel circuit est impossible à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doit être intact pour pouvoir être étudié. Il est impossible à modéliser numériquement car les propriétés des différents éléments sont encore méconnues. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini mathématiquement au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement fiables et robustes. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et obtenir des résultats spécifiques de genre. Les expériences seront effectuées de façon séquentielle, afin de finaliser les expériences de mise au point des différents outils avant d’effectuer les expériences de comportement, ce qui permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Un temps d’habituation à la pièce et au dispositif d’enregistrement est prévu, sur 20-30 minutes pendant deux jours consécutifs. Pendant les tests comportementaux, une couverture de 5cm de mousse souple est placée sous le dispositif expérimental, afin d’amortir une éventuelle chute de l’animal. Des animaux qui ne subissent pas les chirurgies sont hébergés avec les animaux tests. Ils sont présents sur la plateforme d’arrivée des tests de comportements, réduisant ainsi le stress des animaux tests et les motivant à faire les tâches sans qu’une restriction hydrique soit nécessaire. Du coton de nidification est prélevé dans la cage d’hébergement, et frotté sur le dispositif expérimental afin de diminuer le stress des animaux. Les animaux sont manipulés grâce à une petite coupelle en plastique, afin d’éviter la préhension répétitive par la queue.
Choix des espèces
Pour étudier comment certains neurones contrôlent les mouvements, nous utilisons la souris. Ce choix est justifié car la souris permet de cibler très précisément des neurones grâce à des outils scientifiques avancés. Cela aide à comprendre comment les signaux vont des différentes zones du cortex jusqu’à la moelle épinière et in fine pour contrôler les muscles. La souris permet aussi de moduler l’activité des neurones tout en observant les animaux bouger librement, ce qui est difficile à faire avec d’autres animaux. De plus, beaucoup d’études existent déjà sur les circuits nerveux de la moelle épinière de la souris, ce qui facilite l’analyse des résultats. Nous travaillons avec des souris d’au moins 21 jours, car à cet âge les circuits de contrôle des mouvements sont complètement développés et stables. Cela garantit que les résultats ne sont pas influencés par la croissance.
Etude hématologique d’un modèle murin DNM2 humanisé
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tout souriceau sans lait visible dans l'estomac pendant vingt-quatre heures est mis à mort, comme tout individu dont la peau devient bleutée entre six et douze jours de vie. 150 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, aucune ne survivant au projet. Les 90 souriceaux porteurs de la version humaine de la protéine DNM2 naissent anémiés, plus petits et plus pâles, et meurent d'eux-mêmes entre onze et quatorze jours, 60 embryons étant par ailleurs prélevés aux stades E13.5 et E14.5. Aucun geste ne leur est infligé de leur vivant, la souffrance venant de la modification génétique elle-même, l'analyse du sang intervenant après décapitation à douze jours. Le porteur fixe ce prélèvement à douze jours, âge auquel environ 80 % des souris anémiées sont encore en vie.
Objectifs
Les myopathies sont des maladies qui touchent les muscles. Elles provoquent une faiblesse générale et des difficultés à se déplacer. Parmi les gènes impliqués, DNM2 joue un rôle important, notamment dans les formes les plus sévères de ces maladies. Pour mieux comprendre comment ces myopathies se développent chez l’être humain, les souris dont certains gènes ont été modifiés sont utilisées. Dans ce projet, l’objectif est d’étudier une souris « humanisée » : elle fabrique la version humaine de la protéine DNM2, mais ne produit plus la version propre à la souris. Même si les protéines DNM2 humaine et de souris se ressemblent beaucoup (elles sont identiques à 98 %), les premières observations montrent que ces souris humanisées sont plus petites, plus pâles et qu’elles meurent très jeunes, entre 11 et 14 jours après la naissance. Nous aimerions donc réaliser une étude du sang (une analyse hématologique) chez ces souris pour comprendre pourquoi remplacer la protéine de souris par la protéine humaine entraîne de tels problèmes, notamment sur les fonctions du sang.
Bénéfices attendus
Le projet vise à mieux comprendre la protéine DNM2, à découvrir de potentielles nouvelles fonctions hématologiques et à déterminer quelles parties de la protéine (là où il y a des différences entre la protéine de souris et la protéine humaine) sont importantes pour ces fonctions.
Procédures
Les animaux ne subiront pas d'interventions mais des biopsies seront prélevées après mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux humanisés présentent des signes d'anémie aux effets indésirables comme la fatigue et la faiblesse musculaire. Comme les animaux n'ont pas besoin de se déplacer et sont nourris par la femelle jusqu'à leur mise à mort, nos prévoyons de mettre en place un environnement enrichi avec tunnel transparent et une grande quantité de littière et des accouplements (une seule femelle sera mis en accouplement avec un mâle) seront mis en place.
Devenir
Les animaux d'expérience seront mis à mort à 12 jours pour l'étude hématologique (90 animaux), au stade embryonnaire E14.5 pour la quantification de l'hémoglobine (30 animaux) et au stade embryonnaire E13.5 pour la production de lignées cellulaires pour tests d'endocytose (30 animaux).
Remplacement
Comme nous voulons étudier les différences fonctionnelles des protéines de souris et les protéines humaines sur des anomalies de sang, le modèle murin est incontournable. La souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra de mieux comprendre les voies de signalisation impliquée dans le développement de l'anémie des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au minimum pour obtenir une puissance statistique suffisante soit 10 animaux par génotype par analyse (comme nous avons 3 génotypes wt, Tg et Hum, 30 animaux par analyse). Nous prévoyons de faire des analyses hématologiques à P12 sur sang total (30 animaux), sur plasma (30 animaux), et pour des mesures de cytometrie en flux (30 animaux). Nous prévoyons également de faire une analyse d'expression de l'hémoglobine sur des embryons au stade E14.5 (30 animaux) et des productions de lignée cellulaire avec des emrbyons au stade E13.5 (30 animaux) pour tests d'endocytose. Nous prévoyons donc un total de 150 animaux d'expérience.
Raffinement
Nous allors réaliser nos prélèvements de sang à P12, âge où la grande majorité des animaux humanisés sont encore en vie et où le prélèvement de sang après décapitation est suffisant pour nos analyses hématologiques. Comme les animaux d'expérience ne seront pas sevrés, afin d’améliorer le bien-être des géniteurs et de diminuer au maximum le stress lié aux nouveaux-nés anémiques, nous incluerons un environnement enrichi avec tunnel transparent et une grande quantité de littière ainsi que des couples adaptés avec une seule femelle mis en accouplement avec un mâle. Les animaux humanisés pour l'étude hématologiques seront mis à mort à 12 jours, ils ne seront donc pas sevrés. Nous compterons les animaux à P0 et nous nous assurerons qu'ils soient bien en groupe dans le nid attestant que la femelle s'occupe de ses petits. Tout animal délaissé sera mis à mort pour éviter l'hypothermie et l'hypoglycémie. Nous apporterons une attention particulière aux points limites suivants : 1) l'absence de prise alimentaire par observation de l'estomac de P0 à P6 : tout animal sans lait visible dans l'estomac pendant 24h sera mis à mort. 2) de P6 à P12 la couleur de la peau sera obervée et tout animal cyanosé sera mis à mort. Nous suveillerons l'attitude de la mère et tout animal délaissé ou ne réagissant pas à une stimulation lors de l'ouverture du nid sera euthanasié pour éviter hypothermie et hypoglycémie.
Choix des espèces
Comme la souris fonctionne de manière assez similaire à l’être humain, elle est un bon modèle pour comprendre ce qui se passe dans l’organisme lorsqu’une anémie se développe. Pour découvrir de nouvelles fonctions de la protéine DNM2, nous devons analyser le sang de souris âgées de 12 jours : à cet âge, environ 80 % des souris atteintes d’anémie sont encore vivantes, et il est possible de prélever assez de sang pour effectuer les analyses nécessaires. Concernant les biopsies de foie fœtal, il existe une étape normale du développement où l’hémoglobine « fœtale » est remplacée par l’hémoglobine « adulte ». Chez une souris normale, ce changement est pratiquement terminé au stade embryonnaire appelé E14.5. Nous voulons vérifier si ce passage se déroule au même rythme chez les souris « humanisées », ou s’il est retardé. Enfin, pour étudier certaines fonctions cellulaires (comme l’endocytose), nous devons obtenir des cellules particulières provenant d’embryons. Pour cela, il est nécessaire d’interrompre le développement des embryons précisément au stade E13.5.
Utilisation de souris transgéniques pour étudier des intéractions protéiques lors de la mobilisation des graisses – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Neuf jours de régime cétogène ou vingt heures de jeûne, une pesée quotidienne, une piqûre de la veine caudale tous les deux jours pour mesurer la glycémie, un gavage libérant des graisses dans le sang, puis un prélèvement à la veine sous-mandibulaire juste avant la mise à mort. 1 258 souris transgéniques vont être utilisées ainsi, toutes tuées pour prélever le sang et les organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la moitié d'entre elles et modéré pour l'autre moitié. Le projet porte sur les interactions entre trois protéines du foie lors d'un afflux d'acides gras, dont le porteur attend "une contribution à la recherche biomédicale". Des points limites gradés portent sur le poids, l'apparence et le comportement, et il indique qu'un animal qui les atteint est retiré de la procédure et replacé en hébergement standard.
Objectifs
Le foie est un organe majeur qui est capable de s’adapter aux différents changements nutritionnels auxquels nous sommes exposés (période de jeûne, régime enrichi ou carencé en certains nutriments, …). Par exemple, lors d’un jeûne, le foie est le lieu de production du sucre nécessaire au fonctionnement de l’organisme en période de carence en nutriments. Cette grande capacité du foie à s’adapter à différents statuts nutritionnels est principalement assurée par des protéines spécifiques. Parmi ces protéines importantes lors de périodes de jeûne figure la protéine PPARa, qui est également importante lors de la consommation d’un régime cétogène (très riche en graisses et pauvre en sucres). Dans ce projet, pour étudier les interactions entre PPARa et 2 autres protéines lors d'un afflux d'acides gras arrivant au foie, nous générerons des souris dont le gène PPARa et le gène d’autres protéines ne sont plus fonctionnels dans le foie. Les animaux seront soumis à une période de jeûne ou à un régime cétogène ou traités avec une molécule pharmacologique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les différentes protéines qui sont impliquées lors du jeûne et de la consommation d’un régime cétogène, qui sont 2 interventions nutritionnelles actuellement étudiées pour leurs effets bénéfiques dans plusieurs pathologies. Ainsi, les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.
