Rongeurs

Choisies à six à dix semaines parce que la graisse et le tissu fibreux des animaux plus âgés gêneraient la visibilité sous échographie, 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un marqueur neuronal leur est injecté à la microseringue près de la crosse aortique sous anesthésie, geste dont le porteur reconnaît le risque de pneumothorax, puis un régime enrichi en adénine leur provoque pendant vingt-huit jours une maladie rénale accompagnée d'une altération de l'état général et d'une perte de poids. Cinq à six semaines après l'injection, elles sont tuées pour prélever leurs organes et mettre leurs neurones en culture. Sur le remplacement, le porteur affirme que les alternatives non animales n'existent pas pour étudier la communication entre le sang et le cerveau.

Objectifs

L'insuffisance rénale chronique touche près de 700 millions d'adultes dans le monde, avec des taux plus élevés dans les pays les plus développés. Les complications liées aux maladies rénales chroniques incluent notamment l’hypertension artérielle, qui est la cause principale des maladies cardiovasculaires et des décès prématurés dans le monde. Les patients atteints de la maladie rénale chronique souffrent également de nombreuses complications neurologiques, notamment d'anxiété, de dépression, d'anomalies motrices, de troubles du sommeil et de troubles cognitifs. Il a été montré que la maladie rénale chronique, à la fois chez les patients et dans les modèles murins de cette maladie, entraîne des dysfonctionnements des mécanismes de régulation de la pression artérielle. Ces mécanismes réflexes modulent le diamètre des veines et des artères, ainsi que le rythme et la contractilité cardiaque, afin de contrôler la pression sanguine. La détection de la pression artérielle est initiée par des neurones dont les terminaisons, sensibles à l’étirement des vaisseaux sanguins, se situent dans des structures particulières des grosses artères : les sinus carotidiens (au niveau du cou) et la crosse aortique (à la sortie du coeur). Cette sensibilité à l’étirement leur est conférée par l’expression de protéines similaires à celles qui sont impliquées dans le toucher et dont notre équipe est spécialiste. Notre projet vise donc à caractériser les spécificités fonctionnelles et moléculaires des neurones aortiques chez la souris en conditions physiologique, et leurs modifications dans le modèle de la maladie rénale chronique. Nous pourrons ainsi évaluer si ces modifications participent à l’hypertension observée dans la maladie.

Bénéfices attendus

Notre étude pourrait être à l'origine de l'identification de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la régulation de la pression artérielle. L’utilisation du modèle de maladie rénale chronique nous permettra de mieux comprendre comment les neurones à l’origine de la régulation de la pression artérielle sont affectés au cours de la maladie et de déterminer si ceux-ci peuvent être à l’origine de l’hypertension qui accompagne les maladies rénales chroniques. De là, pourra être envisagé le développement de nouvelles stratégies pharmacologiques.

Procédures

1) Injection guidée par échographie de marqueurs dans la crosse aortique. Les souris seront anesthésiées pour être positionnées sous l'échographe. Pour éviter toute douleur liée à l’injection, nous administrerons préalablement un analgésique par voie sous-cutanée. La zone d’injection sera épilée puis désinfectée. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante permettant le suivi de paramètres cardiorespiratoires ainsi qu’un suivi de la température. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de la procédure. A l'aide d'une microseringue, nous injecterons aux environs de la crosse aortique 1 microlitre d'une solution contenant un marqueur neuronal. La procédure durera 15 à 20 minutes maximum. En fin de procédure l’animal sera réveillé, placé dans une pièce de surveillance post-examen, chauffé, avec eau et nourriture. 2) Visualisation du marquage de la crosse aortique. 4 à 5 jours après l’injection, les souris seront anesthésiées pour vérifier la présence d’un marquage au niveau de la crosse aortique grâce à un appareil d'imagerie in vivo. La manipulation durera 10 min maximum. 3) Les animaux seront soumis à un régime alimentaire spécifique induisant le modèle de maladie rénale (28j). 4) 5 à 6 semaines après l’injection, les souris seront mises à mort pour prélever les organes et procéder à des cultures de neurones et prélèvement d’organes.

Impact sur les animaux

Les risques sont liés à 1) l’anesthésie : stress de la manipulation, déshydratation, détresse respiratoire et perte de poids ; 2) à l'injection bien que celle-ci soit guidée par échographie : risque de pneumothorax (douleurs diffuses et intenses dans la région du thorax, difficultés à respirer, respiration très rapide, faiblesse générale) et risque d’infection au point d’injection. Il n'y a aucun effet indésirable lié aux molécules injectées. L’induction d’une maladie rénale par un régime spécifique provoque une altération de l’état général et un stress de l’animal qui peut se manifester par une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure. Les organes seront prélevés pour réaliser des analyses et des cultures neuronales.

Remplacement

Le marquage des neurones de la crosse aortique ne peut se faire que sur des animaux vivants. Les marqueurs neuronaux fonctionnent chez la souris. Les alternatives non animales n'existent pas. Nous étudions une communication entre organes : le système sanguin et le cerveau, qu'il est impossible de modéliser in vitro ou à l'aide de modèles informatiques. Cette étude ne peut pas être faite chez l'humain.

Réduction

Comme évalué dans des études préliminaires concernant l’injection guidée sous échographie et le modèle murin de maladie rénale chronique, des lots de 35 et de 20 animaux sont nécessaires afin d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats. Nous utiliserons des tests statistiques spécifiques pour comparer deux lots entre eux ou pour comparer plusieurs (>2) lots.

Raffinement

Les injections sous échographie se feront sous anesthésie. Pour éviter toute douleur liée à la procédure, nous administrerons deux analgésiques par voie sous cutanée. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante permettant le suivi des paramètres cardiorespiratoires ainsi qu’un suivi de la température. Le gel d’échographie sera chauffé préalablement à son application sur l’animal. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de l'examen. En fin de procédure l’animal sera réveillé, placé dans une pièce post-examen, chauffé, avec eau et nourriture ad libitum. Suite à la chirurgie, nous utiliserons une grille d'évaluation du bien-être des animaux tous les jours pendant 3 jours puis 2 fois par semaine. L'évaluation sera dépendante de plusieurs critères dont chaque modification sera cotée. En fonction du score total, les animaux pourront être placés sous traitement analgésique et/ou il y aura arrêt de l’expérimentation par mise à mort de l’animal. L’environnement des animaux sera enrichi avec des dômes autoclavables, des morceaux de bois à ronger et des nids à base de coton.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle souris car le marquage des neurones de la crosse aortique par injection sous échographie est une méthode que nous avons validée au sein du notre laboratoire. De plus, nous maîtrisons le modèle de maladie rénale chronique par régime riche en adénine validé chez la souris. Enfin, cette espèce permet également le recours à des techniques validées de quantification moléculaire, permettant de répondre à nos hypothèses. Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront âgées de 6 à 10 semaines ce qui correspond à un stade jeune adulte. Les souris ne présentent pas encore d'accumulation de tissus graisseux et/ou fibreux qui pourraient nuire à la visibilité des structures sous échographie.

