Rongeurs

Jusqu'à trois chirurgies par animal et trois heures sur la table d'opération : 720 rats subissent une lésion du cortex moteur, une dissection du nerf vague et, pour une partie d'entre eux, l'implantation d'une électrode et de capteurs de télémétrie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 80 rats et modéré pour 640, tous tués à l'issue pour prélever le cerveau. Chaque animal passe trois tests de motricité, cylindre, stepping et open field, avant et après la lésion, et 160 rats voient leur pression artérielle enregistrée cinq minutes par jour pendant 31 jours. Le porteur retient le rat parce que sa taille et sa stabilité cardiovasculaire donnent des résultats moins variables que chez la souris, ce qui permet selon lui de réduire le nombre d'individus utilisés.

Objectifs

Chaque année en France, environ 150 000 personnes sont victimes d’un traumatisme crânien. 30% d’entre elles sont hospitalisées pour des lésions cérébrales consécutives à un choc. Par sa position anatomique, le cortex moteur est plus exposé aux lésions traumatiques que d’autres régions corticales. Les dommages dans cette région cérébrale vont entrainer des déficits moteurs avec une récupération fonctionnelle limitée. Chez la souris ayant subi une lésion cérébrale traumatique dans le cortex moteur, la transplantation cellulaire est une approche thérapeutique prometteuse. Néanmoins, l’efficacité de la greffe et la survie des neurones greffés nécessitent d’être optimisées. De plus, durant ces 10 dernières années, la stimulation du nerf vague (utilisée depuis plus de 20 ans en tant que traitement non pharmacologique de l’épilepsie chez l’Homme) est également apparue comme une thérapeutique prometteuse pour le traumatisme crânien. La question est donc de savoir, à long terme si une stimulation du nerf vague permet d’améliorer l’efficacité de la thérapie cellulaire dans un modèle de lésion corticale traumatique afin d’envisager une transposition de cette approche chez l’humain. La question à moyen terme est d’évaluer l’impact de stimulation du nerf vague sur la récupération motrice et cérébrale. Après un traumatisme crânien, la surveillance de la pression intracrânienne et artérielle est cruciale pour évaluer l'état neurologique du patient. Ainsi, en mesurant simultanément la pression artérielle et le rythme cardiaque par électrocardiogramme, nous pourrons déterminer si leurs fluctuations pendant la stimulation du nerf vague sont prédictives de la récupération motrice et cérébrale L’objectif de ce projet est donc de tester, chez le rat, les effets de la stimulation du nerf vague sur la lésion corticale traumatique tout en mesurant en continu la pression artérielle, l’activité cardiaque grâce à la télémétrie. Nous mesurerons les fluctuations de ces paramètres ainsi que des différents paramètres cérébraux afin de tester leur implication dans la récupération motrice après une lésion traumatique corticale.

Bénéfices attendus

La comparaison des effets d’une stimulation chronique ou aiguë du nerf vague sur l’inflammation cérébrale et périphérique, ainsi que sur la récupération motrice fonctionnelle et ananatomique et cérébrale permettra à moyen terme la mise au point d’un protocole efficace pour le traitement d’une lésion corticale traumatique. De plus, les paramètres cardiovasculaires évalués par télémétrie après stimulation constitueront, à moyen terme des marqueurs prédictifs précieux, qui pourront être utilisés à des fins de diagnostics précoces et de traitements personnalisés.

