Rongeurs

Pour caler la dose de nanoparticules d'or et la fréquence des tirs laser qui chauffent une tumeur jusqu'à la détruire, 25 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de mélanome humain, une injection de nanoparticules dans la tumeur, une irradiation infrarouge, jusqu'à deux prélèvements de sang et vingt-quatre heures seule en cage métabolique. Le porteur annonce comme suites une perte de poids, une déshydratation, une ulcération et une coloration de la peau, et écrit que chaque animal sera son propre témoin pour réduire les effectifs. Le suivi de la tumeur au pied à coulisse dure jusqu'à quatre mois, ou s'arrête quand le volume tumoral atteint la taille limite qui déclenche la mise à mort.

Objectifs

Les cancers de la peau de type mélanome concernent près de 80 000 patients par an en France. Le traitement chirurgical demeure le standard dans la majorité des situations mais il est associé à un impact physiologique et physique indéniable pour ces tumeurs situées principalement sur les zones exposées au soleil, tel que le visage. Les immunothérapies (activation du système immunitaire du patient) ont montré des résultats spectaculaires au cours de ces dix dernières années. En effet, les immunothérapies induisent des taux de réponse jusque-là inégalés chez les patients atteints de mélanome métastatique . Malheureusement, certains patients demeurent insensibles aux immunothérapies notamment par des mécanismes de résistances innées. De plus, d’autres patients, pourtant répondeurs au traitement en première intention, présentent des évolutions tumorales secondaires souvent liées à des mécanismes de résistance acquis.Dans ce contexte général, les principaux objectifs de ce projet sont d’étudier les effets de la photothérapie thermique plasmonique (PPTT, des molécules synthétiques qui absorbent l'énergie d'un laser proche infra rouge pour tuer les cellules tumorales en dégageant de la chaleur) sur le mélanome avancé métastatique utilisée seule ou en combinaison avec une immunothérapie .Ce projet cherche à déterminer l’impact in vivo de la combinaison de la PPTT des nanoparticules d'or injectées dans les tumeurs et une immunothérapie . Avant de commencer l’étude préclinique combinant traitement PPTT et immuno thérapie sur des souris humanisées ( souris qui ont la même réponse immunitaire qu'un humain) , nous devons en premier lieu réaliser une étude préliminaire sur des souris immunodéprimées ( le même fond génétique que les souris qui seront humanisées dans le projet final ) porteuses d’un mélanome humain ,afin de valider la concentration des volumes de nanoparticules d’or à injecter , la fréquence d’injection ainsi que les effets de l’hyperthermie sur ces tumeurs. L’objectif est d’évaluer l’impact direct de la PPTT dans un modèle murin porteur de mélanome humain.

Bénéfices attendus

L’objectif est d’évaluer l’impact direct de la photothérapie par laser sur des souris porteuses de tumeurs cutanéees humaines. Après avoir gréffé sur la peau les cellules tumorales, les souris seront traitées ou non à l’aide dd'un composé de nanoparticules d'or à différentes concentrations et l’évolution de la croissance tumorale sera suivie au pied à coulisse digital afin d'avoir des des données préliminaires sur une étude à plus grande échelle combinant le traitement photothérapie et l'immunothérapie sur souris humanisées ce qui permettera de raffiner la procédure d'une part et d'optimiser le volume d'injection de nanoparticules et la fréquence optimum du traîtement laser

Procédures

induction tumorale : 10mn Injection de nanoparticule : 10mn irradiation laser :10mn Prélèvement sanguin : 2 prélèvements de 5mn pour 20 souris , 1 prélèvements de 5mn pour 5 souris Mesure tumorale 10mn par animaux ,3 fois par semaine pendant 4mois ou jusqu'à que le volume total des tumeurs ai atteint la taille limite .hébergement individuel avec en cage métabolique 24h avec maintien de contact visuel et auditif entre individu.

Impact sur les animaux

perte de poids, déshydratation, pousse tumorale et modifications cutanées apparaissant avec le traitement (ulcération, coloration de la peau, inflammation).nuisances liées à l'anesthésie gazeuse, hématome lié aux prélèvements sanguins , isolement de 24h en cage métabolique

Devenir

L'ensemble des animaux de l'étude seront mis à mort afin de récupérer les tissus et les analyser par la suite

Remplacement

Afin de pouvoir évaluer de nouvelles thérapies, les modèles animaux sont un passage obligatoire après l'évaluation in vitro. Le rongeur est le modèle le plus utlisé actuellement pour l'évaluation de nouvelles thérapies en l'occurence sur cette étude cela sera des souris.De plus pour des raisons se rapprochant du clinique et donc de l'humain nous devons uriliser des souris immunodéprimées car cela sera le modèle utilisé pour humanisation à la suiite de cette étude préliminaire , or il n'existe à ce jour aucun autre modèle de rongeur humanisé.

