Rongeurs

Tuées pour la plupart afin de prélever pancréas, foie, muscles et tissu adipeux, 885 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une centaine devant être réutilisées ailleurs ou cédées à d'autres équipes. Elles sont obèses et diabétiques, par lignée, par régime gras ou par destruction chimique de leurs cellules pancréatiques, et reçoivent jusqu'à une injection intrapéritonéale par jour pendant trois semaines. La mesure de la glycémie exige une petite incision de la veine caudale tous les deux jours, plusieurs fois par heure les jours de test de tolérance, et le porteur décrit une polydipsie qui peut multiplier par dix la prise de boisson. Il conclut qu'il n'existe "aucun modèle non animal utilisable" pour ces études, les inconnues étant selon lui trop nombreuses pour bâtir un modèle informatique fiable.

Objectifs

Le diabète et ses conséquences métaboliques sont de plus en plus répandus, touchant des millions de personnes dans le monde, et souffrent encore d’un manque de traitements pharmacologiques efficaces. Un diabète non maîtrisé, peut, au fil du temps, provoquer de graves lésions cardiaques, vasculaires, oculaires, rénales et nerveuses. Les cellules béta-pancréatiques sont au cœur du problème, car elles ne fournissent pas suffisamment d’insuline aux organes pour éviter la maladie, en raison de leur défaillance, mais aussi de leur destruction. Malgré les efforts de recherches, peu d’options thérapeutiques sur le traitement des cellules Bêta sont disponibles. Récemment, 2 composés peptidiques biomimétiques (1 et 2) développés par notre laboratoire, et visant à protéger les cellules bêta et à maintenir leur fonctionnement, ont démontré leur efficacité et leur non-toxicité à travers plusieurs approches in vitro. Ainsi, notre objectif est de tester l’efficacité in vivo de ces 2 composés peptidiques chez 4 modèles d’animaux diabétiques différents. Procédure 1 : test du composé 1 chez un modèle de souris obèse et diabétique de type 2. Procédure 2 : test du composé 2 chez deux modèles de souris diabétiques (type 1 pour l’un et type 2 pour l’autre), procédure 3 : test des 2 composés chez un modèle de souris rendues obèses et diabétiques suite à une alimentation riche en graisse, procédure 4 : test du composé 2 dans un modèle de souris rendue diabétique de type 1 suite à la destruction des cellules bêta pancréatiques. Aussi, pour améliorer l’adhésion au traitement, nous prévoyons de formuler ces nouvelles molécules pour pouvoir les administrer par voie orale. Pour ce faire, nous utiliserons les propriétés d’un polysaccharide issu d’une algue brune, l’alginate, que nous réduirons sous la forme de nanoparticule, une taille permettant de mieux encapsuler les molécules. Notre maitrise dans ce domaine, confirme que les nanoparticules d’alginate sont un adjuvant efficace pour encapsuler les substances et les délivrer à leur organes cibles. L’objectif de cette demande est de déterminer l’effet de ces deux composés associés ou pas avec l’alginate sur l’amélioration de l’état diabétique de modèles murins diabétiques et obèses. Cette étude sera réalisée sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Le diabète et l’obésité représentent un véritable enjeu de santé publique, ces pathologies étant classées parmi les urgences sanitaires actuelles du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. À ce jour, peu d’options thérapeutiques restent disponibles pour traiter ou ralentir l’évolution de ces pathologies et de leurs complications. L’étude, le développement et la caractérisation de nouvelles cibles et de nouveaux agents pharmacologiques apparaît donc primordial afin de remédier à ce besoin médical non satisfait. L’exploitation de molécules protégeant les cellules bêta pancréatiques et potentialisant leur fonctionnement est prometteuse dans le développement d’un traitement anti-diabétique. Grâce aux nanotechnologies, et dans une vision de gestion durable et biologique, dont les avancées permettent d’améliorer et d’optimiser la délivrance des médicaments (peptide/nanoparticule), nous utiliserons l’alginate, un polysaccharide naturel provenant d’une algue brune comme nanoparticule. L’alginate est déjà utilisé dans le milieu industriel comme adjuvant et comme excipient de médicaments.

Procédures

Le type d'intervention se limite à des injections intra-péritonéales, et des prélèvements sanguins au niveau de la queue pour mesurer la glycémie. La mesure de la glycémie à l’aide d’un glucomètre nécessite une petite incision au niveau de la veine caudale pour prélever une quantité de sang d’environ de 2 à 2,5 μL. Ce type de prélèvement dure 3-4 secondes. Les injections s'effectueront sur une durée de 3 semaines, selon une fréquence pouvant aller au maximum jusqu'à 1 fois/jour. Pour chaque injection, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes. La mesure de la glycémie se fera à une fréquence une fois tous les 2 jours sauf lors des tests de tolérance au glucose ou les tests de tolérance à l'insuline, où dans ce cas s'effectueront à plusieurs reprises dans un temps limité de 2h ou 1h30 respectivement. Il est également prévu de mesurer l'insuline et les triglycérides en prélevant 20 μl et 50μl de sang, respectivement de la queue, une fois par semaine et lors des tests de tolérance.

