Rongeurs
Plateforme préclinique de modélisation des réactions allergiques chez la souris [MODIFICATION]
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
14 000 souris vont être utilisées sur cinq ans, soit 100 à 400 par molécule testée pour une cinquantaine de molécules, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 4 000 d'entre elles en sévère. Rendues allergiques par voie orale, par contact cutané ou par nébulisation, elles subissent un déclenchement de la réaction qui peut aller jusqu'au choc anaphylactique, avec hypothermie, démangeaisons, gonflements et difficultés respiratoires. 11 900 sont tuées et 2 100 partent vers un projet de formation interne aux gestes techniques, ce qui évite selon le porteur de commander des souris pour la formation. Il précise qu'aucune analyse statistique n'a servi à fixer ce total, l'estimation reposant sur les études des années précédentes et sur une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
Les allergies médiées par les immunoglobulines E (IgE), ou hypersensibilités, sont des réactions immunitaires exagérées à des antigènes environnementaux inoffensifs tels que des allergènes alimentaires, des pollens, des acariens ou encore des venins. Ces réactions peuvent aller de simples manifestations locales (urticaire, rhinite) à des manifestations systémiques graves telles que l’anaphylaxie. L’hypersensibilité de type I, aussi appelée réaction allergique immédiate, est une réponse immunitaire excessive qui se produit rapidement (quelques minutes) après l’exposition à un allergène chez une personne sensibilisée. Conséquences : inflammation, rougeur, démangeaisons, œdème, bronchoconstriction, etc. L’hypersensibilité de type IV, aussi appelée hypersensibilité retardée, est une réaction immunitaire cellulaire qui se manifeste 24 à 72 heures après l’exposition à un antigène. Conséquences : infiltration cellulaire, œdème, rougeur, induration. La compréhension des mécanismes de l’hypersensibilité de type I et IV et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques nécessite le développement de modèles précliniques fiables, reproductibles et transposables à l’homme. L'objectif principal de ce projet est de développer et caractériser différents modèles murins d’allergie médiée par les IgE et les lymphocytes T, en utilisant des souris conventionnelles non-humanisées ou humanisées (système immunitaire ou foie) ou doublement humanisées (système immunitaire + foie ). Les modèles développés serviront à mimer les différentes formes de réactions allergiques, systémiques ou localisées, afin de mieux comprendre les réponses immunitaires et d’évaluer à terme des outils préventifs, prophylactiques ou thérapeutiques. Des souris « non allergiques » (non sensibilisées) pourront être utilisés afin de déterminer la pharmacocinétique / pharmacodynamique des candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à proposer une plateforme complète de modélisation préclinique des allergies médiées par les IgE, adaptée à l'étude des mécanismes immunologiques et à l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques. On entend par « une plateforme complète » toute la chaîne de valeur préclinique, dans une logique de personnalisation, qualité et efficacité scientifique, ne se limitant pas à la simple exécution technique d’un modèle. Cela repose sur une approche progressive, car les expériences peuvent débuter si nécessaire par l’utilisation de modèles murins classiques pour les phases exploratoires, puis intégrant des modèles humanisés uniquement lorsque cela est nécessaire pour affiner la pertinence des résultats dans un contexte proche de l’humain.
Procédures
Identification par puce électronique :2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. Administration : la fréquence dépend du protocole d’étude sauf pour les injections d’anticorps qui sera de 2 fois maximum. Chaque injection durera entre 10 et 15 secondes. Administration orale de l’allergène : 8-10 fois maximum. Chaque administration orale durera 20 secondes. [MODIFICATION] Administration par nébulisation : la fréquence dépend du protocole d’étude, durée de 5 min maximum. Administration locale, par contact cutané, de l’allergène : 8-10 fois maximum. Chaque administration locale durera 20 secondes. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal. Le nombre d’administration dépendra du traitement et de la voie d’administration choisie. Le suivi de la réponse anaphylactique se fera par un scoring allergique dans le cas d’allergie systémique active ou passive. Dans le cas d’allergie passive cutanée le suivi de la réponse allergique se fera par mesure de l’épaississement des oreilles, sous anesthésie, ainsi que par l’évaluation de la perméabilité vasculaire. Durée de 10 à 15 secondes. Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire et figurera dans le protocolé d’étude.
Impact sur les animaux
-Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements : il n’y a pas de nuisances attendues, mais il existe un risque d’observer des effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées. - Prélèvements sanguins : il n’y a pas de nuisance attendue mais un risque d’anémie, d’hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne. -Prise de température corporelle à l’aide d’une sonde : irritation, inflammation, stress. Le challenge est également susceptible d’induire une réaction allergique ou un choc anaphylactique pouvant se manifester notamment par une hypothermie, la présence de démangeaisons, de gonflements, de problèmes respiratoires et un impact sur l’activité de la souris. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car ils auront reçu des candidats médicaments pour lesquels un impact négatif sur la santé des souris ne peut être exclu. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de ce projet pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer, in vitro, un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer les réactions physiologiques humaines responsables de la mise en place d’une allergie, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de traitements innovants pour les patients.
Réduction
Un total de [MODIFICATION] 14 000 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans, permettant de réaliser [MODIFICATION] 465 études précliniques. Le nombre de souris par étude sera de 5 à 10 individus par groupe (pour faire face à la variabilité du modèle), avec un minimum de 4 groupes (1 groupe placebo et 3 groupes traités). Ce nombre total d’animaux inclut les groupes contrôles, les tests pilotes de validation de modèle, les répétitions inter-expérimentateurs et les pertes éventuelles. Il est prévu de tester approximativement entre 50 et 60 molécules de nature différente sur la durée de validité de ce projet. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum. Cette estimation permet de garantir la robustesse statistique des résultats tout en respectant le principe de Réduction, grâce à une mutualisation des groupes contrôles et des revalidations de modèles précédents. Chaque molécule nécessite entre 100 à 400 animaux selon le protocole expérimental (modèle local ou systémique, voie d’administration, durée, nombre de groupes, etc.)
Raffinement
En début d’étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées en cage ventilée, préférentiellement par groupe social stable composé de 5 individus. Des compléments alimentaires (ex : Diet Gel) pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Entre autres, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple des morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, tunnel en carton, kraft et/ou boules de coton. A leur entrée dans l’animalerie, les souris recevront une période d’acclimatation de 4 jours minimum. Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique, du score d’allergie et de la perte de poids. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique et allergique ainsi que perte de poids dépassant les seuils définis.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. L’utilisation de modèles murins d’allergie au pollen a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Poursuivre sur cette espèce est donc indiqué. De plus, lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain, ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente, permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur system immunitaire. Pour les souris humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
Mise au point de formulations de type exosomes dans le traitement de pathologies neurologiques par voie intraveineuse, intranasale en comparaison avec la voie intracérébroventriculaire chez la Souris
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
755 souris sont tuées pour prélever leurs organes et mesurer où se distribuent les formulations testées, 100 autres pouvant être réutilisées dans d'autres études. 855 souris en tout vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent une chirurgie de trente minutes pour recevoir le produit directement dans le cerveau, d'autres une injection dans la veine de la queue après un passage en enceinte chauffée, d'autres un dépôt dans le nez, avec jusqu'à six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures. Le porteur prévoit de traiter les animaux un par un et de renoncer à traiter le reste du groupe si le premier montre des signes cliniques précoces, ces souris épargnées formant les 100 individus réutilisables.
Objectifs
De nombreuses pathologies affectant le système nerveux et pour lesquelles il n’existe pas de traitement efficace sont décrites (maladie d’Alzheimer ou de Parkinson pour les plus connues). Ces maladies neurologiques, souvent rares (affectant moins de 1 personne sur 2000), sont très invalidantes voire mortelles et considérées comme la première cause de handicap dans le monde. En 2021, près de 3 milliards d’individus étaient atteints d’une maladie neurologique. Les équipes de Recherche et Développement pharmaceutique travaillent pour mettre au point des candidats médicaments en vue d’améliorer le traitement de patients atteints par ces maladies neurologiques. L’une des difficultés dans le développement de ces candidats médicaments est le passage de la barrière hématoencéphalique BHE (barrière physiologique entre le sang et le cerveau) pour qu’ils atteignent les cellules du système nerveux. Pour passer cette barrière, de nombreux médicaments utilisés pour le traitement des maladies neurologiques sont administrés de façon hautement invasive par injection au niveau des vertèbres entre les méninges chez l’Homme (voie intrathécale IT). La souris, modèle de choix pour évaluer la sécurité et l’efficacité de candidats médicaments de maladies neurologiques, présente une forte homologie physiologique et comportementale avec l’Homme. Cependant la voie IT utilisée en clinique humaine n’est pas réalisable chez la souris du fait de sa petite taille, donc les candidats médicaments sont administrés directement dans le cerveau. De nouvelles formulations utilisant des exosomes (vésicules protéiques naturellement excrétées par les cellules constituant une voie de communication intercellulaire) sont actuellement en cours de développement pour améliorer le passage dans les structures cérébrales, l’activité et/ou la tolérabilité de ces candidats médicaments. De plus, ces formulations pourraient permettre d’envisager l’administration des candidats médicaments chez l’Homme par des voies moins contraignantes que la voie IT. L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérabilité et la biodistribution d’exosomes (passage de la BHE) administrés chez la souris via d’autres voies, moins contraignantes que directement dans le cerveau, (dans une veine ou par le nez), puis d’évaluer la tolérabilité et la biodistribution d’exosomes chargés avec une molécule de référence, après administration par ces 2 voies en comparaison avec la voie de référence(directement dans le cerveau) chez la souris.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, l’évaluation chez la souris de nouvelles formulations mettant en œuvre des exosomes doit permettre d’identifier des voies d’administration telles que la voie intranasale ou intraveineuse, autorisant le passage de la barrière hémato-encéphalique. En effet, actuellement, une grande majorité des médicaments pour le traitement de maladies neurologiques et notamment neurodégénératives sont administrés en clinique par voie intrathécale, permettant de s’affranchir du passage de la barrière hémato-encéphalique et ainsi permettre l’action du médicament sur le cerveau. Cependant, la voie intrathécale est contraignante pour le patient notamment dans le cadre d’administrations répétées. Les bénéfices escomptés de ce projet sont : - d’évaluer la biodistribution et la toxicité potentielle de formulations (exosomes), puis d’une molécule de référence contenue dans ces exosomes (court terme) -l’optimisation des formulations de candidats médicaments pour améliorer leur activité, leur distribution et diminuer leur toxicité. Le fait de charger ces candidats médicaments dans des exosomes peut aussi permettre de protéger la molécule de la dégradation (permettant de réduire le nombre d’administrations et donc la contrainte à la fois pour l’animal mais aussi pour l’Homme), - à long terme, validation et utilisation de voies d’administration autres que la voie intracérébroventriculaire (chez la souris) ou intrathécale utilisée en clinique pour l’administration de candidats médicaments seuls (moins de contraintes pour l’animal et pour l’Homme dans les études ultérieures), - à terme, un traitement plus efficace possiblement moins contraignant pour les patients atteints de maladies neurologiques.
