Rongeurs
Etude du flux sanguin au cours du développement des valves dans un modèle souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Anesthésiées au gaz pour une échocardiographie, 105 souris femelles sont tuées sans reprendre conscience, des cœurs étant prélevés pour analyse histologique. Le projet mesure la vitesse du flux sanguin dans les valves aortiques aux stades embryonnaire et fœtal, afin de proposer un modèle des forces de frottement qui s'exercent pendant le développement. Le porteur décrit l'échocardiographie comme une procédure indolore ne nécessitant pas d'analgésique, l'unique nuisance déclarée tenant au stress de l'anesthésie. Il ne précise ni le nombre d'embryons concernés, ni les stades retenus, ni le nombre d'examens par femelle, l'effectif restant présenté comme "un nombre minimal" défini statistiquement.
Objectifs
Les maladies des valves cardiaques, appelées aussi valvulopathies, peuvent entraîner une dysfonction cardiaque d’apparition progressive. Certaines valvulopathies touchent spécifiquement la valve aortique, qui assure une circulation unidirectionnelle entre le ventricule gauche et l’aorte. La valve aortique joue le rôle de clapet empêchant ainsi le reflux du sang de l’aorte vers le ventricule gauche. Notre projet a pour objectif de mesurer la vitesse du flux sanguin au niveau des valves au cours du développement embryonnaire. L’enregistrement de ces flux, parallèlement à une analyse de l’anatomie à différents stades du développement, permettra de proposer un modèle des forces de frottement exercées au cours du développement. Cette étude ouvrira la voie à l’identification du ou des modes de signalisation cellulaire répondant aux forces qui contrôlent le développement normal de la valve aortique.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet d’augmenter nos connaissances sur le développement des valves cardiaques et d’identifier les voies de signalisation importante pour el développement normal de cette structure du cœur.
Procédures
Les animaux seront soumis à échocardiographie sous une anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Au cours de cette procédure, les nuisances sont liées au stress de l’anesthésie.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvement des coeurs et analyse histologique.
Remplacement
Notre projet consiste à étudier la physiologie cardiaque aux stades embryonnaire et fœtal. Malheureusement, le développement embryonnaire ne peut pas être reproduit in vitro et nous devons maintenir une analyse d’un modèle in vivo.
Réduction
Un nombre minimal de souris femelles sera inclus dans le projet. Ce nombre a été défini à l'aide d'une approche statistique permettant d'obtenir des données d'échographies significatives, fiables et reproductibles.
Raffinement
Dès l’importation des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal sur l’ensemble de nos individus. Les animaux seront hébergés en groupe. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress (mains en coupelle et tunnels). L’échocardiographie est une procédure indolore, ne nécessitant pas de recours aux analgésiques. Afin de limiter le stress des animaux lié à une contention prolongée, elle sera systématiquement réalisée sous anesthésie générale gazeuse.
Choix des espèces
L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celles du cœur humain. Le modèle souris est un bon modèle d’étude du développement du cœur et de la conséquence hémodynamique sur le développement des valves. Différents stades embryonnaires et foetaux seront nécessaires pour étudier de façon linéaire la vitesse du flux sanguin au cours du développement
Immunisation chez la souris par voie intrapéritonéale ou intramusculaire.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Soumises à huit anesthésies générales au maximum sur un an, à quatre injections intramusculaires suivies d'une électroporation ou à quatre injections dans l'abdomen, 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 100 d'entre elles et modéré pour 200. L'objectif déclaré est de vérifier que des antigènes candidats et les voies d'administration retenues déclenchent une réponse immunitaire, en vue de vaccins antiparasitaires et de sérums antivenimeux. Toutes sont tuées en fin d'expérience, le porteur prévoyant de prélever "la totalité du sang" pour disposer du maximum d'anticorps. Il écrit par ailleurs que le protocole "n'induit pas de souffrance particulière autre que celle due à des anesthésies générales", alors que 200 de ces souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré.
Objectifs
Ce projet se situe dans le domaine de l'immunisation. Le but est, d'une part, obtenir des anticorps contre certaines protéines néfastes pour la santé (par exemple, des toxines), et d'autre part, d'identifier des antigènes candidats à un vaccin dans le cas de maladies infectieuses. L'immunisation peut se faire sous forme de vaccin génétique (comme dans le cas des vaccins contre la COVID-19), ou de vaccin à base de protéine (comme dans le cas par exemple du vaccin contre l'hapétite B). Dans ce contexte, le but de ce projet est de nous permettre de vérifier que les antigènes que nous avons identifiés et les voies d'administration que nous avons choisies permettent une réponse immunitaire efficace, (c'est à dire que les anticorps produits protègent de la toxicité ou de l'infection))
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre de la mise au point de nouveaux vaccins contre des maladies parasitaires, et de la production d'anticorps protégeant contre des protéines toxiques (comme c'est le cas par exemple des produits que l'on se procure en pharmacie contre les morsures de serpent). Il est donc attendu d'une part l'identification d'antigènes permettant au système immunitaire de générer cette réponse protectrice, et de vérifier que les voies d'administration choisies le permette.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à 8 anesthésies générales au maximum, d'une trentaine de minutes. Certains animaux subiront 4 injections intramusculaires au maximum suivies d'une électroporation (application d'un champ électrique faible pendant moins de 5 secondes). D'autres animaux subiront 4 injections péritonéales au maximum, ce qui dure de l'ordre de 5 à 10 secondes Les animaux subiront également sous anesthésie des prises de sang (5 au maximum sur un an, de 100 µl chacune), ce qui dure environ 15 secondes
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à 8 anesthésies générales ou injections péritonéales au maximum sur un an : Cela induit un stress léger du à la manipulation de l'animal, une douleur légère due à l'injection, et une hypothermie passagère, L'électroporation peut induire un certain raidissement au réveil
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort. En effet, afin de disposer du maximum d'anticorps pour les analyses fonctionnelles ultérieures, nous prélèverons la totalité du sang en fin d'expérience.
Remplacement
Avant de recourir à l'expérimentation animale, les tests alternatifs réalisables ont été faits : en particulier, détermination sur ordinateur des antigènes candidats. Des tests sur culture cellulaire ont également été réalisé, ainsi que destests de toxicité sur culture cellulaire également. Néanmoins, un test sur organisme entier est nécessaire, les tests sur cellules ne pouvant induire une réponse immunitaire.
Réduction
Il s'agit ici d'examiner si les voies d'administration étudiées zet les antigènes identifiés peuvent, ou non, engendrer une réponse immunitaire importante. Des groupes de 4 animaux ont été prévus, la variation interindividuelle dans le domaine de la vaccination pouvant être importante. Lexpérience montre que plus d'animaux seraient inutiles. Des groupes plus réduits pourraient amener à devoir refaire l'expérience : en effet, il arrive fréquemment qu'un ou deux animaux ne produisent pas de réponse immunitaire.
Raffinement
Le protocole expérimental n'induit pas de souffrance particulière autre que celle due à des anesthésies générales. Les prises de sang seront réalisées sous anesthésie générale pour éviter un stress trop important à l'animal. Par ailleurs, les animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter d'éventuelles souffrance. Le cas échéant, un analgésique sera administré. Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
Le but étant de mettre au point des systèmes vaccinaux pour l'humain, une étude sur mammifère est nécessaire. La souris est un mammifère adapté pour étudier en première intention une réponse immunitaire. Si les résultats sont positifs, des études ultérieures pourront être nécessaires sur d'autres mammifères. Les animaux utilisés devront avoir un système immunitaire fonctionnel : Ce seront des souris de 6 semaines, âge auquel nous avons toujours obtenu de bons résultats (en terme de qualité scientifique).
Diplôme Universitaire de microchirurgie (approche expérimentale chez le rat)
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Former une centaine de chirurgiens à la microchirurgie en cinq années suppose ici un rat par participant et par séance. 990 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chaque animal subit environ trois heures d'interventions successives selon la dextérité des apprenants, sutures des deux carotides, de l'aorte et des vaisseaux fémoraux, greffe rénale, greffon jugulaire. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur des vaisseaux au sang circulant, la première séance se déroulant sur des nouilles de shirataki avant le passage aux rats, et rattache l'ensemble à un diplôme universitaire délivré à des internes et des vétérinaires.
