Rongeurs
Étude de l’effet des ultrasons sur l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique et l’augmentation de la délivrance de médicaments dans les métastases cérébrales de cancer du sein dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
303 souris femelles immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Une chirurgie de trente minutes leur implante des cellules de cancer du sein humain dans le crâne, puis elles développent des tumeurs cérébrales avec maux de tête, étourdissements et signes neurologiques. Le protocole ajoute des injections intrapéritonéales, la pose d'un cathéter toutes les deux semaines et des séances d'ultrasons destinées à ouvrir la barrière hémato-encéphalique, une surdose pouvant provoquer un œdème cérébral ou une hémorragie. Le porteur rappelle que les traitements actuels ne prolongent la survie des patientes que de quelques mois et vise un essai clinique, ce projet se limitant à valider une combinaison.
Objectifs
Les métastases cérébrales (MCs) du cancer du sein représentent une complication fréquente et sévère chez les patientes atteintes d’un cancer du sein avancé. L’utilisation de nouveaux traitements, tels que les conjugués anticorps-médicaments, a démontré son efficacité dans le traitement des cancers du sein primaires. Cependant, la barrière hémato-encéphalique en limite l’efficacité dans le cas des atteintes cérébrales. Ce projet vise à évaluer l’efficacité de ces conjugués anticorps-médicaments dans le traitement des MCs, en les combinant avec des ultrasons afin d’ouvrir temporairement la barrière hémato-encéphalique. Grâce à cette technique, qui induit la formation de pores dans la barrière, les traitements pourraient ainsi atteindre plus efficacement les cellules cancéreuses localisées dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Le traitement actuel des métastases cérébrales est restreint et permet de prolonger la survie des patientes pour quelques mois seulement. Le frein majeur à l’amélioration des soins reste principalement sur la barrière hémato-encéphalique. Ce projet vise à valider l'efficacité de la combinaison des ultrasons avec les traitements dans le but de poursuivre vers un essai clinique.
Procédures
L’implantation cellulaire par chirurgie sera réalisée une seule fois pendant 30 minutes sur une souris anesthésiée. Les injections intrapéritonéales seront réalisées sur des animaux vigiles : 6 fois lors de la procédure 1, 3 fois lors de la procédure 2 et 2 fois lors de la procédure 3 (2 minutes chacune). La pose d’un cathéter (1 fois toutes les 2 semaines, 5 minutes) et les injections intraveineuses (1 fois toutes les 2 semaines pendant 6 semaines) seront également effectuées sur des animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les animaux développeront des tumeurs intracrâniennes qui peuvent entraîner : - Des maux de tête - Des étourdissements - Des symptômes neurologiques - Une perte de poids liée au cancer Les contentions multiples (pesée, traitement, suivi par imagerie) peuvent générer du stress chez l’animal. Les injections de chimiothérapies peuvent s’accompagner d’effets indésirables tels que : - Nausées, perte d’appétit – fatigue. Très rarement, les injections répétitives de traitements au même point d’injection peuvent engendrer des irritations ou infections locales. Les nuisances et effets indésirables prévus sur les animaux par le protocole ultrasons pourraient être : - Une surdose ultrasonore peut entraîner un risque d’œdème cérébral local ou d’hémorragie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour collecter le cerveau, à des fins d’analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
En amont de ce projet, nous avons réalisé des études in vitro préliminaires pour évaluer les traitements sur nos lignes cellulaires, pour affiner les paramètres des ultrasons, et limiter le nombre d’expériences in vivo. Cependant, la barrière du cerveau et son environnement cérébral ne sont pas reproductibles in vitro à ce jour. Ni la modélisation in silico, ni l’expérimentation in vitro ne permettent de prédire l’efficacité de la délivrance des molécules et l’impact du traitement ultrasonore sur le tissu. Il est donc indispensable d’utiliser des modèles animaux.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons utilisé des guides statistiques et des résultats préalables détaillés dans la littérature. Grâce à ces approches, nous avons déterminé que des groupes expérimentaux composés de 12 animaux permettront d’obtenir des résultats statistiquement corrects qui ne compromettront pas l’interprétation de nos résultats.
Raffinement
L’ensemble des actes effectués chez les animaux seront faits par des personnes formées. Chaque suivi par imagerie sera réalisé sous anesthésie et l’animal sera maintenu sur un tapis chauffant pour assurer son bien-être. Lors des sessions de thérapie, les injections seront réalisées sous anesthésie. Les souris seront hébergées en groupe avec un milieu enrichi. Des points limites seront définis en amont des interventions, ceux-ci auront vocation à limiter et surtout éviter une souffrance animale. Une grille de score basée sur ces points limites sera utilisée.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné la souris pour notre étude, car il a été démontré, par l’utilisation de cellules de cancer du sein, qu’elle était capable de développer la pathologie avec les mêmes manifestations que l’humain. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines. A cet âge, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise de greffes. Les souris sont immunodéficientes car les cellules injectées sont des cellules d’origines humaines ainsi il n’y a pas de rejet de la greffe. Les individus sélectionnés sont exclusivement des femelles. Ce choix résulte du fait que la pathologie touche presque uniquement les femmes.
Étude de la régulation endocrine de la physiologie lors de la malnutrition protéique chez la souris juvénile
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
530 souris juvéniles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont environ 280 qui subissent trente prélèvements de sang, un toutes les six minutes pendant trois heures, après une incision d'un millimètre à la queue. Nourries pendant cinq semaines d'un régime pauvre en protéines qui reproduit la malnutrition infantile, elles sont mesurées chaque semaine sous anesthésie, contentionnées chaque jour pour détecter la puberté, soumises à des frottis vaginaux quotidiens et à un jeûne de six heures. 48 femelles sont opérées des ovaires et d'autres reçoivent un régime qui provoque une hypothyroïdie, avec ralentissement de la croissance et baisse du tonus musculaire. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, y compris les mères, tuées au sevrage de leurs petits parce que leur exposition au régime interdit de les réutiliser.
Objectifs
La malnutrition infantile constitue un problème de santé publique majeur à l’échelle mondiale. Elle entraîne des altérations durables de la croissance, du métabolisme et de la maturation sexuelle. Des études récentes suggèrent que cette réponse à la malnutrition est modulée par le sexe, les garçons étant globalement plus affectés que les filles. De précédentes études ont confirmé ces observations dans un modèle murin : un régime déficitaire en protéines perturbe davantage la croissance et le métabolisme des mâles juvéniles, tandis qu’il retarde significativement la puberté chez les femelles. Ces observations suggèrent l’existence de compromis physiologiques différents entre les mâles et les femelles, coordonnés par des facteurs endocriniens. Plusieurs hormones candidates sont impliquées : les hormones sexuelles, les hormones thyroïdiennes, ainsi qu'un signal provenant du foie, induit en réponse à la restriction protéique. Ce dernier module trois processus clés pendant la période juvénile : la croissance, le métabolisme et la reproduction en fonction du statut nutritionnel. L’objectif général de ce projet est d’explorer comment l’ensemble de ces signaux module la réponse à la malnutrition juvénile, et dans quelle mesure ils participent à la différence de réponse entre les mâles et les femelles. Chaque signal indépendant permettant d’expliquer une partie de cette réponse, l’analyse de tous ces signaux donnera un point de vue global sur le contrôle de l’adaptation à la malnutrition protéique en fonction du sexe. À travers une série de sept procédures combinant approches génétiques, pharmacologiques et chirurgicales, nous chercherons à identifier le rôle causal de ces signaux dans trois processus physiologiques majeurs : croissance, reproduction et métabolisme. Ce projet contribuera à mieux comprendre l'origine de pathologies métaboliques et reproductives, en tenant compte du sexe et de la nutrition.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment différents signaux coordonnent les réponses physiologiques à la malnutrition protéique juvénile, en tenant compte du sexe. Ces connaissances contribueront à améliorer notre compréhension de la physiologie juvénile en contexte de malnutrition et pourraient, à terme, éclairer de nouvelles pistes de prévention ou d’intervention en santé humaine. Notamment, ce projet participe à comprendre les bases de la réponse différente entre le sexe à un même régime alimentaire, et pourrait donc permettre l'adaptation de la prise en charge de la malnutrition au sexe des enfants et individus concernés.
Procédures
530 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 5 semaines. Toutes les souris seront mesurées chaque semaine sous anesthésie générale (3 minutes) puis pesées (< 1 min) entre 21 et 56 jours. Certaines souris subiront des contentions manuelles, tous les jours à partir de 21 jours (< 1 min par contention) pour détecter la puberté. Chez certaines femelles, un frottis vaginal sera réalisé quotidiennement à partir de cette détection et jusqu’à 56 jours (15 sec de contention). Pour étudier les hormones circulant dans le sang, environ 280 souris subiront une unique incision à la queue (1 seconde) puis 30 prélèvements d’une petite goutte de sang toutes les 6 minutes pendant 3 heures (≈ 5 secondes par prélèvement) sur animal vigile dans sa cage. Afin d’étudier l’effet d’une hormone, celle-ci sera injectée en sous-cutanée (10 sec), puis suivie de 3 prélèvements d’une petite goutte de sang à 0, 10 et 30 min. À 56 jours, un prélèvement final de 200 μL de sang sera effectué sous anesthésie générale (3 minutes). Dans les procédures chirurgicales, 48 femelles subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (20 minutes d’intervention), précédée d’une injection d’analgésiques et d’une anesthésie locale (10 sec). La couverture analgésique (par injections) sera maintenue le jour de l’intervention et le lendemain. Environ 320 souris subiront un test permettant d’évaluer la réponse de chaque individu à un sucre (glucose), et seront donc soumises à : 6 heures de jeûne, introduction orale de glucose (10 sec), incision à la queue (1 sec), 7 prélèvements d’une petite goutte de sang et 3 prélèvements supplémentaires de quelques gouttes (durée totale de prélèvement < 10 minutes). 52 souris de 0 à 21 jours et 10 souris adultes en lactation seront nourries avec un régime pauvre en iode et contenant un traitement bloquant la production d’hormone thyroïdienne, induisant un manque d’hormone thyroïdienne.
Impact sur les animaux
Les pesées, mesures et frottis vaginaux hebdomadaires induisent un stress modéré lié à la contention, ainsi qu’un inconfort de courte durée. La caractérisation de la puberté nécessite de manipuler les animaux, ce qui peut occasionner un stress de courte durée. Les prélèvements de petites gouttes de sang à la queue impliquent une incision d’environ 1 mm et un recueil répété des gouttes, provoquant une douleur légère à chaque point temporel. Le jeûne de 6 heures induit un stress modéré. Le gavage est source d’inconfort et peut entraîner un risque de fausse route ou d’irritation oesophagienne. Les injections sous-cutanées peuvent causer une douleur brève au point d’injection. Les chirurgies ovariennes induisent une douleur modérée de moyenne durée au réveil, limitée grâce à la prise en charge. Les hypothyroïdies induites, bien que transitoires, peuvent entraîner un ralentissement de la croissance, une altération du tonus musculaire, de la température corporelle ou du rythme cardiaque. Ces effets sont surveillés et réversibles après sevrage.