Procédures
• Administration unique des composés dans le cerveau nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie et couverture analgésique (durée de la chirurgie 30 min environ) • A l’administration (unique) de composés (par injection dans une veine de la queue ou dépôt dans la narine) nécessitant une contention courte ou le passage préalable dans une enceinte thermorégulée • A l’administration (unique) de leurre (par injection dans une veine de la queue) nécessitant le passage préalable dans une enceinte thermorégulée • Administrations d’analgésique (moins de 10 sec, pendant 2 jours max) (maximum 2 x par jour en couverture et selon la voie d’administration du composé testé) • Prélèvements de sang de très faibles volumes sur animal vigile : la contention est d’une durée maximale de 2min et chaque prélèvement dure moins de 30s (maximum 6 points de prélèvement sur 24h) • Administration d’anesthésiques et analgésie en fin d’expérimentation avant euthanasie (moins de 10 sec) • Prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : • Anesthésie en fin d’expérimentation et potentiellement (selon la voie testée) avant administration des composés étudiés (degré de sévérité léger) • Pour certains groupes de souris : phase de chirurgie sous anesthésie générale nécessaire à l’administration unique du composé d’intérêt dans le cerveau ainsi que la période post-opératoire peuvent générer du stress et une douleur modérée • Administration (unique) de composés nécessitant une contention courte (15sec) (degré de sévérité léger) • Administration unique de composés par voie intraveineuse nécessitant le passage préalable dans une enceinte thermorégulée (durée maximale de 5min), contention dans une boite adaptée à l’espèce utilisée (2min maximum) (degré de sévérité modéré) • Administration de l’anesthésique en fin d’expérimentation préalable à l’euthanasie (degré de sévérité léger) • Prélèvements de très faibles volumes de sang : la contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (degré de sévérité modéré). - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : Le composé administré peut en lui-même induire des effets cliniques et peut provoquer une nuisance (degré de sévérité maximal : modéré, durée maximale des études : 3 semaines) pour l’animal (impacts sur l’activité, état général, variation du poids corporel par exemple).
Devenir
L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’une formulation ou d’une molécule dans ce projet seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour réaliser des prélèvements nécessaires aux analyses et à la détermination de leur distribution et/ou activité au sein de l’organisme. Dans le cas des injections intracérébro-ventriculaires (ICV), il est possible que des souris reçoivent uniquement l’analgésie avant l’injection ICV (si un premier animal traité présentait des signes cliniques précoces, les autres animaux du groupe ne seront pas traités et pourront être inclus dans d’autres études). Dans ce cas, elles pourront être réutilisées soit dans cette DAP soit dans une autre DAP après une période suffisante d’élimination du composé et avis vétérinaire
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer de nouvelles formulations innovantes pour l’administration de candidats médicaments utilisés dans le traitement de maladies neurologiques. Bien qu’ils soient de plus en plus perfectionnés, les modèles in vitro de passage de la barrière hémato-encéphalique restent néanmoins incomplets pour juger de la distribution, de l’activité et de la tolérabilité des candidats médicaments ainsi que de l’interaction avec les autres processus physiologiques retrouvés au niveau de la barrière hémato-encéphalique d’un organisme entier (système immunitaire, cellules sanguines par exemple). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et la souris est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet à ce stade de développement (constitution de la barrière hémato-encéphalique, processus physiologiques très semblables à l’Homme, panel comportemental faisant de la souris le modèle de choix dans l’évaluation de l’efficacité et de la sécurité de candidats médicaments à visée neurologique).
Réduction
La sélection des formulations contenant des exosomes associées ou non à des candidats médicaments est basée sur des études de screening in vitro et ou silico. Ces méthodes alternatives de screening vitro de passage de la barrière hémato-encéphalique sont utilisées préalablement pour caractériser et sélectionner les formulations à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement leur nombre. Ces études préliminaires de sécurité interviennent avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Des tests de chargement de la molécule de référence dans les exosomes associés à des quantifications seront aussi réalisées in vitro préalablement à la mise en place de ce projet. L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. En effet, le nombre d’animaux (3 individus/groupe selon la procédure) est considéré comme un compromis efficace pour interpréter avec fiabilité les résultats scientifiques associés aux objectifs de ce projet tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint possible. Ce nombre est issu de l’expérience dans le domaine, dans la plupart des projets évaluant une tolérabilité et/ou une distribution, c’est le nombre minimal permettant de donner des résultats interprétables Les études de ce projet permettent d’évaluer l’activité et la distribution de la molécule dans ces formulations et ainsi d’affiner le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le nombre total d’animaux pour les études ultérieures (autres DAP). Selon la procédure, plusieurs examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés sur un même animal (observations cliniques, pesées corporelles, prélèvement de sang pour cinétique ou dosages, etc…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire à chaque procédure de ce projet tout en respectant les conseils de la Structure de Bien-Etre Animal. Enfin, les prélèvements de petits volumes de sang, permettent de suivre la cinétique sur un même animal, réduisant également le nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision rapide est prise par les équipes scientifiques en charge des animaux (sur la base de critères d’arrêt/points limites) puis par le responsable d’étude et le vétérinaire au besoin. Selon la clinique observée, cette décision peut inclure une prescription de soins, ou en dernier recours une euthanasie de l’animal. Pour aider à la décision, une grille de points limites spécifique à l’espèce étudiée et à la voie d’administration est mise en place avant l’apparition des points limites. Dans cette grille, l’attention sera portée sur l’apparition de signes cliniques concernant à minima le déplacement, l’activité, la posture, la respiration ou l’apparition éventuelle de troubles neuromusculaires. En plus de ce suivi quotidien, les administrations seront réalisées de manière séquentielle quelle que soit la voie d’administration concernée : si un premier animal traité présentait des signes cliniques précoces (30 minutes après traitement par ex.), les autres animaux du groupe ne seront pas traités. L'administration des formulations/molécule directement dans le cerveau est réalisée sous anesthésie générale avec une couverture analgésique afin de limiter tout risque de douleur au réveil de l'animal. La phase de chirurgie est ainsi réalisée selon les bonnes pratiques avec des espaces dédiés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie, une anesthésie et une analgésie adaptées à la chirurgie, un maintien de la température corporelle de l’animal dès l’anesthésie et une asepsie maintenue pendant toute la chirurgie. De faibles quantités de sang peuvent être rapidement prélevées chez les souris de manière peu invasive et peu stressante, ce qui limite l'impact sur les animaux et respecte leur bien-être. Cette méthode évite d’utiliser les procédures classiques qui nécessitent de placer l'animal dans une enceinte thermorégulée pour dilater les vaisseaux. Dès qu’un acte expérimental est susceptible de causer une douleur), une analgésie adaptée est mise en place en plus de l’anesthésie générale afin de limiter tout risque de douleur. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant un hébergement individuel), avec de l’enrichissement adapté aux besoins de la souris (matériel de nidification, matériel à ronger, tunnel).
Choix des espèces
L’ensemble des procédures de ce projet est réalisé chez la souris car : - La souris présente une forte homologie physiologique, comportementale et génétique avec l’Homme et ainsi une forte valeur translationnelle permettant d’obtenir la meilleure prédiction possible chez l’Homme. S’ajoutent à cela les données historiques (internes, issues de la littérature, par souche, âge, sexe), nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que la disponibilité de nombreuses lignées transgéniques mimant des pathologies humaines chez la souris, permettant d’établir l’efficacité des candidats médicaments dans des études ultérieures. - La voie ICV réalisable chez la souris, pourra être utilisée comme un contrôle positif car elle permet de délivrer les formulations ou candidats médicaments directement dans le cerveau (en s’affranchissant du passage de la barrière hémato-encéphalique). De plus, cette voie d’administration nécessite une chirurgie moins invasive que la voie intrathécale utilisée chez d’autres espèces comme le rat - Les structures cérébrales, dont certaines sont la cible des formulations et des candidats médicaments, peuvent être aisément prélevées et étudiées. - De nombreuses études nécessaires au développement d’une molécule à visée neurologique utilisent ce modèle expérimental, les études sur les exosomes étant classiquement réalisées chez la souris. De jeunes adultes et adultes seront utilisés ce qui correspond à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de molécule à visée neurologique et dans les études d’efficacité ultérieures à ce projet. Ces études vont permettre de présélectionner précocement de nouvelles formulations ainsi que de nouvelles voies d’administrations pour la délivrance de molécules thérapeutiques avant la mise en place des études ultérieures chez le rat par voie intrathécale, même voie utilisée en clinique chez l’Homme.
Evaluation d’un transporteur de médicament pour lutter contre le cancer du foie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Des cellules de tumeur du foie sont implantées dans le ventre de souriceaux très jeunes et fortement immunodéprimés, pour reproduire l'hépatoblastome de l'enfant. 220 souris au total vont être utilisées, les petits greffés et leurs mères, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour vingt d'entre elles et sévère pour deux cents, toutes tuées pour prélever les foies et les tumeurs. La tumeur est mesurée deux fois par semaine par imagerie de bioluminescence. Le porteur écrit que la majorité des nuisances n'aura pas d'effet parce que les souris sont manipulées sous anesthésie, et résume l'objectif comme la démonstration que ce modèle animal sert à tester de futurs médicaments.
Objectifs
L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence utilise une chimiothérapie à l’aide d’un agent anticancéreux utilisé à l’hôpital mais qui est très toxique et ne permet pas de guérir tous les enfants. Ce cancer est caractérisé par des mutations bien connues mais les mécanismes biologiques responsables de son émergence après la naissance chez l’Homme restent très mal comprises. Notre modèle de cancer du foie chez la souris très jeune permet de mimer la maladie observée chez les enfants, d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de son apparition et de tester l’efficacité de candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Montrer que ces cellules d’hépatoblastomes répondent à une approche de thérapie génique et donc que ce modèle animal est utile pour tester de futurs médicaments. Disposer d’un modèle chez la souris très jeune qui permette d’étudier avec plus d’exactitude les mécanismes à l’origine de ce cancer pédiatrique.
Procédures
Implantation de cellules tumorales dans le foie après une incision de la peau au niveau ventral (1 seule incision et implantation, 10 minutes). Points de sutures au niveau ventral (3 points de sutures, 10 minutes). Administration unique de médicaments (20 secondes par injection). Mesure de la tumeur par imagerie à bioluminescence 2 fois par semaine (10 minutes par analyse). Pesée des souris deux fois par semaine (20 secondes par pesée).
Impact sur les animaux
Les nuisances sont la manipulation des cages et des souris, l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille, un stress lors de manipulations répétées, une légère douleur au point de piqure, une légère douleur liée aux particules virales injectées, une légère sensation de froid lors du nettoyage de la peau à l’alcool. Dans le cas où un point de suture se romprait, il sera recousu au plus vite. Comme les souris sont manipulées sous anesthésie, la majorité de ces nuisances n’aura pas d’effet sur les animaux.
Devenir
Les 220 animaux (souris greffées et leurs mères) seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des foies et des tumeurs et leur analyse par des approches moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude en boite de culture, car ces derniers ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, la communication et la diversité d’interactions entre les cellules normales et les cellules tumorales dans un animal entier.
Réduction
Nos effectifs sont déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour des raisons de réduction, nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie pour empêcher la douleur et le stress. Un analgésique sera utilisé 30 min avant toute opération. Les animaux sont hébergés en cages à raison de 3 mères et de 10 souriceaux par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. En cas de besoin et pour le bien-être des animaux, nous ajouterons de la nourriture humidifiée/ou du gel nutritif dans les cages ou feront des injections intrapéritonéales de sérum physiologique. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de paille végétale. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera traité par des analgésiques (buprénorphine à 30 µg/mL). S’il n’y a pas d’amélioration, il sera euthanasié sans attendre. Enfin, nous appliquerons les points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. Nous utiliserons des souris très jeunes pour mimer le plus justement possible le contexte de la maladie chez les enfants très jeunes.
Rôle des plaquettes dans la plasticité cérébrale et dans la récupération post-AVC chez la souris (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une artère cérébrale leur est bouchée définitivement sous anesthésie pour provoquer un accident vasculaire, puis un antiagrégant plaquettaire est ajouté à leur eau de boisson jusqu'à la mise à mort : 810 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Il s'agit de savoir si les plaquettes participent à la réparation du cerveau après un AVC, et si les médicaments qui bloquent leur activation gênent la récupération des patients qui en prennent. Le porteur revendique une mortalité "extrêmement faible" dans ce modèle et annonce des points limites stricts. Il mentionne des tests comportementaux générateurs de stress et d'anxiété, ainsi qu'une évaluation neurologique de cinq minutes, sans préciser lesquels ni ce qu'elle mesure.