Procédures
Des groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou un régime cétogène riche en graisses et pauvre en sucre pendant 2 semaines. MODIFICATION : durée du régime réduite à 9 jours. Les animaux seront pesés chaque semaine. MODIFICATION : pesée des animaux tous les jours. La glycémie sera mesurée chaque semaine (2 fois au total) par prélèvement d’une seule goutte de sang à la queue (petite piqûre de la veine caudale avec une lancette de 1 mm). La mesure ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. MODIFICATION : mesure de la glycémie tous les 2 jours. Juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire. D’autres groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou mis à jeun pendant 20h. Après les 20h de jeûne et juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire. D’autres groupes d’animaux seront traités par gavage avec une molécule pharmacologique permettant la libération d’une grande quantité de graisses dans la circulation sanguine. Le gavage prend moins de 30 secondes. Six heures après et juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire.
Impact sur les animaux
Le jeûne peut induire une baisse de la glycémie et de la température corporelle. Le régime cétogène peut induire une perte de poids et une baisse de la glycémie. MODIFICATION : le régime cétogène peut induire une diminution de la prise alimentaire conduisant à une réduction de la mobilité. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une légère douleur. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et une légère douleur. Le gavage peut entraîner un stress des animaux.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation de l’animal entier car les réponses de l’organisme engendrées par les interventions pharmacologiques nutritionnelles (jeûne et régime cétogène) étudiées sont complexes et ne peuvent pas être mimées avec fidélité en culture cellulaire. En effet, plusieurs organes de l'organisme communiquent entre eux. L’utilisation de souris transgéniques de laboratoire est appropriée car il est possible d'étudier le rôle de protéines spécifiques.
Réduction
Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.
Raffinement
Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant la piqûre permettant de prélever une goutte de sang. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons les consommations alimentaire et hydrique. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.
Choix des espèces
L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.
Etude des mécanismes et réponses immunitaires des allergies alimentaires chez la souris, test de candidats médicaments et thérapies innovantes
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 600 d'entre elles et modéré pour 1600, avec jusqu'à cinq prises de sang sous la mâchoire par souris, une par semaine. Pour rendre des souris allergiques à l'arachide puis déclencher une réaction allergique, du beurre d'arachide leur est administré par sonde gastrique, un geste qui peut léser l'œsophage et le foie, et certaines reçoivent des traitements par injections répétées. Le porteur décrit des douleurs inflammatoires, diarrhées et douleurs abdominales, pouvant entraîner hypothermie et perte de poids, et un "stress important" lié à la manipulation répétée. Il annonce au futur, sans conditionnel, une meilleure prise en charge des personnes allergiques et moins d'hospitalisations. Il écarte une prise volontaire du beurre d'arachide, qui éviterait la sonde, parce qu'elle "demande une étape d'entrainement importante" avant de garantir la quantité absorbée.
Objectifs
Les allergies alimentaires et les réactions graves qu’elles peuvent provoquer, comme l’anaphylaxie (une réaction très rapide pouvant mettre la vie en danger), constituent aujourd’hui un important problème de santé publique. Leur fréquence augmente et elles peuvent être très sévères. En Europe, on estime que 3 à 6 % des adultes et 6 à 13 % des enfants sont concernés. L’allergie à l’arachide est l’une des plus redoutées. Lorsqu’une personne allergique en consomme, elle peut développer des symptômes digestifs (vomissements, diarrhée, douleurs au ventre), cutanés (gonflements), respiratoires (difficultés à respirer) et cardiovasculaires (baisse de la tension), pouvant aller jusqu’à la perte de connaissance et, dans de rares cas, au décès. Pour mieux comprendre ces allergies et développer de nouveaux traitements, les chercheurs utilisent des modèles animaux, notamment des modèles chez la souris. Cela permet d’étudier de près les mécanismes biologiques qui déclenchent l’allergie et l’anaphylaxie. L’objectif de ce projet est de créer et d’analyser un modèle de souris allergiques à l’arachide (par exemple au beurre d’arachide). Ce modèle aidera à mieux comprendre comment l’allergie se développe, comment la réaction allergique survient et quels sont les mécanismes immunologiques impliqués. À terme, il servira aussi à tester de nouveaux médicaments ou stratégies thérapeutiques contre l’allergie à l’arachide. Le projet se déroule en trois procédure autour des objectifs spécifiques suivants : 1. Développer le modèle d’allergie alimentaire o Mettre au point un protocole reproductible pour rendre les souris allergiques à l’arachide et déclencher une réaction allergique. o Déterminer les doses, la fréquence et les conditions qui provoquent une réaction allergique fiable et spécifique. 2.Tester des composés à visée thérapeutique o Évaluer l’efficacité de candidats médicaments pour réduire ou prévenir la réaction allergique. 3. Etudier les mécanismes biologiques impliqués o Analyser les voies de signalisation et les réponses immunitaires activées dans ce modèle.
Bénéfices attendus
L’allergie à l’arachide est l’une des allergies alimentaires les plus graves. Elle peut durer toute la vie et provoquer des réactions très violentes, comme le choc anaphylactique, qui peut être mortel. Aujourd’hui, il n’existe aucun traitement pour guérir cette allergie : la seule solution est d’éviter complètement l’arachide et de savoir réagir en cas d’urgence. Ce projet vise plusieurs objectifs importants : • Mieux comprendre comment et pourquoi le corps devient allergique à l’arachide, en étudiant les mécanismes du système immunitaire impliqués dans ces réactions. • Créer un modèle animal fiable pour pouvoir tester de nouveaux médicaments, des méthodes pour rendre les patients moins sensibles à l’arachide, ou de nouvelles formes d’immunothérapie. • Identifier des marqueurs biologiques capables de prédire la gravité de l’allergie ou la manière dont un patient répondra à un futur traitement. Ces avancées permettront d’améliorer la prise en charge des personnes allergiques, de réduire le nombre d’hospitalisations dues aux réactions graves, et de favoriser le développement de traitements plus ciblés et mieux tolérés à l’avenir.
Procédures
L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements et le prélèvement submandibullaire (5x maximum, et 1x/semaine) peuvent induire une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et un stress. L'administration intragastrique peut entraîner chez les animaux des lésions au niveau de l’œsophage et du foie, ainsi qu’un stress important lié à la manipulation répétée. Les souris en expérimentation sont observées tous les jours pour identifier d’éventuels effets indésirables et d’éventuels signes de souffrance.
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie par exemple diarrhée, douleurs abdominales comme chez l’homme. La douleur pourra générer une hypothermie et/ou une perte de poids. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. L'administration intragastrique peut entraîner chez les animaux des lésions au niveau de l’œsophage et du foie, ainsi qu’un stress important lié à la manipulation répétée. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements et le prélèvement submandibullaire peuvent induire une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et un stress. Les souris en expérimentation sont observées tous les jours pour identifier d’éventuels effets indésirables et d’éventuels signes de souffrance. Nous proposons donc une procédure de suivi utilisant une grille de score. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet pourront présenter un phénotype dommageable du fait de leur sensibilité plus élevée aux infections, car elles présentent une absence de défenses immunitaires efficaces. Si elles sont contaminées par des bactéries et/ou virus, cela entrainerait leur décès. Si nous sommes amenés à en utiliser, elles seront donc hébergées en portoir ventilé où il y a une très haute protection contre ces agents pathogènes empêchant ainsi l’expression de ce phénotype. Ce statut est également garanti durant les différentes manipulations pendant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris s'il y a lieu).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques nécessaires à la validation du modèle et l’analyse de l’effet des différentes molécules et thérapies testées.
Remplacement
La mise en place d’un modèle murin d’allergie alimentaire à l’arachide implique nécessairement l’utilisation d’un organisme entier. En effet, les mécanismes allergiques requièrent une complexité physiologique et immunologique qui ne peut être reproduite in vitro à ce jour. Néanmoins, une stratégie active de remplacement partiel a été intégrée dans la conception du projet : • Avant de démarrer les phases in vivo, une caractérisation biochimique poussée des extraits /ou beurre d’arachide est effectuée in vitro, afin de valider les lots expérimentaux et limiter les tests sur animaux. • Des cultures cellulaires primaires ou lignées humaines sont utilisées pour tester in vitro la réactivité aux extraits. Ces approches permettent d’optimiser la qualité des extraits et de prédire leur capacité à induire une réponse immunitaire. Cependant, le déclenchement et l’étude fine de la réaction allergique, de l’inflammation intestinale in situ et des paramètres cliniques systémiques nécessitent une approche in vivo. Aucun substitut ne permet actuellement d’évaluer de manière fiable les conséquences physiopathologiques complètes d’une exposition répétée à un allergène alimentaire chez l’humain.
Réduction
Une attention particulière est portée à la réduction du nombre d’animaux utilisés tout au long du projet. Cette réduction repose sur une planification expérimentale rigoureuse, sur l’analyse statistique en amont, et sur l’exploitation optimale des données récoltées. Plusieurs mesures concrètes de réduction sont mises en œuvre : 1. Tests pilotes préalables : Un petit nombre d’animaux (n < 10) sera utilisé dans une phase préliminaire pour identifier les doses optimales d’allergène, les modalités de sensibilisation et les fenêtres de provocation les plus pertinentes. Cela évitera les essais multiples à grande échelle. 2. Calcul de puissance statistique : Les effectifs animaux par groupe sont justifiés par une analyse de puissance (power analysis) permettant d’atteindre une significativité statistique avec un minimum d’animaux (généralement 6 à 10 par groupe selon les variables mesurées). 3. Utilisation de groupes partagés : Certains groupes témoins (souris naïves ou sensibilisées mais non provoquées) peuvent être communs à plusieurs sous-expériences si les conditions restent identiques. Cela limite le nombre total de groupes expérimentaux.
Raffinement
Le projet intègre de nombreuses mesures de raffinement visant à minimiser la douleur, le stress, et les souffrances potentielles des animaux, tout en améliorant la qualité des données scientifiques obtenues. Les mesures principales ci-dessous listées seront mises en œuvre : Sélection des méthodes les moins invasives possibles : o La voie intragastrique est privilégiée à la voie intrapéritonéale lorsque possible. o L’utilisation d’aiguilles fines, la réduction du nombre d’injections, et le recours à des formulations douces sont privilégiés. Nous n'envisageons pas de faire un apprentissage d'administration du beurre d'arachide de manière volontaire sans passer par l'administration intragastrique car cela demande une étape d'entrainement importante avant de pourvoir réaliser ce geste et de garantir la quantité prise par administration.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce la plus pertinente pour ce projet en raison de sa réponse immunitaire bien caractérisée et de sa forte sensibilité aux allergènes alimentaires. Les souris de différentes lignées classiques sont particulièrement adaptées pour modéliser la sensibilisation à l’arachide et les réactions allergiques. La souris permet une reproductibilité expérimentale élevée, un suivi longitudinal individuel, et offre un accès à de nombreux outils immunologiques et génétiques (anticorps, lignées transgéniques). Les animaux sont utilisés au stade adulte, de 7 à 16 semaines à l'arrivée afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).