Soumises pendant six mois à des entraînements de course sur tapis de 45 minutes trois fois par semaine, plus force et équilibre, 108 souris de 50 semaines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever sang, muscle, foie et tissu adipeux. Elles passent sept séries de tests de performance qui les fatiguent, sept mesures de composition corporelle avec contention et jeûne allant jusqu'à quatorze heures, et un transport de 15,3 kilomètres entre deux établissements. Le protocole vise à démontrer que des protéines de ténébrion valent des protéines laitières pour accompagner la reprise du sport chez les personnes vieillissantes. Le porteur écrit d'emblée penser démontrer l'effet attendu, et destine les résultats au développement de nouveaux produits alimentaires.

Objectifs

Ce projet se fera sur 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Notre objectif est de tester l’impact d’une approche combinant une complémentation nutritionnelle en protéines d’insectes (Ténébrion) et en vitamine D avec un programme d’activité physique adaptée dans le but de limiter la perte de fonction musculaire au cours du vieillissement chez la souris en surpoids. Les critères principaux d'investigation sont les performances physiques, la composition corporelle, la synthèse protéique musculaire, l'inflammation et le métabolisme de la vitamine D. A l'issue du projet, plusieurs dosages biochimiques (protéines circulantes relarguées) seront effectués au niveau circulant et au niveau du muscle squelettique, du foie et du tissu adipeux. L’objectif final de ce projet est de démontrer que la qualité nutritionnelle des protéines d’insectes est compatible avec la pratique sportive dans un contexte de veillissement.

Bénéfices attendus

Nous pensons démontrer par ce protocole qu’une complémentation combinée de protéines et de vitamine D a un effet anabolique musculaire plus fort qu’une complémentation protéique simple ou qu’une situation sans complémentation. Nous nous attendons à ce que la vitamine D puisse potentialiser l’effet anabolique des protéines, et puisse favoriser la restauration de l’homéostasie glucidique et lipidique, limiter l’inflammation du tissu adipeux et l'infiltration lipidique dans les tissus. Nous attendons également que la complémentation en protéines de ténébrion ait des effets anaboliques comparables aux protéines laitières (protéines de référence) afin de démontrer que cette source de protéines présente une bonne digestibilité et est aussi efficace qu’une protéine laitière au cours de la récupération sportive. En perspective à long terme, ce projet apportera des données scientifiques pour le développement de nouveaux produits alimentaires destinés aux personnes (âgées) souhaitant un accompagnement nutritionnel lors de la reprise d'activité physique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des entrainements d’endurance (45 min 3x/sem), de force (15 min 1x/sem) et d’équilibre (15 min, 1x/sem) ainsi que des tests de performances physiques (vitesse maximale de course, force d’agrippement, équilibre) chaque mois (15 min par tests) pendant 6 mois à l’EU1 pour suivre leurs capacités locomotrices. Les animaux seront soumis de manière non invasive à une estimation de leur masse maigre et grasse par résonnance magnétique 1x/mois et à une estimation de leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte (2x) pendant 6 mois à l’UE2 pour suivre l’évolution de leur composition corporelle et leur dépense énergétique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront souris à un protocole d’activité physique modérée de 16 semaines (course sur tapis, entrainement en résistance et équilibre) qui entrainera la prise en main quotidienne des animaux. Le personnel impliqué dans les mesures est formé à la contention low stress. Les animaux seront soumis à des tests de performances physiques (vitesse de course, force, équilibre) répétés 7x sur la durée du protocole (24 semaines) qui entraineront de la fatigue suivie d’une période de récupération. Des mesures de composition corporelle (7x) nécessiteront une contention des animaux d’une durée inférieure à 2 min et une mise à jeun des animaux d’une durée inférieure à 14h. Pour la mesure de la synthèse protéique musculaire (mesure unique en fin de protocole), les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée. La piqure d’aiguille pour l’injection est réalisée sur animal vigile en contention et entrainera une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure afin de prélever les tissus nécessaires aux analyses biochimiques (sang, muscle, tissu adipeux, foie).

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacée par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas de mesurer simultanément l’évolution de la fonctionnalité musculaire (masse et force), de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant. Il est difficile de suppléer l’activité physique par des systèmes in vitro même si des systèmes de stimulation électriques de cellules musculaires existent, ils ne remplacent pas les adaptations cardio-respiratoires à l’exercice. Ce projet requiert une analyse multi-tissus du métabolisme de la vitamine D afin de comprendre pourquoi la déficience en vitamine D est si importante chez l'homme. Pour effectuer une télle étude chez l'homme, il faudrait pratiquer des biopsies tissulaires du foie, du tissu adipeux et du muscle squelettqiue. Ces techniques restent trop invasives à mettre en place chez un même volontaire sain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de souris nécessaires est calculé pour une différence attendue de 25% pour la synthèse protéique musculaire entre les souris nourris avec les régimes non supplémentés en protéines et les souris nourris avec les régimes supplémentés en protéines (protéines de lactosérum ou protéines d’insectes). Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. Ainsi, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à l'âge, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 108.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les souris seront hébergées par 6 dans des cages de dimension conforme à la réglementation comportant à mimina une maison en carton à double entrée, des batonnets en bois, et des ficelles de carton pou la nidification . Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum. Les points limites et l’arbre de décision adapté à cette étude sont présentés en annexes 1 et 2. Pour le transport des animaux à l'EU2, les animaux seront placés dans des cages de transport agrées opaques avec nourriture + eau gélifiée + enrichissement. Les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 15.3 km).

Choix des espèces

Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi la souris car cette espèce a montré une très bonne compliance à la course sur tapis dans nos études antérueures. De plus, ces souris sont très actives en environnement enrichi ce qui est crucial pour tester l’effet de l’activité physique volontaire. Nous avons utilisé cette espèce par le passé et validé toutes les procédures détaillées dans ce dossier avec ces souris. Notre protocole vise à freiner une diminution de la fonction musculaire avec l’âge (sarcopénie). Nous utiliserons donc des souris de 50 semaines à l’entrée dans le protocole. A la fin du protocole, les souris seront âgées de 74 semaines ce qui est suffisant pour obersver une baisse de la force musculaire et des performances physiques dans les groupes non supplémentés et non entrainés.