Objectifs
En France, l’accident vasculaire cérébral (AVC) reste une cause majeure de handicap, de troubles cognitifs et de mortalité. Les seuls traitements disponibles sont soit l’administration d’un médicament ou d’un dipositif permettant de dissoudre le caillot de sang responsable de l’accident vasculaire cérébral. Seule une minorité de patients ont accès à ces traitements en raison de la fenêtre thérapeutique étroite, du nombre limité de centres spécialisés et des contre-indications. Aucun traitement ne prévient les troubles cognitifs post- accident vasculaire cérébral, qui touche 25% des patients. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements qui permettraient de traiter un plus grand nombre de patients d’une part et de prévenir les troubles de la mémoire qui se développent au décours de l’AVC d’autre part. Certains patients non traités peuvent s’améliorer spontanément suggérant ainsi l’existence d’une plasticité cérébrale c’est-à-dire d’une autoréparation. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques. Au-delà de leur rôle dans la formation du caillot sanguin, les plaquettes sont de plus en plus reconnues comme des modulateurs de processus physiopathologiques importants, tels l'inflammation et la régénération tissulaire. Cependant, leur contribution à la réparation dans l’accident vasculaire cérébral n’a été que très peu étudiée et uniquement à la phase précoce. Cette question est d’autant plus cruciale que de nombreux patients sont traités par des médicaments qui empêchent la formation de nouveaux caillots en empêchant l’activation des plaquettes pour prévenir la survenue d’un second accident vasculaire cérébral. Or, il semble qu’il y ait un plus grand nombre de troubles cognitifs chez les patients traités par antiagrégants plaquettaires. L’objectif de ce projet sera de déterminer la contribution des plaquettes et des médicaments qui empêchent leur activation dans la réparation neurovasculaire post – accident vasculaire cérébral à long terme. Le projet se deroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2)
Bénéfices attendus
L’hypothèse de ce projet est que les plaquettes contribuent à la réparation cérébrale après un accident vasculaire cérébral et qu'un traitement anti-coagulant, administré à la phase tardive pourrait avoir un impact négatif ou positif selon la cible pharmacologique sur cette récupération post-ischémie cérébrale. Au-delà des seuls domaines de la biologie plaquettaire et de la physiopathologie de l'accident vasculaire cérébral, cette approche originale fournira la base fondamentale pour les futures études précliniques sur la réparation post-ischémie cérébrale. De plus, les résultats pourraient avoir des implications cliniques importantes car la thérapie anti-plaquettaire est utilisée pour la prévention secondaire de l'accident vasculaire cérébral, avec pour seul objectif d’empêcher la formation d’un nouveau caillot mais sans aucune connaissance sur la réparation à plus long terme.
Procédures
Dans cette étude, un modèle murin d’accident vasculaire cérébral induit par une occlusion permanente procédure réalisée systématiquement sous anesthésie et analgésie sera utilisé. L’intervention chirurgicale dure environ 10 minutes. Chaque animal recevra deux injections (analgésie) ainsi que deux prélèvements sanguins (réalisé à J3 et le jour de la mise à mort). L’injection dure en moyenne 10 secondes, tandis que le prélèvement sanguin ne dépasse pas 2 minutes. Toutes les souris feront l’objet d’une évaluation neurologique qui dure environ 5 minutes. Ce modèle sera combiné à une administration dans l’eau de boisson d’un des traitements anti-plaquettaire dès l’induction de l’accident vasculaire cérébral jusqu’au jour de la mise à mort. L'intervention chirurgicale, l'évaluation neurologique, l'administration des traitements ainsi que les prélèvement sanguins seront réalisés dans l'EU1. L'enregistrement électrophysiologique sera réalisé dans l'EU2.
Impact sur les animaux
- Les injections d'anesthésiques et d'analgésiques causent un stress et une douleur modérée de courte durée les prélèvements sanguins causent un stress et une douleur modérée de courte durée. - L’induction de l'ischémie cérébrale provoque aussi une douleur modérée chez l’animal de courte durée lors de l’incision de la peau. - La prise des traitements anti-agrégants peut induire un risque de saignement. - Les tests comportementaux induisent un stress et de l’anxiété modéré et de courte durée.
Devenir
Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques.
Remplacement
Le modèle in vitro ne permet de rendre compte de la complexité des évènements qui se mettent en place à long terme dans le cerveau (plasticité cérébrale) après l’ischémie cérébrale. L’utilisation de souris déficientes en plaquettes ou de ses différents récepteurs permettra d’étudier leurs rôles respectifs dans le remodelage neurovasculaire post-ischémie cérébrale à long terme. Les modèles murins d'accident vasculaire cérébral permettent de reproduire la physiopathologie de l'accident vasculaire ischémique chez l'homme.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude statistique a été réalisée au préalable à l’aide d’un logiciel spécialisé. Cette analyse permet de déterminer précisément le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Les groupes ont été conçus de manière optimisée, basée sur des études antérieures, garantissant ainsi l’utilisation du strict nécessaire d’animaux. De plus, le modèle d’accident vasculaire cérébral utilisé est bien maîtrisé par l’équipe, avec une mortalité extrêment faible ce qui permet de mener les recherches de façon rigoureuse et éthique. Pour analyser les résultats, des méthodes statistiques adaptées seront appliquées, garantissant une interprétation fiable des données tout en respectant l’engagement à réduire l’usage des animaux.
Raffinement
Le bien-être des animaux est une priorité dans l’étude. Leur suivi sera assuré par une équipe qualifiée : un soigneur spécialisé s’occupera d’eux chaque jour, et un chercheur expérimenté effectuera un contrôle approfondi deux fois par semaine. Les souris seront hébergées par groupes de cinq dans des cages ventilées, équipées de materiel pour leur permettre de construire des nids et d’améliorer leur confort. Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé attentivement grâce à une grille de scores définie, prenant en compte des points limites stricts et adaptés au projet. Cette méthode permettra de détecter rapidement toute souffrance et d’y remédier. En cas de douleur, un traitement adapté sera administré, et si nécessaire, une mise à mort sera réalisée selon les réglementations en vigueur afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature et notre laboratoire. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 12 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés et dans une perspective translationnelle, l’accident vasculaire cérébral survient à l’âge adulte.
Impact des PFAS et emulsifiants alimentaires sur la santé de l’axe microbiote-intestin-cerveau en condition de barrière intestinale intègre ou fragilisée par un stress chronique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va du léger au sévère, 540 d'entre elles en sévère. Elles reçoivent des polluants par la bouche dix fois en quatre-vingt-dix jours, passent une heure par jour perchées sur une plateforme au milieu d'un bac d'eau pendant onze jours, puis subissent l'implantation d'un dispositif sous la peau et le gonflement progressif d'un ballonnet dans le rectum, en cinq étapes douloureuses de dix secondes. Arrivées à l'animalerie à quatre semaines, elles servent à étudier l'effet d'une exposition précoce aux PFAS et aux émulsifiants alimentaires sur l'intestin et le cerveau. Le porteur écrit que les effets attendus "demeurent globalement transitoires".
Objectifs
Notre mode de vie moderne nous expose chaque jour à différentes substances chimiques présentes dans l’environnement et dans notre alimentation. Certaines d’entre elles, utilisées pour rendre les objets du quotidien antiadhésifs ou imperméables (comme certains ustensiles de cuisine, emballages ou textiles), attirent aujourd’hui l’attention car elles persistent longtemps dans l’environnement et peuvent s’accumuler dans l’organisme. Leurs effets sur la santé ne sont pas encore totalement connus, mais des données suggèrent qu’elles pourraient influencer le métabolisme, la fertilité, le système immunitaire ou certains processus biologiques à long terme, surtout en cas d’exposition prolongée ou à faibles doses. D’autres additifs alimentaires, utilisés pour améliorer la texture et la conservation des produits transformés, sont considérés comme sûrs dans les conditions actuelles. Cependant, des recherches récentes montrent qu’ils pourraient modifier l’équilibre du microbiote intestinal (les bactéries qui vivent dans nos intestins) et provoquer de légères réactions inflammatoires. Le système digestif joue un rôle clé car il est en contact direct avec ces substances. Un déséquilibre de cet équilibre fragile pourrait contribuer à l’apparition de troubles fonctionnels intestinaux, comme le syndrome de l’intestin irritable, caractérisé par une hypersensibilité abdominale. Ce projet a trois objectifs principaux : Étudier les effets d’une exposition prolongée à certaines substances polluantes environnementales et alimentaires, seules ou combinées, sur la barrière intestinale, le microbiote, les défenses immunitaires et la sensibilité digestive. Évaluer l’impact d’un stress chronique associé à ces expositions, afin de mieux comprendre leurs interactions sur la santé intestinale. Approfondir la compréhension de l’« exposome intestinal », c’est-à-dire l’ensemble des facteurs environnementaux qui peuvent influencer la santé digestive tout au long de la vie. En combinant ces approches, le projet vise à mieux comprendre comment certaines expositions environnementales peuvent contribuer à des déséquilibres digestifs persistants.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines substances présentes dans notre environnement et notre alimentation (comme certains polluants ou additifs alimentaires appelés émulsifiants) peuvent influencer la santé intestinale et la façon dont notre corps perçoit les signaux digestifs. À court terme, il apportera de nouvelles connaissances scientifiques en étudiant, pour la première fois, l’effet combiné de ces expositions sur le microbiote intestinal (les bactéries qui vivent dans nos intestins), sur la barrière intestinale (qui protège l’organisme) et sur la communication entre l’intestin et le cerveau. Ces résultats pourraient permettre d’identifier des signes précoces de déséquilibre intestinal, utiles pour la prévention et le diagnostic. À plus long terme, les données obtenues pourraient contribuer à améliorer les recommandations de santé publique concernant certains additifs ou polluants persistants, et encourager le développement d’alternatives plus respectueuses de la santé et de l’environnement. Enfin, en approfondissant la compréhension des liens entre environnement, microbiote et confort digestif, ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies destinées à améliorer la qualité de vie des personnes souffrant de troubles intestinaux fonctionnels.
Procédures
Types d’interventions prévues : - Administration orale : les animaux recevront une administration orale répétée 10 fois sur une période de 90 jours. Chaque manipulation, d’une durée d’environ 10 secondes, est réalisée par du personnel expérimenté et formé afin de limiter le stress. - Exposition à un stress chronique : Certains animaux seront placés sur une petite plateforme au centre d’un bac rempli d’eau, pendant 1 heure par jour, et ce durant les 11 derniers jours d'exposition (5 jours de stress, 2 jours de repos, 4 jours de stress). - Prélèvements sanguins : Du sang sera prélevé au niveau de la queue des animaux éveillés, à trois moments de l’étude (avant, au milieu et à la fin). Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes et respecte les volumes autorisés par la réglementation. - Mesure de la sensibilité intestinale : sous anesthésie générale, un petit dispositif sera implanté sous la peau pour mesurer la réaction de l’intestin. L’intervention, d’une durée maximale de 30 minutes, sera suivie d’une période d’hébergement individuel d’une durée de 4 jours, afin de permettre une récupération optimale et d’assurer une surveillance individualisée. La mesure de la réaction intestinale consiste à introduire un petit ballonnet dans le rectum, qui est gonflé progressivement en cinq étapes. Chaque étape dure 10 secondes, avec des pauses de 5 à 10 minutes entre elles. Cette procédure est réalisée une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
Les effets attendus au cours de ce protocole peuvent varier selon la nature des interventions, mais demeurent globalement transitoires. 1. Administration orale (polluants et traceur fluorescent) : Cet acte peut provoquer un léger stress ou une agitation passagère liée à la manipulation. Dans de rares cas, une irritation mineure de la gorge ou de l’œsophage peut apparaitre. La répétition de l’administration (tous les 10 jours sur une période de 90 jours) peut entraîner un stress limité, surveillé grâce à un suivi comportemental adapté. 2. Administration d’émulsifiants dans l’eau de boisson : Aucun inconfort particulier n’est attendu. De petites variations dans le comportement alimentaire ou le transit digestif peuvent apparaitre, selon la tolérance individuelle des animaux. 3. Exposition à un stress psychologique chronique : Cette étape peut entraîner une contrainte psychologique temporaire, se traduisant par une diminution de la mobilité, une vigilance accrue ou des signes de stress passagers. 4. Évaluation de la sensibilité intestinale : La courte intervention chirurgicale sous anesthésie générale peut s’accompagner d’une baisse transitoire de l’activité ou de l’appétit, ainsi que de signes d’inconfort abdominal modéré. Par la suite, la mesure de la sensibilité intestinale peut s’accompagner d’une douleur modérée pendant 10 secondes à chaque étape, suivie d’inconfort et d’un stress temporaire. 5. Hébergement individuel : Cette situation peut représenter une source de stress social, se manifestant par une anxiété passagère, une baisse d’activité ou des comportements répétitifs.