Etude de l’exposition aux polluants associés à l’alimentation ultra transformée sur les fonctions cérébrales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 467 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines passant cinq jours seules en cage de mesure du métabolisme et recevant sept micro-prélèvements de sang par test. Nourries dès la gestation de leur mère avec un régime imitant l'alimentation ultra-transformée et additionné de polluants, elles subissent des tests d'anxiété et de mémoire, puis un faisceau infrarouge appliqué quatre fois trente secondes sur la patte, répété après l'injection d'un composé qui la fait rougir et gonfler. Le porteur annonce une prise de poids, des désordres métaboliques et des symptômes rappelant le diabète. Le modèle informatique de prédiction et les nouvelles réglementations alimentaires espérés restent à moyen et long terme, quand l'exposition aux polluants commence, elle, dès la vie intra-utérine.
Objectifs
Les plastiques présents dans notre environnement représentent une source inquiétante de pollution. Les micro et nanoparticules issues de l'abrasion des plastiques transportent des substances chimiques polluantes qui se diffusent dans les tissus biologiques. Les aliments ultra-transformés, quant à eux, présentent non seulement une composition déséquilibrée (teneurs élevées en sel, sucres raffinés et graisses saturées), mais contiennent également un nombre important de substances chimiques nocives, ajoutées ou formées lors de la transformation industrielle. Les substances chimiques présentes dans les aliments ultra-transformés s'ajoutent aux polluants provenant des particules de plastiques. La consommation d'aliments ultra-transformés représente plus de 60 % des calories consommées dans certaines régions d'Europe. Dans une étude récente de notre groupe, où des hommes ont été exposés à une alimentation ultra-transformée, nous avons découvert que cette consommation dégrade l'humeur, altère la fonction reproductive et la sécrétion d’hormone par le cerveau. Dans cette même étude, nous avons observé que la consommation d’une alimentation ultra-transformée pouvait engendrer un taux de polluants élevés dans le sang. Nous émettons donc l'hypothèse que la consommation d'aliments ultra-transformés détériore les fonctions cérébrales par l'action de polluants chimiques associés. Les résultats de cette première étude chez l’Homme ont servi de base à l’élaboration de ce projet, dans lequel une nourriture présentant les caractéristiques d’une alimentation ultra-transformée telle qu’elle peut être trouvée chez l’Homme additionnée de polluants candidats sera administrée à des souris jeunes et adultes afin de déterminer leurs effets sur le fonctionnement du cerveau et le comportement.
Bénéfices attendus
A moyen terme, nous souhaitons créer un modèle informatique qui permettra de prédire les effets des additifs et polluants sur la fonction et la santé du cerveau. Le bénéfice attendu à long terme est de participer à fournir les preuves scientifiques nécessaires à l'établissement de nouvelles réglementations pour l'industrie alimentaire et les décideurs politiques.
Procédures
La moitié des animaux est exposée à un régime de type ultra-transformé (riche en graisse, sucre et sels, pauvre en fibres) pendant un minimum de 8 ou 16 semaines. - Les animaux du groupe dont le métabolisme énergétique est analysé sont hébergés individuellement pour une durée maximum de 5 jours. Pour la détermination de leur composition corporelle, ils sont placés dans le tube d’analyse de l’appareil pendant quelques minutes. - Le groupe d’animaux sur lequel les analyses comportementales sont réalisées effectue un test de quelques minutes par jour pendant trois jour (tests d’anxiété). Le test de mémoire consiste en 5 jours d’entrainement (4 x 10 minutes par jour) et un jour de test (quelque minutes). - Le groupe d’animaux subissant les tests métaboliques reçoit une injection (15 secondes) et 7 micro-prélèvements de sang (environ 30 secondes par geste) pour chacun des 2 tests réalisés. Pour la réalisation de ces tests, la nourriture est retirée pendant 6h ou 15h (selon le test) avant le début des expériences. Pour le test de sensibilité thermique cutanée, les animaux sont placés dans une enceinte individuelle puis soumis à un faisceau lumineux infrarouge entraînant une augmentation ponctuelle de la température de la peau au niveau de la patte (30 secondes x 4 ; répété après l’injection d'un composé inflammatoire (30 secondes).
Impact sur les animaux
Les animaux soumis à un régime de type ultra-transformé (riche en graisse, sucre et sels, pauvre en fibres) sur une longue période peuvent présenter une prise de poids plus importantes que les animaux soumis à un régime standard, ainsi que des symptômes rappelant le diabète (désordres métaboliques, troubles du comportement alimentaire, anxiété). L’analyse du métabolisme requiert que certains animaux soient hébergés individuellement pour une durée maximum de 5 jours, pouvant générer un stress. Pour la détermination de la composition corporelle des animaux, ils sont placés dans le tube d’analyse de l’appareil pendant quelques minutes, pouvant générer un stress. Pour les tests métaboliques, une douleur légère de courte durée associée aux injections et aux micro-prélèvements de sang est attendue. Les analyses comportementales peuvent stresser les animaux. Celles-ci sont de courte durée (quelques minutes pour chaque test). Pour le test de sensibilité, les animaux sont placés dans une enceinte individuelle puis soumis à un faisceau lumineux infrarouge entraînant une augmentation de la température de la peau au niveau de la patte (30 secondes x 4 ; répété après l’injection d'un composé entraînant une rougeur et un gonflement au niveau de la patte).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures afin de collecter les tissus et organes pour analyses biologiques.
Remplacement
Les études impliquant l’analyse des effets de la nutrition sur l’organisme nécessitent l’utilisation d’un modèle animal, plusieurs tissus et systèmes intégrés étant affectés et interragissant au cours de la réponse (cerveau, foie, graisse, système immunitaire). A ce jour il est impossible de récréer ces conditions sans l'utilisation d'un organisme vivant. Cependant l’objectif de notre étude est de collecter suffisamment de données afin de créer un modèle informatique pouvant prédire l'effet des polluants qui devrait permettre l’utilisation de moins d’animaux à l’avenir.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Pour estimer le nombre d'animaux utilisés, nous avons utilisé un logiciel de calcul de taille d'échantillon. Chaque fois que cela est possible nous utiliserons un groupe de souris contrôles commun à plusieurs séries d'études. Nous optimiserons également la collecte de tissus postmortem à l’issue de chaque procédure afin de créer une « bibliothèque d’échantillons » pouvant être utilisés pour de futures analyses.
Raffinement
Avant le début de l’étude, les souris sont acclimatées au cycle de lumière inversée (allumage de 19h à 7h ; obscurité de 7h à 19h) pendant 2 semaines, cela permet de se conformer au cycle normal des animaux, les souris étant actives pendant la phase nocturne. Une lumière rouge, invisible pour les souris, est utilisée pour visiter les animaux. La température est maintenue à 26°C, proche de la zone de thermoneutralité des souris et facilitant la régulation de leur température corporelle. Elles seront également habituées à être manipulées pendant cette période, pour réduire toute forme de stress par la suite. Les polluants seront administrés aux animaux incorporés dans une gelose et au travers d’une administration orale volontaire, qui aura fait l’objet d’un entraînement préléalable. Les cages utilisées pour analyser la calorimétrie permettent aux animaux de conserver un contact visuel et olfactif et sont équipées de façon à fournir des occasions accrues d’interaction avec l’environnement (litière, mangeoire, biberon et maisonnette suspendus, roue) afin de compenser le fait que les animaux doivent être hébergés seuls pendant ce laps de temps. Pour le test de préférence au sucrose, une cage avec lecteur de puces (permettant d'indentifier individuellement les souris) permet d’héberger les animaux en groupe. Les prélèvements sanguins effectués en fin d’étude seront réalisés sous anesthésie. Pour les tests métaboliques, les animaux sont mises au calme dans la salle 1h avant le début de l'expérimentation. En cas d'hypoglycémie sévère pendant un test, du glucose est injecté et le test est immédiatement arrêté. Dans les tests de sensibilité cutanée, l‘animal échappe lui-même à la douleur en retirant sa patte. Dans tous les cas, la patte de l‘animal n‘est jamais exposée plus de 30 secondes à la chaleur. Cette exposition n‘entraîne aucune brulure ni lésion tissulaire. Des points limites ont été définis et seront appliqués afin de limiter la douleur et l’angoisse des animaux au minimum.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence dans les études métaboliques, nous pouvons donc bénéficier d’un grand nombre de ressources et de données préliminaires existantes. Les animaux seront exposés aux régimes et polluants pendant la gestation de la mère, pendant l'allaitement et après le sevrage jusqu’à l’âge adulte afin de récréer au mieux les conditions d’une exposition tout au long de la vie et en particulier l’exposition à un très jeune âge. Les tests (comportementaux, métaboliques, physiologiques) seront eux tous réalisés sur des animaux adultes (à l'âge de 8 ou 16 semaines).