Réduction

Nous avons déterminé 5 souris par groupe car c'est le nombre minimum de souris nécessaire pour avoir des résultats significatifs. De plus nous avons fait le choix que chaque animal soit son propre contrôle afin de réduire le nombre de groupe et donc le nombre d'animaux.

Raffinement

Pour le suivi tumoral, des mesures au pied à coulisse seront réalisées tous les 2 jours avant traitement puis 3 fois par semaine. C’est une technique non invasive qui permet de suivre la croissance tumorale sans avoir à sacrifier les animaux. La procédure est indolore pour l’animal.En ce qui concerne l’injection de nanoparticules, elle se fera en intratumorale . Les deux doses testées ayant déjà été utilisées chez l'animal nous savons qu'elles sont bien tolérées. Enfin, en ce qui concerne l'irradiation infra-rouge, elle se fera sur animal anesthésié par voie gazeuse avec injection au préalable d'analgésique en sous-cutanée pour palier à la douleur que pourrait engendrer l'hypethermie.Les souris seront hébergées dans des cages adaptées à l'intérieur des salles d'hébergement de l'animalerie où l'ambiance est parfaitement contrôlée (hygrométrie, température, ventilation, bruit). De plus, les cages sont équipées d'enrichissement pour limiter le stress.Afin que l'immunité défaillante des animaux ne s'exprime pas, ils seront hébergés en portoir ventilé et le change est effectué sous hotte avec du matériel autoclavé.Lors de chaque étape du protocole pouvant engendrer un stress ou une douleur (double greffe , injection de nanoparticules et irradiation laser), les animaux seront anesthésiés sous anesthésies gazeuse et de l'anamlgésique sera injectée en sous-cutanée. Cette injection pourra être renouvelée 12 heures plus tard si nécessaire (signes de douleur chez l'animal).Enfin pour éviter des hématomes liés aux prélèvement sanguin , le site de prélèvement sera comprimé grace à une compresse stérile jusqu'à l'arrêt du saignement.

Choix des espèces

Afin de pouvoir évaluer de nouvelles thérapies, les modèles animaux sont un passage obligatoire après l'évaluation in vitro. Le rongeur est le modèle le plus utlisé actuellement pour l'évaluation de nouvelles thérapies en l'occurence sur cette étude cela sera des souris.De plus pour des raisons se rapprochant du clinique et donc de l'humain nous devons uriliser des souris immunodéprimées car cela sera le modèle utilisé pour humanisation à la suiite de cette étude préliminaire. Animaux jeunes adultes de 6 à 8 semaines. Les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes.

Cinq composés anti-obésité sont testés pour le compte d'un client, à un stade précoce de leur développement. 72 souris rendues obèses par huit semaines de régime gras vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune passe quatre-vingt-onze jours seule en cage, reçoit un composé chaque jour sur toute cette durée, subit jusqu'à trente-trois pesées, quatre mises à jeun et huit prélèvements de sang à la queue. Le porteur reconnaît que l'isolement pèse sur des animaux sociaux et que l'obésité provoquée réduit leur capacité de mouvement, et présente l'étude in vivo comme une étape réglementaire "incontournable" avant le passage à l'humain.

Objectifs

L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus d'1 milliard de personnes en 2022, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un véritable fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Parmi ceux-ci, la sémaglutide a obtenu récemment une autorisation de mise sur le marché. La Sémaglutide présente une excellente efficacité mais certaines inquiétudes émergent car la perte de poids résultante de son utilisation provient à la fois d'une perte de masse grasse mais également d'une perte de masse musculaire. Cette dernière s'avère problématique chez l'obèse qui est déjà un sujet à risque de faiblesse musculaire. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un potentiel composé anti-obésité. Le projet devra permettre de montrer l'efficacité de 5 composés sur les symptômes liés à l'obésité sur un modèle de souris obèses.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, dont la sémaglutide qui est la plus efficace et la plus prescrite. Néanmoins, la sémaglutide présente un effet délétère sur la masse et la fonction musculaire lors d'administration chroniques. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Hébergement individuel (91 jours) ; 2) Administration quotidienne des composés (91 jours; durée : env. 1 minute) ; 3) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (max. 33 mesures; durée : env. 1 minute) ; 4) Analyse non invasive de composition corporelle (3 mesures, durée de la mesure : 2 minutes) ; 5) Mise à jeun en présence d'eau (4 fois, durée : 4 à 5h) ; 6) Administration de glucose par voie orale (1 fois, durée : env. 1minute); 7) Prélèvements sanguin à la queue (max. 8 prélèvements, durée du prélèvement : 2 minutes).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boîte de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. L'administration des traitements par voie orale, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de stress. La mise à jeun (de 4h et 5h) préalable aux prélèvements sanguins pratiqués, bien que réalisée en phase diurne, pourront induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de la procèdure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentare, l'homéostasie du glucose et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que les composés testés ont fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées par à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. L'administration des traitements seront réalisées par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives puis individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Lors du dernier prélèvement sanguin, les souris seront systématiquement anesthésiées en amont afin de supprimer toute perception de stress. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (45% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux réceptionnés seront âgées de 5 semaines. Le choix de ce stade de développement est guidé par la phase d'acclimation d'une semaine et la phase d'induction à l'obésité de 8 semaines (sous un régime enrichie en graisse à 45%). Les souris seront donc âgées de 14 semaines au moment du début de l'administration des traitements ce qui correspondant au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