Devenir
Tous les animaux en fin de procédure, seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements de tissus post-mortem pour différentes analyses et dosages.
Remplacement
Des modèles cellulaires seront utilisés pour étudier les effets potentiels des polluants et des additifs alimentaires sur l’épithélium intestinal. Cependant, à ce stade du projet, les approches in vitro ou ex vivo ne permettent pas de reproduire la complexité de la physiologie digestive et des interactions entre microbiote, système immunitaire et système nerveux entérique. L’utilisation d’un modèle in vivo reste donc nécessaire pour comprendre de manière intégrée les conséquences d’une exposition prolongée à ces composés sur la santé intestinale, notamment sur les mécanismes de régulation de l’inflammation et de la sensibilité intestinale.
Réduction
Les études préliminaires menées dans le cadre de ce projet ont permis d’optimiser la procédure d’évaluation de la sensibilité intestinale, tant sur le plan technique que sur celui du bien-être animal. L’expérience acquise par l’équipe (rapidité d’exécution, maîtrise des gestes, conditions post-opératoires adaptées, maintien temporaire d’une température ambiante de 26 °C) a permis de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables, sur la base d’un calcul de puissance statistique. Ainsi, le nombre de souris par groupe est passé à 12 ou 15 suivant les protocoles, tout en maintenant la robustesse des analyses. Les résultats seront confirmés par deux expérimentations indépendantes afin d’assurer leur reproductibilité. Des analyses statistiques multivariées et corrélatives permettront d’exploiter pleinement les données générées, garantissant une utilisation optimale des animaux inclus. La taille des groupes expérimentaux est strictement limitée au minimum nécessaire pour atteindre la puissance scientifique attendue, conformément au principe des 3R.
Raffinement
Le bien-être des animaux est une priorité tout au long de l’étude. Les souris sont hébergées dans des conditions conformes aux recommandations européennes, avec un environnement enrichi qui favorise leurs comportements naturels. Les manipulations, comme les pesées hebdomadaires, sont réalisées de manière douce et progressive afin de réduire le stress et faciliter l’habituation. Lors des périodes où les animaux doivent être hébergés individuellement, les cages transparentes permettent de conserver des interactions visuelles, olfactives et auditives avec leurs congénères. Des matériaux de nidification (fibres de coton) et des objets d’enrichissement (bûchettes de bois) sont fournis pour stimuler leurs activités naturelles de construction et de rongement. Une observation quotidienne, notamment lors de la distribution des régimes alimentaires, permet de détecter rapidement tout changement de comportement ou d’état général. Des critères précis (points limites) garantissent une intervention rapide en cas de signe de souffrance ou de détérioration du bien-être. Les procédures peuvent être interrompues ou adaptées sur avis vétérinaire. Lors des interventions, toutes les précautions sont prises pour éviter la douleur et assurer une récupération optimale : anesthésie adaptée, maintien de la température corporelle, environnement chauffé après l’opération et réhydratation si nécessaire. L’ensemble du protocole a été conçu pour garantir un haut niveau de bien-être animal tout en préservant la qualité scientifique des résultats. Le projet respecte la réglementation en vigueur (Directive 2010/63/UE et Code rural) ainsi que les principes éthiques de l’expérimentation animale. Chaque étape applique les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement), avec pour priorités la limitation du nombre d’animaux, la minimisation des contraintes et le maintien du confort. Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, sous la supervision d’un vétérinaire, afin d’assurer à la fois la prise en charge optimale des animaux et la fiabilité scientifique des résultats.
Choix des espèces
Le modèle murin (Mus musculus) est un modèle de référence pour l’étude de la physiologie digestive et de la sensibilité intestinale. Il est largement utilisé en recherche biomédicale en raison de sa similarité avec l’humain sur les plans immunologique, métabolique et neurophysiologique, ainsi que de la disponibilité de nombreux outils génétiques et analytiques permettant d’explorer finement les mécanismes d’action des expositions environnementales. Ce modèle a été retenu car il est bien caractérisé, stable sur le plan génétique et couramment utilisé dans les études portant sur le microbiote, la réponse immunitaire et les effets du stress. Le modèle de stress (évitement passif de l’eau) a été spécifiquement validé avec cette lignée. Plusieurs travaux récents ont montré que ce modèle reproduit de manière fiable certaines modifications physiologiques observées lors de situations de stress prolongé, notamment une altération modérée de la motricité intestinale, une adaptation de la production de mucine et une modulation des réponses neuroendocrines et immunitaires. Ces caractéristiques font de ce modèle un outil pertinent pour explorer les interactions entre stress, microbiote, inflammation et fonction barrière intestinale. Les souris seront âgées de 4 semaines à leur arrivée à l’animalerie, suivies d’une période d’acclimatation d’une semaine avant le début des expositions. Le choix de jeunes souris permet d’étudier l’impact d’une exposition précoce à un mélange des polluants environnementaux et des additifs alimentaires, seuls ou combinés, et d’en suivre les effets à long terme sur la santé digestive et la communication intestin-cerveau. À la fin du protocole, les animaux auront environ 16 semaines, ce qui correspond à un stade jeune adulte, couramment utilisé pour les études de physiologie intégrée. Le choix de la souris, plutôt que d’une autre espèce, s’explique également par la disponibilité d’un large corpus de données de référence dans des conditions expérimentales similaires. Cela favorise la comparabilité des résultats, limite le nombre d’animaux nécessaires et évite la duplication d’expériences, conformément au principe de Réduction des 3R.
Evaluation de l’inhibition pharmacologique d’un canal calcique pour traiter l’insuffisance cardiaque gauche, induite par différentes causes
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Opérées du cœur sous anesthésie pour provoquer un infarctus, équipées d'un capteur de télémétrie et parfois d'un diffuseur de médicament sous la peau, gavées chaque jour pendant une à deux semaines, 460 souris passent ensuite trois à quatre échocardiographies sous anesthésie. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré à sévère, la moitié des animaux en sévère, et une partie d'entre eux porte une mutation qui les rend obèses et diabétiques. Le porteur indique que la chirurgie de l'infarctus cause une douleur importante pendant plusieurs jours, puis que l'insuffisance cardiaque provoque une accumulation de liquide dans les poumons, des difficultés respiratoires et une perte de poids. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leur cœur.
Objectifs
Dans ce projet nous voulons évaluer l’effet du blocage d’un canal au calcium particulier, au cours de l’insuffisance cardiaque gauche ; pour cela nous utiliserons deux modèles chez la souris car l’insuffisance cardiaque a plusieurs causes : un modèle de crise cardiaque (infarctus du myocarde) et un modèle mimant le diabète et l’hypertension. L’infarctus du myocarde (IM) est un problème de santé publique majeur : le nombre de cas est estimé à 120 000 par an en France. Environ une personne sur dix décède dans l’heure qui suit l’IM et une personne sur 7 de plus dans l’année suivante. C'est une maladie qui évolue et cause des anomalies dans le rythme des battements cardiaques et/ou une insuffisance cardiaque (IC) chronique ; cela est responsable à terme du décès des patients. L’IC correspond à l’incapacité du cœur à pomper suffisamment de sang pour répondre aux besoins de l’organisme. Cela entraine des conséquences dramatiques non seulement pour le cœur mais également pour les autres organes notamment les poumons, les reins, le foie et les muscles. Dans les cellules cardiaques, le calcium est un élément essentiel à la régulation du rythme et de la fonction cardiaque. La régulation des canaux au calcium est donc une piste pour de nouveaux traitements. Il a déjà été montré que le blocage de notre cible donnait une protection contre le développement de l’IC dans un autre modèle. Mais l’IC peut avoir de nombreuses causes, il faut donc confirmer cet effet protecteur dans des modèles différents.
Bénéfices attendus
Alors que la qualité de vie des patients atteints d'IC s'est considérablement améliorée au cours des 25 dernières années, la mortalité reste élevée. Près de la moitié des patients décèdent dans les cinq ans qui suivent le diagnostic. Les traitements actuels pour l'IC sont essentiellement des anti-hypertenseurs qui agissent sur le système neurohormonal et/ou des diurétiques qui diminuent la congestion pulmonaire : ils ne traitent pas la cause, c’est-à-dire la diminution de la fonction du cœur. En conséquence, de nouveaux traitements sont nécessaires et donc de nouvelles avancées dans le traitement de l'IC doivent être réalisées. Notre canal d’intérêt apparaît comme une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour cette maladie encore incurable. Par une approche à différents niveaux, molécule-cellule-organe-animal, ce projet contribuera à la compréhension de la fonction de ce canal dans les maladies cardiaques. Ce projet a un fort potentiel pour traduire la recherche en une meilleure prise en charge des patients en identifiant une cible thérapeutique innovante. Des inhibiteurs de notre canal cible, qui sont déjà utilisés chez les patients pour les maladies inflammatoires, pourraient ainsi rapidement servir à traiter l’IC.
Procédures
Certains animaux subiront une chirurgie au niveau du cœur, sous anesthésie générale et analgésie, pour mimer un infarctus du myocarde ; cette opération dure environ 15 minutes. Tous les animaux auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie pour implanter un capteur de télémétrie : cette opération dure environ 20 minutes ; certains seront implantés en même temps avec un mini-dispositif qui diffuse un produit pharmaceutique ; cela n’allonge quasiment pas la durée de l’opération. Tous les animaux recevront le traitement bloqueur du canal cible ou le placebo par gavage par la bouche, pendant 7 à 14 jours, une fois par jour. Cet acte nécessite une contention et prend environ 30 secondes pour chaque animal. Tous les animaux seront suivis par échocardiographie sous anesthésie ; cette procédure est non invasive, dure environ 15 minutes, 3 à 4 échographies par animal. Ils seront également suivis par électrocardiogramme grâce aux capteurs de télémétrie, de façon non invasive également ; enregistrement pendant 24h de l’animal dans sa cage, 2 fois par animal.
Impact sur les animaux
La chirurgie pour l’infarctus du myocarde cause une douleur importante immédiatement après l’opération et pendant plusieurs jours. Ensuite, le développement de l’IC implique des symptômes de la maladie : une accumulation de liquide dans les poumons qui causent faiblesse, difficultés respiratoires et perte de poids. Ces symptômes apparaissent progressivement et à des degrés de gravité variables selon les animaux. L’administration par voie orale du traitement implique un stress passager car il faut maintenir les animaux fermement pendant quelques secondes chaque jour. La chirurgie pour l’implantation des capteurs et des dispositifs de diffusion induit une douleur légère à modérée pendant 12 à 24h après la chirurgie. Un inconfort peut exister à cause de la présence sous la peau de ces deux implants, qui restent implantés 4 semaines. Du fait d’une mutation, une partie des animaux utilisés développe une obésité et un diabète (taux anormaux de glucose et d’insuline dans le sang).
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue des procédures afin de prélever le cœur ainsi que d’autres organes, pour compléter les données physiologiques par des études de biologie moléculaire.