Devenir
L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt. Les mères qui auront eu accès à un régime hypothyroïdien pendant la lactation seront mises à mort au sevrage de leurs petits, à cause de leur exposition temporaire au régime qui affecte leur physiologie et ne permet donc pas leur réutilisation.
Remplacement
Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal. De plus, ce projet vise notamment à comprendre des mécanismes systémiques et moléculaires (en utilisant des traitements et modèles génétiques), et ne peut donc pas être réalisée en clinique humaine.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en préservant la robustesse statistique des résultats. Ayant déjà des données solides et reproductibles sur l’effet de la malnutrition protéique chez les juvéniles, la procédure pilote ne comporte qu’un seul groupe, qui sera comparé aux données précédemment acquises. Pour les procédures complètes, le nombre de 14 mâles et 12 femelles a été déterminé à partir d’un calcul statistique. Nos études précédentes nous permettent de déterminer le nombre minimal d'animaux à utiliser pour détecter un changement, notamment sur nos critères d'évaluation de la puberté. Sur le plan statistique, la prise en compte simultanée de plusieurs facteurs (régime alimentaire, sexe, etc.) permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour pouvoir conclure sur le mécanisme biologique impliqué. Afin de limiter le nombre d’animaux à utiliser dans de futures expériences, tous les organes d’intérêt potentiels (muscle, tissu adipeux, etc.) seront prélevés à la fin des procédures et conservés pour d’éventuelles analyses ultérieures.
Raffinement
La procédure expérimentale ne sera initiée que chez des animaux avec un poids suffisant au moment du sevrage. La croissance sera mesurée individuellement chaque semaine. Pour les jeunes récemment sevrés, la nourriture sera placée directement dans la litière afin qu'ils puissent manger facilement. La prise alimentaire sera également suivie pour s’assurer que les animaux mangent. Le régime faible en protéine et le test métabolique sont déjà utilisés au laboratoire et n’induisent pas de souffrance manifeste. L’utilisation d’anesthésie gazeuse permet une induction rapide, un bon contrôle de la profondeur d’anesthésie pendant la chirurgie, et un réveil plus rapide. La température corporelle sera contrôlée pendant et après l’anesthésie. Après chirurgie, les animaux seront placés en cage propre et chauffée. Une grille d’évaluation de leur bien-être permettra d’adapter les doses d'analgésiques individuellement pendant 48 h. Toutes les mesures visent à limiter le stress et la douleur tout en assurant la robustesse scientifique des données. Des points limites précis et prédictifs ont été définis spécifiquement pour ce projet.
Choix des espèces
La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet des régulations endocrines dans une étude nutritionnelle. Les animaux utilisés seront suivis pendant les 5 semaines après le sevrage (procédure commencée à 3 semaines), jusqu’à 8 semaines. L'objectif du projet est d'étudier les effets de différentes hormones sur le métabolisme et la croissance pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé pour les 3 paramètres d'intérêt : la croissance, la puberté, le métabolisme.
Preuve de concept d’une nouvelle thérapie cellulaire dans le choc septique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris utilisées sont immunodéprimées et humanisées entre un et trois jours de vie, pour qu'elles acceptent des cellules immunitaires humaines sans les rejeter. Elles sont 24, dont 16 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes seront tuées. Le protocole leur ligature et perfore le cæcum sous anesthésie pour déclencher un choc septique, dont le porteur indique qu'il conduit à la mort de la souris en vingt-quatre heures, le critère mesuré étant justement la survie en heures. Le projet est présenté comme exploratoire, destiné à produire les données préliminaires nécessaires au calcul d'effectif d'un protocole ultérieur : le bénéfice thérapeutique reste une hypothèse à moyen terme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité pré-clinique de l’injection d’un médicament cellulaire de thérapie innovante sur la modulation du choc septique par le suivi clinique (la survie, en heure, après induction d’un choc septique), et l’analyse histologique et biologique post-mortem des dommages tissulaires. La transplantation repose sur l'utilisation de cellules immunitaires, produites selon des normes médicales. L'idée est que ces cellules aident à controler l'inflammation et à réguler le système himunitaires pendant le choc septique. Le projet nécessite l’utilisation de souris immunodéprimées, humanisées, capables d’accepter ces cellules immunitaires humaines.
Bénéfices attendus
A ce jour, aucun modèle in vitro (2 ou 3 dimensions) ni in silico ne permet de reproduire le choc septique et donc de tester de nouvelles thérapeutiques. Ainsi, le bénéfice attendu à moyen terme de ce projet exploratoire sera de faire la preuve de concept de l'utilisation des cellules immunitaires humaines dans le contexte du choc septique. Ce projet permettra : 1/ De confirmer chez l'animal l'efficacité du produit de thérapie cellulaire. 2/ Développer une étude expérimentale confirmant ce projet exploratoire pour utiliser à terme les cellules immunitaires humaines comme nouveau produit de thérapie cellulaire dans le traitement du choc septique.
Procédures
-Une injection de cellules humaines issues de donneurs sains (injection en 5 secondes) -Un prélèvement sanguin au niveau de la veine caudale entre 8 et 12 semaines de vie pour vérifier la prise de greffe (prélèvement de 5 secondes) -Une anesthésie générale gazeuse associée à l'opération provoquant le choc septique (LCP), d’un prélèvement de sang de faible volume à la veine de la queue , suivi d’une injection intraveineuse de cellules immunitaires humaines ou de sérum physiologique (15 minutes en tout sous anesthésie).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont: 1/La piqûre d'aiguille pour l’injection et le prélèvement qui entraîne une douleur légère de courte durée. 2/L'induction d'un choc septique qui conduit à un stress, ainsi qu'une diminution de l’activité, une perte de poids, et la mort de la souris en 24H.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour confirmer les données cliniques.
Remplacement
Les connaissances sur le mécanisme d'action des cellules thérapeutiques myéloïdes suppressives humaines ont été caractérisées dans un premier temps in vitro. Toutefois, pour proposer ces cellules comme médicament de thérapie innovante chez l'Homme, une étude pré- clinique robuste dans un modèle murin est indispensable. En effet, dans le choc septique (pathologie multi-organes) aucun modèle "in silico" ou "in vitro’ en laboratoire n'est à ce jour disponible pour évaluer l'impact d'une thérapie cellulaire, ainsi le seul modèle validé est le modèle murin.
Réduction
Ce projet étant exploratoire et vise donc à poduire des données préliminaires nécéssaires au calcul du nombre de souris dans un prochain protocole expérimental, le nombre de souris a donc été réduit au minimum à 8 par groupe. Afin d’écarter un éventuel effet sexe, mâles et femelles seront utilisés.
Raffinement
Les souris seront hébergées et expérimentées dans un secteur exempt d'organismes pathogènes et opportunistes spécifiques adapté aux animaux en déficience du système immunitaire (portoir ventilé, cages avec capot et filtre, nourriture irradiée, eau de boisson autoclavée), avec tous les éléments d’enrichissement nécessaires au bien-être et à la nidification (autoclavés). Une prise en charge de la douleur est prévue par administration régulière d’antalgique. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Les points limites sont clairement définis, conduisant à un arbre décisionnel pour l'arrêt anticipé de la souffrance.
Choix des espèces
La souris immunodéprimée est en élevage à l’animalerie centrale. Elle permet l’élaboration d’un modèle humanisé avec développement de cellules sanguines humaines, car cette souris immunodéprimée ne rejette pas les cellules humaines. La ligature perforation du caceum reste à ce jour, la meilleure procédure pour tester in vitro le choc septique. Ainsi l'utilisation d'un modèle murin de NSG humanisé de choc septique permettra de tester l’efficacité de cellules immunitaires humaines comme nouveau produit de thérapie cellulaire. Les souris seront humanisées entre 1 et 3 jours de vie puis un choc septique sera induit chez les souris entre 8 à 12 semaines après vérification de la prise de greffe à partir d'une goutte de sang prélevée au niveau de la veine de la queue de la souris et analyse en cytométrie en flux. Ces critères permettent de garantir une prise de greffe de cellules sanguines humaines dans > 90% des cas, et sont en accord avec la littérature. Le choc septique sera induit chez les souris humanisées âgées entre 8 à 12 semaines de vie.
Exploitation de l’activité des cytokines dans des environnements chimiques tumoraux complexes pour optimiser les immunothérapies dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Cancers
Injectées de cellules tumorales pour 9 704 d'entre elles, puis traitées par une injection quotidienne pendant cinq jours, 9 934 souris vont être utilisées et toutes tuées pour prélever sang et organes. 824 sont anesthésiées deux fois par semaine pendant trente minutes pour un suivi des métastases par imagerie, 3 900 subissent des prélèvements sanguins, et 2 240 reçoivent une seconde injection de cellules tumorales soixante jours après la première. Le porteur écrit avoir écarté tout analgésique parce qu'il pourrait modifier les réponses immunitaires étudiées, et compte sur des points limites pour arrêter les procédures. Toutes les atteintes décrites sont qualifiées de légères et de courte durée, sans que rien n'explique pourquoi 300 souris relèvent d'un niveau de souffrance sévère et 9 634 d'un niveau modéré.
Objectifs
Les cytokines (messagers du système immunitaire) et les thérapies cellulaires ont montré des résultats prometteurs dans le traitement de divers cancers. Cependant, l’efficacité de ces thérapies peut être considérablement influencée par l’environnement chimique extracellulaire (acidité, concentration élevée de certaines molécules, température, …) En effet, l'environnement qui entoure la tumeur est caractérisé par des propriétés chimiques uniques (comme une acidité élevée) qui peuvent avoir un impact sur le fonctionnement des cytokines et des cellules immunitaires. Il a été démontré que l’environnement acide altère l’activité de certaines cytokines et nuit à l’efficacité des thérapies cellulaires. De même, la concentration élevée de certaines molécules dans l’environnement des cellules peuvent moduler la fonction des cellules immunitaires et influencer l’efficacité des immunothérapies. Comprendre comment ces facteurs modulent les messagers du système immunitaire (ou cytokines) et l’activité cellulaire est crucial pour développer des stratégies thérapeutiques plus efficaces. Notre laboratoire se concentre sur l'étude de l'impact de l'environnement chimique extracellulaire sur la fonction de deux cytokines en particulier et sur les thérapies cellulaires. Nous visons à créer de nouvelles variantes de cytokines et de thérapies cellulaires optimisées pour fonctionner dans des microenvironnements spécifiques, caractéristiques des tumeurs, afin d'améliorer leur efficacité thérapeutique. Ainsi, en développant des variantes de cytokines conçues pour fonctionner de manière optimale dans ces microenvironnements spécifiques, nous visons à surmonter les limitations imposées par le microenvironnement tumoral et à améliorer l’efficacité des cytokines et des thérapies cellulaires.