Des injections quotidiennes pendant cinq à dix jours, puis la mise à mort : 55 souris génétiquement modifiées pour développer la maladie d'Alzheimer et des activités épileptiques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois antidépresseurs leur sont administrés pour déterminer lesquels aggravent ces crises, et leurs cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour y enregistrer l'activité des neurones. Le porteur souligne qu'aucune chirurgie ni aucun prélèvement n'est pratiqué sur les animaux de ce projet. Il indique par ailleurs que le traitement pourrait exacerber les activités épileptiques et provoquer des crises d'épilepsie sévères, l'ensemble restant déclaré en souffrance modérée.

Objectifs

Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui développent la maladie d'Alzheimer (MA) et des activités épileptiques. Des études montrent une exacerbation de ces activités épileptiques lorsque les souris sont traitées avec certains antidépresseurs alors que d'autres pourraient avoir un effet protecteur vis-à-vis de ces activités. Notre objectif est d'élucider les mécanismes synaptiques et cellulaires par lesquels les antidépresseurs modulent à long terme l'activité épileptique des souris modèles de la MA. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements de l'activité neuronale de ces souris après un traitement antidépresseur. Trois antidépresseurs seront comparés. Notre projet pourrait, à long terme, permettre de limiter la progression du déclin cognitif chez les patients atteints de la MA en remplaçant les traitements antidépresseurs aggravateurs par d’autres traitements ayant des bénéfices au moins similaires mais ne provoquant pas d'aggravation des activités épileptiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de déterminer si certains antidépresseurs aggravent les activités épileptiques présentes chez les souris modèles de la maladie d’Alzheimer, si d'autres antidépresseurs ont un rôle plutôt protecteur vis-à-vis de ces mêmes activités, et par quels mécanismes ces effets sont médiés. Ainsi, si notre hypothèse se vérifie, ce projet justifiera à court terme la mise en place d’études cliniques permettant de tester cette hypothèse chez les patients. A long terme, ce projet pourrait donc permettre de mieux adapter les traitements et ainsi apporter un bénéfice considérable aux patients atteints de la MA en évitant de majorer les activités épileptiques et donc leurs troubles de la mémoire.

Procédures

Les antidépresseurs seront administrés aux animaux par voie orale en les mélangeant à l'eau de boisson ou injectés pendant 5 à 10 jours avant leur mise à mort. Le nombre maximum d'injections est fixé à 10 en tout à la fréquence d'une injection par jour. Aucune procédure chirurgicale ni aucun prélèvement ne sera effectué sur les animaux inclus dans ce projet.

Impact sur les animaux

Habituellement, les activités épileptiques des souris modèles de la MA sont essentiellement des pointes isolées qui surviennent pendant le sommeil et ne sont pas associées à des modifications comportementales. Mais l'administration chronique de certains antidépresseurs pourrait exacerber ces activités épileptiques et provoquer des crises d'épilepsie sévères. Les pesées peuvent entrainer un stress léger de quelques dizaines de secondes. Des injections pourront être réalisées quotidiennement pour l'administration de l'un des antidépresseurs sont susceptibles d'induire un stress modéré.

Devenir

A l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux seront mis à mort et leurs cerveaux prélevés afin de réaliser des enregistrements de l'activité neuronale ex vivo.