294 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la mamelle, puis un agent de contraste directement dans la tumeur, avant trois séances d'irradiation localisée sous anesthésie générale, une par jour. Le porteur indique que le modèle est réputé produire des tumeurs qui nécrosent rapidement malgré leur petite taille, et que cette nécrose peut entraîner une douleur modérée. Il annonce un changement radical dans l'administration des radio-sensibilisants, bloquée depuis des décennies sur des dérivés du platine, quand l'étude compare des formulations d'émulsions sur des tumeurs greffées.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet radio-sensibilisant de différentes formulations d’émulsions d'agents de contraste sur la croissance tumorale ainsi que la caractérisation des modifications du microenvironnement tumoral associées aux traitements. Cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles combinaisons thérapeutiques et conduire à un changement radical dans l’administration concomitante de radio-sensibilisants, qui sont restés depuis des décennies bloqués sur des agents relativement anciens et parfois toxiques tels que les dérivés du platine, générant un gain thérapeutique relativement faible.

Bénéfices attendus

En adoptant cette approche, nous visons à minimiser les limitations des thérapies utilisées seules, à améliorer les résultats thérapeutiques et à augmenter la réponse globale des tumeurs en limitant les toxicités liées aux traitements. Cette stratégie de traitement à multiples facettes non seulement promet d'améliorer les résultats thérapeutiques actuels mais pourrait également nous conduire à développer de nouvelles stratégies de traitement antitumoral plus efficaces et moins toxiques. Ce projet espère fournir une base solide et des nouvelles perspectives pour optimiser les traitements cliniques futurs tout en réduisant les effets secondaires des thérapies en question.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de cellules tumorales sous anesthésie locale (une fois, durée environ 20 secondes) et à une injection du traitement (une fois, durée environ 20 secondes), sous anesthésie générale. Les animaux auront des irradiations localisées des tumeurs (une fois par jour pendant trois jours, un cycle d'irradiation dure environ 2 minutes), sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

En raison de la croissance des tumeurs ou des effets secondaires des traitements, les animaux peuvent présenter des changements de comportement modérés, tels qu'une diminution de l'appétit et/ou une réduction de l'activité. Le modèle utilisé est réputé pour produire des tumeurs qui nécrosent rapidement, malgré leur petite taille. Cette nécrose peut entraîner une douleur modérée à court terme.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour examen post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer l'effet thérapeutique des agents de contrast à base de lipiodol, combinés à la radiothérapie. Ceci exige donc un système biologique dynamique et complet en interaction direct avec le stroma tumoral. Ceci nécessite le recours à un modèle animal vivant entier et ne peut pas être modélisé in vitro ni in silico..

Réduction

Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique à priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. Le critère de jugement principal pour le calcul de puissance est la taille tumorale.

Raffinement

Une anesthésie générale sera faite lors des injections des cellules tumorales dans la mamelle de la souris mais aussi lors des injections de agents de contraste en intratumoral. Les conditions d'hébergement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaire. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des maisons en carton afin de diminuer leur angoisse. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement, au minimum de façon hebdomadaire. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Un aliment appétent et énergétique sera proposé en cas de nécessité.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie l'étude de la croissance tumorale. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 7 à 9 semaines, âge auquel les souris sont adultes.

Caractériser l'effet de molécules à visée thérapeutique sur la cognition : 960 souris et 960 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour contrôle histologique. Chacun subit une chirurgie d'implantation de deux à trois heures sous anesthésie générale, puis des tâches comportementales pouvant atteindre une séance quotidienne de 25 minutes pendant quatre semaines, avec hébergement individuel, tête restreinte et restriction hydrique ou alimentaire. Ni les molécules ni les tâches comportementales ne sont nommées. Le porteur annonce des soins postopératoires sans douleur tout en listant un risque de douleur aiguë après la chirurgie, et justifie l'effectif de 1 920 animaux par "la force de notre hypothèse" et des années d'expérience, sans calcul rapporté.

Objectifs

Le présent projet s’inscrit dans un contexte de recherche préclinique visant à caractériser l’effet de molécules à visée thérapeutique sur la cognition et le fonctionnement cérébral. Les techniques utilisées incluent l’enregistrement et la modulation de l’activité neuronale chez l’animal anesthésié ou vigile et libre de ses mouvements. Ces approches permettent d’évaluer en temps réel l’impact potentiel d’un traitement thérapeutique sur les fonctions neuronales, cognitives et comportementales. Le modèle animal est indispensable pour étudier le potentiel thérapeutique de composés pharmacologiques avant leur éventuel développement clinique. Les rongeurs (souris et rats) sont classiquement utilisés pour la recherche préclinique en santé humaine, notamment dans des études de molécules susceptibles de modifier l’activité neuronale, le comportement et/ou la cognition. Les procédures employées suivent des standards établis dans les laboratoires de recherche publique, garantissant la fiabilité et la reproductibilité des données expérimentales.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’accompagner des études précliniques combinant approches comportementales et neurophysiologiques afin de mieux comprendre les effets de composés pharmacologiques à visée thérapeutique. Ce projet permettra de caractériser de manière précise l’impact de ces composés sur la cognition, le comportement et le fonctionnement cérébral, en fournissant des données fiables et reproductibles sur leurs effets neuronaux et cognitifs. Ces informations contribueront à identifier les cibles thérapeutiques pertinentes et à orienter le développement de nouveaux traitements dans un contexte préclinique.

Procédures

Les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée approximative de 2 à 3 heures, permettant l’enregistrement de l’activité neuronale dans une région cérébrale d’intérêt. Selon les études, les animaux effectueront différentes tâches comportementales adaptées aux molécules et aux régions cérébrales étudiées. Un ensemble de tâches standardisées est utilisé, dont la récurrence et la durée peuvent varier d’une séance unique de 15 minutes jusqu’à une séance quotidienne de 25 minutes sur environ 4 semaines. Cette approche combinant mesures neurophysiologiques et évaluation comportementale permettra de mieux caractériser l’impact des composés pharmacologiques sur la fonction cérébrale et la cognition. L’hébergement individuel sera appliqué uniquement aux animaux porteurs d’implants ou soumis à un contrôle hydrique ou calorique,(de quelques jours à plusieurs semaines, maximum 1 mois), tandis que la restriction hydrique ou alimentaire sera mise en place sur la période expérimentale correspondante afin de mesurer individuellement les apports (de quelques jours à une semaine).