Liraglutide pour le traitement préventif de l’arthropathie hémophilique dans un modèle murin d’hémophilie B
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Les souris utilisées sont hémophiles B, dépourvues de facteur IX de la coagulation, et ne saignent qu'après un traumatisme. Elles sont 21, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour cinq d'entre elles et modéré pour les seize autres. Chacune subit trois ponctions du genou sous anesthésie pour provoquer une atteinte articulaire, puis reçoit des injections de liraglutide ou du traitement de référence, avec une gêne locomotrice et une perte de poids possibles. Le porteur écrit n'attendre aucune douleur au réveil, sur la seule base de l'expérience de son groupe. La mise à mort est justifiée par le prélèvement d'un millilitre de sang total, volume qu'il déclare incompatible avec le maintien en vie de l'animal.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est indétectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Les saignements articulaires répétés, peuvent conduire à une atteinte articulaire handicapante appelée arthropathie hémophilique (AH). Il s’agit d’une complication grave, de la maladie. La présence anormale du sang dans la cavité articulaire conduit à une inflammation et à terme à la destruction progressive de l’articulation. Le pilier du traitement de l'hémophilie est la substitution du facteur de coagulation manquant, afin de prévenir les saignements récurrents responsables de l'arthropathie. Cependant, aucun traitement actuellement disponible ne cible spécifiquement l’inflammation articulaire, pour la faire régresser afin de bloquer la progression de l’AH, alors que le liraglutide visant à contrôler l’inflammation pourrait avoir un effet bénéfique, protecteur contre l’AH handicapante. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité préventive du liraglutide pour traiter la synovite de l’AH et de bloquer ainsi l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B
Bénéfices attendus
La comparaison entre le traitement habituel par concentré de facteur de coagulation et le liraglutide, va permettre d’évaluer l’efficacité potentielle de ce médicament dans le contexte d’arthropathie hémophilique, médicament couramment utilisée dans d’autres pathologies et ayant un effet anti-inflammatoire significatif sans effet secondaire majeur. Si les résultats de l’étude montrent une efficacité suffisante du liraglutide dans l’arthropathie hémophilique, une étude clinique pourra alors être proposée pour évaluer l’efficacité du liraglutide chez des patients hémophiles.
Procédures
Les souris seront séparées en 2 groupes pour comparer l'effet d'un adjuvent au traitement de référence dans la prise en charge de l'arthropathie hémophilique. Pour cela, les souris auront trois ponctions articulaires pour mimer la maladie et recevront soit le traitement de référence seul par injection ou le traitement de référence plus l'adjuvent par injection. Au terme de l'expérimentation, un prélèvement de sang total sera effectué. Les animaux seront soumis, sous anesthésie générale, à 1. Une ponction articulaire : 2-3 min 2. Un prélèvement sanguin: 1 min 3. La mesure du genou siège d’arthropathie : 30 sec 4. Une injection (groupe 1) et deux injections (groupe 2) : 1-2 min 5. Un prélèvement sanguin et mise à mort : 3-5 min
Impact sur les animaux
Au cours du projet, tous les gestes sont réalisés sous anesthésie et certains post mortem. Après le réveil suite à l’induction de l’arthropathie et de l’injection retro-orbitale, l’expérience de notre groupe ne nous fait attendre aucune douleur. Les injections répétées des traitements peuvent provoquer une douleur légère (piqûre d’aiguille). Le modèle de souris hémophile KO ne présente pas de saignements spontanés mais des risques d’hémorragie en cas de blessure. Une possible gêne locomotrice suite aux ponctions répétées et une possible perte de poids suite à l’administration de la molécule testée peuvent se présenter au cours du protocole.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement de 1mL de sang total, non compatible avec le maintien en vie de l'animal
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures biologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tout gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Rôle des macrophages méningés dans la régulation de la mémoire dans des conditions physiologiques et inflammatoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Des chocs électriques répétés dans un test de peur contextuelle, six injections sous la peau du crâne en deux semaines, ou huit jours d'injections d'interféron provoquant une sensation de maladie : 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit de savoir si les macrophages des méninges influencent la mémoire et le comportement, en les éliminant ou en les empêchant de produire une molécule. Le porteur écrit qu'aucune des procédures ne sera "particulièrement douloureuse", après avoir décrit ces chocs électriques et l'inconfort provoqué par l'interféron. Les souris sont tuées dans les heures qui suivent les tests comportementaux, pour prélever leurs méninges et leur cerveau.
Objectifs
Ces dernières années, la recherche a commencé à mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans les membranes qui entourent le cerveau, appelées les méninges. On sait maintenant que certaines cellules immunitaires présentes à cet endroit ne servent pas seulement à nous protéger contre les infections, mais peuvent aussi influencer le fonctionnement du cerveau et le comportement. Parmi ces cellules, ce sont surtout les cellules dites « lymphoïdes » qui ont été étudiées jusqu'à présent. Elles produisent des molécules (les cytokines) capables d'agir sur le cerveau, en influençant par exemple la naissance de nouveaux neurones ou l’activité des circuits neuronaux. Cependant, le rôle d’un autre type de cellule immunitaire, les macrophages méningés, reste encore mal compris. Ces macrophages sont pourtant très nombreux aux frontières du cerveau et produisent aussi de nombreuses molécules qui pourraient avoir un impact sur son fonctionnement. Des recherches préliminaires menées dans notre laboratoire suggèrent qu’une molécule appelée Pf4, produite par ces macrophages, pourrait favoriser la formation de nouveaux neurones et stimuler l’activité neuronale dans une région du cerveau appelée l’hippocampe. Cela pourrait indiquer un lien direct entre ces cellules immunitaires et certaines fonctions du cerveau. Par ailleurs, on sait que lors d’une infection, notre comportement change souvent (fatigue, baisse de motivation, repli sur soi, etc.). Ces réactions, appelées « comportement de maladie », pourraient aussi être liées à l’activation des macrophages méningés, qui sont parmi les premières cellules à détecter l’inflammation venant du reste du corps. Le but de ce projet est donc de mieux comprendre comment les macrophages méningés influencent le comportement et les capacités mentales, à la fois dans des situations normales et en cas d’inflammation. En identifiant les mécanismes impliqués, ce travail pourrait aider à mieux lutter contre les problèmes cognitifs causés par l’inflammation, comme ceux observés dans certaines maladies chroniques ou avec le vieillissement.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est de comprendre comment les macrophages méningés communiquent avec le cerveau et contribuent à réguler l'activité neuronale dans des conditions homéostatiques et inflammatoires. Compte tenu de la complexité de ces processus biologiques, qui sont encore loin d'être modélisés par des systèmes in silico ou in vitro, ce projet s'appuiera principalement sur l'utilisation de modèles in vivo. La caractérisation de cet axe neuro-immunitaire ouvrira potentiellement de nouvelles voies dans notre capacité à sauvegarder l'intégrité fonctionnelle du cerveau pendant les conditions inflammatoires ou à stimuler les performances cognitives dans le cas de conditions progressives telles que les maladies neurodégénératives et le vieillissement . En effet, ce projet vise à obtenir deux avantages principaux : 1) le bénéfice à moyen terme d'une meilleure caractérisation de la fonction des macrophages dans la neurogenèse et dans autres activités neuronales avec des implications dans la mémoire et le comportement et 2) le bénéfice à long terme de l'identification de médiateurs candidats qui favorisent les fonctions cérébrales, conduisant à des approches pharmaceutiques innovantes qui tirent parti des macrophages pour agir sue les maladies neurologiques.
Procédures
Les souris utilisées dans cette étude recevront différents traitements selon leur groupe. Chez les souris de type sauvage, une injection sera faite sous la peau au niveau du crâne, tous les deux jours pendant deux semaines (soit six fois au total). Ce traitement vise à éliminer spécifiquement les macrophages présents dans les méninges. Les souris génétiquement modifiées recevront un autre type de traitement : • Pour la première lignée, les injections (également tous les deux jours pendant deux semaines) contiendront une substance appelée tamoxifène, qui empêchera les macrophages méningés de produire la molécule Pf4 • Pour la seconde lignée, les souris recevront pendant huit jours consécutifs une injection d’interféron alpha (IFN-α), une molécule qui induira une inflammation généralisée mais pas aigue. Une fois les traitements terminés, toutes les souris passeront une série de tests pour évaluer leurs capacités de mémoire et de comportement.
Impact sur les animaux
Les souris seront soumises à anesthésie gazeuse, de sorte qu'elles ne ressentiront pas de douleur pendant la procédure, alors qu'elles pourraient en ressentir au niveau du site d'injection à leur réveil. Même si les souris se familiarisent avec l'opérateur et s'habituent aux paramètres expérimentaux, elles peuvent encore ressentir un stress modéré lors de certains tests comportementaux. En particulier le test de la peur contextuelle va engendrer de la légère douleur à travers des chocs électriques rapides mais répétés. Quant aux souris transgéniques, l'injection intrapéritonéale de IFN peut provoquer une légère sensation de douleur au point d'injection, tandis que l'effet systémique d'une faible dose de IFN provoque une sensation de maladie et d'inconfort chez les souris. Aucune des procédures effectuées dans le cadre de ce projet ne sera particulièrement douloureuse. Néanmoins, nous surveillerons quotidiennement l'état de santé des souris, afin d'évaluer en particulier leur réaction aux traitements. Concernant les deux modèles transgéniques, l’identification (tatouage) et le génotypage (prélèvement de poils) seront réalisé grâce à procédures non-invasives.
Devenir
Les animaux seront mis à mort dans les premières heures suivant les tests comportementaux afin de pouvoir prélever des échantillons biologiques qui nous permettront d’étudier des processus qui se déroulent dans les méninges et le cerveau.
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est de comprendre comment les macrophages méningés peuvent moduler les activités neuronales et finalement contribuer à la modulation du comportement et de la cognition. Cependant, l'interaction entre les systèmes immunitaire et nerveux que nous voulons étudier ne peut pas être isolée de l'environnement tissulaire complexe où elle a lieu, qui représente une partie essentielle du système. Ce niveau de complexité n'a été atteint par aucune plateforme technologique disponible à ce jour, c'est pourquoi les modèles in vivo restent essentiels pour étudier de manière fiable l'interaction entre les systèmes immunitaire et nerveux et absolument irremplaçables pour évaluer les caractéristiques comportementales. Une fois que le lien fonctionnel entre les macrophages méningés et l'activité neuronale aura été établi et que des mécanismes moléculaires candidats auront été mis en avant, des expériences complémentaires seront menées à l'aide de systèmes in vitro, tels que des essais de neurogenèse sur des cellules souches.
Réduction
Toutes les expériences seront effectuées de manière pertinente et complète afin de limiter au minimum le nombre d’animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, nous allons utiliser les mêmes souris pour plusieurs tests (deux groupes de tests comportementaux). Cette réutilisation pourrait contribuer à augmenter le niveau de stress de l'animal mais devrait nous permettre de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires. 25 animaux seront utilisés pour chaque condition expérimentale pour chaque groupe de tests comportementaux, soit un total de 700 animaux en 5 années de projet. Les résultats seront analysés à l'aide du test statistique le plus adapté. Nous essaierons de réduire encore le nombre d'animaux nécessaires si les données collectées, les analyses statistiques et les données de la littérature nous permettent d'adapter nos estimations au cours du projet. Après les tests comportementaux, le cerveau et les méninges seront prélevés sur chaque souris afin de réaliser plusieurs études à plusieurs niveaux.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, conçues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques. Les souris seront suivies régulièrement et des points limites adaptés et précoces permettront en cas de souffrance de prendre les mesures adéquates en concertation avec notre vétérinaire référent ou notre structure chargé du bien-être animal.