Remplacement
Notre bloqueur du canal cible a été testé et a prouvé son efficacité dans un autre modèle d’IC gauche. Néanmoins, l’insuffisance cardiaque chez l’humain est dépendante de nombreux facteurs et peut être la conséquence de nombreuses maladies ; il est donc important de tester ce nouveau traitement dans différentes conditions et c’est pourquoi nous voulons le faire dans deux modèles dans cette étude. Au vu du niveau de complexité et de la spécialisation des cellules cardiaques, aucun système d’étude in vitro ne permet actuellement d’analyser la fonction et le dysfonctionnement cardiaque. Ainsi le recours à des modèles animaux reste impératif. Le cœur est un organe complexe, composé anatomiquement de plusieurs compartiments et physiologiquement de plusieurs tissus spécialisés. De plus, notre étude porte sur l’effet d’un traitement sur le cœur en conditions pathologiques, il est donc indispensable d’étudier le cœur intégré à l’organisme ; les modélisations par ordinateur ne sont pas suffisantes pour mimer une telle complexité. Il est donc nécessaire pour l’évaluation de la fonction cardiaque d’utiliser un mammifère entier adulte afin de s’approcher le plus possible des mécanismes physiopathologiques humains. La souris est un bon modèle car les gènes étudiés sont conservés.
Réduction
Une planification à l’aide de logiciels de statistiques nous a permis de déterminer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables, pour chaque objectif du projet. De plus, au sein d'une procédure expérimentale, les lots de souris sont soumis à diverses techniques d’études afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et maximiser le recueil de données sur les mêmes animaux. En fin d’expérimentation, les animaux seront euthanasiés et des expériences de biologie moléculaire et des études sur tissus ou cellules isolés seront effectuées afin d’optimiser les ressources à notre disposition et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux élevés au sein de l’animalerie seront pris en charge et observés de leur naissance à leur euthanasie. Les cages des animaux seront enrichies et les animaux seront suivis par un personnel spécifiquement formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles, dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Les interventions chirurgicales se font sous anesthésie générale et les animaux reçoivent une analgésie pré- et post-opératoire. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne et de pesées régulières en fonction des procédures. Une grille de score a été définie, évaluant les paramètres suivants : apparence physique, poids et état du cœur (par échocardiographie). Des points limites, en fonction du score obtenu selon cette grille, ont été décidés, menant à l’administration d’analgésie supplémentaire ou à l’euthanasie.
Choix des espèces
La souris constitue un bon modèle cardiovasculaire car c’est un rongeur possédant un cœur à 4 cavités et une physiologie semblable à l’être humain. De ce fait, cette espèce est la plus couramment utilisée comme modèle d'étude de la fonction cardiovasculaire. De plus, il a été démontré que nos protéines d’intérêt retrouvées chez l’être humain ont des fonctions similaires chez la souris. Ainsi, ces animaux représentent un bon modèle sur le plan physiologique et génétique. Des souris adultes âgées d’environ 2 mois seront utilisées car c’est à cet âge que l’IC se développe le plus rapidement. Les souris mutantes sélectionnées développent un diabète et une obésité, qui constituent des facteurs de risque importants de l’insuffisance cardiaque ; de ce fait, c’est un bon modèle pour mimer l’insuffisance cardiaque multifactorielle chez la souris.
Développement d’hépatocytes humains fonctionnels via leur amplification initiale in vivo
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris dont l'état ne peut plus être rétabli pourront être tuées avant terme, sur la base d'une grille de mesure de l'inconfort. 430 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées au plus tard huit mois après la greffe. Une partie de leurs propres cellules de foie est détruite par injection, une fois ou une fois par semaine pendant neuf semaines, puis des hépatocytes humains leur sont greffés sous la membrane du rein ou dans la rate, avant des prélèvements sanguins répétés pendant huit mois. Le porteur écrit qu'aucune nuisance n'est décrite pour cette destruction partielle du foie, et présente le projet comme un moyen de diminuer à terme le nombre d'animaux utilisés dans les tests de toxicité.
Objectifs
Les atteintes du foie ou atteintes hépatiques sont une des raisons principales du retrait de médicaments du marché et de l’échec de nouvelles molécules en développement au cours des essais cliniques. Les études pré-cliniques de toxicité hépatique et de pharmacocinétique sont des éléments essentiels pour réduire ces retraits et échecs et les conséquences médicales graves parfois observées chez les patients ainsi que pour accélérer le développement de nouveaux médicaments. Le foie est principalement constitué de cellules appelées hépatocytes dont l’une des fonctions est la biotransformation et la détoxification des médicaments et toxines. Ainsi, la culture de cellules de foie humain constitue le modèle de référence pour prédire le métabolisme et la toxicité hépatique des médicaments en développement. Cependant, leur accès est limité et ils présentent l’inconvénient majeur d’une grande variabilité entre donneurs. Ainsi, les laboratoires se tournent vers des modèles animaux ou de lignées cellulaires modifiées éloignés de la physiologie humaine. L’objectif général du projet est de développer des lignées d’hépatocytes humains hautement fonctionnels à la manière de ce que nous avons précédemment réalisé avec des cellules du pancréas actuellement considérées comme un modèle in vitro de référence des cellules sécrétrices d'insuline humaines. Afin de parvenir à cet objectif, le projet nécessite tout d’abord de mettre au point un protocole de greffe d’hépatocytes humains dans la souris. En effet l’amplification et la sélection initiale des cellules dans l’animal a été un élément décisif de la génération des lignées de cellules béta humaines fonctionnelles. Puis dans un second temps le projet consistera à générer plusieurs lignées d’hépatocytes à partir de tissus issus de patients qui seront ensuite caractérisées in vitro afin de sélectionner les lignées d’hépatocytes fonctionnels adaptées aux études pré-cliniques.
Bénéfices attendus
Le développement d’hépatocytes, les cellules actives du foie, humains et fonctionnels, aurait des conséquences directes positives sur la santé humaine tout en diminuant l’utilisation de modèles animaux. Des hépatocytes humains, représentatifs des différences de métabolisme et de toxicité des médicaments entre individus, permettraient la caractérisation fiable et précoce des nouveaux médicaments en développement, réduisant les échecs et accélérant le développement de nouvelles thérapies. De plus cette caractérisation du métabolisme et de la toxicité des molécules en développement faite sur des cellules humaines, permettrait de rendre les médicaments plus sûrs en amont des essais cliniques, augmenterait la sécurité des médicaments mis sur le marché et diminuerait les risques de toxicité chez les patients. Enfin, l’accès à de tels hépatocytes humains prédictifs diminuerait l’utilisation d’animaux dans les études de métabolisme et de toxicité. En effet, alors même que les modèles animaux utilisés en recherche pharmaceutique sont seulement partiellement prédictifs, ils sont utilisés du fait de l’absence d’une alternative. La validation de la capacité de prédiction de la toxicité et du métabolisme des cellules que nous allons générer, qui est prévue comme un objectif principal du projet, aurait pour conséquence immédiate une diminution de l’utilisation d’animaux. Finalement, ces cellules humaines fonctionnelles accélèreraient la recherche sur la physiologie des cellules du foie et sur les mécanismes des maladies du foie. Elles faciliteraient ainsi grâce à leur reproductibilité et au fait que ce soit un modèle humain, l’identification de cibles thérapeutiques.
Procédures
Un groupe de 60 animaux maximum subira une élimination partielle de leurs hépatocytes nécessitant 1 injection (30 animaux) ou 1 injection par semaine pendant 9 semaines (30 animaux), réalisées à l’état vigile. Puis ces animaux subiront des prélèvements sanguins au rythme de 1 prélèvement par semaine pendant 2 semaines puis 2 prélèvements par mois pendant un maximum de 3 mois. Ces prélèvements seront réalisés à l'état vigile. La durée individuelle de ces actes d’injection et de prélèvement est de 30 secondes. Un second groupe de 370 animaux maximum subira l'élimination partielle de leurs hépatocytes nécessitant, selon les résultats des groupes pilotes, 1 injection ou 1 injection par semaine pendant 9 semaines, réalisées à l’état vigile. Les animaux subiront ensuite la greffe d’hépatocytes humains. Cette procédure de chirurgie sera effectuée sous anesthésie et dure environ 15 minutes. Puis les animaux subiront 3 injections d’analgésique post-chirurgie (30 secondes par acte). Ces injections seront réalisées à l'état vigile. Enfin, les animaux subiront des prélèvements sanguins. Le nombre de prélèvements sera de 1 prélèvement par semaine pendant 4 semaines puis 2 prélèvements par mois pendant un maximum de 8 mois. Ces prélèvements seront réalisés à l'état vigile. La durée individuelle de ces actes d’injection et de prélèvement est de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, les souris seront soumises à une élimination partielle de leurs hépatocytes, induite chimiquement, puis à une chirurgie pour greffe d’hépatocytes humains sous la membrane qui entoure un de leur rein ou par injection dans la rate et enfin à des prélèvements sanguins et échographies afin de mesurer la multiplication des hépatocytes humains. Plusieurs nuisances liées à la procédure de greffe des hépatocytes pourraient être subies par les animaux. Il s’agit de douleur et de stress liés à la chirurgie et de gêne et/ou douleur occasionnée par la plaie. Il pourrait s’agir également d’une hypothermie liée à l’anesthésie ou d’une infection suite à la chirurgie. Par ailleurs les animaux pourraient subir une gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des injections. Enfin les animaux pourraient subir une gêne et du stress lors des prélèvements de sang pour le suivi des cellules implantées. Enfin, il n’y a pas de nuisances décrites induites par l'élimination partielle des hépatocytes. Il n’y a pas non plus de nuisances attendues en conséquence de la multiplication des hépatocytes humains greffés étant donné que la taille du greffon restera très modeste d’après notre expérience sur les précédents types cellulaires générés.
Devenir
Les animaux utilisés pour les études pilotes de déplétion des hépatocytes endogènes seront euthanasiés au maximum 3 mois après la procédure afin de confirmer la déplétion des hépatocytes. Ils ne pourront pas être ré-utilisés pour les expériences de greffe d’hépatocytes humains car ces greffes doivent être effectuées quelques jours après l’induction de la déplétion. Les animaux utilisés pour la greffe d’hépatocytes humains seront euthanasiés au plus tard 8 mois après la greffe, ce qui est le temps nécessaire pour permettre la croissance d’une lignée d’hépatocytes.
Remplacement
Les travaux prévus dans ce projet ne peuvent pas être transposées dans des modèles in vitro par exemple en culture cellulaire. En effet, notre expérience de génération de précédentes cellules humaines fonctionnelles montre qu’une étape essentielle est la greffe des cellules humaines dans l’animal pour une multiplication sélective de cellules qui conservent leur fonction. Ainsi, lors du développement du modèle de cellules sécrétrices d'insuline, aucune stratégie in vitro n’a permis la sélection de cellules qui maintenaient leur fonction. De plus plusieurs travaux décrivant l’immortalisation in vitro de cellules du foie humain ont été publiés par d’autres équipes, mais aucune de ces lignées de cellules n’a abouti à des cellules avec des caractéristiques fonctionnelles proches des cellules du foie, principalement en ce qui concerne leur capacité à détoxifier les toxines, ce qui empêche leur utilisation dans les études de toxicologie et de pharmacologie. Pour ces raisons, la greffe initiale des hépatocytes humains à des souris apparait indispensable pour pouvoir assurer l’obtention de cellules similaires aux cellules présentes dans le foie.