Impact sur les animaux

Nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/Un risque de perte de poids trop importante durant le contrôle calorique, en cas de perte de poids l'animal est nourri ad libitum pendant 48H. 3/ un risque de perte d’implant lié aux chirurgies implantatoire 4/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après les procédures comportementales, en vue de la réalisation de contrôles histologiques.

Remplacement

L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus cognitifs/comportementaux. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus l'espèce humaine. 3) De plus, nous étudions le fonctionnement des circuits neuronaux alors même que le sujet est éveillé et soumis à des tests comportementaux : il nous faut donc travailler avec des animaux vivants et vigiles.

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e. mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.

Raffinement

À chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de carton, leur permettent de construire des nids, de jouer et de ronger. Leur soin est confié à du personnel qualifié et expert. Il surveille quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suivent les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures chirurgicales. L’expérimentateur possède une solide expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter toute souffrance animale, avec la mise en place de mesures pour les soulager, comme la réhydratation, le réchauffement et une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris et le rat : -sont des mammifères étroitement liés à l'espèce humaine sur le plan phylogénétique, et certains de leurs comportements peuvent être comparés à ceux de l'humain. Ces rongeurs sont fréquemment utilisés dans les études électrophysiologiques, utilisant la technique de fiber photométrie, ainsi que dans les manipulations optogénétiques. -permettent des approches in vivo pour étudier les effets de composés thérapeutiques sur le système nerveux central, ainsi que leurs corrélations avec les fonctions cognitives, à travers l'analyse comportementale. Les animaux seront utilisés au stade adule, soit à partir de 10 semaines, un âge qui correspond à la maturité des circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées. De plus, les rongeurs adultes sont plus résistantes et récupèrent plus rapidement après la chirurgie que les plus jeunes.

Les souris de la souche employée sont immunodéficientes et portent une mutation qui tue leurs propres cellules du foie, ce qui permet d'y greffer des cellules hépatiques humaines, parfois avec des cellules souches qui leur donnent aussi un système immunitaire humain. 8800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments contre des infections virales, le cancer du foie, des maladies métaboliques ou l'insuffisance hépatique. Les procédures comprennent quatre à sept injections d'un composé qui détruit les cellules du foie et les cellules souches, la greffe de cellules humaines, notamment par la veine porte avec un risque hémorragique accru, l'induction de maladies, l'administration des candidats médicaments et des prises de sang. Le porteur estime que l'humanisation ne réussit que chez la moitié environ des souris, et dit avoir fixé l'effectif sans approche statistique, d'après les études des années antérieures et une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial". Il indique que des souris pourront passer dans d'autres projets de l'établissement, dont une formation interne aux gestes techniques, et que les autres seront tuées parce qu'elles "ne recouvreront pas leur état de santé". 200 souris sont déclarées réutilisées.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Dans certains cas, la présence d’un système immunitaire humain, en complément d’un foie humanisé, est indispensable pour étudier des processus physiopathologiques spécifiques, comme dans les maladies métaboliques (ex. : MASH) ou virales (ex. : dengue). Dans ces cas, une double humanisation, incluant à la fois le foie et le système immunitaire des souris, sera envisagée afin de répondre de manière optimale aux besoins scientifiques et aux questions posées. Les cellules hépatiques humaines (et immunitaires, le cas échéant) pourront ensuite, par exemple, être infectées par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable et plus acceptable sur le plan éthique que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. En cas de besoin, il sera également possible d’humaniser simultanément le compartiment immunitaire et hépatique. Cette double humanisation constitue un atout majeur, car elle permet de modéliser plus fidèlement les interactions entre le foie et le système immunitaire humain, particulièrement dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. De plus, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, éthiquement plus acceptable que les primates non-humains, et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée pourront également être exploitées pour l’étude des mécanismes d’insuffisance hépatique et des thérapies ciblant cette condition. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’évaluer les réponses immunitaires humaines face à des pathologies complexes, notamment dans le contexte de traitements antiviraux ou de maladies impliquant des dysfonctionnements immunitaires.

Procédures

[MODIFICATION] 4 à 7 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale, ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par [MODIFICATION] l’identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection, la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de [MODIFICATION] 4 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de la PE2, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences des prélèvements sanguins sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique induisant la mort sélective des hépatocytes murins, ce qui permet de greffer simultanément en plus des cellules souches des hépatocytes humains. Cette approche vise à humaniser à la fois le système immunitaire et le foie. Cette double humanisation offre la possibilité d’évaluer des solutions thérapeutiques pour des maladies métaboliques et virales impliquant le système immunitaire, ainsi que pour les cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.

Les souris M83 sont modifiées génétiquement pour produire une forme humaine de l'alpha-synucléine et développent entre 8 et 22 mois une maladie qui évolue vers la paralysie du train postérieur. 150 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, maintenues jusqu'à l'atteinte des points limites, toutes tuées. La démarche saccadée et la perte d'équilibre servent de signal, leur confirmation déclenchant la mise à mort avant la paralysie, et le seul acte décrit est une ponction cardiaque de deux minutes sous anesthésie. Le porteur présente cette mise à mort comme compassionnelle, quand elle sert aussi à prélever le sang dans lequel chercher des vésicules extracellulaires neuronales.

Objectifs

Le projet vise à identifier des biomarqueurs sanguins dans un modèle de souris modifiées génétiquement pour développer une maladie associée à l’agrégation de l’alpha-synucléine, une protéine qui est le constituant principal des lésions cérébrales dans la maladie de Parkinson. Les vésicules extracellulaires sont des petites structures libérées par les neurones et qui sont retrouvées dans le sang. Leur présence dans le sang de souris offre une fenêtre non invasive sur l'état du cerveau. L'étude des vésicules extracellulaires neuronales dans le sang de ces souris M83 par des méthodes biochimiques permettrait d'identifier des biomarqueurs de maladie. Ces derniers sont des indicateurs biologiques de l'état pathologique du cerveau de la souris, et ils peuvent être utiles au diagnostic précoce de maladies neurodégénératives ou refléter l’existence de maladies différentes sur le plan lésionnel et clinique chez l'homme.