Procédures

240 rats subiront une lésion traumatique corticale et une dissection du nerf vague (2 chirurgies, 45 minutes). 80 subiront une lésion traumatique, une dissection du nerf vague (2 chirurgies, 45 minutes) et une implantation de capteurs de télémétrie (1 chirurgie, 1h30) ET DES PRELEVEMENTS SANGUINS, SOUS ANESTHESIE GAZEUSE, AVANT LA CHIRURGIE DE LESION CORTICALE, 24H ET 7 JOURS APRES LA CHIRURGIE (3 PRELEVEMENTS, 5 MINUTES/PRELEVEMENT. 240 rats subiront une lésion traumatique corticale, une dissection du nerf vague et une implantation d'une éléctrode sur le nerf vague gauche (2 chirurgies,1h30) . 80 rats subiront une lésion traumatique corticale, une dissection du nerf vague, une implantation d'une éléctrode sur le nerf vague gauche et une implantation de capteurs de télémétrie (3chirurgie, 3 heures) ET DES PRELEVEMENTS SANGUINS, SOUS ANESTHESIE GAZEUSE, AVANT LA CHIRURGIE DE LESION CORTICALE, 24H ET 7 JOURS APRES LA CHIRURGIE (3 PRELEVEMENTS, 5 MINUTES/PRELEVEMENT). Les 720 rats du projets subiront 3 tests de motricité allant de 3 à 30 minutes, qui seront réalisés sur 2-3 jours. Ils subitont ces tests une fois avant et une fois après la lésion traumatique. 80 rats subiront une stimulation du nerf vague tous les jours minimum durant 3 jours jusqu'à maximum 31 jours. 160 rats subiront un enregistrement de leur fréquence cardiaque et leur pression artérielle pendant 5 minutes, tous les jours, pendant 31 jours.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables seront ceux induits par l’anesthésie générale, la chirurgie crânienne et la chirurgie de placement des électrodes et des capteurs. La chirurgie entraine une douleur modérée, diminuée par l’utilisation d’antalgique. L’anesthésie générale pourra entrainer un inconfort transitoire au réveil et une légère perte de poids ponctuelle. La lésion du cortex moteur entraine potentiellement une légère diminution de la capacité de préhension de la patte antérieure droite. LES PRELEVEMENTS SANGUINS POURRAIENT PROVOQUER UN STRESS DU A LA CONTENTION ET LA MANIPULATION NECESSAIRES AVANT LA MISE SOUS ANESTHESIE GENERALE, LE RISQUE D’HEMATOME EST FAIBLE POUR LES PRELEVEMENTS REALISES AU NIVEAU DE LA VEINE CAUDALE D’autres nuisances pourront également être produites comme durant les tests de motricité où les animaux seront placés seuls dans ces dispositifs, ce qui pourrait générer un léger stress transitoire pendant 30 secondes (pesée) et 10 minutes (test du cylindre, stepping, open field). a stimulation est indolore mais pourrait occasionner une légère gêne. Lors des stimulations du nerf vague et des mesures de télémétrie, les animaux seront isolés pendant la durée de la stimulation (15min) et les mesures télémétriques (5 minutes). Les animaux stimulés de manière chronique s’habitueront au dispositif, le stress devrait donc diminuer au cours des jours d’expérimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par des méthodes réglementaires pour des prélevements notamment de cerveau.

Remplacement

L’objectif du projet est d’analyser dans le temps les effets in vivo (grâce à des mesures de paramètres tels que la pression artérielle, et l’électrocardiogramme par la technique de télémétrie et des analyses comportementales) d’une stimulation du nerf vague après une lésion traumatique du cortex moteur. Ceci ne peut être actuellement modélisé ni in vitro ou ni in silico. De ce fait, cette étude pourra être réalisée uniquement sur l’animal entier et vivant afin de visualiser l’effet bénéfique de cette approche thérapeutique.

Réduction

Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles, en ayant recours à des analyses statistiques, nous avons calculé qu'il est nécessaire d’avoir 20 animaux par lot. Nous avons 36 lots, soit un total de 720 rats. Des lots sont équivalents (même groupe expérimental) avant la mise à mort. On pourra donc regrouper leurs résultats comportementaux, le nombre d’animaux par lot est donc défini par les analyses post-mortem (histologie et biologie moléculaire, 20 animaux par lot). De nombreuses études ont montré un impact du cycle hormonal féminin sur l’activité du nerf vague, donc chaque lot sera constitué de 10 mâles et 10 femelles,or si des analyses préliminaires avec 5 mâles et 5 femelles par lot, ne montrent pas de différence entre les 2 sexes, les lots seront alors réduit à 10 animaux (5 mâles et 5 femelles). De plus, des lots permettront de contrôler l’impact de la répétition du test sur la motivation des animaux. Si avec le lot, pour lesques il y a 10 jours d’écart entre les test comportementaux pré et post-lésion, on n’observe pas d’effet « répétition du test », les autres lots ne seront pas utilisés.

Raffinement

Avant l’expérimentation les animaux seront acclimatés à l’animalerie et à l’expérimentateur afin de réduire le stress le jour de l’expérimentation. L’expérimentateur manipulera les animaux les jours précédant l’expérimentation. Les animaux seront mis habituation dans la pièce avant toute expérience de comportement. Puis, durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou le stress. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe de 2 dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : stick de bois à ronger et tunnel). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et monitoring de la température corporelle et utilisation d’un coussin chauffant. De plus, les chirurgies seront réalisées par des expérimentateurs compétents et expérimentés à la fois pour la lésion Corticale Traumatique, la dissection du nerf vague et l’implantation de l'électrode et des capteurs de télémétrie afin que les gestes soient précis et efficaces permettant une chirurgie dans les meilleures conditions possibles pour l’animal. Un traitement antalgique sera poursuivi pendant 3 jours post-opératoire. Durant toute la procédure, le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière selon une grille de score (évaluation journalière durant les 7 jours post-chirurgie, évaluation hebdomadaire en pré-chirurgie et 7 jours après la chirurgie) qui permet le suivi des points limites gradés, stricts et précis et qui définit également des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention sera pris en charge sans délai.