Bénéfices attendus
Cette étude fournira des informations précieuses sur le rôle de l’environnement chimique extracellulaire dans l’efficacité des cytokines et des thérapies cellulaires dans le traitement du cancer. En comprenant d’abord comment les cytokines classiques (normales) sont affectées par le microenvironnement entourant les cellules, nous serons mieux placés pour concevoir et développer des cytokines modifiées qui seront adaptées pour fonctionner de manière optimale dans des microenvironnements spécifiques. Les résultats de cette étude pourraient conduire au développement de nouvelles stratégies visant à améliorer l’efficacité des cytokines et des thérapies cellulaires, bénéficiant ainsi aux patients atteints de cancer. De plus, comprendre l’impact de cet environnement sur la fonction des cellules immunitaires et l’efficacité du traitement contribuera à notre connaissance de l’immunologie tumorale et guidera la conception d’immunothérapies plus efficaces.
Procédures
Après leur arrivée et acclimatation (7 jours), les 9934 souris seront manipulées tous les 2 jours pendant 2 semaines avant le début des procédures pour réduire leur stress et les habituer à la manipulation humaine. Nous évaluerons d'abord la sûreté de nos traitements. Pour cela, 90 souris recevront les traitements à raison d'une injection par jour pendant 5 jours (1 min) puis 1 injection d'indicateur de toxicité sous anesthésie gazeuse (10 min). Ce projet comporte plusieurs parties dont plusieurs étapes sont communes. 9704 souris recevront une injection de cellules tumorales ou métastatiques (1 min). Puis, afin d'étudier les caractéristiques de notre traitement, les 9560 souris recevront ce dernier (ou placebo) par injection à raison d'une injection par jour pendant 5 jours (1 min). Parmi ces animaux, 2240 souris (140 naïfs et 2100 déjà exposées aux cellules tumorales) recevront une nouvelle injection de cellules tumorales 60 jours après la première (1 min). De plus, 824 souris recevront une injection 2 fois par semaine sous anesthésie gazeuse (anesthésie: 30 min) afin de suivre le développement des métastases par imagerie. Des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse seront réalisés sur 3900 souris (3520 prélèvements uniques + 380 prélèvements 1 fois par semaine jusqu'à la fin du protocole, 3 min) En parallèle, l'ensemble de ces souris seront testées pour différents paramètres afin d'évaluer le mode de fonctionnement et l'efficacité de nos traitements. Test 1 : 1820 souris recevront 2 injections de traitement ou placebo à 3 jours d'intervalle (30 sec) Test 2 : 390 souris recevront le traitement ou placebo soit par injection 1 fois par jour pendant 11 jours soit par 1 injection tous les 3 jours jusqu'à la fin de l'expérience (30 sec) Test 3 : 900 souris recevront 2 injections de molécule d'intérêt (ou placebo) à 6 jours d'intervalle et 2700 souris recevront 1 injection de molécule d'intérêt (ou placebo) 2 fois par semaine jusqu'à la fin (30 sec) Test 4 : 50 souris recevront 1 injection d'une molécule permettant d'étudier la tumeur 13 jours après l'injection des cellules (30 sec) Test 5 : 720 souris recevront 1 injection 3 jours avant les traitements puis 2 fois par semaine jusqu'à la fin (30 sec). Test 6 : 160 souris seront irradiées 2 fois à 3h d'intervalle (irradiation: 10 min) puis 13 jours après l'injection des cellules et 1 jour avant le début de nos traitements, 160 animaux recevront 1 injection de cellules immunitaires (1 min)
Impact sur les animaux
Les injections de cellules tumorales entraîneront une douleur et un stress légers de courte durée et conduiront, en fonction du modèle, au développement de tumeurs pouvant entraver la liberté de mouvement des animaux. L'évolution de la pathologie induite (développement tumoral) pourrait causer une perte d'appétit et le cas échéant, une perte de poids. Les thérapeutiques envisagées seront administrées par injection ce qui entraînera une douleur et un stress légers de courte durée mais répétés à chaque administration de traitement. Les prélèvements sanguins seront source de stress pour les animaux lors de la contention et causeront une douleur et un stress légers de courte durée au moment de l'acte qui sera unique ou répété en fonction du modèle étudié.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. En effet, la récupération d’échantillons (sang, organes) est essentielle pour déterminer l’efficacité de nos thérapies.
Remplacement
Dans la mesure du possible, nous menons des études in vitro poussées pour caractériser au mieux l'activité et le profil de sécurité de nos traitements d'intérêt avant de proposer des expériences sur les animaux. Ces études comportent l'évaluation de nos traitements d'intérêt dans différents environnement, leurs effets sur différents types cellulaires et leur absence de toxicité sur les cellules. En tirant parti de ces systèmes utilisant des cellules, nous générons des données précliniques robustes sur les mécanismes d'action, la puissance et les profils de sécurité de nos traitements d'intérêt fournissant ainsi une base scientifique solide pour les études in vivo proposées. Cette approche s'aligne sur le principe de remplacement car nous utilisons avec succès des méthodes sur cellules pour remplacer une partie importante des études sur les animaux qui auraient autrement été nécessaires.
Réduction
Pour chaque test que nous effectuons chez l'animal, nous recueillons un très grand nombre de données et d'informations à travers différents paramètres d'analyse. Cette approche permet d’obtenir un maximum d’informations pour chaque animal réduisant ainsi le nombre total requis d’animaux. Nous avons effectué des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimum de souris requis par groupe pour obtenir des résultats robustes sur la base de nos données in vitro et in vivo déjà obtenues et des études publiées utilisant des modèles similaires. Pour l’analyse de nos données, nous prévoyons d'utiliser des méthodes statistiques appropriées pour analyser les différences entre les groupes de traitement. Nous utiliserons également des modèles statistiques afin de procéder au mieux à l’analyse des résultats obtenus.
Raffinement
Nous nous engageons à affiner nos protocoles et nos pratiques pour maximiser le bien-être des animaux et minimiser la souffrance et la détresse. Nos stratégies de raffinement englobent de multiples aspects du soin des animaux. Avant toute procédure, les animaux seront acclimatés un minimum de 7 jours dans leur zone d’hébergement. De plus, des actes d’habituation seront réalisés par les expérimentateurs afin de familiariser les animaux à la manipulation humaine. Tout acte pouvant entraîner souffrance, détresse ou stress sera réalisé sous anesthésie. Notre équipe examine attentivement le potentiel d'inconfort associé à chaque intervention et prend des mesures pour atténuer ces effets. Cela garantit que les animaux ne subissent pas de douleur ou de détresse inutile. Nous travaillerons également en étroite collaboration avec le personnel de l’établissement utilisateur ainsi que la structure de bien-être animal y étant rattachée afin de minimiser la souffrance et la détresse. Cela implique de maintenir des conditions environnementales appropriées et de fournir un espace et des ressources adéquats. L'enrichissement de l'environnement fera partie intégrante de notre programme de soins aux animaux. Des éléments et des structures d'enrichissement seront fournis pour permettre aux souris de présenter des comportements naturels, améliorant ainsi leur bien-être et favorisant des résultats expérimentaux plus pertinents sur le plan biologique. L’utilisation d’analgésiques a été écartée dans ce protocole car ces derniers pourraient moduler les réponses immunitaires étudiées (effets décrits dans la littérature). Pour cela, des points limites stricts et spécifiques pour chaque procédure ont été déterminés et dès l'apparition de l'un d'entre eux, les animaux seront immédiatement mis à mort afin de limiter tout stress ou souffrance.
Choix des espèces
Nous nous sommes concentrés sur le modèle murin qui a l’avantage de présenter des similitudes avec le modèle humain et pour lequel nous disposons d’un large panel d’outils moléculaires pour son étude. Le modèle murin est un modèle de choix pour l’étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. De plus, il s’agit du modèle le plus utilisé dans la communauté scientifique permettant ainsi les échanges internationaux des résultats. Les données disponibles dans la littérature faisant référence aux modèles de cancers que nous utilisons impliquent l'utilisation de souris âgées de 6 à 8 semaines d'âge. De plus, ces modèles sont bien établis au laboratoire, nous souhaitons donc garder les mêmes conditions expérimentales.
Etablissement d’une collection de PDX de sarcomes des tissus mous chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 200 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit un fragment de tumeur prélevé sur un patient atteint de sarcome, greffé sous la peau ou dans le muscle, et développe une tumeur jusqu'à 1 000 ou 2 000 mm3 selon le site avant d'être tuée. Le porteur mentionne des risques de nécrose, d'ulcération, d'anémie et de difficultés respiratoires liées à d'éventuelles métastases pulmonaires, et justifie l'effectif par une seule phrase, deux souris par tumeur. Il décrit la xénogreffe comme "indispensable" et comme un "vrai réplicat" phénotypique et génétique de la tumeur du patient.
Objectifs
Les sarcomes des tissus mous sont des tumeurs rares très complexes et hétérogènes (plus de 70 sous-types différents) qui touchent environ 4000 personnes par an en France. Malgré une chirurgie bien conduite suivie de traitements par chimiothérapies ou radiothérapies, plus de 40 pourcent des patients développent des métastases. A ce stade métastatique, peu de médicaments sont efficaces et les progrès depuis les 20 dernières années sont faibles avec une survie globale qui est passée de 12 à 18 mois seulement. Il existe donc dans cette pathologie un réel besoin de nouvelles thérapies permettant de cibler les metastases afin d’améliorer significativement les chances de survie des patients. Notre équipe est localisée dans un centre de référence dans le traitement de ce cancer rare, ce qui nous offre la possibilité d'obtenir des tumeurs de patients. L'objectif de ce projet est de mettre en place une banque de PDOX (patient-derived orthotopic xenograft) et PDX (patient-derived xenograft) à partir de tissus tumoraux frais de patients atteints de sarcomes. Cela consiste à implanter un fragment tumoral du patient, généralement une biopsie, directement dans la souris soit sous la peau (PDX), soit dans le muscle (PDOX) quand la tumeur d'origine est musculaire. Ces nouveaux modèles nous permettront de tester des médicaments et des combinaisons de médicaments pour lesquels nous avons des données bibliographiques dans d'autres types de cancer et ainsi d'offrir aux patients atteints de sarcomes de nouvelles perspectives de traitements.