Objectifs
La microchirurgie est une discipline chirurgicale qui permet de réparer, de remplacer, de greffer des nerfs ou des vaisseaux et qui permet de disséquer des tumeurs cérébrales sans hémorragie dans un cerveau ou une moelle épinière. Son exercice n’est accessible qu’à un chirurgien rompu aux différentes techniques microchirurgicales, et dont la pratique est quotidienne. Tous les chirurgiens des centres SOS mains notamment en France exercent cette spécialité. Tous les Neurochirurgiens sont formés à la microchirurgie, comme la plupart des chirurgiens qualifiés en chirurgie plastique et reconstructrice. Cette compétence s’acquiert par ce Diplôme Universitaire de microchirurgie dans le cadre de la formation initiale du chirurgien. Le Diplôme Universitaire de microchirugie s'adresse à des chirurgiens en formation (vétérinaires ou internes des service de chirurgie) et permet à ceux-ci d'acquérir la technique , les compétences et le diplôme nécessaire pour pratiquer la chirurgie réparatrice des microvaisseaux. Pour acquérir ces gestes, il est indispensable de travailler sur des vaisseaux avec du sang circulant pour pouvoir apprendre à réparer ces veines et artères de manière à ce que celles ci soient à nouveau opérationnelles sans hémorragie et sans thrombose, une 1ère approche validée chez l'animal est donc indispensable avant l'application de ces techniques sur des patients. Une centaine de chirurgiens pourront ainsi être formés durant ces 5 années.
Bénéfices attendus
Le Diplôme Universitaire de microchirugie s'adresse à des chirurgiens en formation (vétérinaires ou internes des service de chirugie) et permet à ceux-ci d'acquérir la technique , les compétences et le diplôme nécessaire pour pratiquer la chirurgie réparatrice des microvaisseaux chez l'Homme. Une centaine de chirurgiens pourront ainsi être formés durant ces 5 années.
Procédures
Les animaux subiront une procédure chirugicale sans réveil sous anesthésie générale et analgésie. Les rats seront préanesthésiés par un anesthésique volatile dans une cage d'endormissement puis anesthésiés par injection. Une injection d'un analgésique sera réalisée simultanément. Le niveau d'anesthésie sera évalué tout au long du protocole par surveillance visuelle du rythme respiratoire et par stimuli mécaniques. En cas, de signe de réveil, l'animal se verra injecter une 1/2 dose d'anesthésiant. A la fin des procédures, les rats seront mis à mort par injection. Les interventions seron t: Dissection et exposition des différents vaissaux, Suture des 2 carotides, Suture carotide et aorte, Suture veine et artère fémorales et aorte, Greffe rénale, Suture carotide et greffe rénale, Suture carotide et greffon jugulaire sous rénale, Suture carotide, aorte, artère et veine rénale. L'ensemble des interventions aura une durée d'environ 3h selon la dextérité des apprenants.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront le stress de leur manipulation jusqu'à la chambre d'induction d'anesthésie gazeuse. Une fois endormis, l'ensemble des procédures seront sans réveil et effectuées sous anesthésie générale et analgésie adaptée.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés seront mis à mort, les procédures chirurgicale lourdes ne permettent pas le reveil des animaux.
Remplacement
Pour acquérir ces gestes, il est indispensable de travailler sur des vaisseaux avec du sang circulant pour pouvoir apprendre à réparer ces veines et artères de manière à ce que celles ci soient à nouveau opérationnelles (pas d'hémorragie et sang circulant) . L'utilisation d'animaux vivants est donc indispensable.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit à son minimum (1 rat par séance par participant). Plusieurs vaisseaux seront utilisés sur le même animal permettant également d'en réduire le nombre.
Raffinement
La formation concerne des chirurgiens (vétérinaires ou internes des services de chirurgie) et débutera par 5 séances théoriques portant sur la microchirurgie (matériel, méthodes), l'anatomie du rat et sur l'expérimentation animale en insistant sur les parties réglementation, bien être animal et règle des 3 R. La première séance pratique se déroulera entièrement sur du matériel inerte (nouilles chinoises "shirataki") afin d'assimiler puis de valider les gestes techniques avant d'appliquer ceux-ci sur les animaux. L'ensemble des séances suivantes débutera par du travail sur matériel inerte sur lequel le geste technique devra systématiquement être validé par le responsable de séance avant de passer sur l'animal. Les rats seront préanesthésiés par un anesthésique volatile dans une cage d'endormissement puis anesthésiés par injection. Une injection d'un analgésique sera réalisée simultanément. Le niveau d'anesthésie sera évalué tout au long du protocole par surveillance visuelle du rythme respiratoire et par stimuli mécaniques. En cas, de signe de réveil, l'animal se verra injecter une 1/2 dose d'anesthésiant.
Choix des espèces
L'espèce choisie possède des vaisseaux d'un diamètre correspondant à ceux rencontrés en microchirurgie humaine ou vétérinaire. Le rat est donc parfaitement adapté à l'apprentissage de ces techniques. Les rats utilisés seront des jeunes adultes (environ 250/300g), de taille suffisante pour que leur vaisseaux soient comparables à ceux rencontrés lors d'activités de microchirurgie humaine ou vétérinaire.
Rôle des microtubules dans les cellules souches musculaires pour le maintien et la régénération du muscle squelettique chez la souris adulte
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 300 d'entre elles et modéré pour 420. Chacune reçoit une injection quotidienne pendant quatre jours, et les 420 souris du second groupe subissent deux injections dans la même patte, destinées à léser le muscle pour en déclencher la régénération. Le porteur qualifie la suite de "gêne légère et transitoire", la patte blessée restant rétractée au réveil. Étudier les protéines qui donnent leur forme aux cellules souches musculaires exige selon lui l'animal entier, faute de pouvoir reproduire l'environnement du muscle in vitro, ce qui rend à ses yeux la mise à mort "indispensable" à chaque point de prélèvement.
Objectifs
Le muscle squelettique a une capacité remarquable de régénération grâce à la présence de cellules souches musculaires (CSM) en son sein. Les CSM du muscle sain sont dans un état de dormance. En revanche, suite à une lésion, les CSM s’activent, c’est-à-dire qu’elles se réveillent pour se multiplier, se différencier et fusionner pour réparer le muscle. C’est la régénération musculaire. En parallèle, quelques CSM s’auto-renouvellent et retournent en dormance pour maintenir leur stock tout au long de la vie. Lorsque les propriétés de dormance, multiplication, auto-renouvellement ou différenciation des CSM sont compromises, la régénération et la fonction musculaire sont altérées, ce qui conduit à des pathologies du muscle (myopathies). Toutes ces propriétés sont largement régulées par des facteurs extracellulaires, c’est-à-dire les autres types cellulaires du muscle (fibres musculaires, vaisseaux sanguins, nerfs et tissus conjonctifs). Elles dépendent également de la capacité de la CSM elle-même à adapter sa forme aux contraintes de l’environnement. Nos travaux visent à déterminer les rôles de protéines spécifiques de la cellule qui contrôlent la forme des CSM dans ces processus physiologiques. Nous proposons d’utiliser 3 lignées de souris qui permettent d’induire la perte d’expression, spécifiquement dans les CSM, de gènes codant ces protéines impliquées dans la stabilité cellulaire. La perte d’expression de ces gènes sera induite dans le muscle sain pour définir leurs rôles dans la dormance des CSM, et au cours de la réparation musculaire. A terme, nos travaux permettront d’identifier de nouveaux mécanismes qui contrôlent les activités des CSM et donc, la réparation du muscle squelettique.
Bénéfices attendus
Le muscle squelettique adulte est l’un des tissus les plus remarquables : il peut se régénérer en cas de lésion. À l’origine de cette capacité se trouve un réservoir de cellules souches musculaires (CSM). Les CSM ont une activité qui dépend largement de leurs interactions avec les autres types cellulaires présents dans le tissu et nécessaires à leur bon fonctionnement. Cependant, la possibilité que la CSM puisse auto-réguler ses activités, indépendamment de ses voisins cellulaires, commence juste à être exploré, révélant l’importance de protéines de l’architecture des cellules. Ces protéines d’architecture régulent la mobilité ou la forme des cellules. Dans ce projet, nous allons investiguer le(s) rôle(s) des protéines d’architecture indispensables au bon fonctionnement des CSM dans le muscle sain et en régénération. En utilisant 3 modèles de souris dont les gènes invalidés dans les cellules souches musculaires définissent l’architecture cellulaire, c’est-à-dire la forme des cellules, notre projet permettra d’établir leurs rôles i) pour le maintien en dormance des CSM et ii) pour la régénération du muscle squelettique adulte. D’un point de vue scientifique, ceci permettra d’accroitre les données fondamentales sur les mécanismes qui régulent la fonction des CSM. En santé humaine, nos résultats pourraient révéler de nouvelles voies thérapeutiques dans des contextes de maladies où ces mécanismes sont altérés. Par exemple, identifier des molécules qui maintiennent les cellules souches en dormance permettrait de préserver leur efficacité tout au long de la vie.
Procédures
Tous les animaux (720) recevront une injection quotidienne pendant 4 jours consécutifs d’une durée inférieure à 2 minutes pour chaque injection. Une partie des animaux (420) recevra une injection d’analgésique (durée = 1 minute) et deux injections dans la même patte (durée = 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les injections nécessitent la contention des souris qui peut induire un stress léger chez l’animal. Les injections qui induisent une lésion des groupes musculaires injectés peuvent engendrer une gêne légère et transitoire lors de la reprise de locomotion au réveil (patte blessée légèrement rétractée).