Réduction
Le principe de réduction du nombre d’animaux est appliqué dans ce projet en premier lieu via l’estimation précise du nombre d’animaux permettant de garantir l’interprétabilité des résultats. Le nombre d'animaux nécessaires a été déterminé par une approche statistique. Une analyse précise des protocoles publiés a également été réalisée afin de sélectionner les conditions expérimentales favorables et ainsi réduire le nombre de conditions expérimentales à comparer ainsi que le risque d’échecs et par conséquence le nombre d’animaux qui seront utilisés. Par ailleurs, le projet est construit en incluant des étapes pilotes afin d’éliminer toute utilisation inutile d’animaux. Nous procéderons ainsi lors de l’étape 1 à la comparaison de 2 modèles d'élimination partielle des hépatocytes du foie de l'animal. Seul le modèle permettant l'élimination partielle la plus reproductible sera conservé pour les étapes suivantes. Lors de la seconde étape, deux protocoles de greffe des hépatocytes seront comparés. Seul le modèle permettant la greffe reproductible sera conservé pour la troisième étape de génération des cellules à partir de foie humain. De plus, nous veillons très attentivement à ce que toutes les personnes impliquées dans le projet, que ce soit la partie animale mais aussi les parties cellulaire et biochimique de préparation des cellules et d’analyse, soient parfaitement formées aux procédures employées, ceci de façon à réduire au maximum le risque d’échecs, mais aussi de nuisance pour les animaux en ce qui concerne le travail in vivo, et ainsi le nombre d’animaux qui seront utilisés. Enfin, nous procéderons dans toutes nos étapes à une surveillance des animaux pour les nuisances possibles, de façon à les minimiser et ainsi garantir une plus reproductibilité optimale de nos résultats et conséquemment une diminution du nombre de répétitions des expériences et ainsi du nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
La démarche de raffinement de ce projet implique notamment un personnel précisément formé aux procédures afin de limiter les nuisances ou la survenue de complications, ainsi que la surveillance des nuisances possibles à toutes les étapes afin de minimiser les effets néfastes et la souffrance. Un système de mesure objective du niveau d'inconfort, de stress ou de souffrance des animaux est mis en place pour évaluer le bien-être et prendre des actions au plus tôt. Par ailleurs, différentes actions de raffinement seront également menées. Afin de réduire le stress, les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation avant de les manipuler. Pendant l’hébergement ils auront accès à nourriture et boisson ainsi qu’à différents objets pour enrichir leur environnement. Lors de la chirurgie, avant la procédure, les animaux recevront un traitement analgésique, puis une anesthésie générale. Pour prévenir l’hypothermie, un tapis chauffant sera utilisé et l’animal couvert. Dans la phase de réveil, celui-ci sera placé dans une cage séparée dans un environnement également chauffé par un tapis. Sa température corporelle, son hydratation et l'absence de douleur seront suivies. Et de la nourriture et de l’eau seront fournies. Enfin, un traitement analgésique sera administré en préventif pendant 3 jours. La plaie de l’animal sera surveillée et les agrafes retirées autour de 10 jours après la chirurgie. Après récupération, l’animal sera à nouveau hébergé dans les conditions classiques et surveillé tous les jours. L’apparition d'éventuels signes d’hypothermie, de douleur, stress, perte d’activité, déshydratation ou absence de prise de nourriture, perte de poids, infection ou ulcération de la plaie sera surveillée. Si une limite prévue par le système de mesure objective est atteinte, des actions de traitement seront prises en accord avec la structure chargée du bien-être des animaux et avec le vétérinaire de la zootechnie afin d’éviter la dégradation de l’état de l’animal. Dans les cas où il n’est pas possible de rétablir ou de soulager l’état de l’animal, l’euthanasie sera appliquée.
Choix des espèces
Le choix d'utiliser des souris est lié à l’existence de protocoles de greffe d’hépatocytes humains chez cet animal, à la disponibilité de lignées de souris immuno-déprimées qui favorisent l’implantation des cellules humaines ainsi qu’à notre expérience passée de génération de lignées de cellules humaines hautement fonctionnelles via la greffe de cellules primaires immortalisées dans des souris. Les lignées cellulaires que nous avons précédemment générées (principalement cellules béta pancréatiques) ont depuis été adoptées par plusieurs centaines de laboratoires travaillant sur le diabète ou sur la physiologie du pancréas dans le monde. La même stratégie sera appliquée ici à l’amplification et à la maturation d’hépatocytes humains pour lesquels il n’existe pas de modèle cellulaire humain complet. La procédure expérimentale de dérivation de cellules fonctionnelles n’a été testée que sur la souris rendant nécessaire le choix de la souris pour mener le projet concernant les hépatocytes. Enfin, les souris qui seront utilisées auront entre 7 et 12 semaines au moment de l’implantation des cellules ou tissus humains transduits, ceci afin que l’animal ne soit pas trop petit et pour ainsi faciliter et garantir la réussite de la procédure de chirurgie.
Rôle de DLL4 dans la fonction endothéliale et la santé vasculaire et métabolique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Le retrait des ovaires sous anesthésie, l'implantation d'une capsule hormonale sous la peau et, pour 64 d'entre elles, une lésion chirurgicale de l'artère carotide attendent 928 souris, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs vaisseaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit de savoir si un traitement à base d'œstrogènes protège encore les vaisseaux après la ménopause, que la souris ne connaît pas naturellement, d'où l'ablation des ovaires. Le porteur annonce cette ablation pour les 928 animaux du projet, tout en précisant que l'étude porte sur des souris mâles et femelles. Il attribue par ailleurs au prélèvement de sang à la queue "une douleur légère au niveau de l'œil".
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause mondiale de décès. Les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins placées entre le sang et les tissus sont en première ligne face aux altérations métaboliques associées aux facteurs de risque cardiovasculaire. L’incidence de ces maladies est modulée par le sexe et le statut hormonal. En particulier, les hommes, ainsi que les femmes ménopausées — en raison de la baisse des œstrogènes — présentent un risque plus élevé de développer des maladies cardiovasculaires que les femmes non ménopausées. Ce projet vise à déterminer l’interaction entre les hormones sexuelles et un gène impliqué dans le maintien de la fonction endothéliale afin d’évaluer si certains traitements à base d’oestrogènes peuvent continuer à protéger les vaisseaux sanguins après la ménopause. Pour cela, des souris mâles et femelles chez qui un gène impliqué dans la réparation des vaisseaux spécifiquement dans les cellules endothéliale a été désactivé seront étudiées. En parallèle, afin de reproduire la baisse hormonale observée chez les femmes (puisque la souris ne présente pas de ménopause naturelle), les ovaires seront retirés à un groupe de femelles chez qui l’effet d’un traitement hormonal sera évalué. Nous allons étudier comment les différences entre hommes et femmes, ainsi que la présence ou non d’œstrogènes, influencent la forme des vaisseaux sanguins, leur capacité à se réparer et leur rôle de protection et de régulation dans le corps.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux définir les acteurs moléculaires qui pourraient être une cible thérapeutique pour limiter le développement des maladies cardiovasculaires en prenant compte le dimorphisme sexuel existant dans le développement de ces pathologies et le risque accru chez la femme au moment de la ménopause.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1-Gavage (1min) 256 animaux 2-Chirurgie de retrait des ovaires (10-15min) 928 animaux 3-Incision de la peau pour placer une capsule d'hormone à libération prolongée (5min) 928 animaux 4-Injection de molécule permettant l’évaluation de la perméabilité endothéliale (5min) 480 animaux 5-Mise à jeun : maximum 1 fois pour 12 heures effectives (phase active) (2min) 384 animaux 6-Incision de la peau et lésion superficielle de l'artère carotide (20min) 64 animaux 7-Prélèvement sanguin à la veine caudale maximum 3 fois espacé de 24h (3min) 384 animaux
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées dans ce projet sont peu invasives et indolores (pesée, jeûne) ou de classe légère (gavage, prélèvement à la veine caudale) et modérée (chirurgie de retrait des ovaires, incision de la peau pour placer une capsule d'hormones à libération prolongée et chirurgie de lésion superficielle de l'artère carotide). Elles peuvent être associées aux nuisances suivantes : Le prélèvement de sang à la veine caudale peut engendrer une douleur légère au niveau de l'oeil et un stress de la manipulation. Les chirurgies modérée peuvent entrainer une douleur localisée aux sutures, une perte de poids et un stress lié à l'opération.
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus prélevés (vaisseaux) afin de regarder leur capacité à se réparer en présence ou non d'hormones.
Remplacement
L’utilisation de souris comme modèle de recherche nous permettra d’observer et de mesurer, de façon précise, les changements qui touchent les cellules des vaisseaux sanguins selon le sexe et après un traitement hormonal. Les modèles en culture cellulaire ne permettent pas de reproduire ces variations hormonales, d’autant que les cellules endothéliales cultivées perdent rapidement le récepteur aux œstrogènes. Par ailleurs, les différences liées au sexe impliquent de nombreuses hormones, organes et types de cellules qui ne peuvent pas être simulés en laboratoire dans une simple boîte de culture. C’est pourquoi l’expérimentation animale est aujourd’hui la seule méthode qui permet de mener à bien ce projet.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux pour cette étude, nous avons réalisé une veille bibliographique, tenu compte de nos expériences passées et conçu les expériences afin d’obtenir un pouvoir statistique suffisant avec un nombre minimum d’individus. Les études statistiques antérieures et publiés ont montré que des groupes de 8-10 animaux étaient requis pour obtenir une distribution normale des mesures sur des paramètres physiologiques. En effet les chirurgies étant difficiles et minutieuses, une variabilité plus grande dans les résultats est attendue.
Raffinement
Afin de limiter le stress et d'assurer le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation, des mesures de raffinement spécifiques sont mises en place concernant les conditions de logement. Les souris seront hébergées en groupes compatibles dans des cages contenant du matériel de nidification (papier, coton). Les manipulations seront effectuées de manière douce et rapide, en privilégiant les techniques de contention peu stressantes. L’ensemble du personnel est formé aux pratiques de bien-être animal et à la reconnaissance des signes de douleur ou de mal-être, permettant une prise en charge rapide en cas de besoin. Les chirurgies sont réalisées dans une salle différente de celles où ont lieu l’euthanasie et l’hébergement, afin de réduire le stress. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie. Les animaux se verront donc administrés des analgésique (morphinique) après chaque chirurgie. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance : dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessous, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement par les expérimentateurs du projet. Ce suivi aura pour but de détecter de la douleur, d’évaluer la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, il sera anesthésié puis, après perte de conscience, l’animal sera euthanasié par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle permettant une modification génétique aboutissant à une délétion du gène DLL4 spécifiquement dans les cellules endothéliales. Les animaux seront utilisés à l’age adulte (après la puberté) à partir de 7 semaines d’âge pour l’étude des hormones sexuelles et de la ménopause.
Efficacité et rémanence de nouvelles molécules à usage rodonticide
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 1020
Les rongeurs ne recevront aucun analgésique, le porteur invoquant les interactions possibles avec le métabolisme des substances testées. 1 020 rats et 510 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue pour prélever leur foie et leurs reins. Les effets attendus incluent une prostration avancée et durable, des signes hémorragiques et un arrêt de la prise alimentaire, le porteur misant sur des points limites précoces. Il s'agit de tester de nouvelles molécules destinées à tuer des rats et des souris, sur des individus porteurs ou non d'une mutation qui les rend résistants aux poisons actuels, et les deux espèces sont retenues parce qu'elles sont celles que le produit devra tuer sur le terrain.
Objectifs
Les anticoagulants antivitamine K utilisés comme rodonticides sont confrontés à 2 limites : un manque d’efficacité vis-à-vis de certains rongeurs résistants responsable d’échec de traitement et d’une persistance importante dans les tissus de rongeurs responsable d’empoisonnements secondaires. Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules à agir en tant que rodonticide, sur rongeurs porteurs ou non de mutations sur le gène VKORC1 conférent une résistance aux rodonticides actuels, mais aussi d’évaluer leur rémanence pour éviter de sélectionner des molécules trop rémanentes dans le corps du rongeur.