Choix des espèces
Comme de nombreux mécanismes biologiques sont similaires chez la souris et chez l’être humain, nous utiliserons différentes souches de souris, dont certaines ont été modifiées génétiquement. Ces lignées transgéniques ont été conçues pour permettre d’observer et de manipuler plus précisément le rôle des macrophages méningés, nôtres cellules immunitaires d’intérêt. Grace à ces modèles, on pourra tester plus rapidement et de manière plus ciblée nôtres hypothèses. L’utilisation de ces souris transgéniques est donc essentielle pour comprendre comment les macrophages méningés participent à la régulation de processus cérébraux complexes. Pour toutes ces raisons, la souris représente le modèle le plus adapté à ce type d’étude. Les tests comportementaux seront réalisés sur des souris âgées d’environ 60 jours, c’est-à-dire à l’âge adulte, lorsque leurs capacités cognitives (mémoire, apprentissage, etc.) sont complètement développées.
Travaux pratiques de physiologie animale en Licence et Master (souris et rats)
- Enseignement supérieur
Rats : 40
Former des étudiants de licence et de master aux gestes de l'expérimentation animale mobilise ici 240 souris et 40 rats, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Les souris sont contenues, exposées à des lumières, des odeurs, des bruits ou des températures inhabituelles, soumises à des tests de comportement et, pour certaines, à un régime gras et sucré destiné à reproduire un état de surpoids, une même souris pouvant être manipulée lors de plusieurs séances de l'année. Les rats servent à une seule démonstration de chirurgie, sous anesthésie profonde et sans réveil, une procédure pourtant déclarée en souffrance légère. Leurs tissus sont prélevés pour d'autres travaux pratiques et leurs cadavres réutilisés l'année suivante pour l'initiation des étudiants aux gestes de base.
Objectifs
Le projet a pour objectif de former progressivement les étudiants de la filière Biologie Santé à la compréhension et à la pratique de l’expérimentation animale. Il s’adresse aux étudiants de troisième année de Licence et de première année de Master qui se destinent aux métiers de la recherche biomédicale ou de la santé. Les travaux pratiques (TP) proposés permettent aux étudiants d’apprendre comment les fonctions vitales de l’organisme – comme la respiration, la circulation sanguine, le métabolisme ou le fonctionnement des reins – s’adaptent à différentes conditions. Ces séances leur offrent l’occasion de découvrir concrètement les interactions entre les organes et les effets de facteurs comme l’environnement, le stress ou certaines substances sur la physiologie animale. L’expérimentation sur animal vivant est abordée uniquement lorsque les méthodes de simulation ou les modèles informatiques ne suffisent pas à illustrer les phénomènes biologiques étudiés. Elle est toujours encadrée, réglementée et réalisée dans un but strictement pédagogique. Les étudiants apprennent à effectuer des gestes techniques de base (administration de substances, prélèvements, observation du comportement ou de paramètres physiologiques), tout en respectant le bien-être animal et la réglementation en vigueur. Ils sont également initiés à la démarche éthique à travers les principes des 3R : Remplacer les animaux par des modèles alternatifs chaque fois que possible ; Réduire leur nombre en optimisant les expériences ; Raffiner les méthodes pour limiter la douleur, le stress et l’inconfort. Les deux espèces utilisées sont la souris et le rat, modèles de référence en recherche biomédicale. La souris est utilisée pour les travaux de physiologie et de métabolisme, tandis que le rat est réservé à la démonstration des relations entre le cœur et le rein lors d’une séance unique de chirurgie sous anesthésie. Ce projet s’inscrit dans une formation progressive, encadrée et responsable, visant à préparer les futurs biologistes aux exigences techniques, éthiques et réglementaires des métiers de la recherche biomédicale.
Bénéfices attendus
Ce projet vise avant tout à former les étudiants à la compréhension du vivant et à la responsabilité qui accompagne toute utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Il ne s’agit pas de produire de nouvelles connaissances, mais d’offrir une expérience concrète et encadrée de la démarche expérimentale. Les travaux pratiques permettent aux étudiants de mieux comprendre le fonctionnement de l’organisme, notamment la respiration, la circulation sanguine, le métabolisme et les réactions de l’organisme à son environnement. En observant directement les effets de certains paramètres, traitements ou conditions, ils découvrent comment le corps s’adapte et maintient son équilibre. Ces observations complètent les cours théoriques et rendent la physiologie plus concrète. Les étudiants acquièrent également des compétences techniques essentielles : savoir administrer une substance, effectuer un prélèvement, observer un comportement ou enregistrer un paramètre biologique. Ces gestes sont enseignés dans un cadre sécurisé, sous la supervision d’enseignants qualifiés, afin de garantir le respect de l’animal et la maîtrise des bonnes pratiques. Au-delà de la technique, les TP développent la rigueur et l’esprit critique : les étudiants apprennent à formuler des hypothèses, à observer objectivement, à interpréter leurs résultats et à confronter leurs conclusions à la littérature scientifique. Cette méthode de travail renforce leur capacité d’analyse et leur autonomie. Les bénéfices sont aussi éthiques et civiques : les étudiants sont sensibilisés à la notion de responsabilité et aux principes des 3R – Remplacer, Réduire, Raffiner – qui guident toute expérimentation animale. Ils découvrent l’importance de planifier une expérience en limitant au maximum la douleur, le stress et le nombre d’animaux utilisés. Enfin, ces séances représentent une mise en situation réelle du métier de chercheur : les étudiants y apprennent à collaborer, à documenter leurs observations et à respecter les règles encadrant la recherche. Cette approche contribue à former des professionnels conscients des enjeux scientifiques, éthiques et humains de l’expérimentation animale.
Procédures
Au cours des différents travaux pratiques, les animaux seront observés ou manipulés dans le cadre d’exercices pédagogiques simples et encadrés. Ces interventions sont de courte durée et ont pour but d’illustrer le fonctionnement de l’organisme et la manière dont il réagit à différents facteurs. Les souris sont utilisées principalement pour des séances de physiologie et de métabolisme. Elles peuvent être soumises à de courtes phases de contention (maintien doux de l’animal pour un examen ou une mesure), à des stimulations légères telles que l’exposition temporaire à une lumière, une odeur ou un bruit inhabituel, ou encore à de changements de température modérés. Ces situations visent à montrer comment le corps réagit à l’environnement. Certaines souris reçoivent un régime alimentaire riche en graisses et en sucre afin de reproduire un état métabolique proche du surpoids. Ce modèle permet d’étudier les conséquences de l’alimentation sur le métabolisme sans recourir à des procédures invasives. Les tests comportementaux consistent à observer l’attitude naturelle de l’animal face à un nouvel espace ou à un objet inconnu. Ces expériences durent seulement quelques minutes et permettent aux étudiants de comprendre comment le stress, la curiosité ou la peur peuvent influencer le comportement. Dans ces conditions, les animaux peuvent ressentir un inconfort passager lié à la nouveauté, au maintien ou à la contrainte modérée. Cet inconfort peut se manifester par une agitation, une immobilité ou une baisse de l’exploration. Ces signes sont connus et font l’objet d’une surveillance attentive par les enseignants et le personnel qualifié. Si un animal montre des signes de stress important ou de fatigue, la manipulation est immédiatement interrompue et l’animal replacé dans sa cage. Les rats sont utilisés uniquement pour un TP de démonstration chirurgicale sous anesthésie générale profonde. Ils ne se réveillent pas après la procédure, ce qui évite toute douleur ou souffrance postérieure. Dans toutes les séances, les manipulations sont réalisées dans le calme, avec un minimum de bruit et de mouvements, afin de réduire au maximum le stress et l’anxiété des animaux.
Impact sur les animaux
Les manipulations prévues dans ce projet sont réalisées dans un cadre strictement encadré, avec une surveillance constante du comportement et de l’état général des animaux. La majorité des interventions sont de courte durée et n’induisent que des nuisances légères et temporaires. Pour les souris, plusieurs types de situations peuvent provoquer un léger inconfort : Lors des exercices d’apprentissage (contention douce, observation ou petite injection de solution saline), les animaux peuvent ressentir une gêne passagère liée à la manipulation ou à la piqûre. Lors de l’exposition à des stimulations environnementales (lumière, son, odeur inhabituelle ou température légèrement plus basse), un stress léger et momentané peut être observé, souvent traduit par une exploration réduite ou une immobilité. Chez les animaux recevant un régime alimentaire riche, une prise de poids progressive peut s’accompagner d’une baisse d’activité et d’un léger inconfort locomoteur, comparables à un surpoids modéré. Ces modifications restent réversibles à l’arrêt du régime. Pendant certains tests comportementaux, les animaux peuvent montrer une curiosité ou une appréhension passagère face à un nouvel environnement. Ces effets cessent dès qu’ils sont remis dans leur cage. Les mesures de température corporelle, de respiration ou de glycémie peuvent impliquer une brève manipulation, susceptible d’entraîner une sensation désagréable limitée à quelques secondes. Pour les rats, les interventions se déroulent sous anesthésie générale profonde. L’animal ne ressent ni douleur ni stress pendant la procédure. Après les observations nécessaires à la démonstration pédagogique, il n’est pas réveillé, évitant ainsi toute souffrance ultérieure. Dans l’ensemble du projet, les effets observés se limitent à un inconfort léger, un stress transitoire ou une fatigue passagère. Aucun effet durable ni souffrance prolongée n’est attendu. Les signes de malaise, d’agitation ou d’immobilité excessive sont considérés comme des points limites : toute manipulation est alors immédiatement interrompue et l’animal replacé dans des conditions de calme et de confort.
Devenir
A l’issue de la procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus et utiliser dans le cadre d'autres TP incluant des analyses histologiques et de biochimie. Le cadavre quant à eux seront utilisé l'année suivant pour l'initiation des étudiants aux gestes de bases comme décrit dans la présente saisine.