Devenir
Les analyses moléculaires et histologiques nécessitent le prélèvement complet des tissus musculaires (ceci est incompatible avec un suivi longitudinal du même individu tout au long de sa vie). Il est donc indispensable de mettre à mort les animaux à chaque point identifié au cours des procédures.
Remplacement
Ce projet porte sur l’analyse des cellules souches musculaires dont le comportement dépend largement de l’environnement tissulaire et des voisins cellulaires des cellules souches. Sans cet environnement, les cellules souches perdent leurs fonctions. De plus, le tissu musculaire est un tissu complexe dans lequel résident de nombreux types cellulaires comme les vaisseaux sanguins, les cellules du tissu conjonctifs ou les nerfs. Tous communiquent avec la cellule souche musculaire pour contrôler ses fonctions. A ce jour, il n’est pas possible de reproduire l’environnement tissulaire des cellules souches musculaires in vitro. Il n’est donc pas possible de se passer du modèle animal.
Réduction
Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses, histologiques, cellulaires et moléculaires. Des animaux des 2 sexes seront utilisés car les cellules souches musculaires ont un comportement similaire entre les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux.
Raffinement
Les personnes impliquées dans ce projet prendront les dispositions appropriées pour éviter toute souffrance, douleur, angoisse ou inconfort aux animaux. Les injections seront réalisées par un seul expérimentateur pour que les animaux soient habitués à l’expérimentateur, afin de minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. L’injection permettant d’induire le processus de réparation musculaire est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie pour une meilleure prise en compte de la douleur. Les animaux sont placés sur des tapis chauffants jusqu’au réveil complet de l’animal. Comme la locomotion des animaux peut être limitée dans les premières 24h, des croquettes mouillées seront ajoutés au sein des cages pour leur permettre une alimentation et une hydratation constante. Des points limites adaptés à nos procédures ont été mis en place afin de prévenir toute souffrance. Les animaux seront hébergés en groupe (2 à 5 animaux par cage) pour éviter l’isolement social. Ils auront un accès illimité à l’eau et à la nourriture et en conditions de température et hygrométrie contrôlées. Les cages seront enrichies avec des abris en carton et des lanières de papier Kraft.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les modèles de souris présentés dans notre projet vont permettre de déterminer quels sont les rôles du squelette cellulaire pour réguler les fonctions de la cellule souche musculaire dans le muscle non blessé ou en régénération. Plusieurs stades de la vie adulte ont été choisis pour ce projet, afin d’avoir une vision globale du devenir et de la progression des cellules souches musculaires dans le muscle sain de souris jeune adulte, adulte et âgée ou dans le muscle lésé.
Étude du rôle de checkpoints immunitaires intrinsèques aux lymphocytes T sur la réponse anti-mélanome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Greffées d'un mélanome murin sous anesthésie, irradiées quatre minutes, puis reconstituées par injection de cellules immunitaires, 3 978 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit ensuite trois injections d'immunothérapie espacées de deux jours au moins. Le développement tumoral peut entraîner perte de poids, anémie, déshydratation et ulcération de la tumeur. Le porteur écrit que ces souris ne peuvent être "éthiquement" ni réutilisées, ni adoptées, du fait de l'injection de cellules cancéreuses, et prévoit de les tuer toutes.
Objectifs
Les lymphocytes T CD8 sont des cellules essentielles de notre système immunitaire, capables de reconnaître et d’éliminer spécifiquement les cellules cancéreuses ou infectées, assurant ainsi une protection durable contre les maladies. Leur activité est régulée par des protéines appelées checkpoints immunitaires, qui peuvent freiner ou limiter leur action. Ces checkpoints sont aujourd’hui au cœur des stratégies d’immunothérapie contre le cancer, permettant de stimuler le système immunitaire pour mieux attaquer les tumeurs. Cependant, les mécanismes précis par lesquels ces protéines modulent les réponses immunitaires restent encore mal connus. Pour mieux les comprendre, il est indispensable d’utiliser des modèles animaux qui prennent en compte la complexité des interactions entre les différentes cellules dans l’environnement tumoral. Notre projet se concentre sur l’étude de checkpoints immunitaires qui jouent un rôle clé dans la régulation des lymphocytes T CD8 humains et vise à identifier les modalités moléculaires et cellulaires par lesquelles ces molécules contrôlent l’activité anti-tumorale de ces cellules.
Bénéfices attendus
Notre étude pourrait révéler comment certaines tumeurs développent des résistances aux traitements et aider à élaborer de nouvelles stratégies pour renforcer l’efficacité des immunothérapies actuellement développées.
Procédures
Des cellules tumorales de mélanome murin seront implantées de façon unique à des souris anesthésiées et analgésiées, sur une durée de 10 secondes. Les animaux seront ensuite soumis à une irradiation durant 4 minutes afin de permettre une reconstitution de leur système immunitaire par injection unique de cellules immunitaires spécifiques des cellules tumorales implantées, sous anesthésie, durant 10 secondes. Les souris vigiles pourront ensuite être traitées ou non par 3 injections d’immunothérapie par intervalles de temps espacés d’au moins 48 heures, chaque injection durant 10 secondes.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales est susceptible de causer ponctuellement une douleur modérée. Le développement tumoral peut engendrer des effets indésirables tels que perte de poids, anémie, déshydratation. Les tumeurs présentent également un risque d’ulcération. L’irradiation des souris engendre un stress de courte durée. L’injection de cellules immunitaires est susceptible de causer ponctuellement une douleur modérée.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort car elles ne peuvent pas être éthiquement réutilisées, remplacées ou adoptées, du fait de l’injection de cellules cancéreuses. Toutefois, une partie des souris mises à mort permettra d’effectuer des prélèvements d’organes post-mortem, et ainsi mener des expériences ex vivo en plus des données pré-cliniques qu’elles fourniront.
Remplacement
Bien que le projet inclue des expériences in vitro permettant d’étudier l’activité des cellules immunitaires sur des cellules tumorales, ces tests ne peuvent reproduire que partiellement la complexité des processus biologiques ayant lieu dans un organisme vivant entier. En effet, la réponse immunitaire contre une tumeur fait intervenir de nombreux mécanismes qui se déroulent selon une chronologie et dans des tissus variés, de l’activation des lymphocytes dans les organes lymphoïdes secondaires à leur déplacement vers la tumeur. Les modèles in vivo restent donc indispensables pour comprendre ces processus dans leur globalité et obtenir des résultats fiables afin de les transposer aux cancers chez l’être humain.
Réduction
Les effets biologiques présentent une variabilité statistique qui doit être impérativement limitée afin de pouvoir conclure de façon fiable à partir de résultats expérimentaux. Ainsi, à partir de valeurs extraites de la littérature scientifique, nous avons calculé à l’aide de tests statistiques le nombre minimal d’animaux nécessaires à la réalisation d’expériences robustes. Nous avons obtenu une taille d’échantillon de 26 animaux par groupe. Ce nombre pourra être réduit au cours du projet, sur la base de la réévaluation de la variabilité des effets biologiques mesurés.
Raffinement
Les animaux sont manipulés à l’aide de leur abri, ou bien dans le creux de la main, de façon à limiter l’anxiété et le stress lors des manipulations, conformément aux recommandations du NC3R. L’analgésie locale préalable à l’injection des cellules tumorales et des cellules immunitaires permet de supprimer la douleur liée à la piqûre. La surveillance accrue lors de la phase de développement tumoral, avec évaluation du bien-être animal à l’aide d’une grille de scoring, permet de prévenir la souffrance des animaux. En cas d’effets indésirables modérés, des mesures de renutrition et réhydratation sont prévues. En cas d’effets indésirables graves, les souris sont euthanasiées. Le transport adapté ainsi que les différentes sources d’enrichissement contribuent à réduire le stress autour de l’irradiation. L’hébergement en conditions SOPF (exempt de pathogène spécifique ou opportuniste) ainsi que les mesures d’asepsie (utilisation d’équipements de protection individuels, portoirs ventilés individuellement) permettent de réduire le risque infectieux transitoire des animaux, le temps que leur système immunitaire se reconstitue. L’irradiation des souris engendre un stress de courte durée, pris en charge par un transport adapté et un enrichissement de l’hébergement, ainsi que des mesures de protection et d’asepsie le temps de la reconstitution du système immunitaire. L’injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse est susceptible de causer ponctuellement une douleur modérée, qui est prévenue par l’administration d’un analgésique.
Choix des espèces
Le modèle d’étude choisi est le modèle murin, dont la physiologie, notamment du point de vue du système immunitaire, permet la transposabilité des résultats pré-cliniques à la médecine humaine. Les souris seront incluses en procédure à partir de l’âge de 7 semaines, à partir duquel leur système immunitaire est considéré comme mature.