Bénéfices attendus
L'amélioration de l'efficacité de l'arsenal rodonticide, avec un objectif de nouvelles molécules actives sur les rongeurs résistants aux rodonticides actuels. Une diminution de l'écotoxicité par le biais de résidus de rodonticides à un niveau le plus bas possible dans les restes du rongeur, dans le but de diminuer l'impact de la consommation de ces restes sur les espèces prédatrices.
Procédures
Le gavage est une des interventions envisagées mais sera fait sous anesthésie et son usage sera limité au strict minimum. Lors de son utilisation, l'intervention aura lieu une fois par jour pendant la durée d'administration prévue de la molécule (typiquement une semaine), et aura une durée maximale de 5 minutes par animal (contention + geste technique). L'administration de vitamine K sous-cutanée quotidienne est également envisagée hors anesthésie dans le cas de l'utilisation d'une molécule antivitamine K, et cette intervention aura une durée maximale de 30 secondes par animal (contention + geste technique).
Impact sur les animaux
L’apparition de possibles effets indésirables constitués d’un état de prostration avancée et durable, de signes hémorragiques, d’un arrêt de la prise alimentaire 2 jours consécutifs ou d’eau de boisson ou d'autres signes cliniques que nous pourrions définir au cours des études. Les nuisances possibles sont celles liées à l'utilisation du gavage, diminuée au minimum, et à l'injection sous-cutanée de vitamine K1 lors d'utilisation de molécule antivitamine K. Ces nuisances sont constituées de stress, par manipulation et insertion du matériel (sonde de gavage ou aiguille), ainsi que de dommages corporels légers (trou cutané dû à l'aiguille, et possibles lésions oesophagiennes lors de gavages répétés). Les effets indésirables et nuisances des molécules testées sont inconnus, mais seront notés lors de la procédure 1 et seront pris en compte pour la procédure 2.
Devenir
Des prélèvements d'organes entiers nécessaires à la survie de l'animal (foie, rein...) étant appliqués en fin de procédure, la mise à mort des animaux est obligatoire.
Remplacement
Les stades préliminaires des études seront effectués in vitro et in silico afin de limiter le nombre d'expérimentations sur des animaux. Ces études seront faites le plus en profondeur possible sur la cible d'action des molécules pour pouvoir sélectionner moins de molécules à tester et à une dose théorique initiale la plus proche possible de la dose efficace en pratique pour éviter au maximum les répétitions d'expérimentations. Cependant l’expérimentation sur des animaux est nécessaire pour confirmer les résultats obtenus in vitro, et pour répondre aux critères d’efficacité imposés par la législation auxquels les tests in vitro ne permettent pas de répondre.
Réduction
Une approche statistique a permis de déterminer que 4 animaux par groupe-paramètre auront besoin d’être systématiquement présents afin d’avoir une puissance statistique suffisante et ainsi de pouvoir exploiter au mieux les résultats. Ce nombre sera également un maximum pour les études de la procédure 2, et sera augmenté à 5 pour les tests d'efficacité de la procédure 1 car les effets étant inconnus, la puissance statistique nécessaire est plus grande. Ce nombre par groupe-paramètre est à multiplier par la nombre de paramètres à étudier, paramètres qui seront réduits aux plus significatifs (souvent le sexe, et d'autres paramètres comme l'âge si des études précédentes ont montré un impact important sur les effets de la molécule). Les résultats des études préliminaires seront également utilisés au mieux pour limiter le nombre de molécules à tester et donc d'expérimentations.
Raffinement
Lors des tests les animaux seront conservés dans des conditions conformes à leur bien-être, et bénéficieront d’un enrichissement suffisant (abri et feuille d’essuie-main ou coton pour leur permettre de nicher). Les animaux seront laissés en groupe, afin de respecter le caractère sociable des animaux. Le gavage ne sera utilisé qu'en dernier recours et sera fait sous anesthésie à l’isoflurane ; seront préférées l'administration orale liquide par micropipette avec prise spontanée, ou l'administration orale solide dans un aliment appétent, ne nécessitant pas d’anesthésie. L’analgésie ne sera pas utilisée en raison des interactions médicamenteuses potentielles sur le métabolisme des substances actives étudiées. L’accent a donc été mis sur la prévention de la douleur par la définition de points limites le plus précocement possible.
Choix des espèces
Le choix de ces espèces vient du fait qu’il s’agit des espèces cibles. En effet les expérimentations doivent être efficaces sur les mêmes animaux que ceux faisant l’objet du contrôle en condition naturelle. Les animaux doivent être utilisés à différents stades de développement. En effet les réponses en terme d’efficacité et de résidus peuvent varier en fonction du stade de développement, l’équipement métabolique évoluant en fonction de l’âge.
Etude de l’effet de nouvelles cibles thérapeutiques dans un modèle murin de lupus érythémateux systémique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Toutes tuées à la fin pour prélever leurs tissus, 1 728 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la grande majorité en sévère. Elles appartiennent à une lignée qui développe spontanément un lupus accéléré et agressif, avec des lésions des reins, de la peau, du cœur, des poumons, des articulations et du cerveau, et reçoivent jusqu'à 182 administrations de composés et douze prélèvements sanguins pratiqués sur animal vigile. Le porteur écrit qu'un antalgique "pourra être utilisé si nécessaire" et fixe l'arrêt de l'étude vers vingt semaines de vie, selon les scores de maladie. Il justifie l'espèce par un chiffre de "99 % de similitude" entre les génomes humain et murin.
Objectifs
Le lupus systémique est une maladie auto-immune (dysfonctionnement du système immunitaire qui conduit ce dernier à s’attaquer aux constituants normaux de l’organisme) qui touche moins d'une personne sur 2000 en Europe et 4 à 178 personnes pour 100 000 habitants au niveau mondial. Elle touche plus souvent les femmes jeunes (9 femmes pour 1 homme, entre 15 et 44 ans). Plus rarement, le lupus est diagnostiqué chez l’enfant ou le sujet âgé de plus de 50 ans. Les maladies auto-immunes systémiques affectent plusieurs systèmes ou organes, dans lesquels les symptômes sont multiples, variés et peuvent être différents d’un patient à l’autre: fatigue, douleurs, gonflements articulaires, lésions cutanées, atteinte des cellules sanguines, atteinte rénale... Aujourd’hui, on ne guérit pas définitivement d’un lupus, les traitements existants soignent poussées et complications, et préviennent leur apparition. L'objectif de notre projet est d'étudier de nouvelles molécules thérapeutiques à visée anti-inflammatoire permettant de diminuer ou d’inhiber le développement de la maladie par l'intermédiaire d'une lignée de souris génétiquement modifiée qui développe spontanément une maladie auto-immune semblable au lupus érythémateux systémique humain.
Bénéfices attendus
Il n'existe pas encore de traitement permettant une guérison du lupus érythémateux systémique. Le traitement des poussées du lupus systémique est adapté à chaque cas. Le choix des médicaments utilisés dépend de la localisation des atteintes d’organes et de leur gravité. Le traitement actuel a plusieurs objectifs : traiter les poussées du lupus et les éventuelles complications (dues à la maladie ou à un traitement prescrit pour une précédente poussée) ; prévenir les rechutes, en obtenant des rémissions parfois très longues ; préserver la qualité de vie. Ce projet a pour but de tester de nouveaux médicaments à visée anti-inflammatoire permettant de diminuer ou d’inhiber le développement de la maladie, qui pourront être proposés en essais cliniques à court terme. Au long terme, ce projet permettra de proposer de nouvelles thérapies et améliorer la qualité de vie des patients atteints.
Procédures
Prélèvements de sang : maximum 12 prélèvements (1 fois par semaine maximum, 30 secondes/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/souris). Administrations de composés : maximum 182 administrations (30 secondes/souris ; dans le cas de 2 administrations/jour pendant 13 semaines cela représente 182 administrations maximum).
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie qui va débuter vers la 12ème semaine de vie des animaux. Les souris MRL/MpJ-Faslpr/J développent une maladie lupique accélérée et agressive, caractérisée par des lésions immunitaires des reins, de la peau, du coeur, des poumons, des articulations et du cerveau. La douleur pourra générer une perte de poids. Cette perte de poids sera quantifiée par des scores attribués quotidiennement (pesée quotidienne). L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et le produit injecté va permettre, selon l’efficacité des molécules, de réduire la maladie (douleurs inflammatoires). Le gonflement des ganglions durant le developpement de la maladie pourra induire une petite gêne au niveau de la mobilité. D’après la littérature, à 20 semaines 100% des femelles présentes une lymphadénopatie (hypertrophie ganglionnaire) contre 23 semaines pour les mâles. L'étude sera arrêtée en fonction des scores du développement de la maladie (à environ 20 semaines de vie des animaux).
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever des tissus biologiques permettant de réaliser des analyses pour vérifier l'efficacité des candidats médicament sur la maladie.
Remplacement
Dans ce projet nous mettons en place un modèle de lupus érythémateux systémique (LES) qui va se développer spontanément chez des souris génétiquement modifiées afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies dans le cadre d’une monothérapie/combinaison thérapeutique. Ces nouvelles thérapies sont en premier lieu testées et validées sur des lignées cellulaires afin de sélectionner les doses à appliquer in vivo pour l'étude d'efficacité. Cette approche permettra de réduire de façon significative le nombre d’animaux dont nous aurons besoin pour notre recherche. Cependant, les méthodes substitutives à l’expérimentation animale ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament, test nécessaire avant l’initiation d’une phase clinique. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est pour le moment à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires bien que des modélisations tridimensionnelles in vitro des systèmes nerveux et immunitaire de la peau notamment soient en cours de développement actuellement. Les évolutions futures de ces modèles permettront d’obtenir une vision aussi complète que possible des influences réciproques entre système immunitaire et système nerveux sensoriel.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Par conséquent, 12 animaux/groupe maximum seront necessaires.
Raffinement
Un suivi et scoring journalier quotidien sera effectué. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Des croquettes humides ou de l'hydrogel pourront être ajoutés en cas de surveillance renforcée (surveillance 2x/jour). Un antalgique pourra être utilisé si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. Les différences génétiques entre l'homme et la souris sont minces. Les deux espèces possèdent environ 30.000 gènes, dont seulement 300 sont spécifiques à l'un ou l'autre organisme. Il y a donc 99% de similitude génome Humain et celui de la souris. Seulement 1 % des gènes murins n’a aucun équivalent chez l’homme et il existe de grandes analogies entre les deux espèces dans les systèmes et leur fonctionnement ce qui montre que nous avons un ancêtre commun. C'est l’animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique suite à ces découvertes génétiques. De nombreuses études précliniques sont réalisées notamment sur le modèle de Lupus comme décrit dans la litterature Les animaux pourront rentrer dans une étude à partir du stade adulte (à partir de 8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les animaux sont intégrés à l’étude à partir de 8 semaines afin de se situer avant le développement spontané des signes cliniques, ce qui permettra d’avoir une vision sur toute la période d’évolution de la maladie, mais également de faire voyager les animaux avant le développement du phénotype dommageable (les animaux venant de l’étranger). L’étude commencera après minimum 6 jours d’acclimatation.
Evaluation de nouvelles molécules thérapeutiques dans des modèles expérimentaux de polyarthrite rhumatoïde chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections dans l'abdomen et sous la peau tous les trois à quatre jours pendant cinq semaines, puis des prélèvements sanguins sous anesthésie tous les quinze jours pendant trois mois, le temps qu'une arthrite se développe dans leurs articulations. Le bénéfice annoncé reste un modèle murin destiné à évaluer plus tard des traitements ciblés, aucun essai clinique n'étant en vue. Sur le remplacement, le porteur décrit des tests sur cellules isolées suivis d'un passage chez l'animal, et présente la souris comme le modèle approprié pour observer la coopération cellulaire dans un "organisme entier".