Choix des espèces

Le rat est le meilleur modèle de rongeurs pour l’implantation d’une électrode de stimulation dans le nerf vague. En effet, la plupart des études de stimulation du nerf vague ont été réalisées chez cette espèce pour des raisons techniques de localisation et d’isolement du nerf vague. De par sa taille et sa stabilité cardiovasculaire plus importante par rapport à la souris, les résultats obtenus varient peu d’un individu à l’autre, ce qui permet de réduire le nombre d’individus à utiliser pour les études statistiques. Des rats mâles et femelles seront utilisés car la lésion corticale traumatique touche aussi bien les hommes que les femmes. De plus, de nombreuses études ont mis en évidence un impact du cycle hormonal féminin sur le fonctionnement du nerf vague, c’est pourquoi il semble important d’étudier et de comparer les 2 sexes.

Évaluer l'efficacité et la tolérance de traitements de la rétine, et former du personnel à des gestes professionnels, ces deux finalités se superposent ici. 1 100 rats vont être utilisés, dont 1 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et sont tués à l'issue pour analyse des yeux. Un œil par animal subit soit le pincement des vaisseaux et des nerfs qui l'irriguent, soit une élévation de sa pression interne, pendant trente à soixante minutes sous anesthésie, puis des injections dans ou autour de l'œil une à deux fois par semaine et des collyres jusqu'à huit fois par jour. Une centaine d'animaux écartés de l'étude pour un défaut de l'œil repéré avant le début des procédures sont réorientés vers d'autres expériences.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est de mettre en place et d’utiliser des modèles expérimentaux afin de mieux comprendre les dommages que peut subir la rétine (la partie de l’œil qui capte la lumière) lorsqu’elle manque temporairement de sang, comme cela peut arriver dans certaines maladies de l’œil. Ce type de problème, appelé ischémie rétinienne, est lié à plusieurs maladies comme le glaucome, la rétinopathie diabétique ou l’occlusion d’une artère de la rétine. Ces maladies peuvent entraîner une perte de vision. Ces modèles, utilisant des rats, permettent de bloquer temporairement le flux sanguin vers la rétine, puis le rétablir. Ces techniques permettent d’observer les réactions de l’œil, comme le stress, l’inflammation et la mort de certaines cellules. Les premières cellules touchées sont celles qui envoient les signaux visuels au cerveau. Ensuite, d’autres types de cellules de la rétine sont affectées selon la durée du manque de sang. Des cellules de soutien dans l’œil réagissent aussi, ce qui aggrave l’inflammation et les dégâts. Ces modèles aident à comprendre les mécanismes en jeu dans les lésions de la rétine. Ils servent aussi à tester des traitements potentiels pour protéger les cellules de l’œil, réduire l’inflammation ou le stress, avant de passer à des essais chez l’humain. En résumé, ce projet fournit des outils précieux pour mieux comprendre comment la rétine est endommagée lors d’un manque de sang, et pour développer de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est de développer des modèles expérimentaux fiables permettant d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements destinés à protéger ou réparer la rétine après une lésion. La recherche médicale évolue rapidement, et il est essentiel de pouvoir tester ces traitements dans des conditions rigoureuses, tout en respectant les principes du bien-être animal. Grâce à ces modèles, il sera possible de simuler des atteintes rétiniennes similaires à celles observées chez l’humain, comme dans le glaucome ou certaines maladies vasculaires de l’œil. Cela permettra d’observer précisément l’effet des traitements sur les cellules de la rétine et de mesurer leur impact à l’aide d’outils non invasifs d’imagerie et d’électrophysiologie par la mesure de l’activité électrique de la rétine. Ces études contribueront à identifier les molécules les plus prometteuses, à ajuster les doses et à mieux comprendre les mécanismes d’action, tout en garantissant une approche éthique et encadrée.