Remplacement
Tout au long du parcours universitaire, les étudiants sont d’abord formés à l’aide de méthodes de substitution qui permettent de comprendre la physiologie sans utiliser d’animaux vivants. Ces approches incluent des modèles informatiques et in silico, des vidéos pédagogiques, des modèles anatomiques en silicone, des organes issus d’abattoirs ou des travaux sur des invertébrés. Elles constituent la base de l’apprentissage des manipulations et de la compréhension des grands principes physiologiques. Cependant, ces méthodes seules ne permettent pas toujours d’expliquer la complexité du fonctionnement d’un organisme vivant. Certaines fonctions, comme la régulation de la pression artérielle, la communication entre le cœur et le rein, ou la réponse de l’organisme à un stress, ne peuvent être reproduites de manière réaliste par un logiciel ou sur un modèle inerte. L’utilisation ponctuelle d’animaux est donc justifiée pour montrer des phénomènes dynamiques qui ne peuvent être simulés de façon crédible autrement. Ces travaux pratiques ont une finalité exclusivement pédagogique : ils ne visent pas à produire des résultats scientifiques, mais à illustrer la physiologie dans des conditions réelles et à sensibiliser les futurs professionnels de santé et de recherche à une pratique rigoureuse et responsable. Les séances impliquant des animaux vivants sont limitées à l’essentiel, réalisées une seule fois au cours du cursus, et strictement encadrées par des enseignants formés à l’éthique et à la réglementation. Elles permettent aux étudiants d’apprendre comment observer, manipuler et soigner les animaux de manière respectueuse, tout en comprenant pourquoi et comment l’expérimentation animale reste parfois nécessaire. Ainsi, le recours à l’animal ne constitue qu’une étape complémentaire et mesurée dans un ensemble pédagogique fondé avant tout sur les méthodes alternatives et la réflexion éthique.
Réduction
Le principe de réduction vise à limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la qualité de la formation. Chaque séance de travaux pratiques (TP) a été pensée pour que chaque animal serve à plusieurs apprentissages, dans un cadre strictement encadré et respectueux du bien-être animal. Une même souris peut ainsi être observée au cours de plusieurs séances réparties dans l’année universitaire, avec au minimum une à deux semaines de repos entre chaque manipulation. Cette organisation permet de réduire très fortement le nombre total d’animaux utilisés, tout en maintenant la continuité pédagogique. Les rats, quant à eux, ne sont utilisés que pour un seul TP au cours du cursus, consacré à la démonstration de la relation entre cœur et rein, sous anesthésie générale profonde et sans réveil. Les séances se déroulent en petits groupes d’étudiants, généralement par deux à quatre personnes pour un seul animal. Cela permet à chacun d’apprendre tout en limitant les manipulations. Lorsque plusieurs groupes travaillent sur un même thème, les résultats obtenus sont mis en commun, ce qui permet d’analyser les données globalement plutôt que de répéter inutilement les expériences. Les enseignants encouragent également l’utilisation de méthodes non invasives, comme la mesure de paramètres physiologiques externes, l’observation du comportement ou l’utilisation de capteurs sans chirurgie. Ces approches permettent de recueillir des informations précises sans nuire à l’animal. En complément, plusieurs travaux pratiques sur l’être humain sont proposés à des étudiants volontaires. Ils permettent d’illustrer certains principes physiologiques (rythme cardiaque, respiration, réflexes, circulation sanguine) sans recourir à des animaux à chaque fois. Enfin, toutes les séances incluent une formation aux méthodes alternatives, afin que les futurs professionnels comprennent comment réduire encore davantage le recours à l’animal dans leurs pratiques futures.
Raffinement
Le raffinement vise à réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout en garantissant la qualité de la formation. Dans tous les travaux pratiques, des méthodes douces et peu invasives sont privilégiées. Les manipulations sont limitées à ce qui est strictement nécessaire et sont toujours réalisées sous la supervision d’enseignants expérimentés. Lorsqu’une intervention plus sensible est prévue, une anesthésie générale adaptée est utilisée afin que l’animal ne ressente aucune douleur. Une crème anesthésiante peut également être appliquée localement avant certaines procédures. Si besoin, de petites doses supplémentaires d’anesthésique sont administrées pour maintenir un sommeil profond et stable. Dans les rares cas où une ponction ou une injection peut provoquer un léger inconfort, un médicament contre la douleur est prévu en fin de séance. Le bien-être comportemental des animaux fait l’objet d’une attention constante. Avant les séances, les animaux sont habitués progressivement à la présence humaine et à la manipulation, afin de réduire leur stress. Les salles de travaux pratiques sont aménagées pour rester calmes, stables et rassurantes : lumière douce, température contrôlée, absence de bruit ou d’odeur inhabituelle. Le matériel est nettoyé entre chaque manipulation pour éviter toute trace olfactive pouvant troubler les animaux. Si un animal montre des signes d’anxiété, d’agressivité ou de fatigue, la manipulation est immédiatement interrompue et il est replacé dans sa cage. Les animaux réutilisés dans plusieurs séances bénéficient d’un temps de récupération suffisant (une à deux semaines) avant toute nouvelle activité. Leur état général est vérifié avant, pendant et après chaque séance, en collaboration avec le personnel animalier. À la fin du TP, un renforcement positif (friandise, contact calme) est souvent utilisé pour associer l’expérience à un retour au calme. Enfin, le raffinement passe aussi par la formation des étudiants : ils apprennent à manipuler les animaux avec douceur, à reconnaître les signes de stress et à privilégier des techniques alternatives (modèles en silicone, cadavres, simulations) avant tout contact avec l’animal vivant.
Choix des espèces
Dans la mesure où les souris et les rats représentent les modèles les plus utilisés en laboratoire, en expérimentation animale, notre choix s'est porté sur ces 2 espèces, rats et souris. Les souches choisies sont connues pour leur docilité et leur faible agressivité. Tous les animaux seront d'age adultes au moment du TP.
Développement d’un candidat (immunocytokine) à visée thérapeutique pour la thérapie des cancers dans un modèle de souris humanisées
- Recherche appliquée
- Cancers
Une tumeur atteignant 1 500 mm3, une baisse de mobilité, un isolement : ces signes marquent la fin de l'étude pour les souris concernées, surtout dans les groupes témoins non traités. 440 souris de sept semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever organes et tumeurs. Chacune reçoit une greffe tumorale au flanc, sept injections intrapéritonéales, jusqu'à cinq prélèvements sanguins sous anesthésie, neuf pesées et une quinzaine de mesures de tumeur sur cinq semaines. L'enjeu est de départager plusieurs candidats immunocytokines et d'en retenir un, dont le développement industriel et réglementaire sera poursuivi en vue d'essais cliniques.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser et développer une nouvelle immunocytokine destinée au traitement de différents types de cancers, dans le but d’améliorer la réponse thérapeutique chez les patients qui échappent aux traitements actuel. Les molécules testées ont déjà montré in vitro leur capacité à augmenter fonctionnalité des cellules humaines anti-tumorales en présence du traitement actuel. Dans un premier temps, plusieurs candidats seront comparés à travers une étude pharmacocinétique, afin de sélectionner la molécule la plus prometteuse. Ensuite, le candidat retenu sera évalué, sur la base de son profil dose-réponse et de sa compatibilité avec les traitements déjà existants, permettant de reproduire plus fidèlement la réponse immunitaire et de valider son potentiel thérapeutique.
Bénéfices attendus
Le meilleur candidat sera validé et son développement industriel et règlementaire sera poursuivi en vue de la réalisation d’essais cliniques. Ces nouvelles thérapies, capables de cibler plus spécifiquement les cellules tumorales, présentent une efficacité supérieure aux traitements actuels et pourraient offrir une alternative thérapeutique aux patients réfractaires au traitement actuel.
Procédures
Mesure de la masse corporelle sur animal vigile (9 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 9 minutes au total). Implantation de la tumeur sur animal vigile : 1 injection, maximum 1 minute/ animal Injection intrapéritonéale candidat ou traitement actuel sur animal vigile (7 injections, 1 minutes maximum chacune, soit 7 minutes au total). Prélèvement de sang sur animal anesthésié (5 prélèvements max, 2 minutes maximum chacune, temps de mise en boîte de contention + prélèvement, soit 10 minutes au total). Mesure de la tumeur tous les 2/3 jours sur environ 5 semaines (15 mesures, maximum 1 minute / animal = 15 minutes)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement : le stress et la douleur liés aux manipulations, comprenant les traitements, les prélèvements sanguins, les pesées, ainsi que la contention nécessaire lors des injections (sous-cutanées pour l’implantation tumorale puis intrapéritonéales pour l’administration des traitements). L’injection de cellules tumorales entraîne la formation d’une tumeur au niveau du flanc des animaux. Des effets indésirables (tumeur qui atteint 1500mm3, hypomotilité, isolement) peuvent apparaître en fin d’expérimentation, en particulier chez les groupes témoins non traités par les candidats ou le traitement de référence, en raison de la progression tumorale.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements des organes et tumeurs.
Remplacement
Les immunocytokines (notre molécule thérapeutique) agissent dans un environnement biologique complexe (réseau immunitaire, cellules stromales, microenvironnement tumoral, vascularisation), or ces interactions ne peuvent être correctement reproduites dans un système in vitro (culture cellulaire, organoïdes) ou simulées par modélisation informatique. Les paramètres essentiels (pharmacocinétique, biodistribution, élimination, effets immunitaires systémiques) nécessitent un organisme entier pour être évalués.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés tient compte des contraintes statistiques. De plus, nous conserverons tous les prélèvements de sang, d’organes et tissus pour des analyses ultérieures. Notre savoir-faire sur les modèles tumoraux, nous a permis d’optimiser les injections, les prélèvements et d’ainsi de diminuer le nombre d’animaux par groupe. Ainsi, 10 animaux par groupe permettent d’obtenir une puissance statistique suffisante pour détecter des différences significatives de croissance tumorale ou de survie entre groupes , en tenant compte de la variabilité biologique inhérente aux modèles tumoraux syngéniques.
Raffinement
Nous assurons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur, en complément de celle réalisée par le personnel animalier. Des points limites précoces ont été définis et seront systématiquement appliqués. Lorsqu’un point limite est atteint, plusieurs mesures peuvent être mises en œuvre selon la situation : adaptation du suivi, retrait de l’animal de l’étude, ou mise à mort lorsque cela est nécessaire. Pour les injections (cellules tumorales ou traitements), nous appliquons de la lidocaïne sur le site d’injection quelques minutes avant la procédure. Les animaux sont anesthésiés localement pour les injections sous-cutanées et intrapéritonéales, et par isoflurane lors des prélèvements sanguins.