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune caractérisée par une inflammation au niveau des articulations aboutissant à la déformation des articulations et, à terme, une perte de qualité de vie des patients. Certaines personnes sont plus à risque de développer cette maladie, notamment celles qui possèdent un certain type d’anticorps. Ces anticorps apparaissent parfois avant les premiers symptômes et sont liés aux formes les plus sévères de la maladie. Les traitements actuels sont basés sur l’immunosuppression : ils freinent l’ensemble du système immunitaire pour limiter l’inflammation. Mais cela peut aussi affaiblir les défenses naturelles du corps, augmentant le risque d’infections graves. Notre équipe développe une nouvelle approche : cibler uniquement les cellules immunitaires responsables de la production de ces anticorps particuliers, sans toucher aux autres cellules immunitaires. Pour cela, il est essentiel de tester ces thérapies sur des modèles expérimentaux fiables. Notre projet consiste à développer un nouveau modèle murin reproduisant les caractéristiques de la PR, notamment la présence de ces anticorps. Ce modèle unique nous permettra ensuite de tester avec une plus grande fiabilité des traitements innovants qui ciblent uniquement les cellules malades, pour une approche plus précise, plus efficace et avec moins d’effets indésirables.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mettre en place un nouveau modèle murin d’arthrite, reproduisant la pathologie humaine, avec la présence des anticorps spécifiques à cette maladie. Ce modèle unique permettra d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cellules pathogènes spécifiquement pour limiter les effets secondaires des traitement actuels.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs injections intra-péritonéales (
Impact sur les animaux
Douleur légère due aux injections intrapéritonéales et sous-cutanées. Douleur modérée due au développement de l’arthrite ou à une réaction immunitaire exacerbée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures pour analyser les cellules immunitaires présentes et l’impact des molécules testées sur les cellules exprimant/sécrétant les anticorps spécifiques de la pathologie.
Remplacement
Nos recherches visent à trouver de nouveaux traitements pour la polyarthrite rhumatoïde, une maladie où le système immunitaire attaque les articulations. Nous cherchons à développer des thérapies capables de cibler et détruire uniquement les cellules du système immunitaire qui fabriquent les anticorps responsables de ces attaques. D’abord, nous testons ces approches en laboratoire sur des cellules isolées (in vitro). Les plus prometteuses seront ensuite testées sur des modèles vivants (in vivo) pour vérifier leur efficacité avant d’envisager des essais sur l’humain. Pour cela, nous devons créer des modèles expérimentaux qui reproduisent le système immunitaire humain, y compris les cellules qui provoquent la maladie. Ces modèles permettront ensuite d’évaluer concrètement les nouvelles molécules thérapeutiques que nous aurons sélectionnées.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé avec un logiciel adapté pour nous permettre d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Seules les molécules ayant démontré une activité in vitro seront évaluées in vivo, afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les animaux seront observés régulièrement selon de nombreux critères : paramètres comportementaux et perte de poids. Le développement de l’arthrite sera suivi 3 fois par semaine pour évaluer le bien-être animal et adopter les mesures de raffinement appropriées. Un enrichissement des cages sera réalisé en utilisant des copeaux de litière et des igloos, et de la nourriture humidifiée dans la cage.
Choix des espèces
La souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'immunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Ces modèles permettent d’évaluer l’effet des molécules développées, leur efficacité sur les pathologies mais également l’identification d’effets secondaires potentiels. Les souris doivent être utilisées à l’âge adulte pour avoir un système immunitaire mature.
Elucider le rôle des interactions neurogliales dans le remodelage du canal central en contexte neuro-inflammatoire chez la souris adulte
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
768 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir une toxine bactérienne sous la peau, cinq injections quotidiennes d'un composé, une chirurgie de trente minutes pour injecter un virus dans les ventricules du cerveau et quatre heures de test de la miction, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur indique que le lipopolysaccharide déclenche un état de maladie avec anorexie, somnolence et évitement social, qui culmine six à dix heures après l'injection, et classe la poutre d'équilibre et le tapis roulant parmi les tests les plus stressants. 624 souris sont tuées pour prélever leur moelle épinière, 144 autres partent vers d'autres projets ou vers la reproduction. Les retombées annoncées, des biomarqueurs dans le liquide céphalo-rachidien et des stratégies protégeant la barrière de la moelle épinière, sont renvoyées au moyen et au long terme.
Objectifs
Le canal central de la moelle épinière est bordé par une barrière qui régule les échanges entre le liquide céphalo-rachidien (LCR) et le tissu nerveux environnant. Cette interface est en contact étroit avec plusieurs types de cellules spécialisées. Lors d’épisodes neuro-inflammatoires, la structure et la perméabilité de la barrière peuvent être altérées, ce qui risque de modifier la composition du LCR, de perturber la communication entre les cellules nerveuses, et d’entraîner des troubles des fonctions sensorimotrices et autonomes, par exemple le contrôle de la vessie. Les mécanismes de plasticité de cette barrière restent encore largement méconnus, en particulier dans un contexte inflammatoire. Mieux comprendre comment cette interface se remodèle et interagit avec les cellules nerveuses est essentiel pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et mieux prendre en charge les patients présentant des troubles des fonctions autonomes (par ex contrôle de la vessie) liés à une inflammation de la moelle épinière. Notre projet a pour objectif de déterminer comment une inflammation induite par une toxine bactérienne, le lipopolysaccharide (LPS) modifie la morphologie et le fonctionnement de cette barrière. Nous chercherons à déterminer quels changements cellulaires et moléculaires surviennent au niveau de cette barrière et quelles sont les conséquences sur la dynamique du LCR et la régulation des fonctions sensorimotrices et autonomes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre la plasticité de la barrière qui régule les échanges entre le liquide céphalo-rachidien (LCR) et le tissu nerveux environnant en contexte neuro-inflammatoire. À court terme, les travaux permettront de caractériser les modifications cellulaires, moléculaires et fonctionnelles (miction (action d'uriner), locomotion) induites par une inflammation aiguë, grâce une combinaison d’approches techniques. À moyen terme, les résultats permettront d’identifier de nouvelles cibles susceptibles d’être mobilisées pour restaurer ou protéger l’intégrité de la barrière. L’étude des conséquences fonctionnelles, notamment urinaires et locomotrices, apportera des éléments déterminants pour comprendre la genèse de symptômes observés dans les pathologies inflammatoires de la moelle épinière, telles que la sclérose en plaques ou les myélites. À long terme, ce projet contribuera à la mise en évidence de biomarqueurs dans le LCR permettant de suivre l’évolution et la réponse aux traitements des affections inflammatoires de la moelle épinière. Les connaissances acquises ouvriront également la voie à des stratégies thérapeutiques visant à limiter les effets délétères de l’inflammation et à favoriser la régénération tissulaire.
Procédures
# Injection-sous cutanée d’une toxine bactérienne (LPS) : moins d’une minute. # Injections sous-cutanées d’un composé pharmacologique une fois par jour pendant 5 jours : moins d’une minute. # Injection d’un virus (non pathogène) dans les ventricules du cerveau sous anesthésie : chirurgie 30 minutes ; surveillance après l'opération : 1h ; l’animal est en dehors de la zone de stabulation pendant 2 à 4h. # Prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie (acte terminal) : 15 minutes. # Injection d’un traceur dans les ventricules du cerveau sous anesthésie (acte terminal) : 15 minutes. # Test comportementaux : - Etude la miction : 4h. - Activité locomotrice spontanée : 40 minutes. - Poutre d’équilibre : 3/5 x 5 minutes. - Tapis roulant : 30 minutes.
Impact sur les animaux
1\ L’injection aigue de lipopolysaccharide est classiquement utilisée pour induire une neuro-inflammation aiguë chez les animaux. Ce traitement engendre un état de maladie transitoire dont les symptômes (anorexie, hyper ou hypothermie, inactivité, somnolence, évitement social, …) culminent à 6-10h post injection et se résolvent en 24h. 2\ Les injections sous-cutanées quotidiennes d'une substance pharmacologique pendant cinq jours consécutifs peuvent provoquer du stress et de l’inconfort en raison des manipulations répétées. 3\ Les interventions chirurgicales (injections dans les ventricules du cerveau) menées sur les animaux sont susceptibles de générer des douleurs et du stress après l'opération. La chirurgie proprement dite durera environ 30 minutes et le suivi immédiat durera au minimum 1 heure. 4\ Les tests comportementaux peuvent également induire du stress lié à la nouveauté de l’environnement et à la manipulation des animaux. Chaque test induit un stress plus ou moins important selon sa nature (par exemple, l’étude la miction ou la mesure de l’activité locomotrice spontanée sont peu stressantes alors que la poutre d’équilibre et le tapis roulant sont plus stressants). 5\ Afin de mettre au point la caractérisation génétique des animaux transgéniques utilisés dans notre projet, nous allons réaliser des biopsies de queue ce qui engendrera un stress et une douleur au niveau de la queue des animaux.
Devenir
624 souris seront mises à mort pour prélèvement de la moelle épinière et analyses. La moitié des souris (ie 144 souris) qui auront été caractérisées génétiquement sont inclues dans les 624 souris qui seront mises à mort et l'autre moitié (ie 144 souris) sera ré-utilisée dans d'autres projets ou pour de la reproduction.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier la plasticité de la zone de la moelle épinière qui est à proximité du liquide céphalo-rachidien (LCR) en contexte neuro-inflammatoire et ses conséquences sur différentes fonctions de l’organisme telles que la fonction urinaire et la fonction locomotrice. Ces phénomènes impliquent des interactions complexes entre les différents types cellulaires et la circulation du LCR qui ne peuvent être reproduites ni in vitro, ni informatiquement. De plus, la fonction urinaire et la fonction locomotrice ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants. Ce projet ne peut pas être réalisé chez l’Humain puisque nous avons besoin d’extraire les moelles épinières pour nos analyses. L’utilisation de la souris, espèce pour laquelle il existe de nombreux outils génétiques adaptés à nos objectifs, est donc indispensable.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés soit à partir de notre expérience, soit à partir d’analyses de puissance statistique afin de limiter au maximum le nombre d’animaux. Les animaux engagés dans les tests comportementaux (miction et locomotion) seront ensuite utilisés pour des analyses post-mortem maximisant ainsi les données obtenues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages collectives (2-4 animaux par cage) et enrichies (maison, buchettes, tunnel, …). Nous leur fournirons une grande quantité de matériel de nidification quelques jours avant l’injection de la toxine bactérienne (LPS) afin qu’ils puissent avoir des zones de température différentes au sein de la cage. Après l’injection de LPS, ils auront accès à des friandises et/ou du gel nourrissant et/ou des croquettes mouillées en plus de leur nourriture habituelle. Toutes les injections (hormis les injections dans les ventricules du cerveau) se feront par voie sous-cutanée afin d’éviter la voie intrapéritonéale, plus douloureuse et moins reproductible. Toutes les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie appropriée avec analgésie systématique par du personnel expérimenté. Pour limiter le stress et l’inconfort liés aux injections sous-cutanées quotidiennes de composés pharmacologiques sur cinq jours, nous essaierons de mettre en place l’administration volontaire par micro-pipette (composé dilué dans une solution appétente). Pour les tests comportementaux, les animaux seront habitués à la pièce / cage d’expérimentation la semaine précédant les tests (3 séances de 30 min – 1h). Nous ferons attention à ce que les animaux soient toujours en présence d’odeurs familières (litière de leur cage d’origine).
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus pertinente pour notre étude car (1) ce modèle est largement maîtrisé au sein de notre équipe et au laboratoire, et (2) notre projet repose sur l’utilisation de lignées transgéniques spécifiques permettant le marquage ou la manipulation ciblée de différents types cellulaires. L’existence d’outils génétiques adaptés chez la souris permet d’atteindre nos objectifs expérimentaux avec précision tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires. Les animaux utilisés seront des souris adultes (60-90 jours) au démarrage de l’expérimentation. Le choix de ce stade de développement est guidé par la volonté de réaliser des expériences chez la souris adulte, post-pubertaire.