Bénéfices attendus
L’établissement de greffes de tumeurs issues directement du patient (PDX) présente plusieurs avantages par rapport aux greffes de lignées cellulaires. Ces modèles PDX sont plus proches de la morphologie originale de la tumeur et conservent une certaine hétérogénéité. De plus, ils gardent les caractéristiques génétiques du patient d'origine, ils sont donc à priori de meilleurs modèles précliniques que les modèles de greffes classiques. Les tumeurs de patients peuvent etre implantées soit sous la peau des souris, soit en orthotopique quand cela est possible, c'est à dire à son emplacement d'origine, ici le muscle. Cette méthode a démontré une très grande concordance clinique avec la réponse aux traitements des patients ou avec le degré d'agressivité tumoral en favorisant l'apparition éventuelle de tumeurs secondaires (métastases). Ces modèles permettront donc de mieux comprendre la biologie des sarcomes, de tester de nouvelles thérapies ou combinaison de thérapies ou encore d'explorer les mécanismes de résistance aux médicaments souvent observés chez les patients.
Procédures
Greffe de tumeurs humaines en intramusculaire ou en sous-cutané (1 fois par souris, 2 min par souris pour les implantation en sous-cutanée et 5 à 10 min pour les implantations en intramusculaire)
Impact sur les animaux
Les procédures d'implantation de fragments de tumeur en sous-cutané ou en intramusculaire peuvent provoquer un inconfort léger et diminuer la mobilité des souris (intramusculaire). Les implantations en sous-cutanée ont également un risque de nécrose et/ou ulcération et donc d'anémie. Des difficultés respiratoires dues à d’éventuelles métastases pulmonaires peuvent également survenir. Le developpement des tumeurs peut entrainer des changements métaboliques associés notamment à une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort quand les tumeurs atteignent 1000 mm3 pour les implantations intramusculaires, 2000 mm3 pour les implantations sous-cutanées ou lorsqu'un point limite est atteint.
Remplacement
Dans le cadre d’études précliniques visant à démontrer l’efficacité d’une molécule en monothérapie ou en combinaison, avec l’idée de construire un rationnel solide pour des études cliniques de phase précoce, la réalisation de modèle de xénogreffe à partir de tumeur de patient est indispensable. Ce modèle est celui qui préserve le plus les caractéristiques de la tumeur du patient, c’est un vrai « réplicat » phénotypique, génétique, génomique et biochimique de la tumeur d’origine. De plus, l’oncogenèse et plus particulièrement l’apparition de métastases sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel avant de pouvoir réaliser les essais chez l'homme.
Réduction
le nombre de souris est limité au maximum (2 souris par tumeur pour l’établissement du modèle)
Raffinement
Toutes les expérimentations sont réalisées par du personnel qualifié, les animaux sont surveillés par le personnel de l'animalerie quotidiennement et sont hébergés dans des cages comprenant une nourriture adaptée et enrichies par plateformes, cabanes rouges et du coton de nidification. Lors des différentes procédures, les animaux sont sous anesthésie générale et des analgésiques (anti-douleur) sont donnés pour éviter toutes souffrances. Une liste de points limites stricts et spécifiques à ce projet est établi afin de respecter le bien-etre animal.
Choix des espèces
Les xénogreffes à partir de tumeur de patient ne peuvent se faire que sur des modèles d’animaux immunodéprimés. Les souris utilisées sont des modèles très immunodéprimés particulièrement adaptés à l’implantation de cellules tumorales. Les souris sont hébergées dans des cages identifiées par un étiquetage spécifique, et la nourriture et boissons sont données à volonté. Animaux âgés de 8-10 semaines (jeunes adultes) pour qu’ils puissent supporter la greffe et le développement de la tumeur. Les sarcomes n'etant pas associés au sexe des patients, des souris des 2 sexes seront utilisées.
Comparaison de la physiologie cardiaque et vasculaire in vivo, sur organes isolés in vitro et sur tissus entre des rats jeunes et âgés.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
L'apprentissage de l'échographie par quatre chercheurs du laboratoire passe par 30 rats, jeunes mâles, jeunes femelles et mâles réformés d'un an et demi. Utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, ils seront tous tués pour prélèvement d'organes. Chacun est anesthésié la veille pour être rasé, puis anesthésié de nouveau, dépilé à la crème et échographié quarante minutes, deux fois à quinze jours d'intervalle, avec deux mesures de dépense énergétique de repos de même durée. Le porteur écrit qu'il ne peut pas se passer d'animaux vivants pour maîtriser la technique.
Objectifs
Une partie importante de nos travaux de recherche est en relation avec la fonction cardiovasculaire et pour étendre nos moyens d’investigation dans ce domaine, notre laboratoire a acquis récemment un échographe petit animal. 4 chercheurs du laboratoire ont participé aux formations et testé deux sondes différentes sur des rattes de 17 mois dans le cadre d’une précédente demande d’autorisation de projet. Nous avons pu remarquer que chez des rats âgés la mesure est parfois plus complexe car les tissus, comme le tissu adipeux par exemple, apparaissent en blanc et complexifient la qualité des images. Avec ce nouveau projet, nous aimerions continuer à nous former à la technique en comparant nos données précédentes avec des données sur des animaux plus jeunes (mâles et femelles de 11 à 14 semaines) mais également sur des rats mâles âgés (1 an et demi environ et réformés). La mesure de dépense énergétique de repos peut servir de biomarqueur d’activité et nous souhaitons également la réaliser sur des animaux des deux sexes à différents âges.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à 4 membres du laboratoire de réaliser une étude physiologique complète en maîtrisant l’échographie et le fonctionnement cardiovasculaire entre rats jeunes et âgés. A court terme, cette technique non invasive pourra être mise en œuvre dans les nombreux protocoles expérimentaux utilisés pour nos études précliniques visant à développer des programmes de prévention des pathologies cardiovasculaires par l’activité physique et/ou la nutrition, ou pour la prévention des accidents de décompression. A plus long terme, ces connaissances pourront ensuite être transférées à l’humain dans le cadre d’études cliniques utilisant aussi l’échographie.
Procédures
Chaque rat(e) sera anesthésié pour pouvoir raser les poils des zones d’intérêt la veille de l’échographie. Avant la session d’échographie qui dure 40 min, l’animal est anesthésié et maintenu au chaud grâce à un tapis chauffant. Il sera dépilé à la crème dépilatoire (durée 5 minutes environ). Cette séance est réalisée 2 fois sur le même animal, espacée de deux semaines. La mesure de Dépense énergétique de repos dure 40 min et est réalisée 2 fois espacée de deux semaines.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur tous les animaux sont : - le stress lié à la contention lors de l’induction de l’anesthésie : durée 2 minutes de gravité légère. - le stress lié directement au temps d’endormissement à l’anesthésie : durée 4 min d’intensité légère. - le stress lié à la mesure de la dépense énergétique de repos : acte de gravité légère, durée maximale de 40 minutes.
Devenir
Les 30 animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes
Remplacement
Pour maîtriser la technique d'échographie « petit animal », il est nécessaire de s'entraîner sur notre animal anesthésié et nous ne pouvons pas nous passer de l’utilisation d’animaux vivants.
Réduction
Un nombre de 10 rats par groupe (jeune mâle, jeune femelle, vieux mâles) nous permet de réitérer les gestes techniques régulièrement avec 2 sessions sur le même rat, espacées chacune de deux semaines à la fois sur l’échographie et la mesure de la dépense énergétique de repos. ce nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en assurant une robustesse statistique des effectifs. Nous prendrons contact avec notre notre structure chargée du bien-être des animaux pour utiliser des animaux reproducteurs-reproductrices réformés, issus d’un projet hors-champ réglementaire, et qui sont prévus pour une mise à mort.
Raffinement
Tous les actes liés à l’échographie réalisés pendant la procédure se font sous anesthésie. Les animaux sont placés sur tapis chauffant pour éviter la chute de température pendant la procédure mais aussi jusqu’au réveil des animaux concernés. Un gel ophtalmique est déposé dans les yeux pendant l’anesthésie pour éviter le dessèchement de l’œil. Nous procédons à une phase d’habituation progressive dans l’enceinte hermétique 3 jours avant la mesure de la dépense énergétique. Nous allons récompenser les animaux par des friandises (pomme ou biscuit sec en fonction des préférences) après la séance de mesure de la dépense énergétique et à leur réveil après la séance d’échographie pour l’associer à un stimulus agréable, en plus de caresser la tête du rat le temps de son réveil effectif. Des points limites prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.
Choix des espèces
Le rat est un modèle préclinique que nous utilisons au laboratoire et sur lequel nous souhaitons maîtriser les explorations cardiovasculaires non invasives par échographie. Nous souhaitons comparer l’échographie cardiaque des rats mâles et femelles à différents âges. Les rats jeunes ont entre 10 à 14 semaines et les rats mâles âgés de plus de 12 mois.
Etude des dynamiques des populations myéloïdes lors de la réponse inflammatoire à E. coli et S. aureus
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une injection de bactéries tuées par la chaleur, puis un prélèvement de sang à quinze minutes, un autre à vingt-quatre heures, un autre à quarante-huit heures, jusqu'à cinq en dix jours, chacun sur souris vigile maintenue à la main. 2 496 souris passent par là, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, l'autre moitié un niveau modéré. Le porteur souligne comme raffinement qu'aucun pathogène vivant ne sera injecté, ce qui n'empêche pas une perte de poids liée à la réponse immunitaire déclenchée. Elles sont tuées en fin de procédure pour prélever moelle osseuse, sang et rate.
Objectifs
Staphylococcus aureus (staphylocoque doré) et Escherichia coli (E. coli) sont deux bactéries opportunistes pathogènes, parmi les plus fréquemment isolées à partir de prélèvements sanguins et d’infections invasives. C’est en raison de leur forte présence chez les patients à l’hôpital que ce projet de recherche s’intéresse à la réponse immunitaire induite par ces deux pathogènes. Malgré les avancées récentes dans la compréhension des mécanismes de réponse de l’hôte aux pathogènes, plusieurs aspects restent à élucider. Cela inclut notamment l’origine des cellules immunitaires retrouvées dans la circulation sanguine, leur processus de sortie de la moelle osseuse, ainsi que leur devenir dans les organes (multiplication, fonctions immunitaires). Dans le cadre de ce projet, nous avons identifié des marqueurs cellulaires exprimés par certaines sous-populations immunitaires de la moelle, potentiellement impliquées dans la réponse de l’hôte. L’expression de ces marqueurs semble modulée en fonction du type de pathogène rencontré. L’objectif de ce projet est donc de valider ces observations, initialement réalisées sur des cellules immunitaires dérivées de la moelle osseuse de souris, et de mieux comprendre comment ces cellules adaptent leur survie et l’expression de marqueurs de leur origine en réponse à des éléments bactériens.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes mis en œuvre par l’organisme en réponse à deux pathogènes impliqués dans la majorité des infections sanguines observées chez les patients à l’hôpital. Le modèle murin permet d’étudier de manière précise, dans différents niveaux du système immunitaire (moelle osseuse, sang, rate), les différences de réponse, tant au niveau cellulaire que moléculaire. Cela offre la possibilité de mieux comprendre la dynamique des réactions immunitaires et de mettre en évidence de nouveaux outils diagnostiques applicables en milieu clinique. Face à l’augmentation des infections causées par des bactéries multirésistantes, il est essentiel de pouvoir caractériser les étapes de l’infection et de la réponse immunitaire pour adapter rapidement la prise en charge du patient.