Bénéfices attendus

Le projet vise à rechercher si de nouveaux marqueurs moléculaires de la maladie peuvent être identifiés dans ce modèle expérimental à partir d’un prélèvement de sang. Réalisable par simple prélèvement sanguin et au cours de l’incubation de la maladie, cette identification ouvrirait la voie à des recherches de marqueurs précoces de la maladie.

Procédures

Les animaux sont soumis à une anesthésie, ainsi qu'à une ponction cardiaque d'une durée de 2 minutes au maximum.

Impact sur les animaux

L’apparition des signes cliniques moteurs se manifeste par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort compassionnelle des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort, en fonction de points limites adaptés, afin de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet qui vise à rechercher des biomarqueurs dans le sang ne peut être réalisé que sur animal vivant. Il n'existe pas aujourd'hui de méthode alternative pour évaluer le potentiel de ce type d'approche.

Réduction

Le projet complet prévoit un total de 150 souris, maintenues jusqu’à l’atteinte des points limites définis. La quantité de prélèvements issus de ces souris est jugée suffisante pour permettre la réalisation d’extraction de vésicules extracellulaires neuronales, et mener à bien nos analyses.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un portoir ventilé par groupe de 5 souris de même sexe, et originaires de la même portée, et maintenus dans un environnement enrichi (dômes en plastique, buchettes en bois et éléments de nidification) pendant toute la durée de l’expérimentation. Ces enrichissements sont renouvelés chaque semaine, et la litière en rafle de maïs changée de façon bi-hedomadaire. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. Le test de suspension par la queue montre une dégradation de l’écartement des pattes postérieures. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés selon les critères et le scoring prévu en annexe et justifiant la mise à mort de l’animal. Lors de la ponction intracardiaque, une analgésie est réalisée 30 minutes avant l'anesthésie.

Choix des espèces

Les souris M83 sont des souris modifiées génétiquement et qui produisent une forme de la protéine alpha-synucléine humaine entraînant le développement d’une pathologie de cette protéine accompagnée d’une symptomatologie motrice. Elles développent une maladie qui se manifeste cliniquement par l’apparition d’une paralysie lors du vieillissement, entre 8 et 22 mois. Elles constituent un modèle pertinent de la maladie de Parkinson chez l'homme.

123 cobayes vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue, 29 d'entre eux devant être réutilisés dans un autre modèle d'otite parce que leurs deux tympans se sont refermés spontanément avant le traitement. Chacun subit une perforation des tympans sous anesthésie générale, une trentaine une seconde intervention, puis onze semaines d'examens otoscopiques hebdomadaires, trois mesures d'audition et deux à trois prélèvements de microbiote, chaque fois sous anesthésie. L'objectif est de tester des gels et des patchs chargés de probiotiques pour refermer un tympan perforé sans chirurgie, une approche destinée en priorité aux enfants des pays mal équipés. Le porteur qualifie ces méthodes de moins invasives et moins douloureuses actuellement disponibles, et conclut que le recours à l'animal est "incontournable".

Objectifs

L'otite moyenne chronique est la maladie infantile la plus fréquente dans le monde. Elle se caractérise par des écoulements auriculaires dus à une perforation persistante du tympan. Cette membrane sépare l'oreille moyenne de l'oreille externe. Sa fonction principale est la transmission des sons. L'otite moyenne chronique est une cause fréquente de perte auditive, voire de décès dûs à des complications intracrâniennes, notamment dans les pays en développement. L'administration d'antibiotiques à large spectre induit des effets secondaires et est en partie responsable de l'augmentation de la résistance aux antibiotiques. Si la perforation ne se répare pas d'elle-même, une intervention chirurgicale (sous anesthésie générale) est nécessaire mais son accès peut être compliqué dans les pays en développement qui ne sont pas bien équipés (par exemple, absence de loupe binoculaire pour la chirurgie). Ce projet propose une nouvelle approche de soins combinant une procédure simple de réparation du tympan et une alternative aux antibiotiques. Des biomatériaux actifs de type gel ou patch avec des propriétés mucoadhésives et cicatrisantes faciles à administrer et contenant des probiotiques seront introduits dans l’oreille pour fermer la perforation du tympan et ainsi faciliter sa cicatrisation tout en restaurant le microbiote local. Nous faisons l'hypothèse qu'une telle stratégie sans chirurgie associée à des probiotiques pourrait être une approche pertinente pour traiter l’otite moyenne chronique chez l'enfant et prévenir les récidives d'otites. Cette étude a pour objectif de tester différentes stratégies de réparation tympanique (gel ou patch ou patch+gel, avec ou sans probiotiques) sur un modèle animal afin de trouver la solution la plus adaptée et efficace possible.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels de l’otite moyenne chronique chez l'enfant sont confrontés à plusieurs limitations : résistance croissante aux antibiotiques, accès à des chirurgiens et des centres médicaux experts, procédures coûteuses et longues, risque de complications anesthésiques, inégalité d'accès aux traitements dans les friches médicales et les pays en développement. Compte tenu de la forte prévalence de cette pathologie chez les enfants et de son impact négatif sur la qualité de vie et le développement de ces jeunes patients, il est crucial d'ouvrir de nouvelles approches thérapeutiques. Ce projet vise à développer un dispositif biomédical pour régénérer le tympan perforé en utilisant des gels et des patchs aux propriétés mucoadhésives et cicatrisantes associés à des probiotiques. Ce projet est particulièrement novateur car il va au-delà de l'état actuel de l'art. À notre connaissance, il n'existe pas de système permettant simultanément l'administration de probiotiques dans l'oreille moyenne et la réparation du tympan. En cas de succès, ce projet serait poursuivi par des études cliniques en collaboration avec des hôpitaux pédiatriques. L'approche probiotique locale pourrait également être proposée en cas de perforation recente dans les pays en développement.

Procédures

Les cobayes seront soumis à différents gestes techniques : une chirurgie sans incision sous anesthésie générale d’une durée de 10 minutes et pour une trentaine de cobayes une deuxième chirurgie sans incision de courte durée (10 minutes) après récupération complète de la première chirurgie ; une mesure de l’audition sous anesthésie générale d’une durée de 10 minutes, répétées 3 fois sur 11 semaines (procédure non douloureuse) ; des prélèvements du microbiote du conduit auditif et de l’oreille moyenne sous anesthésie générale, répétés deux à trois fois, d’une durée de quelques secondes (procédure non douloureuse) ; une administration des traitements sous anesthésie générale, par voie locale, d’une durée de 5 minutes ; un examen otoscopique du tympan une fois par semaine sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes pendant 11 semaines (procédure non douloureuse).