Étude de nouveaux traitements de l’alcoolodépendance dans un modèle pertinent de consommation excessive d’alcool et d’addiction à l’alcool.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tous tués à l'issue, pour prélever leurs tissus ou vérifier l'emplacement des canules implantées dans leur crâne, 5 830 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie de trente à soixante minutes pour l'implantation de canules, de lentilles ou l'injection d'un vecteur viral, puis s'auto-administre de l'alcool quinze à trente minutes par jour, cinq jours par semaine, pendant trois à quatre mois. S'y ajoutent jusqu'à douze injections dans l'abdomen et des sessions destinées à mesurer la consommation compulsive, que le porteur reconnaît aversives. Le même porteur présente la cage d'auto-administration d'alcool comme un "enrichissement moteur" et un "enrichissement cognitif", l'appui sur le levier valant apprentissage d'une tâche.
Objectifs
L’alcoolo-dépendance est une maladie chronique et hautement récidivante en dépit des thérapies existantes puisque 70% des patients rechutent après 12 mois de prise en charge (plus de 90% après 4 ans). Les mécanismes neurobiologiques impliqués dans la perte de contrôle sur la consommation d’alcool sont encore mal connus et trop peu de médicaments sont actuellement disponibles pour le traitement de l’alcoolodépendance et des troubles de la consommation d'alcool. Certaines structures cérébrales ont tout de même été identifiés comme étant des acteurs clefs des addictions en général et de l’alcoolo- dépendance en particulier. Dans ce contexte de recherche de nouveaux traitements, nous proposons de réaliser un projet qui permettra d’évaluer l’efficacité d’une dizaine de molécules dans différents aspects de la pathologie des troubles de la consommation d’alcool. Dans un second temps d'étude des bases neurobiologiques nous nous concentrerons sur 5 molécules au maximim. Ces aspects (consommation, motivation, rechute, compulsion, bases neurobiologiques…) seront donc étudiés grâce à la mise en œuvre des différentes procédures qui sont donc complémentaires. Nous allons de plus réaliser ce projet en utilisant des rats, aussi bien mâles que femelles car nous savons que les effets de l'alcool peuvent être différents entre les 2 sexes, mais aussi les effets des médicaments.
Bénéfices attendus
Au cours de ce projet nous nous attendons à identifer certaines molécules avec un réel potentiel dans le traitement des troubles de l'usage d'alcool. Nous pourrons grâce aux différentes procédures comportementales identifier précisemment les différentes dimensions du trouble de l'usage d'alcool (motivation, recherche, rechute...). Ensuite, nous allons clarifier la problématique de l'efficacité des traitement en fonction du sexe. Et enfin, nous identifierons des mécanimes neurobiologiques responsable du trouble de l'usage d'alcool et des mécanismes d'action des molécules efficaces à réduire ce trouble.
Procédures
1- Chirurgies (Implantation de canules, injection de vecteur viral, implantation de lentilles) : 1 seule chirurgie par rat - Durée de la chirurgie : 30 à 60 minutes. 2- Deux prélèvements de sang par rat au maximum sous anesthésie générale : durée de l'intervention : 3 minutes. 3- Auto-administration d'alcool : protocole de 15-30 minutes par jour, 5 jours par semaine pendant 3-4 mois. 4- Injection intra-péritonéales : chaque animal recevra plusieurs injections sur toute la durée des mois d'auto-administration - Maximum de 10-12 injections mais en moyenne 6 injections.
Impact sur les animaux
1- Douleurs au moment de l'injection intrapéritonéale; 2- douleurs post-opératoires prises en charge par un traitement analgésique; 3- perte de poids transitoire potentiel suite aux chirurgie; 4- Risque infectieux au niveau de la plaie situé sur le crâne; 5- Effet aversif lors des sessions d'évaluation de la compulsion.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures pour soit permettre le prélèvement de tissu en post-mortem en vue d'analyses complémentaires sur tissu, soit pour vérifier les sites d'implantation des canules guide ou des lentilles.
Remplacement
Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Les modèles que nous avons choisis font partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature. L'animal dans son entièreté est le seul modèle disponible actuellement pour remplir les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à une analyse statistique correcte pour chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant les mêmes modèles de consommation d'alcool. Nous avons également pris en compte la variabilité inter-individuelle observée dans les différents paradigmes (comportementaux et chirurgicaux) utilisés. Aucun test statistique a priori n’a été utilisé pour déterminer la taille des groupes étant donné que nous ne pouvons pas anticiper la taille de l'effet des molécules que nous allons tester. Dans l’optique d’une réduction du nombre d’animaux utilisés, nous ne sélectionnerons que les molécules qui auront montrés un effet statistiquement significatif sur au moins un des comportements évalués. Nous en prévoyons 5 au maximum mais ce nombre pourra être plus faible et réduira donc d’autant le nombre d’animaux utilisés au total sur le projet. Nous évaluerons donc les effets de nos molécules testées sur les 2 sexes. Puis en fonction des résultats obtenus, effet sur un seul des 2 sexes ou un effet identique sur les deux sexes ou effets différent chez les deux sexes, nous ajusterons le design expérimental nous permettant de réduire potentiellement le nombre total de rats utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans des cages enrichies grâce à un tube en carton et une buchette en bois. Les animaux seront manipulés 5 jours par semaine avec une intensification de l'habituation à la manipulation et un conditionnement positif à ces manipulations durant les jours suivant l'arrivée des animaux au sein de la plateforme, permettant ainsi une forte réduction du stress. Les rats seront placés 5 jours par semaine dans une cage d'auto-administration permettant un enrichissement moteur (appui sur les leviers) et un enrichissement cognitif (apprentissage d'une tâche d'auto-administration nécessitant une planification de l'action). Nous utiliserons la Rat Grimace Scale (RGS) tout au long de ce projet pour l'évaluation du niveau de souffrance/douleur ressentie par les animaux. De plus, nous ajouterons des points de surveillance spécifiques à cet acte, à savoir, aspect de la plaie, suintement, hémorragie, problème de suture jusqu'à la cicatrisation de la plaie avec une prise en charge analgésique adéquate.
Choix des espèces
L’espèce rat est choisie pour ce projet en raison de sa pertinence biologique et comportementale en particulier dans les protocoles d’auto-administration volontaire d’éthanol. De nombreuses données scientifiques validées démontrent que le rat est sensible aux effets renforçants de l’alcool, ce qui en fait une espèce pertinente pour modéliser l’initiation, l’escalade et la perte de contrôle de la consommation. Le rat accepte spontanément de consommer des solutions d’éthanol en accès libre ou en réponse à des contingences opérantes, ce qui permet de reproduire des comportements analogues à l’usage volontaire observé chez l’humain. L'utilisation du rat permet la mise en œuvre de protocoles plus complexes qui sont difficilement réalisables chez la souris en raison de différences comportementales et motivationnelles. L’utilisation du rat constitue le meilleur compromis entre pertinence scientifique, faisabilité technique et respect des principes des 3R. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte pour nous permettre de mimer les troubles de la consommation d'alcool observés chez l'être humain adulte.
Oncologie : Effets de composés chimiques sur le développement de mélanome induit chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour savoir si les crèmes solaires favorisent le mélanome, 150 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes et de sang. Un mélanome leur est induit par application cutanée répétée de tamoxifène, puis les composés à tester sont appliqués sur la peau pendant deux à vingt-quatre semaines, chaque application précédée d'une tonte sous anesthésie. Les souris portent une collerette et passent des périodes en cage individuelle. Le porteur décrit des papules pigmentées apparaissant en trois à quatre semaines, puis des tumeurs de grande taille et des métastases pulmonaires et ganglionnaires, la mise à mort survenant entre le quarantième et le soixante-quinzième jour pour charge tumorale ou ulcération de la peau.
Objectifs
Le mélanome cutané se situe au 8ème rang des cancers chez l'homme et au 6ème rang chez la femme. C'est une tumeur potentiellement agressive surtout lorsqu'elle est prise à un stade tardif et qui peut donner des métastases mettant en jeu le pronostic vital. L'incidence et la mortalité du mélanome ont augmenté régulièrement au cours des dernières décennies. L'induction du stress oxydatif (SO) par les rayons ultraviolets (UV), en particulier les UVA, par divers mécanismes, est un phénomène bien documenté. Des résultats préliminaires révèlent que les filtres solaires, conçus pour bloquer les rayons UV, peuvent induire indépendamment le SO, in vitro et in vivo. De plus, des données démontrent que les crèmes solaires peuvent induire la réticulation de l'ADN génomique et mitochondrial dans la peau de personnes saines. Il est donc crucial de déterminer si les crèmes solaires sont effectivement capables de générer un SO délétère et de favoriser les lésions de l'ADN, et d'étudier si ces lésions entraînent ensuite une augmentation de l'incidence du mélanome primaire et/ou métastatique dans le modèle murin in vivo. Cette étude pourrait faire progresser significativement nos connaissances et redéfinir les paradigmes entourant la formulation des crèmes solaires et leurs implications biologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’explorer les effets de l’application d’une crème solaire sur le développement de mélanomes cutanés. Ce projet permettra de déterminer si les filtres solaires sont capables de générer le stress oxydatif et favoriser les lésions de l’ADN et par conséquent augmenter l’incidence du mélanome primaire et/ou métastatique dans le modèle murin in vivo. Un total de 6 études environ sera réalisé sur la totalité du projet
Procédures
Le mélanome sera induit chez une partie des souris par application quotidienne (5 minutes) de tamoxifène, (sous anesthésie générale, inférieur à 15 min), pendant au maximum 3 jours. Le nombre de lésions sera enregistré 2 fois par semaine et mesurée 3 fois par semaine à partir de leur apparition (5 min). Les molécules test seront administrées par voie topique aux souris pendant 2 à 24 semaines à une fréquence variable. Les animaux seront pesés un minimum de 2 fois par semaine (< 2 minutes). Les applications topiques seront précédées par une tonte réalisée sous anesthésie pour assurer la reproductibilité (acte d’environ 15 minutes). Les animaux porteront des collerettes et seront hébergés individuellement. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie).