Remplacement

Le projet a pour objectif d’évaluer l’effet des antidépresseurs sur les activités épileptiques dans la maladie d’Alzheimer (MA) ainsi que les mécanismes par lesquels ces effets sont médiés. L'épilepsie comme la dépression dépendent d'interactions qui se font entre différentes régions cérébrales au sein de larges réseaux, qui ne peuvent pas, à l'heure actuelle, être mimées dans de simples cultures cellulaires. Une approche par modélisation informatique des interactions entre maladie d'Alzheimer, épilepsie et antidépresseur ne pourra se faire que sur la base de données expérimentales qui ne sont que parcellaires pour le moment. De plus, des travaux récents montrent que les traitements antidépresseurs n’ont pas d’effet à court terme, ce qui implique qu’ils doivent être administrés aux animaux de manière chronique et non seulement appliqués sur les tissus d’intérêt. Ainsi, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle murin de la MA qui ne peut donc être remplacé par aucun autre modèle et est le seul actuellement existant pour reproduire les caractéristiques de la maladie présentes chez l'humain.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en œuvre plusieurs stratégies de réduction. Les enregistrements de l’activité neuronale, normale ou épileptique, sont réalisés sur deux échantillons enregistrées simultanément. Notre équipement permet de réaliser trois enregistrement simultanés. Cette approche réduit ainsi le nombre d’animaux nécessaires d’un facteur trois. Le nombre d’expériences est calculé sur la base d’une puissance statistique suffisante pour détecter des différences significatives tout en évitant toute utilisation excessive. Les deux sexes sont représentés de manière équilibrée afin de prendre en compte d’éventuelles différences biologiques. Nous prévoyons six groupes expérimentaux selon l’âge, le génotype et le traitement des animaux. Les souris non traitées permettront de caractériser les mécanismes à l’origine de l’activité épileptique. Les souris traitées seront utilisées pour évaluer les effets des antidépresseurs sur cette activité. Au total, 55 souris seront nécessaires pour obtenir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre d’animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement par des personnels formés au soin. Si une altération de l’état est observée, une grille d'évaluation sera utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Les antidépresseurs utilisés dans ce projet sont susceptibles d’induire une aggravation des activités épileptiques présentes chez les souris modèles de la MA. Ce phénomène pourrait être à l’origine d’une altération du comportement des animaux. Afin de réduire la souffrance des animaux à cette étape du projet, nous nous baserons sur les résultats obtenus précédemment au cours d’un traitement antidépresseur chronique, pour déterminer la durée optimale du traitement antidépresseur à appliquer afin d’obtenir des résultats exploitables tout en limitant la souffrance des animaux. Dans tous les cas la durée de traitement sera comprise entre 5 et 10 jours en la limitant autant que possible à 8 jours. La procédure s’achèvera par la mise à mort des animaux après anesthésie.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous utiliserons des souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Cette lignée reproduit de nombreuses caractéristiques de la pathologie observées chez l’humain : troubles de la mémoire et activités épileptiques, entre autres. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour l’étude des effets des antidépresseurs sur les activités épileptiques dans la MA. Les animaux seront inclus dans le protocole à l’âge adulte entre 3 mois et 8 mois. À 3 mois, les souris modèles de la MA sont à un stade précoce de la maladie d’Alzheimer : elles présentent déjà des activités épileptiques mais à basses fréquences ; c’est également à cet âge que commencent à apparaître les troubles de la mémoire. Ainsi, si notre hypothèse se confirme, il sera plus facile de mettre en évidence un effet aggravant de certains antidépresseurs sur les activités épileptiques à cet âge. À 8 mois, les souris modèles de la MA sont à un stade avancé de la maladie d’Alzheimer : elles présentent des activités épileptiques et des troubles notables de la mémoire. Ainsi, si notre hypothèse se confirme, il sera plus facile de mettre en évidence un effet atténuateur d'autres antidépresseurs sur les activités épileptiques à cet âge.

Dépourvues de défenses immunitaires, les souris de ce projet reçoivent dans l'articulation du genou des cellules tumorales prélevées sur des patients, sans risque de rejet. 267 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit ensuite jusqu'à quatre semaines d'injections hebdomadaires ou de gavage quotidien, avec un prélèvement de sang chaque semaine. Le porteur indique que la tumeur peut faire souffrir l'animal, restreindre l'amplitude de ses mouvements et parfois dégrader son os, et que toutes les souris seront tuées pour analyser les tissus.

Objectifs

Le projet a pour but de mettre au point un modèle fiable de tumeur ténosynoviale à cellules géantes (TGCT) par injection dans l’articulation du genou de souris de cellules de patients atteints de ces tumeurs. Dans un second temps, ce modèle permettra d’évaluer l’efficacité de différents traitements. Ces différentes molécules sont, soit déjà utilisés pour le traitement des TGCTs chez l’homme, soit pertinentes dans d’autres pathologies proches et ont donc un potentiel pour être utilisées dans le traitement des TGCTs. Dans le cas de molécules déjà validées, ce modèle nous permettra d’évaluer l’efficacité de leur administration locale (intra-articulaire). Cette voie est peu utilisée pour l’instant dans le traitement des TGCTs mais pourrait permettre de grandement réduire les effets secondaires de ces traitements qui sont le frein majeur à leur utilisation.