Procédures
Nous injecterons les bactéries inactivées ou les éléments bactériens mimant une infection en une seule injection par animal, d'une durée inférieure à 30 secondes. Des prélèvements sanguins de 50 microlitres seront réalisés chez les souris vigiles à 15 minutes, 24 heures, 48 heures, 7 jours, et jusqu’à un maximum de 10 jours après l’injection. Chaque animal fera l’objet d’au maximum cinq prélèvements, chacun d’une durée de 1 minute.
Impact sur les animaux
Les animaux seront au cours de ce projet, injectés en intraveineuse ou en intra-péritonéale afin d’introduire les bactéries inactivées ou les motifs bactériens pouvant entrainer une douleur de courte durée et un stress dû à la contention. Les prélèvements réalisés pourront également induire un stress court lié à la contention ainsi qu’une douleur légère due au prélèvement. Nous utiliserons des doses de bactéries inactivées ou les motifs bactériens non léthales qui pourront induire une perte transitoire de poids induite par l’initiation d’une réponse immunitaire.
Devenir
Mise à mort des animaux ayant été infectés en fin de procédure.
Remplacement
Les expérimentations menées précédemment nous ont permis de mettre en évidence de nouveaux mécanismes impliqués dans la survie des cellules et leur adaptation à la présence de pathogènes ou de composants bactériens. Dans une démarche de remplacement, des travaux d’exposition de cellules immunitaires en culture à des motifs mimant la présence de bactéries ont été réalisés. Ces expérimentations ont permis de mettre en évidence l’évolution de marqueurs exprimés à la surface des cellules, essentiels à leur survie. Ces résultats nous ont également permis d’établir l’existence de différences de sensibilité selon les types de cellules immunitaires, en fonction des motifs bactériens rencontrés. Cependant, ces modèles présentent d’importantes limites, notamment en ce qui concerne la reproduction des interactions complexes entre les organes et les multiples types cellulaires.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d'animaux aussi restreint que possible, déterminé à l'aide de tests statistiques appropriés. Toutefois, si des résultats significatifs étaient obtenus avant d’atteindre l’effectif initialement prévu, la procédure concernée serait arrêtée. Nous nous limiterons au nombre d’animaux minimum nécessaire pour atteindre un seuil de significativité statistique.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, aucun pathogène vivant ne sera injecté aux animaux. Seules des bactéries inactivées par la chaleur ou des éléments de ces dernières bactériens, ce qui permet de reproduire les principales étapes de la réponse immunitaire de l’hôte sans induire de maladie. Les injections seront réalisées par voie intrapéritonéale, afin de limiter autant que possible le temps de contention et le stress généré chez les animaux. Après chaque injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pour détecter l’éventuelle apparition de symptômes tels que la prostration, la léthargie, le dos courbé ou l’isolement, considérés comme des points limites. Les animaux seront également pesés chaque jour après l’injection afin d’identifier toute perte de poids excessive pouvant également constituer un point limite.
Choix des espèces
Le modèle murin est largement décrit comme un modèle de référence pour l’étude de la réponse immunitaire. Les systèmes de défense contre les pathogènes sont en effet très conservés chez les mammifères, et les réponses immunitaires de l’hôte vis-à-vis des agents pathogènes sont très similaires entre la souris et l’Homme. Dans ce projet, nous utiliserons des souris âgées de 6 à 8 semaines, conformément aux conditions expérimentales de nos travaux antérieurs. En effet, à cet âge, nous avons observé une stabilisation des populations de cellules immunitaires dans les différents tissus étudiés. Cette stabilité nous permettra d’obtenir des résultats aussi reproductibles que possible. Nous aurons recours à des lignées de souris exprimant des rapporteurs fluorescents, permettant un suivi précis des réponses des cellules immunitaires à la présence de pathogènes ou de leurs composants. Enfin, des souris mâles et femelles seront incluses dans les expérimentations, afin d’optimiser l’utilisation des animaux et d’assurer une homogénéité avec les données obtenues lors des précédents travaux menés dans le laboratoire.
Etudes de pharmacocinétique et pharmacodynamique chez la femelle gestante, études de toxicologie du développement et de la reproduction et de toxicologiment et de la reproduction et de toxicologie juvénile chez le rongeur (rat et souris) non mutants
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 79972
109 100 rongeurs, 79 972 rats et 29 128 souris, vont être utilisés pour 149 études de toxicité de la reproduction et du développement, tous tués à l'issue. 10 463 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les autres un niveau léger. Certains portent en permanence un cathéter avec harnais ou bouton d'accès vasculaire et restent branchés à un système de perfusion, d'autres passent des évaluations neurocomportementales dans l'obscurité, et les femelles gestantes sont ouvertes par césarienne pour examen des fœtus. Le porteur indique que ces études sont exigées par les lignes directrices internationales avant tout essai clinique et qu'elles rendent ces essais plus sûrs pour les personnes qui y participent, bénéfice qui suppose la mort de 109 100 rats et souris.
Objectifs
L’objectif de ce projet est la réalisation des études réglementaires de toxicologie de la reproduction ou du développement, toxicologie juvenile et des études préliminaires (recherche de dose, dose maximale tolérée, étude de pharmacocinétique, pharmacologie et pharmacodynamique) chez le rongeur (rat et souris) non mutant (149 études envisagées au cours de ce projet). Ces études consistent en l’administration/exposition/mise en contact unique ou répétée du produit à tester (futur médicament, produit chimique, dispositif médical) suivie d’observations régulières des animaux, pesées corporelle, suivi de la consommation alimentaire et hydrique, évaluation des effets sur les paramètres sanguins ou urinaires, sur la fertilité, le développement embryo-fetal, pré- et post-natal, neurocomportemental, squelettique et analyse macroscopique ou histopathologique, évaluation de la pharmacocinétique et pharmacodynamique du produit. Ces études permettront d’accéder aux essais cliniques afin de confirmer la sécurité et l’efficacité du produit chez l’Homme avant sa mise sur le marché ou d’obtenir l’autorisation de mise sur le marché (produits chimiques, dispositif médical).
Bénéfices attendus
Les études de toxicologie de la reproduction et les études de toxicologie juvéniles sont réglementairement requises par les lignes directrices Européennes et Internationales et représentent une étape essentielle avant de réaliser des essais cliniques sur un médicament humain ( sur des hommes et femmes en âge de procréer et des enfants), ou pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (dispositifs médicaux, médicament vétérinaire, produit chimique). Ils visent à définir le profil de toxicité ou de tolérabilité des produits à tester et donc rendre les essais cliniques plus sures pour les patients participant à l'essai. Les études de toxicologie de la reproduction permettent d’assurer la sécurité des hommes et femmes en âge de procréer, femmes enceintes ou allaitantes avant de démarrer les essais cliniques (médicaments) ou pour caractériser le risque associé à l’exposition de l’Homme à des produits chimiques (notamment pour les travailleurs) . Notamment vérifier que le produit testé n’altère pas la fertilité, la grossesse et le développement de l’enfant à naitre.
Procédures
Ces études consistent en administration/exposition/mise en contact unique ou répétée du produit ou dispositif médical à tester. La fréquence de ces administrations varie en fonction du produit. La durée des administrations est généralement rapide quelques secondes à quelques minutes. Elles peuvent parfois être plus longues. Les administrations sont suivies d’observations régulières des animaux, de pesées corporelles, d’évaluation des effets sur les paramètres sanguins ou urinaires ou sur le développement neurocomportemental, physique et des fonctions reproductives.
Impact sur les animaux
Tous les animaux n’ont pas toutes les nuisances : Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, en procédures d’administration, de prélèvement de sang, de tests de maturation sexuelle et/ou frottis vaginaux. Dans le cas d’administration intraveineuse lente, la procédure d’administration peut être plus longue avec placement de l’animal en tube à contention. Stress lors de changement d’environnement, confrontation à une situation inconnue et modification des conditions de luminosité (obscurité partielle ou totale avec utilisation possible d’une lumière rouge) et de température lors d’évaluations neurocomportementales. Anesthésie de quelques minutes et réveil d’anesthésie lors des prélèvements de sang réalisés sous anesthésie Anesthésie et douleur légère en post-opératoire pour la pose des cathéters Port de harnais ou d’un bouton d’accès vasculaire pour les animaux implantés avec un cathéter en permanence depuis la chirurgie jusqu’à la fin de période de traitement Connection à un systéme de perfusion (téther) pour les animaux avec cathéter lors des phases de perfusion Mise à jeun, placement en cage à diurèse et absence d’accès à l’eau lors des collectes d’urines (durée de 6h à 16h maximum) Stress lié à l’hébergement individuel pour les souris males (au maximum 12 mois), les animaux implantés avec un cathéter de perfusion et études avec application dermale (au maximum 12 mois) Effets toxicologiques/pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration des médicaments ou produits chimiques à tester. Des points limites précoces adaptés sont mis en place selon la typologie d’etude et la classe du produit à tester afin d’eviter une prolongation des effets observés. En cas d’atteinte de ces points limites, des mesures sont rapidement prises pour limiter la souffrance. Pour les fœtus et petits avant sevrage, séparation de la mère pendant quelques minutes afin de réaliser les pesées et examens physiques.
Devenir
En accord avec le plan d’étude, les animaux seront euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques et microscopiques) tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles ou d’examens de fœtus après césarienne des femelles gestantes.
Remplacement
Il n’existe pas actuellement d’alternatives à l’utilisation d’animaux qui permettent de déterminer la toxicité de substances suite à une exposition systémique. Dans ces études, un relevé des signes , ainsi qu’une évaluation macroscopique et microscopique des organes et/ou une hystérectomie nécessitant d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les lignes directrices. Il n’existe actuellement pas de méthode in vitro permettant d’évaluer l’effet d’un produit sur la fertilité, le développement embryo-fœtal, pré- et post-natal.