Procédures

Les animaux inclus dans ce projet seront soumis à différentes interventions expérimentales, réparties sur une période de 1 à 4 semaines selon les résultats obtenus avec les traitements testés. Concernant les procédures chirurgicales d’induction de la pathologie, deux méthodes seront utilisées, chacune pratiquée une seule fois sur un œil par animal. La première consiste à pincer les vaisseaux et les nerfs qui vascularisent et innervent l’œil. La seconde consiste à augmenter la pression dans l’œil. Ces procédures, réalisées sous anesthésie générale et locale, durent entre 30 et 60 minutes. Concernant les évaluations, différents examens seront réalisés une fois par semaine comme la mesure de l’activité neuronale de l’œil, l’évaluation anatomique par imagerie optique et biomicroscopie. Les deux premiers examens nécessitant une immobilisation complète de l’animal seront réalisés sous anesthésie générale, et regroupés dans une même session pour limiter le nombre d’anesthésies. Chaque examen dure quelques minutes. L’administrations des traitements se feront par : 1. L’applications de gouttes. Cette procédure nécessite une contention légère, d’une durée d’1 à 2 minutes et réalisée 3 fois par jour avec un maximum de 6 à 8 fois par jour. 2. Les injections sous-cutanées, intramusculaires ou intrapéritonéales. Ces procédures, également très rapides (1 à 2 minutes) sont réalisées sur animal vigile. 3. Injections intra- ou péri-oculaires sont réalisées sous anesthésie locale et générale si nécessaire, à une fréquence de 1 à 2 fois par semaine. Ces procédures durent environ 5 minutes par animal et nécessitent l’utilisation d’un microscope chirurgical. Des prélèvements biologiques seront peut-être nécessaires afin de doser le principe actif ou des marqueurs de la maladie. Pour cela, des prélèvements sanguins ponctuels pourront être réalisés et ne dépassent pas 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables anticipés dans le cadre de ce projet sont considérés comme modérés. L’expérience acquise lors d’études antérieures, ainsi que les données issues de la littérature scientifique, indiquent que les manifestations les plus fréquentes incluent : 1. une rougeur conjonctivale liée à une inflammation locale modérée lors d’injections ou d’administrations, 2. un léger saignement réversible au site d’injection, ou d’incision, 3. un trouble transitoire ou une opacification de la cornée. L’élévation de la pression intraoculaire induite dans ces modèles sera transitoire et réversible, et ne devrait pas générer de douleur manifeste après le réveil de l’animal. Les examens et les administrations nécessitent une contention brève des animaux, pouvant induire un stress ponctuel de quelques minutes. Des mesures spécifiques seront mises en place pour limiter cet impact (habituation, manipulation douce, environnement calme). Certaines procédures, telles que les injections intra ou péri-oculaires ou les examens nécessitant une immobilisation prolongée, seront réalisées sous anesthésie légère, afin de garantir le confort de l’animal. Ces anesthésies peuvent occasionner une gêne transitoire ou un léger saignement, mais ne présentent pas de risque significatif à long terme.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Mais les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure (estimé à environ 10%, hormis ceux exclus pour cause de points limites) pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire. Ces animaux sont des animaux qui sont exclus de l'étude en raison d'un défaut anatomique ou physiologique détecté aux examens de baseline au niveau de l'œil avant le début de l’étude. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie.

Remplacement

L’œil est un organe très complexe, composé de nombreuses parties (cornée, cristallin, rétine…) qui interagissent entre elles et avec le reste du corps. Il subit en permanence des variations mécaniques, chimiques et biologiques qui influencent son fonctionnement et sa réaction aux traitements. Des techniques comme les cultures cellulaires, les organoïdes ou les simulations informatiques existent, mais elles ne peuvent pas reproduire toutes les interactions présentes dans un œil vivant. Par exemple, elles ne simulent pas correctement les effets sur l’ensemble du corps, les variations de pression dans l’œil ou bien les réactions complexes liées à des maladies comme le glaucome. C’est pourquoi les modèles animaux sont ici encore indispensables car ils permettent premièrement de reproduire plus fidèlement les conditions du glaucome. Deuxièmement, de tester l’efficacité et la tolérance de nouveaux traitements dans un organisme vivant. Troisièmement d’étudier les effets à long terme sur la rétine et le nerf optique dans un environnement complet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques, tout en garantissant une analyse statique fiable des résultats. En fonction des résultats, les outils statistiques à notre disposition permettront, le cas échéant, d’ajuster encore à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, plusieurs stratégies complémentaires seront mises en œuvre : Utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie (imagerie rétinienne, etc.), permettant de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, sans nécessité de mise à mort à chaque point d’analyse. Chaque fois que cela est scientifiquement pertinent, les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Afin l'optimisation des protocoles expérimentaux permettra de limiter la variabilité interindividuelle et maximiser la robustesse des résultats.