Bénéfices attendus

La prise en charge des patients atteints de TGCT est insuffisante avec de nombreux patients souffrants d’effets secondaires ou non répondeurs aux thérapeutiques actuelles. Ce projet permettra de mettre en évidence l’efficacité de nouveaux traitements dans un modèle adapté et de valider que l’administration locale (intra-articulaire) permet une efficacité au moins équivalente en réduisant les effets secondaires pour les molécules déjà utilisées. Ces nouveaux traitements et modes d’administration pourront ensuite être proposés pour des essais cliniques chez l’homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule injection intra-articulaire sous anesthésie (induction + geste + réveil = 5 min) dans le cadre de la mise en place du modèle. Pour tester les traitements, ils subiront en plus des injections hebdomadaires (intra-articulaire ou intra-veineuse) ou un gavage quotidien ainsi qu’un prélèvement sanguin hebdomadaire. Les injections intra-articulaires et leurs contrôles en intra-veineuses seront également réalisées sous anesthésie (induction + geste + réveil = 5 min). Les autres interventions seront réalisées sur les animaux vigiles, avec environ 30 secondes de manipulation par animal comprenant une dizaine de secondes de contention pour réaliser le geste. Le temps de traitement total reste à définir mais ne devrait pas excéder 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les molécules à tester sont connues pour induire comme effets secondaires potentiels les plus graves une baisse du nombre de neutrophiles dans la circulation sanguine et une atteinte du foie. Les différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement) seront attentivement surveillés, particulièrement dans les heures et jours suivants les injections. Une induction efficace de la tumeur pourrait amener l’animal à ressentir la douleur associée à son développement. Ces tumeurs, d’évolution généralement lente, entrainent surtout une restriction de l’amplitude de mouvement mais peuvent dans certains cas induire de la dégradation osseuse. Le suivi de la mobilité des animaux sera un point de vigilance particulier pour s’assurer que l’accès à la nourriture ou la capacité à interagir ne sont pas affectés.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter et analyser les tissus.

Remplacement

L’articulation se compose de différents tissus qui jouent tous un rôle important dans son fonctionnement et peuvent aussi participer au développement de maladies comme les TGCTs. Le test de molécules d’intérêts thérapeutiques, en particulier avec l’analyse de la voie d’administration la plus adaptée pour réduire des effets secondaires, ne peut pas être pleinement réalisé sur des modèles in vitro et ex vivo. Le recours aux souris ayant une immunité réduite, est un modèle de choix pour l’injection de cellules humaines sans souci de rejet.

Réduction

La réalisation d’un étude pilote permettra de définir la faisabilité et les meilleures conditions de réalisation du projet. Le nombre d’animaux est réduit au minimum suffisant (8 animaux par groupe) pour démontrer des différences statistiquement significatives et reproductibles entre les groupes en utilisant les tests statistiques adaptés. Ensuite, le nombre de molécules se limitera aux plus pertinentes pour l’application chez l’homme (molécules déjà validées à tester en injection intra-articulaire et nouvelles molécules pouvant offrir un bénéfice thérapeutique).

Raffinement

Les souris seront hébergées par cage de 5 maximum avec l’enrichissement nécessaire à la nidification. Les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Pour les injections intra-articulaires, une injection d’analgésique est réalisée pour prévenir la douleur. Les souris sont ensuite anesthésiées par la méthode permettant l’induction et le réveil le plus rapide, et maintenus sur un tapis chauffant pendant la durée de la procédure. Des points limites adaptés ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens pré-cliniques. De nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles pour analyser les cellules dans la tumeur qui viendront de l’animal. Elle permet la constitution de groupes d'animaux suffisamment larges pour pouvoir effectuer des calculs statistiques pertinents et reproductibles. Les souris utilisées permettent la greffe de tissus et de cellules humaines en évitant les phénomènes de rejet et constituent en cela un modèle reconnu. Des souris adultes de 9 semaines seront utilisées pour modéliser les TGCTs qui affectent principalement des adultes.

94 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit, sous anesthésie et à des coordonnées précises, l'injection d'un vecteur viral dans le cervelet, avant une chirurgie terminale destinée à prélever son cerveau. L'objet est de faire exprimer chez la souris treize gènes propres à l'espèce humaine, pour comprendre ce qu'ils ont apporté au cervelet humain. Le porteur qualifie les nuisances de la chirurgie stéréotaxique de bien tolérées, et retient la souris comme "Mammifère le plus éloigné de nous dans l'arbre du vivant", critère qui justifie à ses yeux d'y installer des gènes humains.

Objectifs

L’espèce humaine présente des caractéristiques cognitives supérieures qui ont été en partie liées à l’évolution du cortex cérébral. Mais l’implication des autres régions du cerveau, comme le cervelet, reste largement inexplorée malgré son association avec les fonctions cognitives supérieures (comme le langage) et les troubles cognitifs (comme l’autisme et la dyslexie). De plus, le cervelet humain présente des caractéristiques divergentes par rapport à d’autres espèces, aux niveaux anatomique, fonctionnel et comportemental, dont les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents sont inconnus. Les mécanismes moléculaires qui participent à l’évolution des neurones et circuits neuronaux reposent sur des gènes exprimés chez l'humain et absent des autres espèces. Le rôle de cette étude est d’étudier l’effet de ces innovations moléculaires sur des neurones et circuits matures du cervelet, à l'échelle cellulaire et du circuit. Nous avons une liste de 13 gènes candidats. Pour étudier un effet cellulaire de ces gènes, nous devons faire des expériences où nous faisons exxprimer ces gènes dans un cervelet de Mammifère. Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous dans l'arbre du vivant. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les objectifs de cette études sont d’étudier, parmi les gènes d’intérêts, lesquels sont suffisants chez la souris pour altérer le cervelet mature.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les effets de gènes spécifiquement humains dans le développement du cervelet. Cela permettra d’ouvrir un nouveau champ de l’évolution du système nerveux humain, en dehors du cortex cérébral. A plus long terme, les résultats pourraient mettre en évidence une sensibilité propre à notre espèce à certains troubles cognitifs (spectre autistique), moteurs (ataxie cérébelleuse).