Impact sur les animaux

Les méthodes sélectionnées pour cette étude sont les moins invasives et les moins douloureuses actuellement. La perforation du tympan peut entrainer une douleur faible à modérée qui sera traitée par des antalgiques. Elle peut aussi induire une perte auditive légère. Dans des cas exceptionnels, un écoulement purulent de l’oreille qui marque une infection peut apparaitre.

Devenir

Tous les cobayes inclus dans les groupes expérimentaux au moment du traitement seront mis à mort à l’issue de chaque procédure. Des analyses histologiques sur les organes d’intérêt seront réalisées. Les animaux dont les 2 tympans se sont refermés spontanément avant l’application du traitement seront réutilisés dans une procédure modérée dans un autre modèle d’otite. Cela concernera 29 cobayes. La décision sera prise par notre vétérinaire référent.

Remplacement

L’oreille est un organe complexe et il n'existe pas, à ce jour, de modèle cellulaire permettant de reproduire le tympan qui est une membrane séparant deux compartiments aériens. Le seul moyen permettant d’étudier des traitements pour soigner l’otite moyenne chronique impliquant la cicatrisation du tympan perforé reste l’utilisation d’un modèle animal vivant. Le maintien d’une bonne audition est aussi un paramètre primordial et seul l’animal nous permet de mesurer et d’évaluer la fonction auditive. Ainsi, le recours à l’animal est incontournable pour évaluer des traitements innovants sur la capacité régénérative du tympan et la fonction auditive.

Réduction

Dans chaque groupe, le nombre d’animaux a été fixé afin de s’affranchir des variations individuelles et garantir la validité statistique de l’étude. La mise au point permettra de valider le modèle de perforation chronique de la membrane tympanique et nécessitera au maximum 25 animaux. Le tympan est une membrane avec des fortes capacités de régénération et un modèle chronique de perforation (> 8 semaines) est difficile à obtenir. Dans la littérature, le pourcentage de succès varie de 0 à 84% selon les études Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide d’un logiciel de statistique qui a permis de déterminer le nombre juste et minimal d’animaux qui garantira la validité statistique de l’étude. Une étude pilote avec un nombre limité d’animaux permettra la mise au point du modèle avant de tester les différents traitements. Un plan d’expérience rigoureux a été pensé afin d’optimiser les groupes expérimentaux et réduire le nombre d’animaux. Si les traitements ne présentaient pas l’efficacité escomptée, la procédure serait arrêtée. Certains cobayes dont les tympans se seront refermés spontanément et qui par conséquent ne seront pas inclus dans les groupes expérimentaux seront réutilisés dans une autre procédure.

Raffinement

La semaine précédant l’expérimentation, les cobayes seront manipulés afin de les habituer au contact de l’expérimentateur et ainsi minimiser le stress le jour de la procédure expérimentale. Les méthodes sélectionnées pour cette étude sont les moins invasives et les moins douloureuses actuellement. Chaque geste chirurgical sera court et réalisé sous anesthésie générale par un chirurgien ORL expert. D’après notre expérience, l'altération potentielle de la fonction auditive n'entraine pas de trouble du comportement ni d'agressivité chez le cobaye. Les points limites seront déterminés, à partir d’une grille d’évaluation de l’état général de l’animal, pour détecter une éventuelle souffrance, détresse ou inconfort et seront strictement appliqués. Des mesures de gestion de la douleur seront mises en place en fonction du score avec un protocole antalgique adapté. Les cobayes seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi afin de favoriser des comportements naturels.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est le cobaye. C’est une espèce très utilisée dans la littérature en recherche ORL. L’anatomie du tympan est similaire à celle de l’homme et la surface du tympan est adaptée à la réalisation des gestes techniques. Son conduit auditif court permet un accès facile et une bonne visualisation du tympan. Des cobayes adultes, avec un poids entre 300 et 350 grammes seront utilisés. La taille du tympan chez le cobaye adulte est plus adaptée pour ce travail.

800 souris âgées de 18 à 22 mois vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune recevant jusqu'à 120 injections dans le ventre sur quatre mois. Elles développent spontanément des tumeurs internes, une perte de poids et une baisse d'activité, que le porteur range parmi les effets attendus du modèle de vieillissement. Les molécules testées visent à bloquer des filets libérés par les globules blancs, soupçonnés de favoriser fibrose et tumeurs avec l'âge. Les bénéfices annoncés pour la qualité de vie des personnes âgées sont renvoyés au long terme, quand les injections répétées et la mise à mort de toutes les souris pour analyse de leurs organes sont, elles, programmées.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre comment certaines cellules de défense de notre organisme, les globules blancs appelés neutrophiles, peuvent influencer le vieillissement. Ces cellules libèrent parfois des sortes de filets collants (appelés “NETs”) qui, au lieu de protéger, peuvent parfois causer des dommages. Ils pourraient favoriser la formation de cicatrices internes dans les organes et même contribuer à l’apparition de tumeurs avec l’âge. Pour étudier ce phénomène, nous suivrons des souris âgées (de 18 à 22 mois, ce qui correspond à un âge avancé chez l’humain) et nous testerons différents traitements capables de bloquer la formation ou l’action de ces “filets”. L’objectif final est de mieux comprendre comment ces cellules du système immunitaire participent au vieillissement et d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes âgées.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter des connaissances importantes sur le vieillissement et sur certaines maladies qui y sont associées. En comprenant mieux comment les “filets” libérés par les globules blancs (NETs) participent à la formation de cicatrices dans les tissus ou au développement de tumeurs, nous pourrions ouvrir de nouvelles pistes pour améliorer la santé des personnes âgées. À long terme, ces recherches pourraient aider à développer de nouveaux traitements capables de bloquer ces mécanismes et donc de limiter la perte de fonction des organes, de réduire certains risques liés à l’âge et d’améliorer la qualité de vie des personnes âgées. Ce projet contribuera aussi à une meilleure compréhension générale du vieillissement, ce qui est essentiel pour trouver des solutions contre plusieurs maladies chroniques qui touchent une population de plus en plus nombreuse.