Réduction
Le nombre d’animaux pour les études réglementaires est défini dans les lignes directrices internationales applicables (ICH [International Council for Harmonisation], OCDE [Organisation de coopération et de développement économiques], …) et adapté en fonction du nombre de doses testées, du nombre de produits testés et de la présence ou non d’une période de réversibilité. Pour les études préliminaires, le nombre d’animaux par lot est établi au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des objectifs de l’étude, du nombre de doses testées et du nombre de produits et est précisé dans le plan d’étude. Le plan d’étude fera l’objet d‘une évaluation éthique en l’amont du démarrage de l’étude. Lorsque la méthode de bioanalyse le permet (volume de sang nécessaire pour faire l’analyse), une technique de micro-prélèvement (prélèvement utilisant le plus petit volume de sang possible) peut être utilisé et permet éventuellement de faire les prélèvements sanguins sur les animaux principaux et réduit ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour améliorer leur bien-être, les rats (mâles et femelles) et souris femelles seront hébergés en groupes sociaux sauf incompatibilité avec la procédure expérimentale ou incompatibilité comportementale. Les animaux seront hébergés dans des cages sur fond plastique et sur de la litière avec un enrichissement adapté. Pour les femelles gestantes, un substrat de nidification est ajouté en plus de l'enrichissement classique. Des pesées et/ou des mesures régulières de la consommation alimentaires seront réalisées sur les animaux afin de compléter le suivi clinique. Les techniques engendrant le moins de stress ou d’inconfort sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les actes pouvant engendrer du stress ou de l’inconfort seront réduits au minimum nécessaire (nombre et durée) et seront réalisés sous anesthésie avec un protocole analgésique adapté le cas échéant. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas de signes cliniques ayant des répercussions sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire (mise en place d’un traitement médical, interruption des administrations, réduction de la dose testée par exemple). Pour les études préliminaires de recherche de doses, le choix de la dose suivante est raffiné et adapté en fonction des effets cliniques observés à la dose précédente, après évaluation éthique. Dans le cas d’administration intraveineuse lente supérieur ou égale à 5 min, une habituation des animaux en boite à contention est réalisée au moins 2 fois avant le premier traitement. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec un protocole d’analgésie adapté. Dès que cela est possible, du microprélèvement est utilisé pour les prélèvements sanguins ce qui limite l’impact négatif pour les animaux associés aux prélèvements éventuels.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont des espèces acceptées par les agences réglementaires. Le choix de ces espèces répond aux exigences réglementaires pour la réalisation d'études précliniques ou d’évaluation de la sécurité des molécules chimiques. Il est fait en fonction de critères scientifiques précis, des données de pharmacocinétiques et pharmacodynamiques disponibles, de l’existence de données historiques et en fonction des analogies entre l’Homme et l’animal. Pour les produits à usage vétérinaire, l’espèce cible est utilisée. En fonction du type d’étude et de la population ou des animaux cibles du produit nous choisirons l’âge le plus adéquat qui peut varier du foetus à l’adulte mature qui a terminé sa croissance. Cela répond à l’ensemble des études réglementaires précliniques qui pourraient être nécessaires pour les essais cliniques chez l’Homme et l’autorisation de mise sur le marché d’un nouveau médicament ou pour l’évaluation de la sécurité de produits chimiques.
Production et maintien d’une lignée murine immunodéprimée Nod Scid Gamma
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris qui atteignent un point limite sont mises à mort, et la dégradation de leur état peut survenir sans qu'aucune expérience ne leur soit appliquée : la lignée NSG cumule l'absence de lymphocytes T, B et de cellules NK, une espérance de vie réduite et des troubles de la cicatrisation. 1 275 souris de cette lignée vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, élevées derrière une barrière sanitaire stricte parce que le moindre microbe peut les tuer. Aucune expérience n'est menée dans ce projet, qui maintient la colonie et alimente d'autres travaux de greffe de cellules et de tumeurs humaines. Le porteur qualifie ce modèle d'"irremplaçable" pour reproduire l'environnement tumoral humain, et justifie le choix de la souris par la facilité et la rapidité de sa reproduction.
Objectifs
Gestion d’une lignée murine NSG ( Nod Scid Gamma), immunodéprimée en vue d’une utilisation dans le cadre de projets scientifiques.
Bénéfices attendus
La souris NSG est une lignée hautement immunodéprimée, particulièrement précieuse pour les recherches en immunologie, oncologie, thérapie génique et médecine régénérative. Sa triple mutation la rend dépourvue de lymphocytes T, B et cellules NK (Natural Killer), avec également un déficit de l’immunité innée. Cette immunodépression extrême permet : La greffe de cellules humaines ou animales sans rejet, rendant possible la création de modèles "humanisés" (greffes de moelle osseuse, cellules souches, cellules tumorales humaines, etc.). L'étude de maladies humaines dans un organisme vivant, en particulier les cancers, les maladies infectieuses, auto-immunes, et les réponses aux immunothérapies. Le développement et l’évaluation de nouveaux traitements ciblés en conditions proches du patient humain (ex. : immunothérapie). La lignée NSG est aujourd’hui considérée comme un modèle préclinique de référence pour les études translationales impliquant des xénogreffes humaines.
Procédures
La souris NSG est une souris de laboratoire porteuse de modifications génétiques qui la rendent totalement dépourvue de défenses immunitaires. Elle ne possède ni lymphocytes T, ni lymphocytes B, ni cellules NK, qui sont normalement chargés de protéger l’organisme contre les infections. Cela la rend très vulnérable aux microbes présents dans l’environnement. Pour éviter les infections, ces animaux doivent être élevés dans des conditions sanitaires très strictes, en milieu stérile. Sans ces précautions, ils peuvent tomber malades rapidement, perdre du poids, montrer des signes de souffrance et, dans certains cas, mourir en peu de temps. En plus de ce risque infectieux, leur système immunitaire (comme le thymus ou la rate) est peu développé. Ces souris sont aussi plus sensibles au stress et à la manipulation. En dehors des risques liés aux infections (prévenus par l’élevage en milieu protégé), aucune douleur ni souffrance n’est causée par leur modification génétique. Des soins et une surveillance adaptés sont mis en place pour assurer leur bien-être.
Impact sur les animaux
La souris NSG (NOD scid gamma) présente une immunodépression sévère due à l'absence de lymphocytes T, B et NK, ainsi qu’à un déficit de l’immunité innée. Cette déficience entraîne une vulnérabilité extrême aux infections opportunistes, une espérance de vie réduite, une fragilité physique accrue, ainsi que des troubles de la cicatrisation. Ces caractéristiques peuvent occasionner une dégradation progressive de l’état général, même en l’absence de procédure expérimentale. De ce fait, la lignée NSG est considérée comme ayant un phénotype dommageable.
Devenir
Tous les animaux seront gardés soit pour le maintien de la lignée soit à destination de l'expérimentation. Les animaux mis à mort dans le cadre de cette gestion de lignée sont les animaux qui préseront l'un des points limites cités précédement.
Remplacement
Le modèle NSG constitue l’outil de référence pour les recherches translationnelles en oncologie. En l’absence d’alternative équivalente capable de reproduire l’environnement tumoral humain dans un organisme vivant, il est actuellement irremplaçable pour les objectifs du projet.
Réduction
Le nombre d’animaux produits est strictement corrélé aux besoins expérimentaux identifiés, en lien avec les projets utilisateurs mais également à ceux dans le cadre du maintien de la lignée. Aucun animal ne sera élevé de manière excédentaire ou spéculative. La planification de la reproduction est centralisée et ajustée en continu, en fonction des demandes réelles et prévisionnelles des utilisateurs et du responable de l’élevage. Des outils de suivi permettent de limiter les surplus. Lorsque cela est possible, les animaux sont mutualisés entre plusieurs projets ayant des besoins similaires, afin d’éviter des productions parallèles. En cas de non-utilisation d’animaux produits, une réévaluation de la pertinence des portées suivantes est systématiquement effectuée.
Raffinement
Des mesures spécifiques sont mises en place pour minimiser la douleur, le stress et la souffrance des animaux, en particulier compte tenu du phénotype immunodéprimé de la lignée NSG : . Les animaux sont maintenus en environnement à barrière strict (Zone EOPS: Exempt d'Organisme pathogène spécifique) afin de limiter leur exposition aux agents pathogènes, auxquels ils sont particulièrement sensibles. . Le personnel est formé aux manipulations en conditions aseptiques, et à la surveillance renforcée de cette lignée. . Le suivi sanitaire est quotidien, avec des critères d’arrêt clairement définis pour toute dégradation de l’état général (amaigrissement, piloérection, comportement anormal). . Des dispositifs de raffinement environnemental (enrichissement, cohabitation quand compatible) sont utilisés pour réduire le stress lié à l’isolement ou à la manipulation. Ces mesures garantissent que la production et le maintien de la lignée NSG sont réalisés dans les conditions les plus éthiques possibles, en conformité avec les exigences réglementaires.
Choix des espèces
La souris permet la modification aisée du patrimoine génétique avec une facilitée et une rapidité de reproduction. Dans ce contexte ce modèle n’est pas remplaçable. S'agissant de reproduction d'animaux, ils seront utilisés à l'âge minimum de 8 semaines de vie.
Etude de la virulence de Klebsiella pneumoniae in vivo
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Inoculées une fois avec Klebsiella pneumoniae par la vessie, le nez, le péritoine ou une veine, 690 souris reçoivent ensuite des inhibiteurs par l'eau de boisson, par gavage ou par injection. 570 d'entre elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les 120 autres à un niveau léger, et toutes sont tuées pour prélever tissus et liquides biologiques. L'objectif porte sur les facteurs de virulence d'une bactérie responsable d'infections nosocomiales. Le RNT résume en deux phrases ce que subissent ces 570 souris, une inflammation urinaire ou pulmonaire et un "affaiblissement de l'état général", et indique que le nombre d'animaux n'a fait l'objet d'aucune approche statistique.
Objectifs
L’étude des facteurs de virulence de Klebsiella pneumoniae est essentielle pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels cette bactérie opportuniste provoque des infections graves, notamment des pneumonies, des septicémies, et des infections nosocomiales. Ces facteurs de virulence jouent un rôle clé dans l’évasion du système immunitaire, l’adhésion aux tissus de l’hôte, et la résistance aux antibiotiques. En raison de l’émergence croissante de souches multi-résistantes, Klebsiella pneumoniae représente une menace majeure pour la santé publique mondiale. Étudier ses facteurs de virulence permet non seulement de mieux comprendre sa pathogénicité, mais aussi de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, telles que des vaccins ou des traitements ciblés, afin de mieux prévenir et traiter les infections associées.
Bénéfices attendus
L’étude des facteurs de virulence de Klebsiella va permettre de mieux comprendre les mécanisme mis en place par la bactérie pour infecter l’hôte. Cela permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui permettront à diminuer la virulence de ce pathogène et donc de diminuer les symptômes associés à des infections nosocomiales qui représentent 750 000 infections par an en France et qui sont en lien direct de 4 000 décès par an.