Procédures

Accès au cerveau sous anésthésie générale suivie de l'injection du vecteur viral aux coordonéées 3D précises: 30 - 45 minutes. Chirurgie terminale sous anesthésie générale dans le but de prélever le cerveau pour analyse hystologique.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent d'une part la réalisation des injections et d'autre part, les chirurgies stéréotaxiques. Les nuisances liées à la chirurgie stéréotaxique sont bien tolérées et n'ont que peu d'impact sur les animaux grâce aux soins post-opératoires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et utilisés dans les procédures décrites pour analyses histologiques.

Remplacement

Les modèles in vitro différentiés à partir de cellules souches humaines sont encore trop immatures, manquent certaines structures anatomiques, et de stimulation sensorielle, ce qui ne sera pas le cas in vivo. De plus, notre étude in vivo pourrait permettre d’augmenter nos connaissances pour améliorer les protocoles de différentiation in vitro.

Réduction

Ce projet nécessitera au maximum 94 souris. Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. De plus, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans des cages ventilées d'une surface adéquate, dans un environnement enrichi, et changés sous flux d'air. La chirurgie est effectuée dans une pièce dédiée sous analgésie locale et générale, et anesthésie, en température contrôlée (

Choix des espèces

Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous dans l'arbre du vivant. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Nous utiliserons des souris matures agées de 2 mois de façon à ce que le circuit neuronal du cervelet ait terminé son développement.

Maintenus autour de 90 % de leur poids pour les motiver, 192 rats sont entraînés une heure par jour, cinq jours sur sept, pendant quatre mois. Vient ensuite une chirurgie d'une heure trente pour implanter des électrodes dans deux régions du cerveau, puis une semaine de récupération, deux semaines de réentraînement et un mois d'enregistrement pendant la tâche, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie de faible l'impact de la restriction alimentaire sur le bien-être des rats, tout en indiquant qu'elle doit leur laisser "une légère sensation de faim". Tous sont tués à la fin pour que leur cerveau soit analysé.

Objectifs

La perception du temps est essentielle pour planifier et coordonner de manière optimale ses actions et donc adopter un comportement pertinent. Ce projet visera à identifier et étudier les réseaux neuronaux responsables de la planification et du contrôle temporel des actions chez le rat. Sur la base de données récentes, nous faisons l’hypothèse d’un réseau neuronal de trois structures cérébrales qui va requérir, dans un premier temps, une prise d’information temporelle qui sera ensuite évaluée en tant qu’erreur et permettra l’ajustement de la production temporelle. Grâce à l’enregistrement des neurones de ces structures lors d’une tâche comportementale temporelle, nous chercherons à caractériser la signature neuronale d’un tel comportement et des erreurs faites.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une information précieuse sur les réseaux neuronaux impliqués dans la planification et le contrôle temporel des actions. De plus ce projet s’articule dans une recherche transversale plus vaste menée par notre équipe, qui permettra de transposer les résultats obtenus chez le rat, chez l’homme et nous permettra, grâce aux enregistrements neuronaux précis, de guider nos investigations chez l’homme. Outre son intérêt en recherche fondamentale, ce projet devrait aussi fournir des indications précieuses en recherche translationnelle. En effet, chez les personnes avec troubles du spectre autistique (TSA), on observe un déficit d’évaluation des performances temporelles sans altération de la production temporelle. Notre connaissance de ces mécanismes d’évaluation nous permettra ainsi de mieux comprendre les TSA.

Procédures

Dans ce projet, tous les rats seront entraînés à réaliser une tâche comportementale qui nécessite un apport de nourriture contrôlé (4 mois) à raison d’une séance d’une heure par jour au moins 5 jours sur 7 puis subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (durée environ 1h30) pour implanter des électrodes dans deux régions d’intérêt. Après une semaine de récupération, ils seront ré-entrainés à la même tâche comportementale (2 semaines) puis enregistrés pendant la réalisation de cette dernière (un mois).

Impact sur les animaux

La tâche comportementale n’est pas stressante en soi, mais nécessite que l’animal ait une certaine motivation pour explorer l’environnement et chercher le renforcement positif (récompense alimentaire). Pour être au plus près du comportement naturel et favoriser la motivation, nous procéderons à une alimentation contrôlée, en donnant la nourriture immédiatement après la séance comportementale en quantité suffisante de façon à ce qu’il n’y ait pas de reste de nourriture le lendemain, mais que l’animal ait une légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire. Cependant, pour amorcer leur motivation à effectuer la tâche, les animaux seront restreints dans les premiers jours de la tâche comportementales de façon à les maintenir autour de 90% de leur poids. Le poids de l’animal est vérifié quotidiennement juste avant la tâche (donc au moment le plus éloigné de la dernière ration) et la quantité de nourriture est ajustée si le poids descend en dessous de 90% deux jours consécutifs. La nourriture sera ensuite progressivement augmentée de manière à ce que les rats réatteignent leur poids de forme théorique. Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale et impacte très peu leur bien-être. Un autre point de vigilance concerne la chirurgie. La chirurgie d’implantation des électrodes est faite sous antalgique et anesthésie générale, mais présente un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure (pour analyse des cerveaux).