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, des lésions sont attendues aux sites induits chez les animaux recevant un anti-estrogène. Les lésions apparaissent généralement d'abord sous la forme de multiples papules fortement pigmentées avec une latence de 21-28 jours. Ces lésions se développent ensuite en tumeurs de grande taille, de sorte que les animaux porteurs de tumeurs sont généralement euthanasiés entre le jour 40 et le jour 75 après l'induction tumorale, en raison de la charge tumorale ou de l'ulcération de la peau sus-jacente. En plus des lésions mélanocytaires étroitement adjacentes qui sont devenues confluentes avec la progression de la maladie, nous pouvons nous attendre à observer une excroissance de tumeur non pigmentée s'étendant sous les parties superficielles pigmentées. Une telle perte de production de pigment a été décrite pour de nombreux autres modèles de mélanome murin et est en effet souvent observée dans les mélanomes et les naevus humains. Des métastases ganglionnaires et pulmonaires peuvent être détectées à partir de 6 semaines après l'induction tumorale. Chez les souris non traitées par l'anti-estrogène, nous pouvons nous attendre à l’apparition de tumeurs cutanées de manière plus tardive, entre 3 et 6 mois d’âge. Le port de la collerette et l’hébergement individuel pendant une heure peuvent induire un stress de désorientation, transitoire.
Devenir
Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des molécules sur la maladie d’intérêt.
Remplacement
Des résultats préliminaires révèlent que les crèmes solaires, conçues pour bloquer les rayons UV, peuvent induire indépendamment le stress oxydatif, in vitro. De plus, des données démontrent que les crèmes solaires peuvent induire la réticulation de l'ADN génomique et mitochondrial dans la peau de personnes saines. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’effet des filtres solaires sur l'incidence du mélanome primaire et/ou métastatique, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types de cellules et/ou tissus sont impliqués. L’impact réel des filtres solaires devra donc être vérifié in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’Homme. De plus, pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’études sur animaux.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon leur poids. Le nombre de groupes dépendra du nombre de conditions à comparer. Le nombre d’animaux par groupe sera adapté à la question scientifique et variera entre 6 et 8 10 par groupe. Le nombre d’animaux par groupe est choisi de sorte qu’il soit possible à l’issu de l’étude de faire des conclusions statistiquement significatives.
Raffinement
L’apparition de lésions cutanées sera enregistrée au moins deux fois par semaine et chaque lésion sera mesurée trois fois par semaine dès son apparition. Pour les études de tolérance, les animaux seront pesés quotidiennement pendant 7 jours puis au minimum 2 fois par semaine voire quotidiennement si nécessaire. Pour toute autre étude, les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine voire quotidiennement si nécessaire. Le poids constituant un point limite sera adapté au modèle. Un gel nutritif et de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de toutes les cages dès un seuil de perte de poids défini sur certains animaux. Les administrations topiques seront réalisées sous anesthésie. Le port d’une collerette avec hébergement individuel sera nécessaire. Une période d’acclimatation au port de la collerette sera réalisée et un enrichissement supplémentaire sera fourni (deuxième élément de nidification et aliment humidifié). Si nécessaire, un nettoyage quotidien des yeux avec une compresse imbibée de sérum physiologique stérile palliera le manque de toilettage imposé par le port de la collerette. Les produits tests seront administrés par voie topique sur la peau du dos des animaux, préalablement tondus sur une surface ne devant pas excéder les limites autorisées. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle et de la procédure sont prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction de la maladie et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). De plus, les modèles de mélanome sont bien documentés chez la souris. Des souris de 4-8 semaines seront utilisées, le modèle de mélanome induit étant bien décrit chez des animaux de cet âge pour observer l’apparition spontanée des lésions cutanées.
Impact des sénothérapeutiques sur la résilience pulmonaire à la ré-irradiation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Irradiées à 20 Gy sur la moitié du thorax, jusqu'à deux fois, 60 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour la moitié d'entre elles, toutes tuées pour prélèvement. Dix gavages et un scanner sous anesthésie complètent le protocole. L'objectif déclaré est de tester si un médicament détruisant les cellules sénescentes rend une seconde radiothérapie thoracique plus supportable chez les patients. Le porteur s'appuie sur la bibliographie pour affirmer qu'une première irradiation de 20 Gy ne tue pas les souris, tout en reconnaissant qu'"aucun recul n'existe" sur la toxicité d'une seconde irradiation de la même zone.
Objectifs
Ces dernières années, les traitements des cancers du thorax (comme ceux du poumon) se sont nettement améliorés. Les patients vivent plus longtemps et les tumeurs sont mieux contrôlées. Cependant, cette meilleure survie s’accompagne parfois d’un nouveau défi : l’apparition d’une récidive, d’une nouvelle tumeur, ou de métastases dans la même zone déjà irradiée. Dans ces cas, une seconde radiothérapie, appelée ré-irradiation, peut être envisagée. Mais cette ré-irradiation n’est pas sans risque : les tissus sains gardent une « mémoire » de la première irradiation et peuvent réagir plus fortement lors de la seconde. Plus le temps entre les deux traitements est long, plus les tissus ont le temps de récupérer. À l’inverse, une seconde irradiation trop rapprochée peut entraîner des complications importantes, notamment au niveau des poumons. Un des mécanismes impliqués dans ces réactions est la sénescence cellulaire : c’est un état où les cellules cessent de se diviser mais restent actives, en libérant des substances qui influencent leur environnement. À petite échelle, ce processus aide à la réparation des tissus, mais lorsqu’il devient trop important, il peut favoriser la fibrose pulmonaire, une cicatrisation excessive qui altère le fonctionnement du poumon. L’objectif de ce projet est de voir si l’on peut éliminer ces cellules sénescentes après une première irradiation afin de mieux préparer les tissus à une éventuelle seconde radiothérapie. Pour cela, les chercheurs testent un médicament, connu pour détruire sélectivement les cellules sénescentes. Cette approche, dite sénothérapeutique, pourrait améliorer la tolérance et l’efficacité des traitements chez les patients devant recevoir une ré-irradiation thoracique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment les radiothérapies provoquent la sénescence des cellules pulmonaires, et quelles en sont les conséquences. Il pourrait également montrer qu’en éliminant ces cellules sénescentes, on peut : 1) Réduire les effets secondaires pulmonaires liés à la radiothérapie, 2) Rendre possible une seconde irradiation du thorax dans de meilleures conditions de sécurité, 3) Permettre des traitements plus efficaces et plus intensifs, tout en protégeant les tissus sains. En somme, ce travail vise à ouvrir la voie à des traitements anticancéreux plus performants et mieux tolérés pour les patients atteints de tumeurs thoraciques.
Procédures
Selon les lots : - Irradiation de la moitié du thorax 20 Gy sous anesthésie (durée 7 min, deux fois maximum) - Gavage quotidien ((durée de la contention 1 min, max 10 fois) - Scanner sous anesthésie (durée 4 min, avant euthanasie)
Impact sur les animaux
D’après la bibliographie, l’irradiation de la moitié du thorax à une dose unique de 20 Gy ne génère pas de mortalité. En revanche, aucun recul n’existe sur la toxicité d’une ré-irradiation de la même zone thoracique à une dose de 20 Gy, qui pourrait générer de la toxicité. Les effets cliniques de l’irradiation au niveau thoracique sont essentiellement des difficultés respiratoires.
Devenir
Tous les prélèvements seront faits post-mortem. Les prélèvements concernent tous les animaux du projet, nécessitant leur euthanasie.