Choix des espèces
L’utilisation d'une première souche de souris est essentielle pour étudier la durée de vie et l’élimination de nos candidats, car elles portent une partie d’anticorps humaine. Chez la souris normale, ces mécanismes sont différents de ceux de l’être humain. Le modèle choisi reproduit le fonctionnement humain et permet donc d’obtenir des résultats plus proches de la réalité. Les souris de la deuxieme souche utilisée sont, elles, nécessaires pour tester l’efficacité de nos traitements lorsqu’ils sont associés au traitement actuel, un médicament qui agit uniquement sur la version humaine d’une protéine. Ce modèle permet donc de vérifier si notre traitement fonctionne comme prévu chez l’homme. Enfin, les lignées tumorales utilisées permettent d’évaluer nos candidats dans deux types de cancers : l’un résistant et l’autre sensible à ce médicament. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines (20g environ), correspondant à la phase jeune adulte. À cet âge, le système immunitaire est pleinement mature, la croissance corporelle stabilisée et la prise tumorale reproductible. Cela limite la variabilité interindividuelle et assure la pertinence des résultats obtenus.
Immunotherapie et Thérapie Photodynamique des mélanomes : du fondamental aux applications thérapeutiques combinatoires
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Immunodéficientes pour accepter la greffe de cellules humaines tumorales et immunitaires, 205 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent d'abord une chirurgie sous anesthésie, puis une semaine plus tard l'injection des cellules humaines, puis une injection de Rose Bengale dans la tumeur suivie d'une illumination de dix minutes, une immunothérapie hebdomadaire et un prélèvement sanguin par semaine. La croissance des tumeurs est suivie au pied à coulisse sur animal vigile ou par imagerie sous anesthésie. Le porteur écrit que la maîtrise de la douleur implique pour les animaux de ne pas en subir, et annonce par ailleurs que chez les groupes témoins la tumeur continuera de croître jusqu'au point limite critique.
Objectifs
Le mélanome est un cancer agressif fortement immunogène dont l’incidence et la mortalité demeurent inquiétantes. Le traitement de 1ère intention repose sur des immunothérapies et des thérapies ciblées. Cependant certains patients échappent au traitement. La thérapie photodynamique (PDT), utilisée de manière courante en dermatologie, consiste en l’illumination de cellules tumorales préalablement photosensibilisées par un agent pharmacologique. En présence d’oxygène, et suite à une exposition à une lumière appropriée, l’agent photosensibilisateur (PS) génère des espèces réactives de l’oxygène responsables de la mort tumorale associée à une réponse immunologique permettant d’accentuer l’effet antitumoral de la PDT. La PDT antitumorale émerge comme une nouvelle modalité de traitement efficace avec un nombre croissant d’essais cliniques de faisabilité sur divers modèles d’études dont le mélanome. Le Rose Bengale (RB) est un PS déjà employé en clinique, mais pour de la PDT, or il est un bon candidat pour des lésions cutanées comme le mélanome. Notre projet vise donc à tester l’efficacité in-vivo de la PDT au Rose Bengale dans le mélanome ; à vérifier l’effet immunogène de ce traitement dans un modèle simple et grâce à un modèle à deux tumeurs pour estimer le potentiel abscopal (à distance de la lésion traitée) du traitement. Le positionnement de la PDT dans la stratégie de traitement sera également estimé en associant la PDT-RB à une immunothérapie spécifique ou sur un modèle de cellules résistantes aux thérapies ciblées.
Bénéfices attendus
Il s'agit pour nous d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements dirigés contre le mélanome humain. Les paramètres de PDT-RB testés auront préalablement été sélectionnés sur un ensemble d'expériences réalisées sur les modèles cellulaires en laboratoire. Il s'agira donc de confirmer l'efficacité de la PDT-RB dans le cadre d'un être vivant complet humanisé. Le bénéfice à long terme sera de pouvoir mettre sur le marché de un nouveau traitement, de le positionner dans la stratégie thérapeutique et ainsi d'aider dans la lutte contre le mélanome. L'analyse de l'importance de la réponse immunitaire sur leur mode d'action fait que ces futurs traitements pourraient s'intégrer dans des programmes adaptés à chaque patient au bénéfice d'une médecine personnalisée.
Procédures
Toutes les procédures ont en commun la mise en place du modèle et pour cela les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale (10 min entre l’endormissement et le réveil). La cicatrice pourrait également être l'objet de démangeaison légère sur les 5 premiers jours. Une semaine après, les animaux subiront l’injection de cellules humaines à la fois immunitaires et tumorales, ce qui pourrait engendrer un léger stress de courte durée. Le modèle en place permettra de tester les traitements. Pour la PDT, les animaux auront une injection intratumorale du Rose Bengale (RB) et seront illuminées (extracorporel) 2h après l'injection pendant 10 min. L'injection pourra être la source d'un stress léger de courte durée. L’immunothérapie sera ajoutée par une injection qui sera répétée toutes les semaines (1 fois par semaine); là encore un stress legéer de courte durée pourrait etre generé à chaque injection. Pour le suivi immunologique, un prélèvement de sang sera réalisé préalablement à tout traitement, puis une fois par semaine. Chaque prélèvement pourra être source d'un stress léger de courte durée. Le suivi de la croissance se fera par 2 méthodes. Il s'agira, soit d’utiliser les propriétés du modèle cellulaire qui exprime une enzyme responsable de la création de lumière et de faire un suivi par imagerie. Ce dernier nécessite l’endormissement sous anesthésie gazeuse des animaux, puis l’injection du substrat lumineux. Soit, d'utiliser un modèle n’exprimant pas l’enzyme responsable de la création de lumière et la mesure de la croissance tumorale se fera au moyen d’un pied à coulisse sur animal vigile (contention et mesures) ; toutes les souris auront également le suivi régulier de la croissance par le pied à coulisse.La contention et l'injection du produit d'illumination, de même qu eles anesthésie pourraient être la source d'un stress léger de courte durée mais répété. En fin de protocole, l’ensemble des animaux sera mis à mort, le sang, la tumeur et les organes vitaux seront récupérés pour analyses complémentaires.
Impact sur les animaux
La maîtrise de la douleur et le respect des règles éthiques implique pour les animaux de ne pas subir de douleur. Néanmoins, la procédure expérimentale engendrera inévitablement un stress , là encore, il sera réduit au strict minimum par divers leviers (visite et manipulations régulières, anesthésies gazeuses préalables). L'emplacement des tumeurs est étudié pour ne gêner en rien la locomotion ou l'alimentation des animaux.
Devenir
Tous les animaux auront reçu l'injection d'une masse tumorale suivie ou non d'un traitement expérimental. Selon l'efficacité des traitements, la croissance de la tumeur sera ralentie voire disparaitra, dans le cas contraire et pour les groupes témoins, la tumeur continuera de croitre jusqu'au point limite critique pour son bien-être. Nous pouvons ajouter également que pour des raisons scientifiques, nous devons procéder à la récupération des tissus (sang, tumeur, organes vitaux) qui nous serviront à confirmer l'efficacité du traitement et confirmer son mode d'action. L'ensemble de ces nécessités, éthiques et scientifiques, justifient la mise à mort des animaux en fin de procédure.
Remplacement
Notre objectif est de tester de l’efficacité anti tumorale de notre thérapie (qui de plus est immuno-activatrice) seule ou en combinaison avec des immunothérapies (réduction des mécanismes immunorégulateurs). Des travaux préalables ont été réalisés sur les modèles de lignées cellulaires. Ces résultats mettent en évidence la faisabilité du projet au travers de la validation de l'application de notre thérapie et/ou des immunothérapies in-vitro; dont plusieurs paramètres ont été ainsi fixés. Cependant, s'agissant de développer une nouvelle approche thérapeutique, il est primordial que celle-ci soit également évaluée dans un système physiologique complet, en ce sens un modèle in-vivo est le plus adéquat, voire nécessaire. Le suivi par bioluminecence permet de diminuer le nombre d'animaux, néanmoins, une validation de l'efficacité nécessite d'emblée que plusieurs groupes expérimentaux soient présents, notamment les groupes contrôles, non traités, et traitement unique ou traitement combiné de manière à limiter quantitativement les expérimentations. Dans la mesure où la modélisation expérimentale cellulaire ou in-silico est trop imparfaite, ce type de modèle demeure indispensable à la validation de ces futurs traitements.
Réduction
Grâce à notre experience nous bénéficions de protocoles déjà approuvés ce qui permet de ne pas avoir à faire de mise au point. L'ensemble des animaux ne servira uniquement que pour l'étude de l'effet des traitements. Néanmoins, dans un souci de conservation de la fiabilité des résultats et pour ainsi éviter d'avoir à refaire les expériences, nous réaliserons des groupes d'étude suffisamment solides d'un point de vue biostatistique (validé grâce à un outil d'évaluation en ligne). Ainsi, pour des modèles humanisés des groupes de 5 souris pour 5 reconstitutions seront suffisants. Le suivi de croissance tumorale se fera de manière externe sans nécessité de recours à une dissection, permettant ainsi un suivi longitudinal optimisé sans mise à mort. Enfin, il s'agira de ne tester que les molécules déjà présélectionnées pour leur efficacité dans les modèles précliniques in-vitro.
Raffinement
Nous avons cherché à optimiser l'expérimentation en mettant en place une méthodologie d'étude courte et efficace : suivi de tumeur sur un temps limité (4 semaines maximum), tout en minimisant les douleurs ou détresse. Nous avons ainsi choisi des modèles de souris dont nous connaissons les comportements et la capacité de prise de greffe. Les animaux plus jeunes, seront manipulés régulièrement et ainsi habitués en vue d'une réduction du stress. En cours d'expérimentation, nous avons choisi de faire les greffes tumorales uniquement sous-cutané (au flanc arrière) de manière à ne gêner en rien la vie de l'animal (locomotion, alimentation), le suivi sera ainsi facilité par mesure manuelle externe sur animal vigile (mesure au pied à coulisse), ou grâce à un système d'imagerie par bioluminescence (l'animal sera alors sous anesthésie dans l'appareil à +37°C). Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaires, nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.
Choix des espèces
Les souris sont des petits rongeurs qui permettent de réaliser des groupes cohérents et limités pour l'étude efficace des effets des molécules thérapeutiques testées en faible quantité. Nous utilisons des souris immunodéficientes pour permettre la xenogreffe de cellules humaines (tumorales et immunitaires).