Remplacement

Ce projet de recherche fondamentale s’inscrit dans le champ des Neurosciences comportementales. En effet, l’évaluation comportementale et neurobiologique de la planification temporelle d’actions nécessite l’utilisation d’organismes entiers et vivants. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas déterminer les codes neuronaux sous-tendant le comportement sans faire appel à l’implantation d’électrodes qui ne peut se faire chez des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les oiseaux. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible grâce à l’étude de plusieurs paramètres chez le même animal. Nous avons calculé le nombre de rats minimal par groupe pour obtenir des résultats significatifs et exploitables, en tenant compte de la perte de certains animaux (comportement temporel instable, perte à la chirurgie, mauvaise localisation des électrodes). Pour l’ensemble des données, une analyse statistique consistant pour l’essentiel à une analyse de la variance sera effectuée.

Raffinement

Après quelques jours d’acclimatation à leur arrivée dans l’animalerie, les rats sont manipulés et pesés quotidiennement au moins une semaine avant le début de l’entraînement à la tâche comportementale, afin de les habituer à l’expérimentateur et de laisser les rats s’habituer à la quantité contrôlée de nourriture. Pour la procédure chirurgicale, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement par l’expérimentateur ou les zootechniciens pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites associés à des actions sont identifiés pour le cas où les mesures de prises en charge de la douleur et de l’inconfort pouvant résulter de l’étape chirurgicale ne seraient pas suffisantes. Une grille de score (fournie en annexe) sera utilisée pour évaluer la douleur et l’inconfort des animaux notamment pendant le suivi post-opératoire. Concernant la mise à mort, nous utilisons une overdose d’euthanasiant et vérifions que les réflexes sont abolis avant de procéder au prélèvement du cerveau. Nous avons aussi optimisé les équipements comportementaux pour permettre aux animaux porteurs d’implants cérébraux de se mouvoir avec le maximum de confort (mangeoire de haute taille). De plus nous avons dessiné et imprimé à l’imprimante 3D des supports d’implants cérébraux améliorant là aussi le confort des animaux en réduisant les possibilités d’accroches dans l’environnement de test. L’enrichissement des rats implantés est aussi modifiée (maison en carton à la place des tunnels de plastique) pour empêcher les rats de se faire mal en se coinçant l’implant. Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec le SBEA (Structure chargée du Bien Etre des Animaux) et les conseils vétérinaires.

Choix des espèces

D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude des circuits neuronaux des processus cognitifs, largement conservés le long du phylum. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rongeur des aptitudes cognitives complexes. Les rats ont été sélectionnés pour ce projet car la littérature sur l’apprentissage temporel, dont nos propres publications, est majoritairement basée sur des études chez le rat, fournissant une base de connaissances solide. Les analyses anatomiques et fonctionnelles dans ces expériences s'appuient sur une richesse de connaissances sur la structure anatomique et la neurochimie du rat. Par ailleurs, le rat est généralement considéré comme ayant des capacités cognitives plus évoluées que la souris et la taille supérieure du rat nous permet de réaliser des interventions plus spécifiques au niveau central. Ce modèle animal est donc le plus approprié à la fois pour les études comportementales et neurobiologiques. Nous utilisons pour ce projet de jeunes adultes âgés de trois mois environ au début des expériences. Des rats jeunes adultes (~3 mois) seront utilisés pour s’assurer que le cortex préfrontal et sa connectivité soient matures dès le début de l’apprentissage de la tâche comportementale.

Une chirurgie du crâne de vingt à quarante-cinq minutes sous anesthésie, pour injecter dans le cerveau : 288 souris vont la subir, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour que leur cerveau soit découpé en coupes. Les animaux sont opérés à trois âges, dont les cinq premiers jours de vie, ce qui implique aussi des femelles gestantes dans le protocole. Le porteur indique que l'incision peut être douloureuse et provoquer, exceptionnellement, une hémorragie cérébrale, une infection ou une déshydratation. Il annonce l'observation du comportement des souris pour repérer des signes proches de l'autisme ou des crises d'épilepsie, sans nommer aucun des tests employés, et fixe l'effectif à 288 sur la seule base d'un "logiciel spécialisé".