Remplacement
On ne peut vraiment comprendre comment le tissu pulmonaire réagit aux rayonnements ionisants qu’en l’étudiant dans un organisme vivant, où toutes les fonctions biologiques interagissent entre elles
Réduction
Les expériences faites pour étudier les lésions causées par les rayonnements dépendent beaucoup du fonctionnement naturel du corps (la physiologie). Pour que les résultats des tests statistiques soient fiables, il faut utiliser au moins 10 animaux par groupe exposé aux radiations. Cela permet d’obtenir des données suffisamment solides pour tirer des conclusions valables. En revanche, 5 animaux par groupe sont suffisants pour les groupes non irradiés.
Raffinement
Les animaux utilisés pour les expériences sont soignés et hébergés dans des conditions adaptées, afin de réduire au maximum leur souffrance. Ils sont surveillés régulièrement, anesthésiés pendant les irradiations et vivent en groupe dans un environnement enrichi pour leur bien-être.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien connu et très utilisé pour les recherches avant les essais sur l’humain. C’est aussi l’animal de référence dans notre laboratoire. Les études précédentes sur l’irradiation des poumons ont déjà été réalisées sur des souris. Les animaux utilisés auront entre 8 et 22 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte. Nous choisissons des souris adultes car notre recherche porte sur les effets à long terme de la radiothérapie chez les adultes. Les effets chez les enfants (ou jeunes sujets) relèvent d’un autre domaine de recherche.
Recherche de l’efficacité du CBT101 dans le modèle de souris SOD1-G93A de Sclérose Latérale Amyotrophique (ALS)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation qui leur fait développer une sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent deux administrations nasales par jour pendant 98 jours, soit 196 gestes par animal, plus une pesée quotidienne, quatorze prélèvements sanguins sous anesthésie et des tests neuromoteurs répétés. Le porteur indique que la maladie leur fera perdre 20 % de leur poids initial puis les paralysera, la mise à mort intervenant à ce stade. Il écarte le poisson zèbre, pourtant disponible comme modèle de la maladie, au motif que la voie nasale et la durée du traitement ne s'y prêtent pas, et conclut que la souris transgénique est le choix "le plus rationnel".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de rechercher si la molécule étudiée est efficace dans un modèle animal de Sclérose Latérale Amyotrophique, ou maladie de Charcot. La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative des neurones qui permettent aux muscles de fonctionner et qui malheureusement conduit, à terme, au décès du patient. A ce jour, malgré plusieurs médicaments disponibles sur le marché, aucun n’est réellement efficace pour, ne serait-ce que, ralentir la progression de la maladie. Un modèle de souris transgénique est disponible pour étudier la pathologie et tester de nouveaux médicaments. La molécule étudiée est administrée par la voie nasale et va cibler spécifiquement les neurones pour y délivrer une molécule endogène permettant de restaurant l’équilibre énergétique des neurones. L'administration par le nez permet une mise en contact direct avec les neurones (dans un premier temps ceux liés à l'odorat et à la sensibilité de la face puis par diffusion de proches en proches aux autres neurones du cerveau). Cette distribution a déjà été démontré chez la souris et le primate non-humain. De plus, son efficacité a été objectivée dans d’autres modèles précliniques de maladies neurologiques comme une maladie rare appelée le Déficit en Transporteur de la Créatine et la maladie de Parkinson. L’objectif du projet est donc de tester l’efficacité de cette nouvelle molécule donnée par la voie nasale pendant plusieurs semaines chez des souris transgéniques. L'efficacité sera mesurée par des tests de neuropharmacologie ainsi que par la mesure de biomarqueurs principalement dans le sang. Les atteintes neuronales des souris seront aussi étudiées. Cette étude permettra d'orienter les futures études de ce nouveau médicament chez les patients.
Bénéfices attendus
L’étude fait partie d’un projet plus large visant à développer une nouvelle molécule dans des maladies neurologiques. Cette molécule aide à réguler l'énergie des cellules en fournissant de la créatine aux neurones. Elle pourrait avoir de grands bénéfices pour les patients atteints de maladies neurologiques, notamment dégénératives, comme la maladie de Charcot ou SLA. A l’issue de la présente étude pré-clinique courant 2025, et en fonction des résultats, notamment de l'efficacité du produit à l’étude, une étude clinique pourrait être envisagée chez des patients atteints de SLA.
Procédures
Les interventions suivantes seront réalisées sur toutes les souris: - L’administration se fera par voie nasale deux fois par jour du médicament ou du placebo à toutes les souris de l’étude dans la cavité nasale. Ce geste sera réalisé sur animal vigile tous les jours pendant toute la durée de l’étude (soit 98 jours donc réalisé 196 fois) et durera 1 minute. - La pesée quotidienne, réalisée sur animaux vigile, durera 2 minutes. - Le test neuromoteur Neuroscore sera réalisé 2 fois par semaine sur souris vigile et durera 4 minutes. - Le test motricité sera réalisé 5 fois au cours de l’étude sur animal vigile et durera 5 minutes. - Le test de tonus musculaire sera réalisé 5 fois au cours de l’étude sur animal vigile et durera 5 min. - Prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit 14 fois), sous anesthésie générale et durera une minute.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques utilisées sont des souris qui par nature ont un fond génétique qui va les conduire à développer une Sclérose Latérale Amyotrophique murine (Maladie de Charcot chez l’homme). Ainsi, elles verront l’apparition de symptômes neuromusculaires conduisant à la baisse de leur poids qui atteindra 20% de leur poids initial pendant plus de 24 h puis à une paralysie. L’euthanasie de l'animal sera alors réalisée. Un prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine, en sous-mandibulaire, ce qui pourraient engendrer des nuisances, telles que des hématomes et une légère douleur au point de piqure. L'anesthésie, la contention, les tests comportementaux peuvent provoquer un stress léger.
Devenir
Les animaux sont mis à mort car ils sont porteurs d’une maladie génétique qui va conduire à leur mort.
Remplacement
La maladie de Charcot ou Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative extrêmement complexe des motoneurones (les neurones qui partent du cerveau pour régir les activités périphériques, comme la respiration, la déglutition ou la préhension). Les études in vitro ne sont pas représentatives de la complexité de la maladie. C’est d’ailleurs le cas des maladies neurodégénératives pour lesquelles seuls des modèles animaux sont capable d’apporter des informations utiles pour ensuite pouvoir se projeter chez le patient. Parmi les modèle animaux, les modèles de souris génétiquement modifiées sont les plus représentatives de la maladie. Il existe aussi des modèles de poisson zèbre, mais ils sont plus largement utilisés pour étudier la physiopathologie de la maladie. Ce modèle de poisson est moins représentatif pour étudier l’effet d’un médicament qui, comme le nôtre, agit sur la mitochondrie et l’énergie apportée dans les neurones. De plus l’administration nasale de la molécule étudiées est limitante pour utiliser ce modèle. Le choix des souris transgéniques est donc le plus rationnel et le plus efficace pour atteindre l’objectif de tester la molécule administrée par la voie nasale dans un modèle de la Sclérose latérale Amyotrophique.
Réduction
L’étude s’appuie sur la bibliographie déjà existante sur les effets de la créatine dans des modèles de cette maladie et de la distribution efficace de la molécule vers les neurones pour ne concevoir qu’une seule étude, là où il est souvent nécessaire d’en réaliser plusieurs ou alors de plus grande ampleur (avec plusieurs doses par exemple). Ainsi le nombre de bras a été réduit, puisque 1 seule dose sera testée. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum (16 par groupes avec 8 males et 8 femelles par groupe), considérant que les 2 sexes seront étudiés dans cette étude et que les tests neuromoteurs demandent statistiquement plus d’animaux que d’autres type de mesures (comme des études de pharmacocinétique, par exemple).
Raffinement
Les souris seront logées en groupes de quatre dans des cages respectant les normes réglementaires, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal, les souris seront manipulées quotidiennement par les mêmes expérimentateurs. Ces mêmes expérimentateurs feront les administrations de la molécule et les tests comportementaux tout au long du projet. Les expérimentateurs s’assureront quotidiennement du bien-être animal au moment des administrations de la molécule par une surveillance et une pesée. Des points limites seront mis en place. Les mises à mort seront effectuées sous anesthésie profonde. Enfin, pour limiter le stress des animaux lors des tests comportementaux, des phases d’acclimatations dans les différentes enceintes font partie intégrante du protocole.
Choix des espèces
Les souris transgéniques utilisées sont le modèle de référence de la maladie de Charcot ou Sclérose Latérale Amyotrophique. Les souris devront commencer le traitement avant l’arrivée des premiers symptômes autour de 12-14 semaines. Elles arriveront au laboratoire à 6 semaines, après 2 semaines d'acclimatation et d'entrainement elles recevront le traitement à 8 semaines. Il existe un modèle de poisson Zebra Fish (oui poisson zèbre) de la maladie, mais la voie d’administration (voie nasale), la fréquence (quotidienne) et la durée du traitement (plusieurs semaines voire mois) avec la molécule étudiée ne permettent d’utiliser ce modèle. De plus, la recherche de biomarqueurs sanguins et cérébraux ne serait pas possible, limitant une transposition ultérieure chez le patient.