Procédures

Dans ce projet, les souris âgées seront soumises à une seule catégorie d’intervention, réalisée par du personnel expérimenté afin de limiter au maximum leur stress et leur inconfort : • Injections de traitements : certaines souris recevront des médicaments expérimentaux par une petite piqûre dans le ventre. o Chaque injection dure moins de 30 secondes. o Selon le produit testé, ces injections seront effectuées : • quotidiennement pour les inhibiteurs, soit environ 120 fois sur la durée totale de 4 mois, ou • 2 à 3 fois par semaine pour les anticorps, soit environ 40 à 50 fois au total. o Les sites d’injection seront alternés pour éviter toute irritation locale. Ces interventions sont courtes, non chirurgicales, et n’entraînent qu’un inconfort léger et transitoire. Aucun autre geste invasif n’est prévu dans le cadre de ce projet.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, plusieurs effets indésirables sont susceptibles d’apparaître chez les souris : • Effets liés aux injections : De légères irritations locales peuvent survenir au point d’injection (rougeur, petit gonflement ou peau tannée). Ces réactions restent généralement transitoires. • Effets systémiques possibles : Certains traitements peuvent provoquer une fatigue passagère, une diminution de l’appétit ou une léger trouble de l’état général, sans gravité durable. • Effets liés au vieillissement naturel : Les souris âgées (18 à 22 mois) présentent spontanément des signes de vieillissement physiologique, tels qu’une activité locomotrice réduite, un pelage altéré, une perte modérée de poids ou l’apparition de tumeurs internes. Ces manifestations font partie des effets attendus du modèle de vieillissement et peuvent s’ajouter aux nuisances mineures liées aux injections répétées. Aucun autre effet indésirable spécifique n’est anticipé.

Devenir

À la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre l’analyse complète de leurs organes et de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Cette étape est indispensable, car les effets du vieillissement, tels que les cicatrices dans les tissus (fibrose) ou l’apparition de tumeurs, ne peuvent être évalués qu’en observant directement les organes au microscope et en réalisant des analyses biologiques détaillées. Les prélèvements permettront d’étudier la sévérité des lésions, la présence de cellules immunitaires spécifiques et l’impact des différents traitements testés sur ces altérations.

Remplacement

Avant de travailler sur les animaux, nous avons utilisé des modèles en laboratoire, par exemple des cultures de cellules vieillies (“cellules sénescentes”) et d’autres types de cellules présentes dans les tissus et le système immunitaire. Ces expériences nous ont permis de montrer que les cellules vieillies peuvent stimuler la libération de “filets” protecteurs (appelés NETs), et que ces filets peuvent contribuer à la formation de cicatrices dans les tissus (fibrose) et au développement de tumeurs. Toutefois, ces modèles de laboratoire ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’un organisme entier — comme la circulation du sang, le vieillissement global ou les interactions entre organes. C’est pourquoi un modèle animal reste indispensable pour répondre aux questions posées par ce projet.

Réduction

Le nombre de souris a été soigneusement calculé à l’aide d’outils statistiques, afin d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le moins d’animaux possible. Les travaux déjà réalisés dans d’autres modèles nous ont permis de cibler précisément les analyses et la durée du suivi (18 à 22 mois). Seuls 20 animaux par lot sont nécessaires pour tester nos hypothèses, ce qui correspond au minimum requis pour assurer une solidité scientifique tout en respectant le principe de réduction.

Raffinement

Des mesures concrètes seront mises en place pour réduire au maximum la douleur et l’inconfort des animaux. Les souris seront hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement favorisant leur bien-être (abris, matériel de nidification). Les injections de traitement seront effectuées par du personnel qualifié, en alternant les points d’injection pour limiter les irritations locales. En cas de signe de souffrance importante (ex. grosse tumeur, perte de poids sévère, difficultés respiratoires), l’animal sera immédiatement retiré de l’expérience et mis à mort de manière éthique et indolore.

Choix des espèces

Ce projet cherche à comprendre le rôle de certaines cellules du système immunitaire, appelées neutrophiles, et des “filets” qu’elles libèrent, dans le développement de maladies liées au vieillissement, comme les cicatrices anormales dans les tissus ou l’apparition de tumeurs. La souris a été choisie comme modèle d’étude car elle présente de fortes similitudes avec l’être humain concernant le fonctionnement du système immunitaire et les mécanismes de vieillissement. Cela permet d’obtenir des résultats fiables et transposables à l’humain. Nous utilisons des souris âgées de 18 à 22 mois, ce qui correspond à un âge avancé chez l’humain. Ce choix est essentiel pour étudier les phénomènes associés au vieillissement, tels que l’accumulation de cellules vieillies, la formation de cicatrices dans les organes ou le développement spontané de tumeurs. Le recours à ce modèle permet donc d’étudier de façon rigoureuse le rôle des neutrophiles dans les maladies liées à l’âge et de tester des traitements susceptibles d’améliorer la santé et la qualité de vie au cours du vieillissement.

Un point limite doit permettre de retirer de l'étude tout animal présentant un effet secondaire sévère. 161 rats, 120 lapins et 50 porcs vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la plupart tués pour prélever les sites d'injection, dix porcs étant gardés vivants en fin d'étude pour être réutilisés. Les dispositifs médicaux injectables leur sont implantés sous la peau ou dans le derme sous anesthésie générale, suivis de prises de sang hebdomadaires puis mensuelles et, chez les porcs, de vingt biopsies cutanées au maximum par animal. Le porteur écrit que le recours aux animaux est rendu obligatoire par le règlement européen 2017/745 et la norme ISO 10993 pour obtenir le marquage CE, et cette modification du projet augmente le nombre de lapins parce que plus de formulations qu'annoncé seront mises au point.

Objectifs

Le projet a pour objectifs d'obtenir des informations relatives à la tolérance locale de dispositifs médicaux injectables résorbables (DM classe III) et de répondre aux exigences quant à la constitution des dossiers réglementaires en vue de leur mise sur le marché. Les exigences relatives à la caractérisation de ces DM sont de plus en plus élevées, afin de garantir la sécurité des patients à court et long terme. La réalisation d'études de tolérance locale sur des modèles animaux appropriés, permettant de détecter au mieux l'apparition d'effets secondaires, est essentielle dans étapes de développement des dispositifs médicaux injectables. Toutes les études réalisées, même très en amont dans le processus de développement, sont susceptibles d'être utilisées dans les dossiers réglementaires, pour la partie "conception". Les études de tolérance sont généralement couplées à des observations d'efficacité des produits évalués (versus des produits de référence), et à la caractérisation de leur comportement dans l'organisme (modification des propriétés physiques du produit, dégradation, intégration dans les tissus...): ainsi une seule étude permet l'obtention de nombreuses informations pertinentes. MODIFICATION : Augmentation du nombre total de Lapin prévu dans la demande d'autorisation de projet, dans la même période d'autorisation. Sur la période d'autorisation, nous développerons plus de dispositifs médicaux biocompatibles innovants qu'il était prévu initialement, dont il est nécessaire d'évaluer la tolérance pour chaque nouvelle formulation. Leur tolérance est mesurée conformément à des protocoles expérimentaux standard et récurrent néccessitant un nombre d'observation minimum par formulation. Ajout également d'un nouveau fournisseur d'animaux.