Procédures
Les souris vont recevoir une seule inoculation de bactéries par différentes voies suivant la procédure : trans urétrale (30 secondes d'injection) ; intranasale (1 minute d'injection) ; intra péritonéale (15 secondes d'injection) ou intraveineuse (30 secondes d'injection). Dans chacunes des procédures nous allons tester des inhibteurs de facteurs de virulence qui seront eux injectés via différentes voies suivant l'inhibiteur sélectionné : i) traitement par eau de boisson, traitement de 48 à 72h ; ii) injection IP (15 secondes d'injection) sur 3 jours à 24h d'intervalle ; iii) par gavage (1 minute d'injection), 3 gavages à 24h d'intervalle ; ou iv) par injection trans urétrale (30 secondes d'injection).
Impact sur les animaux
Certaines de ces procédures expérimentales pourront entrainer une souffrance chez l’animal avec des effets locaux (inflammation de l’appareil urinaire ou pulmonaire) ou encore systémiques (affaiblissement de l’état général par exemple). Ces nuissances seront qualifiées comme sévères.
Devenir
A la fin de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort car nous avons besoin de récupérer différents tissus et liquides biologiques pour réaliser une analyse ex vivo.
Remplacement
Des méthodes alternatives in vitro seront préalablement réalisées. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d’examiner la dissémination bactérienne entre les différents organes. En effet suivant l’organe cible de Klebsiella, l’environnement sera forcément très différent (exemple vessie vs poumons). Or on sait que les interactions entre la bactérie et son environnement vont être très importants et non négligeables dans notre étude, et cette interaction complexe ne peut être modélisée in vitro.
Réduction
L’ensemble des modèles décrit dans cette saisine sont déjà mis en place au laboratoire : modèle d’instillation dans la vessie, du sepsis ou encore de l’infection pulmonaire. De plus nous utiliserons des inhibiteurs déjà testés in vitro et décrit dans la littérature ou utilisés chez l’homme dans d’autres contextes pour réduire le nombre d'animaux utilisé. Une attention particulière est portée sur le nombre d’animaux strictement nécessaire pour chaque expérience. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (signes cliniques, charge bactérienne, prélèvements de tissus et fluides lors de la nécropsie) pour réduire le nombre d’animaux nécessaires. De plus un système d'imagerie nous permettra de suivre le niveau d'infection des souris de manière longitudinale en les maintenant en vie, nous permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux (aucune approche statistique n'a été réalisée).
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées au nombre de 5 par cage avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 2 fois par mois (tous les 15 jours). Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont 5-10 jours d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement et plus fréquemment pendant les phases aigues. Dans les modèles le nécessitant nous utliserons un anesthésique ( kétamine (70mg/kg) / xylazine (15 mg/kg)) ainsi qu'un analgésique (xylocaïne 2%). Tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse sera mis à mort. Des points limites stricts et spécifiques du projet sont mis en place. Le point limite sera défini selon une valeur objective obtenue par observation « en aveugle » de chaque animal (l’observateur n’a pas connaissance du groupe expérimental afin de réduire le biais cognitif). De plus pour cette étude le nombre d’animaux par protocole est réduit au minimum pour permettre une analyse cohérente des résultats.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable pour l’étude des facteurs de virulence de Klebsiella dans des conditions in vivo. De plus la littérature sur les différents modèles proposés avec Klebsiella est largement décrite. Souris de 5 à 9 semaines suivant le modèle expérimental. Dans la littérature, les souris utilisées pour les différents modèles décrits sont classiquement âgées entre 6 à 9 semaines. Nous prenons une marge d’une semaine pour respecter la période d’acclimatation.
Etude d’un modèle murin d’hypofonction des glandes salivaires : évaluation de l’effet d’inhibiteurs épigénétiques et étude d’association avec d’autres pathologies
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Toutes tuées à l'issue pour que leurs organes soient prélevés et analysés, 616 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur canule les glandes salivaires sous anesthésie pour y injecter un adénovirus qui provoque un syndrome sec, et une partie reçoit en plus un gavage quotidien cinq jours par semaine pendant quatre semaines pour déclencher une fibrose de la peau. D'autres reçoivent une molécule chimique à trois reprises pour induire un lymphome, puis une stimulation immunitaire mensuelle, avec des prises de sang hebdomadaires et des séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'autre modèle que la souris pour le syndrome de Gougerot-Sjögren et la sclérodermie, et qualifie ce modèle d'"indispensable" pour suivre l'apparition des auto-anticorps.
Objectifs
Le Syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) est une maladie auto-immune principalement caractérisée par une inflammation des glandes salivaires et lacrymales responsable d’un syndrome sec. Dans 40% des cas, les patients atteints développent des structures lymphoïdes anormales (ELS) au niveau de leurs glandes salivaires. La présence de ces structures ELS est prédictive d'une expression de la maladie plus aggressive et d'un risque accru de développement de lymphome. Cependant les mécanismes responsables de du dysfonctionnement des glandes salivaires, de la formation des ELS et du développement de l'auto-immunité restent peu connus. Nos collaborateurs ont mis en place un modèle murin de SGS reposant sur la délivrance d'adénovirus non réplicatifs (une fois que le virus a infecté une cellule, aucun autre virus n'est produit) dans la glande salivaire permettant l'induction d'ELS semblables à ceux observés dans le SGS. Tout d'abord, nos objectifs sont donc de mettre en place et caractériser ce modèle murin, ainsi que d'explorer les mécanismes à l'origine du dysfonctionnement des glandes salivaires dans le SGS et les stratégies thérapeutiques potentielles pour y remédier. Ensuite, nous étudierons le SGS dans le contexte d'autres pathologies puisque les patients atteints de SGS ont un risque accru de développement de lymphome et les patients atteints d'une autre maladie auto-immune, la sclérodermie systémique sont à risque de développer un SGS.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le Syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) et pourra permettre d'identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques. Egalement, nous espérons faire avancer la compréhension du lien entre le SGS et d'autres maladies auto-immunes ou cancers.
Procédures
Les souris seront soumises à une chirurgie consistant à une canulation des glandes salivaires (l'acte chirurgical ne durera pas plus de 15 minutes) associée à une anesthésie et une administration d'analgésique. Egalement, pour certains animaux : traitement administré 1 fois par jour pendant 5 jours/semaine pour une durée maximale de 4 semaines (durée : 1 minute / administration) afin d'induire la sclérodermie systémique, une maladie auto-immune caractérisée par le développement anormal d’une fibrose de la peau. Dans d'autres cas (induction d'un lymphome), administration d'une molécule chimique à 3 reprises (durée : 30 secondes / administration) avec 2 jours d'intervalle pour induire l'expression des altérations génétiques associée à une administration mensuelle (durée : 30 secondes / administration) permettant de stimuler leur système immunitaire. Dans le cadre du suivi de ces animaux, des prélèvements de sang, dont la fréquence sera au maximum hebdomadaire et la durée de moins de 30 secondes, seront réalisés. Dans certains cas, de l'imagerie non invasive pourra être réalisée impliquant une administration du substrat d'imagerie et une anesthésie gazeuse, la session durera 20 minutes au maximum.
Impact sur les animaux
La canulation des glandes salivaires pour le modèle du Syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) résultera d'un syndrome sec, une attention particulière sera donc portée sur la consommation d'eau. L'administration par gavage peut générer un stress, un inconfort, voire une fausse route créant une détresse respiratoire, c'est pourquoi elle ne sera réalisée que par des personnes qualifiées pour ce geste et sur animal vigil, diminuant ainsi drastiquement les fausses routes. En cas de fausse route, l’animal sera surveillé le temps de l’évacuation du liquide, l’animal vigil aura le réflexe d’évacuer par lui-même le liquide. Dans nos expériences précédentes, nous n’avons pas observé de stress lié à la répétition de ce geste de gavage. Pour les animaux transgéniques du modèle lymphome, on peut observer un développement tumoral qui reste généralement indolent (non douloureux) comme chez l'Homme ; cependant ces souris seront observées régulièrement afin de détecter l'apparition de signes d'affaiblissement (perte de poids, léthargie, dos courbé...). Les autres nuisances attendues proviendront de l'administration de l'inhibiteur. Dans le cas de la sclérodermie systémique, les souris développent une fibrose cutanée au point d'injection (bas du dos) et une fibrose pulmonaire modérée à partir de la 2ème semaine. Celle-ci est localisée dans la région sous-pleurale et s'étend peu à l’ensemble du parenchyme pulmonaire ce qui évite les difficultés ou souffrances respiratoires dans ce modèle murin.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêt qui seront rigoureusement exploités et analysés afin de recueillir un maximum d'informations.
Remplacement
La compréhension des mécanismes responsables du dysfonctionnement des glandes salivaires dans le Syndrome de Gougerot-Sjögren ne peut se faire que partiellement in vitro/ex vivo puisque les modèles de culture ne nous permettent pas encore de reproduire l'entière complexité de l'environnement des glandes salivaires (présence de tous les acteurs cellulaires impliqués et complexité 3D) mais nous travaillons en parallèle à les développer afin d'avoir recours aux animaux uniquement sur les dernières étapes de notre projet. En effet, la première cible thérapeutique que nous allons explorer a été définie grâce à des expérimentations in vitro. Egalement, les autres cibles potentielles seront déterminées grâce à un modèle d'organoïdes mis en place par des collaborateurs.
Réduction
Les expérimentations sont mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations. De manière générale, nous nous sommes basés sur les résultats de nos collaborateurs décrivant que la méthode de canulation de la glande salivaire permettait dans 70% des cas le développement des symptômes, ce qui implique la nécessité d'au moins 8 animaux par groupe afin d'obtenir au moins 5 animaux exploitables. Les doses croissantes d'adénovirus déficient seront testées en séquentiel, ainsi si la première dose testée s'avère suffisante les doses supérieures ne seront pas réalisées. De même si la décroissance observée à J23 est suffisante, les études aux temps plus tardifs ne seront pas réalisées. Lorsque une analyse transcriptomique et une analyse par immunofluorescence devront être réalisées, il sera nécessaire de doubler le nombre d'animaux par groupe car ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur les mêmes échantillons. Dans le cadre de l'étude d'association avec le lymphome, les groupes sont dimensionnés grâce à notre expérience précédente nous permettant d'attendre un taux de développement tumoral de 40% (nécessité d'augmenter les groupes à 11 animaux pour avoir des résultats exploitables).
Raffinement
La mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel permettront de limiter le stress et la souffrance des animaux. Ils bénéficieront également d'un enrichissement constitué de coton et/ou « maisons » en carton afin de les stimuler, diminuer le stress et afin de se construire un «nid». Le stress sera également limité au maximum grâce à une habituation progressive à la manipulation. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux (apparence physique, comportement) et un suivi bihebdomadaire des signes cliniques permettront d’avoir recours à des anti-douleurs adaptés (par exemple du spray anti-démangeaisons ayant des propriétés antiinflammatoires si démangeaisons au point d'injection chez les animaux où la sclérodermie sera induite) si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, et à l’euthanasie dès que nécessaire. Le raffinement sera également obtenu par un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire avec des dispositions adaptées (collyres, maintien à 37°C...) pour permettre une bonne récupération des animaux. La technique de suivi non-invasif par imagerie bioluminescente nous permettra de réaliser une caractérisation en cinétique du modèle de Syndrome de Gougerot-Sjögren de façon non douloureuse.