Efficacité et toxicité de candidats médicaments impliqués dans le traitement du cancer [MODIFICATION]
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
15 480 souris vont être utilisées sur trois ans, soit 309 études précliniques de 50 animaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 14 700 d'entre elles et sévère pour 780. Chaque souris peut recevoir une tumeur humaine ou murine implantée sous la peau, subir une castration, des perfusions hebdomadaires par cathéter, des prélèvements vaginaux quotidiens pendant plusieurs semaines, des mesures de température rectale et des séances d'imagerie allant jusqu'à quarante-cinq minutes. 14 280 d'entre elles seront tuées, 1 200 transférées vers un projet de "formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris". Le porteur écrit qu'aucune approche statistique n'a servi à fixer l'effectif total, celui-ci reposant sur le nombre d'études des années précédentes et sur une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments en oncologie. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines ou murines sur des souris immunodéficientes, immunocompétentes ou avec un système immunitaire et/ou un foie humanisé. Différentes stratégies d’implantation des tumeurs pourront être mises en œuvre en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament sur la croissance tumorale mais également d’analyser sa toxicité et l’implication du système immunitaire dans la réponse. Des souris sans tumeurs pourront également être utilisées dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutiques en oncologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la fonctionnalité de candidats médicaments dans des modèles se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'humain.
Procédures
Identification puce électronique : 2 fois maximum si non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. [MODIFICATION] Température rectale : stress transitoire, inconfort ou légère douleur à l’insertion du thermomètre, risque minimal de blessure rectale. Prélèvements sanguins réalisés avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Volumes maximaux de prélèvements proportionnels au poids de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Réhydratation avec sérum physiologique si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlée par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Prélèvements vaginaux pourront être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. Prélèvements d’urines et fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre. Les animaux de lus de 18g recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Durée entre 10 et 15 secondes. Administrations de traitements ou cellules réalisées par injections, répétées selon le protocole, durée de quelques secondes. [MODIFICATION] Les animaux pourront recevoir, sous anesthésie, les traitements sous forme de perfusion de façon hebdomadaire, via la pose transitoire d’un cathéter le temps de l’injection. La perfusion sera réalisée à l’aide d’un appareil spécifique, permettant d’injecter un volume maximal défini sur environ vingt minutes à un faible débit. Certaines procédures nécessiteront des actes chirurgicaux (castration, implantation de fragments de tumeurs et/ou de dispositifs sous-cutanés) réalisés sous anesthésie gazeuse avec analgésie préopératoire et suivi post-opératoire rigoureux. Durée implantation environ 8 minutes, pourra être répétée selon les besoins de l’étude. Durée castration, moins de 10 minutes. Le suivi de la croissance tumorale pourra se à l’aide d’un pied à coulisse pour une durée de quelques secondes et/ou par imagerie pour une durée comprise entre 10 et 45 minutes. À l’issue des études, les animaux devant être euthanasiés le seront selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.
Impact sur les animaux
-Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. -Prélèvements vaginaux : peut engendrer une irritation locale, une inflammation ou un stress temporaire. -Chirurgie : douleur, hémorragie, un défaut du système d’anesthésie / analgésie (ex : la souris se réveille en cours de procédure), un état clinique détérioré au réveil (ex : hypothermie), mauvaise cicatrisation. -Administration de traitements ou de cellules cancéreuses : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) -[MODIFICATION] Perfusion : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. Risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire (ajout de plaques chauffantes et de gel ophtalmique en prévention). - Prélèvements sanguins : anémie, hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire (ajout de gel ophtalmique en prévention). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne voire potentiellement douleur si présence de tumeurs au niveau abdominal. -Prise de température corporelle à l’aide d’une sonde : irritation, inflammation, stress. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions, au développement des tumeurs et des éventuelles métastases. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux en fin d'étude, ayant atteints les points limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire. Ceci ne pourra être envisagé que dans les cas ou des animaux ont subi seulement une partie de la procédure (ex : animaux du groupe contrôle négatif) et ne présentant pas d’altérations résiduelles de leur état de santé.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 15480 souris seront utilisées, couvrant une période de 3 ans et permettant de réaliser 309 études précliniques de 50 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée, pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques. La variabilité de la croissance tumorale dépend fortement du modèle tumoral. Le nombre de souris par groupe est fonction de la variabilité de croissance historique sur un modèle déterminé.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées par groupes sociaux, préférentiellement stables, de 2 à 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant de creuser, se cacher et réaliser un nid. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles pour synchroniser le cycle œstral. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, elles bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée avant intervention chirurgicale ou toute procédure potentiellement douloureuse (par exemple : intervention chirurgicale, implantation de certains dispositifs ou [MODIFICATION] cathéters, manipulations invasives des tissus, injection répétées). Un relais dans l’eau de boisson pourra ensuite être réalisé. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement sous anesthésie sans réveil, suivi d’une euthanasie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Des mesures pour éviter tout stress au moment de l’euthanasie sont prévues. Les points limites sont définis selon l’état général (score clinique), perte de poids ou volume tumoral.
Choix des espèces
90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain, ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente, permet la création de lignées humanisées. De plus, le métabolisme des souris présente des similarités avec celui des humains, ce qui permet de prédire la distribution, biotransformation et élimination d’un médicament. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures d’un point de vue physiologique. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang. Les animaux humanisés avec des cellules modifiées seront inclus à partir de 5 semaines, âge auquel la greffe de cellules dans le sang est la plus efficace.
Evaluation d’un nouveau traitement pour corriger la petite taille chez un modèle de souris d’ostéogenèse imparfaite
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris utilisées portent une ostéogenèse imparfaite, la maladie des os de verre, et s'exposent donc à des fractures spontanées accompagnées de douleurs modérées. 800 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant onze injections et deux radiographies sous anesthésie. Le médicament testé vise à corriger la petite taille associée à la maladie, que les bisphosphonates prescrits aux patients ne traitent pas. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" d'étudier la croissance dans un "organisme entier", et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever leurs organes.
Objectifs
L'ostéogenèse imparfaite, ou « maladie des os de verre », est une maladie génétique rare caractérisée par une fragilité osseuse. Les personnes atteintes se fracturent des os facilement tout au long de leur vie. Cette fragilité osseuse est due à l'anomalie d'une protéine essentielle à la structure des os. Quand cette protéine est défectueuse, les os deviennent plus fragiles et moins résistants aux chocs. Les personnes atteintes sont souvent de plus petite taille que la moyenne, et mesurent entre 92 et 108 cm à l'âge adulte. Les causes de cette petite taille ne sont toutefois pas encore comprises. Pour traiter cette maladie, la plupart des patients reçoivent des médicaments appelés bisphosphonates. Ces médicaments aident à limiter les fractures en réduisant la perte osseuse. Cependant, ils ne favorisent pas la croissance des os ni leur bonne qualité. De plus, environ 20 % des patients ne réagissent pas à ce traitement. Il est donc important de trouver de nouveaux traitements qui favorisent la croissance et la solidité des os. Ce projet vise à tester un nouveau médicament sur des souris atteintes d’ostéogenèse imparfaite, afin de déterminer s’il améliore la croissance des os, en particulier dans la zone responsable de l’allongement des os longs. Parallèlement, l’étude portera sur l’évolution du cartilage dans cette zone afin de mieux comprendre les mécanismes responsables de la petite taille observée chez les personnes atteintes.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont au nombre de deux : - mettre en évidence un traitement permettant de corriger la petite taille observée chez les patients atteints d'ostéogénèse imparfaite - comprendre comment la plaque de croissance est altérée suite à une anomalie de la protéine
Procédures
Contention et injection : 5 secondes, 11 fois/souris. Radiographie : 5 minutes, 2 fois/souris.
Impact sur les animaux
- La contention peut causer un stress léger de courte durée - Injections causent un stress léger et une douleur légère de courte durée - Risque de fractures spontanées avec douleurs modérés dû à la pathologie.
Devenir
Les souris seront mises à mort afin de prélever leurs organes et de les étudier.
Remplacement
La croissance est un phénomène dynamique impliquant plusieurs types cellulaires. Or, à ce jour, aucun modèle in vitro ne permet d'étudier la croissance dans son ensemble. Il est donc impératif d'étudier ce processus au sein d'un organisme entier afin d'étudier les communications entre ces différentes cellules, plutôt que de se limiter à l’étude d’un seul type cellulaire.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats seront analysés avec des tests statistiques.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les radiographies et les injections seront effectuées sous anesthésie générale afin d'éviter tout stress supplémentaire pour l'animal. Des points limites spécifiques ont été définis. Toutefois, tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.