Objectifs

Ce projet fait partie d’un programme de recherche plus large qui combine plusieurs approches, allant de l’étude des cellules en laboratoire à l’analyse du comportement. Avant d’utiliser des animaux, de nombreuses expériences ont été réalisées sur des neurones cultivés en laboratoire, afin de réduire au maximum leur utilisation. Cependant, pour comprendre comment le cortex cérébral se forme et comment des neurones qui fonctionnent mal s’intègrent dans un cerveau déjà développé, il est nécessaire d’avoir recours à des animaux, car ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits entièrement en laboratoire

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre l’origine de certaines malformations du cerveau qui apparaissent pendant son développement et qui peuvent entraîner, plus tard, des troubles du comportement comme l’autisme ou l’épilepsie. Pour cela, nous utilisons une technique qui permet de désactiver un gène précis dans certains neurones du cerveau d’animaux, à différents moments de leur développement. Ce type de manipulation ne peut pas être réalisé uniquement sur des cellules en laboratoire. Cette approche nous permettra d’étudier le rôle de ce gène dans la formation et le bon fonctionnement des neurones. Par la suite, nous observerons aussi le comportement des animaux pour comprendre comment l’absence de ce gène peut conduire à des signes proches de l’autisme ou à des crises d’épilepsie. À l’heure actuelle, il n’existe pas d’autre méthode permettant d’étudier ces questions sans utiliser d’animaux. À long terme, ce travail apportera des informations importantes pour mieux comprendre comment apparaissent les troubles neurodéveloppementaux. Il aidera également les chercheurs à développer des outils plus précis pour étudier l’autisme et l’épilepsie, par exemple en repérant des marqueurs biologiques qui pourraient permettre de mieux évaluer les risques ou de suivre l’évolution de ces pathologies.

Procédures

Une seule procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie d'une durée de 20 à 45 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Pour accéder aux structures du cerveau des souris, nous devons recourir à la chirurgie. Cette chirurgie peut être douloureuse au niveau de la tête (zone incisée), induire exceptionnellement une hémorragie cérébrale, une douleur post-opératoire, une infection, une baisse de température des souris ainsi qu’une déshydratation des yeux et de l'animal.

Devenir

Les résultats attendus de ce projet nécessitent de réaliser des analyses histologiques ou électrophysiologiques sur des coupes de cerveaux. Les animaux seront donc mis à mort à l'issue de l'unique procédure de ce projet.

Remplacement

Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires allant de l’étude biochimique ou électrophysiologique au comportement. De nombreuses études « in-vitro » ont donc été effectuées au laboratoire sur des neurones en culture en amont de l’utilisation d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. Néanmoins, l'étude de la formation du cortex cérébral et l'intégration des neurones dysfonctionnels dans un réseau de neurones matures nécessite l'utilisation d'animaux.

Réduction

Pour réduire le nombre de femelles gestantes utilisées, nous avons choisi de n’utiliser qu’un groupe d’animaux contrôle pour nos deux études. Le nombre minimal d’animaux par groupe a été estimé grâce à un logiciel spécialisé.

Raffinement

Pour limiter au maximum la douleur et la souffrance des animaux, plusieurs mesures de bien-être sont mises en place. Les jeunes souris de moins de 3 semaines restent avec leur mère dans une cage contenant du matériel pour faire un nid. À partir de 3 semaines, les mâles et les femelles sont séparés et placées en petits groupes dans des cages possédant tous les matériaux nécessaires pour qu’ils puissent se cacher et construire un nid. Les animaux sont observés chaque jour par l’expérimentateur et/ou le personnel animalier. Leur comportement, leur état général, leur capacité à manger ainsi que l’état de leur pelage sont vérifiés. Toute anomalie est immédiatement notée dans un registre en ligne accessible aux personnes responsables du bien-être animal, ce qui permet une réaction rapide si nécessaire. Un échange quotidien entre le personnel animalier et l’expérimentateur garantit une prise de décision rapide en cas de problème. Pendant la chirurgie, les souris sont placées sous anesthésie générale et reçoivent un traitement antidouleur avant et après l’intervention. Après l’opération, elles sont surveillées deux fois par jour pendant 72 heures, y compris le week-end. L’équipe vérifie alors que la plaie cicatrise correctement, que l’animal mange bien, reste vif et, pour les adultes, qu’il est capable de reconstruire son nid. Si un signe anormal apparaît, une personne en charge du bien-être animal examine immédiatement l’animal et décide des mesures à prendre, en lien avec le vétérinaire référent. Si malgré ces mesures l’état de l’animal ne s’améliore pas, une mise à mort sera pratiquée de façon rapide et sans douleur, selon les méthodes autorisées. Cette décision est prise par le porteur du projet en accord avec la vétérinaire, ou directement par la vétérinaire si l’instructeur n’est pas disponible.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car son cerveau présente des similitudes importantes avec celui de l’être humain, ce qui permet d’étudier plus efficacement le développement cérébral. De plus, la majorité de nos expériences en laboratoire ont déjà été réalisées sur des neurones de souris, et notre équipe maîtrise bien les techniques chirurgicales nécessaires chez cet animal. Dans ce projet, nous étudierons trois périodes clés du développement du cerveau : juste après la naissance (entre 0 et 5 jours), pendant la croissance (entre 14 et 21 jours) et à l’âge adulte.