Choix des espèces
Pour les maladies auto-immunes, le Syndrome de Gougerot-Sjögren et la Sclérodermie systémique, il n'existe pas d'autres modèles que le modèle murin. Par ailleurs, ce modèle est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Concernant le modèle murin de lymphome, l'utilisation de souris transgéniques permet de reproduire avec pertinence les mécanismes précoces de la lymphomagenèse ce qui n'est pas possible avec les modèles murins de greffes. Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 8 semaines d'âge comme cela a été décrit pour ces modèles qui nécessitent un système immunitaire complètement fonctionnel et mature.
Evaluation par éléctrophysiologie in vivo de l’efficacité de composés sur la plasticité synaptique après une administration unique ou répétée par voie entérale et / ou parentérale chez des rongeurs
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 300
Pour mesurer l'effet de composés candidats sur la mémoire, 300 souris et 300 rats sains reçoivent des électrodes implantées dans l'hippocampe ou le cortex préfrontal au cours d'une chirurgie de deux heures. Tous sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue, le sang terminal étant prélevé au sinus rétro-orbitaire. Les administrations vont jusqu'à 180 fois par voie orale ou 21 injections intrapéritonéales par animal, avec jusqu'à huit prélèvements sanguins. Les composés testés ont déjà été évalués in vitro par les clients du porteur, ce projet constituant l'étape suivante d'une prestation commerciale.
Objectifs
La mémoire est une fonction essentielle du cerveau, souvent perturbée dans de nombreuses maladies neurologiques ou psychiatriques. C’est pourquoi elle représente une cible importante pour développer de nouveaux traitements. Ce projet a pour but d’étudier, chez des rongeurs sains (souris ou rats, selon les besoins), l’effet de nouveaux composés sur le fonctionnement du cerveau lié à la mémoire, et plus particulièrement sur la façon dont les connexions entre les neurones peuvent se renforcer ou s’affaiblir. La mémoire repose en grande partie sur ces modifications durables des connexions, appelées plasticité synaptique, comme la potentialisation à long terme (LTP) — un renforcement durable de la transmission entre deux neurones après leur activation répétée — ou la dépression à long terme (LTD) — une diminution prolongée de cette transmission synaptique. Ces mécanismes permettent au cerveau d’apprendre et de stocker des informations. Pour étudier ces mécanismes, nous utilisons une méthode appelée électrophysiologie in vivo, qui consiste à enregistrer l’activité électrique du cerveau chez des animaux éveillés. Concrètement, nous implantons de petites électrodes, avec une grande précision, dans des régions clés impliquées dans la mémoire, comme l’hippocampe ou le cortex préfrontal. Cela nous permet de mesurer l’activité des neurones et de voir comment les signaux entre eux changent après l’administration des composés testés. Les composés seront donnés par voie orale ou injectés, selon ce qui est le plus adapté, et nous mesurerons leurs effets à différents moments. En observant comment ces substances influencent l’activité des réseaux de neurones, nous espérons mieux comprendre leur impact potentiel sur la mémoire. Les résultats obtenus serviront de base pour des recherches futures dans des modèles animaux reproduisant des troubles de la mémoire.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment de nouveaux composés agissent sur les mécanismes qui permettent au cerveau de renforcer ou d’ajuster les connexions entre neurones, un processus essentiel à la mémoire. En étudiant leur effet sur l’activité des réseaux de neurones dans un cerveau vivant, nous pourrons mieux cerner l’impact de ces candidats médicaments sur la plasticité cérébrale. Les données obtenues, issues d’un modèle préclinique dans des conditions proches du fonctionnement normal du cerveau, représenteront une étape clé avant de tester ces composés dans des modèles de maladies. Elles poseront ainsi les bases pour développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les dysfonctionnements des circuits neuronaux impliqués dans les troubles cognitifs liés à différentes maladies neurologiques ou psychiatriques.
Procédures
Sous analgésie anésthésie une seule étape de chirurgie (2 heures). Administrations : sous cutanée 1 à 14 fois max 5 sec ou Intrapéritonéale 1 à 21 fois max 5 sec ou 1 à 14 fois max 1 minute ou voie orale 1 à 180 fois max 5 sec. Prélèvements sanguins maximum 8 fois sur animal vigile ou anesthésiés (5 secondes).
Impact sur les animaux
Les administrations et prélèvements sanguins peuvent induire un stress, dont l’intensité et la durée dépendent du type d’administration et de sa répétition. Les administrations uniques provoquent un stress aigu et transitoire, tandis que les administrations répétées, même sur une période prolongée, ne génèrent pas de stress prolongé si les techniques sont maîtrisées. Pour les administrations aiguës, les signes d’inconfort restent limités. Cependant, des administrations répétées peuvent entraîner une sensibilisation locale ou des modifications comportementales, telles qu’une réduction de l’activité spontanée ou des altérations dans l’interaction avec l’environnement. La toxicité des composés administrés a été évaluée en amont, de manière à minimiser les risques d'effets indésirables. Les produits administrés peuvent induire des modifications dans la consistance des selles, ainsi qu’une baisse de la prise alimentaire transitoire. Une irritation ou une inflammation locale peuvent persister plusieurs minutes selon le composé administré au lieu d'injection. Une injection provoque un inconfort temporaire et une douleur légère. Une rougeur peut persister plusieurs minutes selon le composé administré. Un prélèvement sanguin entraîne une douleur légère au moment de la piqûre et un stress transitoire lié à l’immobilisation. Les prélèvements terminaux de sang par la méthode du sinus rétro-orbitaire sont réalisés sous anesthésie. Un stress temporaire peut être associé à l’anesthésie. Les enregistrements électrophysiologiques in vivo réalisés sur animal vigile, dans leur cage habituelle, limitent considérablement le stress et les perturbations comportementales. L’implantation d’électrodes lors de la procédure chirurgicale peut provoquer une douleur au site d'incision ou des saignements. En post chirurgie, un risque inflammatoire ou infectieux est présent.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.
Remplacement
L’étude des réseaux neuronaux et de l’activité cellulaire est réalisée chez l’animal vigile à l’aide de techniques d’électrophysiologie in vivo. Ces approches permettent d’enregistrer l’activité neuronale dans un environnement physiologique préservé, en tenant compte des interactions complexes entre différentes structures cérébrales et des influences de l’état de vigilance ou du comportement spontané. Les approches non animales, telles que les modélisations in silico, les cultures cellulaires ou les modèles in vitro, apportent des informations précieuses en phase exploratoire, notamment sur les mécanismes moléculaires et cellulaires. Dans ce projet, les composés testés ont d’ailleurs déjà été évalués par nos clients sur des modèles in vitro, ce qui a permis d’identifier des effets initiaux sur l’activité neuronale à un niveau cellulaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’intégration de ces effets dans un réseau cérébral fonctionnel et intact. C’est pourquoi l’expérimentation in vivo s’avère nécessaire dans ce contexte, afin de caractériser l’impact des composés sur l’activité neuronale dans des conditions physiologiques réalistes.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages adaptées, enrichies avec des éléments favorisant leur bien-être, comme des bûchettes de bois à ronger, de la frisure de papier et des carrés de coton. Des tunnels en carton faciliteront les transferts entre cages tout en limitant le stress. Des interactions régulières avec le personnel, ainsi qu’une transition progressive de la lumière, contribueront à améliorer leur acclimatation. Une période d’adaptation d’au moins 10 jours est prévue afin de permettre aux animaux de récupérer du transport et de s’habituer à leur nouvel environnement. Ils seront surveillés quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Après chaque intervention technique, leur comportement et leur état général seront observés avec attention pour détecter rapidement toute réaction anormale ou signe de douleur. Si nécessaire, une surveillance renforcée sera mise en place, en lien avec le responsable du bien-être animal. Les fiches d’observation et les seuils définis dans le cadre du projet seront scrupuleusement respectés pour assurer une détection précoce de toute souffrance. Les animaux seront pesés au moins deux fois par semaine après le début des traitements, afin d’adapter précisément les volumes administrés. Pour les injections répétées (intrapéritonéales ou sous-cutanées), les sites d’administration seront régulièrement changés pour limiter les réactions locales. Concernant les interventions chirurgicales, les animaux seront placés sous anesthésie générale / analgésie pendant toute la durée de l’opération. Une analgésie locale préventive sera administrée, avec une injection 10 minutes avant l’incision, ainsi qu’une application locale d’un mélange anesthésique au niveau du site opératoire. Le maintien de la température corporelle (tapis chauffant), le suivi pendant l’opération (monitoring) et des techniques chirurgicales stériles seront appliqués pour limiter les complications. Une solution ophtalmique sera appliquée sur les yeux pendant l’anesthésie pour éviter leur dessèchement, et une injection de solution saline tiédie à la fin de la chirurgie permettra d’assurer l’hydratation. Enfin, une analgésie post-opératoire sera assurée par l’ajout d’un traitement antidouleur dans l’eau de boisson pendant deux jours.
Choix des espèces
Nos expérimentations sont réalisées sur la souris et le rat, deux modèles couramment utilisés en neurosciences pour étudier les mécanismes cérébraux. Ces espèces présentent des similitudes majeures avec le cerveau humain, notamment en ce qui concerne l’organisation des circuits neuronaux et les mécanismes synaptiques. Ces caractéristiques en font des modèles particulièrement adaptés pour explorer les bases du fonctionnement normal du cerveau ainsi que les processus altérés dans les maladies affectant la mémoire. Grâce à un cerveau moins complexe tout en restant suffisamment proche de celui de l’humain, les souris et les rats permettent d’étudier des fonctions essentielles telles que la plasticité neuronale, l’apprentissage et la mémoire, souvent perturbées dans les pathologies du système nerveux central. Ces modèles offrent ainsi la possibilité d’observer et de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux du fonctionnement cérébral, fournissant des données précieuses pour le développement de traitements ciblés contre ces maladies. Les animaux seront utilisés du jeune l’âge adulte, c’est-à-dire à partir de 4 semaines. Ils seront suivis jusqu’à environ 8 mois, ce qui couvre la période d’âge adulte sans atteindre le stade de vieillissement avancé soit avant l’apparition des altérations liées à l’âge ou à d’éventuelles pathologies. Les données obtenues chez ces animaux fourniront une base fiable pour la comparaison avec des modèles pathologiques plus avancés.