Raffinement

Un suivi quotidien rigoureux des animaux sera mis en place tout au long des études, afin de détecter précocement tout signe de stress, d’inconfort ou d’effet indésirable lié aux procédures expérimentales. Ce suivi permettra d’intervenir rapidement si nécessaire, dans le respect des points limites prédéfinis, conçus pour être précoces, prédictifs et adaptés à la pathologie étudiée. Ces points limites visent à minimiser toute douleur potentielle et à garantir une prise en charge rapide et éthique. Les animaux seront hébergés en groupe, dans des cages enrichies contenant nourriture et eau en libre accès et à volonté, ainsi que des éléments d’enrichissement environnemental (abris, matériaux à ronger) favorisant leur bien-être psychologique et comportemental. Les examens réalisés pour évaluer la pathologie sont non invasifs et comparables à ceux pratiqués en ophtalmologie humaine ou vétérinaire. Lorsque l’immobilité de l’animal est requise pour garantir la qualité des mesures, une anesthésie légère pourra être administrée, dans le seul but d’assurer le confort de l’animal et de limiter le stress. Ce projet a été soumis à l’évaluation d’un comité d’éthique compétent, et sera étroitement suivi par la structure en charge du bien-être animal au sein de l’établissement. Toutes les procédures seront réalisées par un personnel formé et expérimenté, dans le strict respect des réglementations en vigueur et des principes éthiques de l’expérimentation animale.

Choix des espèces

L'espèce sélectionnée pour ce projet présente des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques largement documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, en particulier dans le contexte des pathologies oculaires telles que le glaucome. Ces espèces sont couramment utilisées dans les modèles expérimentaux validés de glaucome et d’hypertonie oculaire notamment. Leur emploi repose sur une expérience accumulée dans la communauté scientifique, garantissant la reproductibilité des résultats et la comparabilité avec d’autres études précliniques. Les animaux seront des jeunes adultes âgés au minimum de 6 semaines pour les rats correspondant à la maturité de la rétine.

Cinq prises de sang en une semaine sur animal vigile pour l'étude de pharmacocinétique, puis deux injections par semaine pendant quatre semaines pour les animaux traités. 436 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après une greffe de cellules cancéreuses sous la peau. Le porteur teste un anticorps dirigé contre une protéine surexprimée dans le mélanome et le cancer du rein, combiné à des traitements du système immunitaire, et signale que la tumeur peut ulcérer la peau au point de greffe. Il indique avoir déjà obtenu avec cet anticorps une inhibition seulement partielle de la croissance tumorale dans un précédent modèle murin.

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une nouvelle stratégie ciblant une protéine impliquée dans le développement du mélanome et du cancer du rein à cellules claires. Actuellement, les modulateurs du système immunitaire constituent le traitement de référence pour le mélanome et le carcinome à cellules rénales. Toutefois, leur efficacité reste limitée du fait d’une faible proportion de réponses complètes. L’ère actuelle repose donc sur des combinaisons thérapeutiques, pour améliorer les réponses tumorales et la survie. Notre projet s’inscrit clairement dans cette démarche, en explorant de nouvelles combinaisons permettant de renforcer l’efficacité tout en maîtrisant la tolérance. Nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine fortement surexprimée dans les mélanomes et les carcinomes à cellules rénales par rapport au tissu normal, et qui pourrait être une cible thérapeutique intéressante dans la prise en charge de ces cancers. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules immunitaires par notre anticorps permet de moduler leur activité. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes en ciblant le système immunitaire. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la progression du des cancers exprimant fortement cette protéine et d’ouvrir de nouvelles pistes de traitement en combinant notre anticorps et des traitements ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Actuellement, les traitements ciblant le système immunitaire sont recommandés dans la prise en charge du mélanome et du cancer du rein, mais leur efficacité reste limitée. Cette étude permettrait le développement clinique de nouvelles thérapies et ainsi contribuer à améliorer la prise en charge des patients à l’avenir pour le traitement des cancers où la protéine que nous avons identifiée est surexprimée et associée à un mauvais pronostic vital. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements des cancers. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur.