Bénéfices attendus

Les projet permettra d'obtenir des données fiables concernant la tolérance, l'intégration et la dégradation des dispositifs médicaux injectables. Il permettra également de répondre aux exigences réglementaires concernant la constitution des dossiers en vue d'une mise sur le marché. Ceci afin d'assurer la sécurité des patients recevant ces produits ainsi d'assurer la sécurité des patients recevant les produits.

Procédures

Les animaux auront des injections sous anesthésie génér le à J0, pour une durée totale de 5 à 15 minutes/animal. D'autres actes sont envisagés mais non systématiques: Prises de sang: rats sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 1/mois maxi, 30 seconde par acte. Lapins vigiles avec anesthésie locale: 1 fois par semaine maximum pendant 1 mois, puis 1 fois par mois maximum, 1 minute maximum par acte. Porcs: sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 2 fois par mois maximum. Biopsies cutanées chez le Porc: sous anesthésie générale (injection intramusculaire, 30 secondes), maximum 20 biopsies réparties sur la durée de l'étude, durée 15 minutes environ par biopsie.

Impact sur les animaux

Les produits développés sont constitués de produits biocompatibles en solution aqueuse plus ou moins visqueuse. Il s'agit de composants très bien documentés pour une utilisation chez l'Homme. Ils sont par ailleurs évalués en premier lieu in vitro: les effets néfastes attendus chez l'animal après implantation sont donc mineurs, et constitués majoritairement d'inflammation locale légère à modérée. Dans de rares cas, les implantations intradermiques chez le Lapin peuvent générer des réaction un peu plus fortes, mais restant localisées au niveau du site d'injection.

Devenir

Dans la majorité des cas, les animaux devront être euthanasiés, afin de prélever les sites d'injection à des fins d'analyse. Cependant, chez les porcs, lors d'injections intradermiques, il sera parfois possible de réaliser les prélèvements par biopsie avec un biopsy punch (sous anesthésie générale) et de conserver les animaux en fin d'étude en vue d'une réutilisation.

Remplacement

Les produits étudiés sont d'abord évalués de façon approfondie grâce à des expériences in vitro: culture cellulaire, modèles de peau artificielle, organe isolé. Les essais de tolérance/biocompatibilité in vivo sont indispensables en complément des tests in vitro, lors de la mise au point d'un dispositif médical. En effet, seule l'implantation dans un organisme complet et vivant permettra d'évaluer d'éventuelles réponses immunitaires/inflammatoires ainsi que l'intégration des produits dans les tissus environnants. Par ailleurs, le recours aux animaux est rendu obligatoire par le règlement Européen (UE) 2017/745 tout en suivant la norme ISO 10993, pour l'élaboration des dossiers pour l'obtention d'un marquage CE (équivalent de l'AMM mais pour les dispositifs médicaux) et également demandé pour les dossiers équivalents dans les pays tiers.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans les études réglementaires est imposé par la norme ISO 10993, les préconisations sont donc suivies, sans augmenter inutilement le nombre d'animaux et sans répéter les protocoles. Dans le cas d'études non réglementaires, on veille à n'utiliser que les animaux strictement nécessaires pour l'obtention des résultats voulus, généralement un nombre très inférieur aux exigences réglementaires. La possibilité d'injecter plusieurs produits en différents sites chez un même animal, permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une période d'acclimatation systématique est respectée (durée selon l'espèce animale, mais toujours minimum 1 semaine). Les animaux sont hébergés en groupe et ont accès à un enrichissement spécifique à leur espèce (matériel de nidification pour les rats, blocs/objets à mâcher pour tous les animaux, jouets…). Des points limites, suffisamment prédictifs, permettent de sortir un animal de l’étude en cas d'effet secondaire sévère, ou de mettre en place des traitements pour des réactions locales (application de cicatrisant, administration d'antidouleur) afin que l'animal soit impacté le moins possible. Toues les manipulations des animaux seront réalisées dans un contexte de renforcement positif, basé sur des interactions amicales avec les personnels en charge des soins, afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Les actes trop stressants ou douloureux sont effectués sous anesthésie générale: injections à J0, prises de sang chez le Rat, chez le Porc, et biopsies cutanées chez le Porc. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de la procédure (observation quotidienne et suivi clinique avec pesée minimum une fois par semaine). Quelles que soient les procédures, toute éventuelle douleur est, si nécessaire, rigoureusement contrôlée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (anesthésie/analgésie).

Choix des espèces

Les 3 espèces font parties des espèces préconisées par la norme en vigeur. Le rat et le lapin sont des modèles d'implantation utilisés et maitrisés dans l'établissement utilisateur depuis 2006. Leur taille est suffisante pour permettre l'implantation de plusieurs produits chez un seul animal, l'utilisation de techniques d'imagerie et d'appareils de mesures de paramètres cutanés. Le porc est l’espèce animale se rapprochant anatomiquement le plus de l’Homme ; notamment dans la structure de la peau (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent). Cette similitude permet d'évaluer avec une plus grande certitude l’effet attendu en clinique. Sa taille, plus importante, permet également l'implantation de plus de produits chez un seul animal, permettant alors de réduire le nombre d'animaux utilisé. Ces modèles sont des modèles de choix (nombreuses données dans la littérature). Leurs comportements sont bien connus, ce qui permet de détecter facilement tout signe de douleur et/ou de mal-être. Les rats utilisés seront de jeunes adultes, environ 300g (=en fin de croissance, paramètres physiologiques stables). Les lapins seront âgés d'environ 14 semaines, soit environ 3.5kg (= présence d'un derme suffisamment épais pour que l'implantation intradermique des produits ne génère pas une contrainte mécanique trop importante). Les porcs utilisés seront de jeunes adultes. En effet, leur taille doit permettre un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids de 35kg à 70kg permettra de travailler sur des structures épidermiques, comparable à celles de l'homme (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent) ; indispensable pour reproduire les conditions attendues en clinique.