Travaux pratiques de Biologie et Physiologie de la Cellule Animale dans le cadre de la formation initiale d’étudiants de licence 3 : préparation d’hépatocytes isolés pour l’étude de la dédifférenciation cellulaire.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Géniteurs réformés de quatre mois, 40 rats mâles vont être anesthésiés puis tués sans reprise de conscience, la perfusion de leur foie par la veine porte provoquant la mort immédiate. Le foie est ensuite retiré de l'abdomen en deux à trois minutes pour poursuivre la perfusion hors du corps. Ces séances servent à montrer à une douzaine d'étudiants de licence la dédifférenciation des hépatocytes en culture, sans produire de connaissance nouvelle. Le porteur retient le rat plutôt que la souris pour que le geste sur la veine porte reste visible de toute la salle, la souris exigeant une loupe binoculaire et un risque d'échec qui conduirait à utiliser davantage d'animaux.
Objectifs
Les hépatocytes (qui représentent 60% des cellules du foie) cultivés in vitro sont un puissant outil permettant d’étudier le fonctionnement du foie. Malheureusement, le geste technique permettant leur préparation mais également leur maintien en culture a été montré comme étant très difficiles. En effet, des conditions de culture ordinaires ou mal contrôlées conduisent à la transformation (dédifférenciation) des hépatocytes produisant un rapide changement de leur morphologie et une réduction significative de leurs fonctions biologiques spécifiques. Le but de cet enseignement pratique de physiologie animale est de présenter aux étudiants cette notion de transformation des hépatocytes issus d’une préparation et mise en culture, ainsi que d’étudier avec eux des conditions de culture cellulaire permettant de la limiter ces modifications de forme et de fonctions de ces cellules du foie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont d’ordre pédagogiques. En effet, cet enseignement pratique de physiologie animale vise à rendre « concret » ce concept étudié en travaux dirigés qu’est la dédifférenciation des hépatocytes. Ainsi, les étudiants, via l’utilisation d’une culture primaire d’hépatocytes de rat, étudieront des conditions de culture cellulaire (composés solubles et insolubles dans le milieu de culture) permettant de limiter la dédifférenciation des hépatocytes.
Procédures
Aucun traitement/intervention ne sera effectué en amont de la séance de travaux pratiques. Ainsi, aucune douleur n’est attendue durant leur hébergement en zone conventionnelle. Suite à la pose du cathéter dans la veine porte, la perfusion du foie est immédiatement débutée (ce qui entraine la mort instantanément de l’animal) pour une durée de 2 à 3 minutes ; temps nécessaire pour exciser le foie de la cavité abdominale du rat afin de poursuite la perfusion « ex vivo ».
Impact sur les animaux
La douleur et la souffrance potentielles du rat seront réduites à celle de l’introduction d’une aiguille 26G dans l’abdomen de l’animal lors de son anesthésie. Afin de minimiser son angoisse, celui-ci sera anesthésié dans une salle d’opération de l’animalerie (proche de la salle d’enseignement pratique) pour ne pas être en présence de « nombreux » étudiants pouvant le stresser. De plus, l’acte sera réalisé par l’enseignant expérimenté pour cette procédure expérimentale et possédant l’expérimentation animale niveau concepteur avec une formation en chirurgie expérimentale sur rongeurs.
Devenir
Tous les rats de ce projet seront mis à mort suite à la perfusion de leur foie via la veine porte. En effet, suite à la pose du cathéter dans la veine porte, la perfusion du foie est immédiatement débutée ce qui entraine la mort instantanée de l’animal permettant d’exciser le foie de la cavité abdominale du rat afin de poursuite la perfusion « ex vivo ».
Remplacement
L’enseignement de la dédifférenciation des hépatocytes et l’étude de conditions de culture cellulaire permettant de limiter cette dernière, nous oblige à avoir recours à l’animal pour réaliser une primo-culture hépatocytaire. En effet, il n’existe actuellement pas de méthode ou de modèle de substitution permettant d’étudier ce phénomène de mise en place de la dédifférenciation qui ne peut pas être observé sur des lignées cellulaires établies. Nous utiliserons le rat comme modèle animal car il serait nécessaire d’avoir recours à beaucoup plus d’animaux si nous avions opté pour le modèle souris.
Réduction
40 à 60 millions d’hépatocytes par gramme de foie de rat pouvant être recueillis grâce à cette méthode, un seul rat ayant un foie d’environ 20g est par conséquent amplement suffisant pour chaque séance de travaux pratiques regroupant une douzaine d’étudiants permettant ainsi de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de minimiser au maximum l’angoisse du rat, celui-ci sera anesthésié dans une salle d’opération de l’animalerie (proche de la salle d’enseignement pratique) pour ne pas être en présence de « nombreux » étudiants pouvant le stresser. Dans l’objectif de réduire au maximum tout inconfort chez le rat durant la procédure expérimentale, la perfusion du foie de l’animal sera réalisée par l’enseignant maitrisant parfaitement le geste technique sous anesthésie profonde. De plus, en amont de la séance de Travaux Pratiques (TP), les étudiants auront, durant 2h de travaux dirigés, un enseignement leur présentant non seulement les objectifs pédagogiques et scientifiques de la séance de TP mais également une forte sensibilisation au bien-être animal, au respect de la règle des 3R et à la réglementation en vigueur relative à l’expérimentation animale. En effet, seront détaillées les différentes étapes pratiques mises en place pour la réduction au maximum de la douleur lors de la perfusion du foie de l’animal avec une anesthésie profonde ainsi qu’une analgésie pour la réalisation de cette perfusion. Enfin, la procédure étant un prélèvement sur animal anesthésié profondément puis mis à mort sans réveil, il n’est pas défini de points limites.
Choix des espèces
Dans un souci pédagogique, le rat est préférentiellement utilisé pour que le geste technique réalisé au niveau de la veine porte (permettant la perfusion du foie) puisse être observé par l’ensemble des étudiants de la séance (12 étudiants environ). Chez la souris, ce geste technique ne peut se faire qu’en ayant recours à une loupe binoculaire et représente un risque d’échec entrainant le recours à plus d’animaux. Des rats mâles adultes de 4 mois (des géniteurs réformés) seront utilisés. En effet, pour cette étude l’animal doit avoir un métabolisme hépatique mature mais pas encore impacté par un éventuel effet de l’âge.
Production d’anticorps anti-Klebsiella pneumoniae chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Injectées dans les deux cuisses sous anesthésie, prélevées au premier jour puis saignées une dernière fois par ponction intracardiaque, 20 souris de cinq semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont tuées pour récupérer leur rate et analyser les populations immunitaires. L'objet est de vérifier si un candidat vaccin contre Klebsiella pneumoniae, bactérie multirésistante, déclenche une production d'anticorps suffisante. Le porteur affirme qu'aucune toxicité n'est attendue parce que le vaccin a déjà été testé, sans nommer ni le vaccin, ni son antigène, ni les études antérieures.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer si le vaccin sélectionné entraine une production d’anticorps conséquente chez la souris. Le développement de vaccins prophylactiques contre la bactérie multirésistante K. pneumoniae constitue une nouvelle stratégie thérapeutique à fort potentiel d'applications cliniques.
Bénéfices attendus
L’efficacité de cette vaccination permettra d’en apprendre davantage sur les mécanismes immunitaires déclenchés par l’administration de ces différentes solutions. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces. De plus, le développement de vaccins prophylactiques contre K. pneumoniae constitue une nouvelle stratégie thérapeutique à fort potentiel d'applications cliniques.
Procédures
- Un prélèvement sanguin à J0 (de 10 secondes) - Une injection du vaccin ou du PBS dans la cuisse droite et gauche sous anesthésie (5 secondes chacune) - Un prélèvement terminal (30 secondes) sous anesthésie générale par injection (5 secondes).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues dans le cadre de ce projet sont principalement liées aux actes expérimentaux réalisés sur les animaux et restent de sévérité légère à modérée : - Un prélèvement à J0 : ici ce prélèvement peut entraîner une douleur aiguë de courte durée ainsi qu’un stress lié à la contention. Un risque faible d’hématome ou de saignement local transitoire est également possible. Ce prélèvement sera effectué par du personnel expérimenté afin de limiter la durée de la manipulation et les nuisances associées. - L’administration des différents vaccins dans la cuisse peut engendrer une douleur locale transitoire au point d’injection, ainsi qu’un inconfort passager lié à la manipulation. Ces injections seront réalisées sous anesthésie volatile, permettant de réduire la perception de la douleur et le stress. Une réaction inflammatoire locale légère (rougeur ou sensibilité) ne peut être totalement exclue, mais aucun effet indésirable significatif n’a été observé lors d’études antérieures avec ces mêmes vaccins. - Le prélèvement terminal sera effectué sous anesthésie générale profonde. Cette procédure n’entraîne pas de nuisance consciente pour l’animal, l’état d’anesthésie garantissant une perte complète de sensibilité avant le prélèvement. - Une autopsie sera ensuite pratiquée pour le recueil des organes d’intérêt. Aucune toxicité n’est attendue ici, le vaccin a déjà été testé auparavant et n’a montré aucun effet indésirable.
Devenir
A l’issue de la procédure la rate des animaux seront récupérées ; en effet, l’évaluation de la réponse immunitaire induite par les candidats vaccins nécessite la réalisation d’un prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque, ainsi que le recueil de la rate afin d’analyser les populations immunitaires et les mécanismes de production d’anticorps.
Remplacement
Le recours au modèle murin est justifié par l’absence d’alternatives expérimentales capables de reproduire de manière pertinente la complexité de la réponse immunitaire in vivo. En effet, les études in vitro (sur lignées cellulaires ou cultures primaires) ne permettent pas d’évaluer la production d’anticorps ni les mécanismes de maturation et de mémoire immunitaire impliqués dans la vaccination. Aujourd’hui, il n’est pas encore possible de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.
Réduction
Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement robustes, tout en respectant la variabilité biologique inhérente aux réponses immunitaires. Par ailleurs, chaque animal contribuera à plusieurs analyses ce qui maximise les données obtenues par individu et limite le nombre total de sujets utilisés
Raffinement
L’administration du vaccin sera effectuée sous anesthésie afin de réduire la douleur et le stress liés aux injections. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un personnel formé et habilité, en veillant à limiter la fréquence et le volume des prélèvements afin de préserver le bien-être des souris. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique régulière tout au long de la procédure afin de détecter précocement toute anomalie clinique, douleur ou signe de souffrance. Des points limites prédéfinis ont été établis et seront appliqués afin de prévenir toute souffrance inutile. Les animaux seront hébergés par groupes de cinq dans un environnement adapté et enrichi (igloos, matériaux de nidification), favorisant leur bien-être et l’expression de comportements naturels.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour l’évaluation de l’efficacité de ces vaccins dans d’autres projets. Des souris de 5 semaines seront nécessaires pour la phase de d’immunisation correspondant à un système immunitaire juvénile.