Choix des espèces
La croissance chez la souris est très similaire de celle chez l'homme. Le mécanisme de croissance est un processus dynamique faisant intervenir plusieurs types cellulaires et donc il est indispensable de pouvoir l'étudier dans un organisme entier. Les analyses seront réalisées à deux âges clés : à 5 semaines, correspondant à la fin de l’enfance chez l’être humain, à 11 semaines, correspondant à la fin de l’adolescence et donc à la fin de la croissance. Certaines souris seront étudiées à différents moments de la formation de la plaque de croissance, afin de mieux comprendre son développement et son rôle dans la croissance osseuse.
Une nouvelle voie pour réduire la lipotoxicité hépatique liant les maladies métaboliques du foie et l’athérosclérose dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
Soumises à un régime riche en graisses et en sucre pendant huit à vingt-quatre semaines, injectées avec des particules pour modifier l'expression d'un gène, puis placées jusqu'à onze jours en cage individuelle ou en enceinte à 30 degrés, 784 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. En fin de parcours s'ajoutent des injections de lipoprotéines tous les deux jours pendant deux semaines, avant que toutes soient tuées pour prélever le sang et les organes. Le projet vise à décrire le dialogue entre le foie, le cœur et les vaisseaux dans la stéatose hépatique et l'athérosclérose, et le porteur affirme que ce dialogue ne s'étudie qu'à l'échelle de l'"organisme entier". La composition et la durée exacte du régime restent indéterminées, renvoyées aux résultats d'une étude pilote encore en cours.
Objectifs
Les maladies métaboliques telles que la stéatose hépatique associée à un dysfonctionnement métabolique sont caractérisées par des désordres touchant le métabolisme énergétique, et notamment des lipides. Elles sont fréquemment associées à des complications cardiaques et vasculaires. L’accumulation de lipides dans la paroi des artères est une conséquence fréquente qui peut conduire à des accidents vasculaires comme la crise cardiaque. Elle est associée à d’autres troubles comme l’obésité, le diabète et les dyslipidémies. Ces maladies touchent plusieurs organes et doivent être étudiées de façon globale afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués. Toutefois les mécanismes impliqués dans la communication foie - cœur et contribuant au développement de l’athérosclérose sont peu connus. L’objectif principal de ce projet est de valider la contribution majeure de la voie d’un transporteur et des lipoprotéines dans cette communication et de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement des maladies cardiovasculaires chez les patients atteints de stéatose hépatique associée à un dysfonctionnement métabolique.
Bénéfices attendus
La prévalence mondiale des maladies du foie telle que la stéatose hépatique associée à un dysfonctionnement métabolique (Metabolic dysfunction–Associated Liver Disease, MASLD) associée à l’athérosclérose ne cesse de croitre (38 pourcents) et celle-ci est associée à une augmentation de la mortalité. Ainsi, 65 pourcents des patients diabétiques de type 2 sont atteints de MASLD. Ce projet permettra de mettre en évidence les mécanismes associés au développement de MASLD et de l’athérosclérose et aux troubles métaboliques qui en découlent tels que l’insulino-résistance, et plus particulièrement d’identifier un lipide clé des hépatocytes dans ce processus. Cette étude nous permettra de comprendre l’importance de la dérégulation de l’homéostasie lipidique des hépatocytes dans le développement des maladies cardiométaboliques et d’explorer les dialogues inter-cellulaire et inter-organes. L’ensemble de ces données permettra d’envisager notre transporteur d’intérêt comme une potentielle cible thérapeutique dans le traitement des patients ayant une MASLD et un risque cardiovasculaire élevé.
Procédures
Les animaux impliqués dans ce projet seront injectés avec des particules (moins de 5 minutes) pour exprimer le gène cible. Un maximum de 6 actes est prévu par animal. Seuls 6 actes au total sont réalisés sur animaux anesthésiés (injection des particules, prélèvements sanguins, échographie cardiaque, électrocardiogramme, activité d’enzyme et injection de lipoprotéines), les autres actes étant réalisés sur des animaux vigiles. Après 2 semaines, les souris seront mises en présence d’un régime riche en graisses et en sucre pour une durée de 8-24 semaines. Avant et après régime, sur les souris vigiles nous évaluerons la masse grasse ce qui nécessite une courte contention (moins de 5 min), et elles seront testées par un faible prélèvement de sang sous anesthésie (moins de 5 minutes). A la suite du régime riche en sucres ou en lipides, les souris seront mises à jeun (entre 2 et 15h) et rapidement évaluées sur le plan métabolique. Les conséquences de l’ingestion de sucres ou de lipides seront alors évaluées grâce à de très faibles prélèvements (5 et 6 prélèvements) de sang sur de courtes périodes (respectivement 5 et 6 prélèvements à 2h et 6h par intervention). De même, la sensibilité des souris à l’insuline, afin d’estimer un potentiel diabète, sera réalisé selon la même procédure (2h) et une procédure complémentaire (5 minutes). Afin que les évaluations soient fiables, les animaux seront vigiles et libres de leurs mouvements. De même, les évaluations seront réparties dans le temps afin d’éviter toute fatigue. Le comportement des animaux sera mesuré sur quatre jours grâce à des cages munies de divers capteurs. L’impact de la température sur la prise de poids sera mesuré dans des cages de thermoneutralité à 30 degrés Celsius. Une partie des animaux sera évaluée sur le fonctionnement du cœur par une échographie (15 minutes) et un électrocardiogramme (15 minutes). Ceci sera réalisé sous anesthésie afin de garantir l’immobilité des souris et la qualité des images sans stresser l’animal. Enfin, des lipoprotéines seront injectées tous les 2 jours pendant les 2 dernières semaines (moins de 5 minutes) pour tester leur effet thérapeutique. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet. Les organes seront prélevés post-mortem.
Impact sur les animaux
Les souris seront exposées à des régimes riches en lipides et en sucre pendant plusieurs semaines (24 maximum) pour induire une MASLD et de l’athérosclérose afin de provoquer les désordres métaboliques qui lui sont associée : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, troubles du rythme, troubles du rythme cardiaque…. Ces régimes pourraient induire un inconfort et une difficulté de déplacement dus à la prise de poids développée. L’injection de particule pourrait induire une douleur de courte durée et un risque d’hématome ou d’hémorragie. De plus, les souris seront soumises à un phénotypage métabolique qui inclus un jeûne non-strict de quelques heures ce qui peut engendrer une sensation de faim chez l’animal. Les injections pour le test de sensibilité à l’insuline et l'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose et un le suivi de glycémie (ou lipides) associé avec des prélèvements sanguins de faible volume pourront induire un stress et une douleur légère de courte durée. L'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose ou de lipide pour le test de tolérance aux lipides pourrait induire des microlésions et des irritations. De plus, les sites d’injections et prélèvements peuvent également s’infecter. L’analyse corporelle ainsi que l’hébergement dans les cages métaboliques ou en thermoneutralité peuvent engendrer un stress de courte durée. Le placement de certaines souris en cage individuelle pendant une période de 11 jours pourra causer un stress social. Les anesthésies gazeuses peuvent provoquer un risque léger de dépression respiratoire et de température corporelle. Enfin, la manipulation des animaux peut induire un stress
Devenir
Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins pour répondre à la question (ou aux objectifs) scientifique de ce projet.
Remplacement
Le dialogue inter-organes (coeur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (hépatocytes et macrophages) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires. Ainsi l’impact induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, l’altération du métabolisme lipidique dans un organe peut avoir un écho profond dans des organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués.
Réduction
Le projet impliquera 784 animaux au total. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre d’évaluations à réaliser, et donc le nombre d’animaux requis. La composition et la durée du régime riche en lipides et en sucres utilisé ici sera déterminée par les résultats d’une étude pilote en cours. Cette méthode nous permet ainsi d’assurer avec un faible nombre d’animaux le succès de ce projet et une utilisation rationnée et réduite au strict nécessaire.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel ou à 30 degrés Celsius (thermoneutralité) est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les greffes et les explorations cardiaques seront réalisées sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux. Les animaux seront vérifiés quotidiennement et un suivi régulier du poids sera effectué afin de s'assurer du bien-être des animaux. Pour faciliter l'alimentation, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage en cas de nécessité. Conformément à la réglementation, les actes techniques seront réalisés par du personnel formé et compétent pour respecter le bien-être animal et diminuer leur stress. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
La souris constitue le modèle privilégié pour l’étude des mécanismes impliqués dans la pathophysiologie des maladies métaboliques : la souris est le mammifère le moins évolué qui développe rapidement des maladies métaboliques similaires à l’Homme. L’analyse de l’athérosclérose requiert une modification du métabolisme lipidique et une altération de la communication inter-organes. Nous utiliserons une lignée de souris qui présente un métabolisme lipidique plus proche de ce que l’on peut observer chez l’Homme. Des souris âgées de 8 à 10 semaines, un âge auquel elles sont suffisamment matures pour être injectées avec les particules, seront utilisées. Les régimes riches en lipides et en sucres seront mis en place à l'âge de 10 à 12 semaines, afin que l’expression du transporteur dans les hépatocytes suite à l’injection des particules soit optimale.