Procédures

Pour l’étude de pharmacocinétique, les animaux recevront une injection unique d’anticorps sur animaux vigiles. Cette injection est réalisée en moins d’une minute. Les animaux subiront 5 prélèvements de sang en une semaine. Chaque prélèvement est réalisé sur animaux vigiles et prend environ une minute à être réalisé. Tous les animaux du projet recevant la greffe de cellules cancéreuses les animaux seront soumis à une injection unique sous la peau de ces dernières. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animal vigile. Tous les animaux subiront un prélèvement de sang terminal sur animal anesthésié . Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisée en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent parfois engendrer une induration ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Dans certains cas la croissance de la tumeur sous cutanée peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée au niveau du site d’implantation des cellules. Un stress physique lors de la manipulation et de la contention nécessaires à l’injection des traitements sont attendus, mais de courte durée.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures pouvant entrainer du stress ou de la douleur sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux seront soumis à une période d’acclimatation de 7 jours à réception ainsi qu’une semaine d’habituation à la contention afin de diminuer le stress lié à cette procédure.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte minimum de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature.

Une amputation de un à deux millimètres de queue au sevrage pour toutes, une injection dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse et trois injections dans l'abdomen en trois jours pour certaines. 1 510 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dont 694 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur cherche à décrire le rôle de deux protéines dans l'organogenèse tardive, sur des embryons observés aux jours 13, 15 et 18 de gestation, ce qui suppose la mise à mort des femelles gestantes. Pour ces 1 510 animaux, la justification de l'effectif tient en deux phrases affirmant que le nombre minimum a été recherché avec des tests statistiques adaptés.

Objectifs

Étudier le développement embryonnaire est un enjeu scientifique majeur tant pour prévenir les pathologies congénitales que pour comprendre les mécanismes physiologiques impliqués dans la différentiation et la construction des tissus biologiques. Les cardiopathies congénitales sont estimées responsables d’environ 35% des morts infantiles, cependant leurs causes précises restent à élucider. Il a été observé que la délétion génétique de deux protéines d’intérêt a pour conséquences des complications cardio-vasculaires chez l'embryon. L’objectif de ce projet est donc de découvrir le rôle essentiel de ces protéines d’intérêt dans le développement de l’embryon afin de mieux comprendre la survenue de maladies congénitales et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans les pathologies adultes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier directement le rôle encore trop peu connu de 2 protéines d’intérêt dans l’organogenèse tardive chez l’embryon de souris et ainsi de nouvelles perspectives dans la compréhension de la survenue des maladies cardiaques congénitales.

Procédures

Certaines souris seront soumises à des injections par intra veineuse sous anesthésie gazeuse (une seule injection de quelques secondes) ainsi qu'à des injections intra péritonéales (une par jour pendant 3 jours). Tous les animaux subiront un prélèvement de queue (1 à 2 mm) lors du sevrage pour génotypage.

Impact sur les animaux

Toutes les souris subiront un prélèvement de biopsie de queue (1-2 mm), pouvant également occasionner une douleur et un stress de courte durée, afin de les génotyper. Certaines souris subiront également une injection en intra péritonéal par jour pendant 3 jours ou une injection retro orbitale sous anesthésie gazeuse pouvant générer du stress ainsi qu’une douleur légère.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyses complémentaires.

Remplacement

L’objet de cette étude est de comprendre l’implication de protéines d’intérêt dans le développement du système cardiovasculaire étant un système physiologique complexe. Par conséquent, les études de culture cellulaire ou d’organoïdes sont insuffisantes pour reproduire la complexité des interactions physiologiques entre nos organes d’intérêt.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les effectifs des groupes ont été élaboré afin d’avoir le nombre minimum d’animaux tout en produisant des résultats scientifiques statistiquement interprétables et pertinents.

Raffinement

Afin de prévenir au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux, les expérimentations se dérouleront avec une surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie et le porteur du projet. Les souris seront hébergées en groupes sociaux avec contrôle de la température ainsi que de l’hydrométrie. Des points limites ont été établis dans ce projet entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.

Choix des espèces

Afin d’appréhender le rôle de protéines d’intérêt dans le développement cardiovasculaire il nous ait essentiel d’avoir un modèle in vivo qui récapitule cette complexité physiologique et dont il est possible de réaliser des manipulations génétiques afin d’isoler l’implication de certains compartiments physiologiques dans notre phénotype. Le modèle murin est aujourd’hui le modèle animal dont le génome et les manipulations génétiques sont les plus accessibles, efficaces et documentés dans la communauté scientifique. C’est donc le modèle le plus adapté à notre étude. Les souris seront étudiées à 13 jours post-fécondation (E13), E15 et E18 étant trois stade couvrant la fin de gestation chez la souris.