Impact sur les animaux

Tout au long de ce projet, l’état général des animaux obèses et des animaux diabétiques sera surveillé quotidiennement car bien que ces pathologies ne soient pas des points limites, les conséquences qu’elles engendrent peuvent être une source de dérèglements internes, tels que une hyperphagie, polydipsie, un problème de thermorégulation, une hyperlipémie et une augmentation des productions hormonales de la glande hypophyse et des glandes surrénales. Ces désordres métaboliques entrainent une polyurie et une activité physique amoindrie. Ainsi les risques de déshydratation sont très importants chez les animaux diabétiques et nécessite une attention particulière. Pour le modèle d’obésité, une prise de masse trop importante peut entraîner une difficulté d’accès à la nourriture et à l’eau de boisson. De plus un excès d’apport alimentaire en lipides peut également entraîner le développement passager de dermatite. Enfin, pour les souris dont le diabète de type 1 est induit (procédure 4), un état d’inconfort et de douleur peut être identifié suite au développement de la maladie et de l’hyperglycémie. Il peut s’ensuivre un arrêt de la croissance pondérale, voire une perte de poids, une hypoinsulinémie, une polydipsie (la prise de boisson pouvant être multipliée par 10), une polyurie et une hyperphagie.

Devenir

Tous les animaux diabétiques et certains de leur contrôles seront utilisés dans les procédures et seront pour la majorité mis à mort pour le prélevement d'organes (pancréas, foie, muscles; tissu adipeux). Les animaux non euthanasiés pourront éventuellement être réutilisés dans d'autres procédures. Par exemple, pour les groupes contrôles, ils pourront être communs à plusieurs études non refaites, voire si possibilité, être donnés à d'autres groupes.

Remplacement

Ce projet propose des substances novatrices pour lesquelles les informations ne sont pas encore disponibles dans la littérature. Bien que le remplacement par des alternatives non animales, telles que les lignées cellulaires ou organoïdes, soient un atout précieux pour la recherche, ces dernières ne peuvent reproduire la physiologie intégrative complexe présente chez la souris, qui est étroitement liée à celle de l'homme. En raison de la grande complexité des troubles physiopathologiques du diabète et de l’obésité et de leur intégration complexe dans l’organisme, les inconnues sont trop nombreuses pour créer des modèles informatiques fiables. Par conséquent, il n'existe aucun modèle non animal utilisable pour ces études.

Réduction

Des expériences in vitro préalables ont été effectuées dans le but de déterminer les conditions optimales de délivrance des molécules, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Afin d’observer une différence statistiquement significative entre deux groupes, 5 animaux par groupe expérimental sont nécessaires. Une réduction de ce nombre pourrait être problématique car quelques animaux peuvent être perdus au cours des expériences (pour cause de mort naturelle). Des études précédentes sur les souris spontanément diabétiques montrent que l’utilisation d’un minimum de 14 à 16 animaux (soit un triplicat d’expériences avec 5 souris/groupe) par groupe de traitement est nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante et donc des effets significatifs sur la glycémie. Le nombre de souris sera également limité puisque l’établissement d’un profil métabolique et l’isolement post-mortem des organes cibles s’effectuera sur un même individu. Enfin, dès que possible, le groupe contrôle sera commun à plusieurs études non refaites.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, des mesures de raffinement seront mises en œuvre pour minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux, notamment par l’utilisation systématique d’analgésiques et d’anesthésiques adaptés, la surveillance accrue des animaux avec des points limites spécifiques, ainsi que par l’enrichissement de leur environnement pour favoriser leur bien-être physique et social. Les animaux seront hébergés par groupe de 5, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de tunnels et de matériaux de nidification. Un suivi quotidien sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Les animaux étant diabétiques, leurs cages seront changées tous les jours afin d'éviter les désagréments causés par le syndrome polyuro-poydipsique. Les nids préalablement construits par les animaux seront éventuellement remis dans leur nouvelle cage pour plus de confort et de sentiment de sécurité. Les points limites sont les suivants : troubles du comportement ; signes d’absence de toilettage (poil hirsute, pelage sale) ; perte de poids de 15 % à 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental.

Choix des espèces

Les caractéristiques morphologiques, physiologiques, endocriniens et inflammatoires de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. L’utilisation d’animaux d‘expérimentation est particulièrement pertinente dans le cadre de la conception d’un dispositif de délivrance de molécules à visée thérapeutique. Les animaux atteints du diabète de type 2 ou diabète de type 1 utilisés dans le projet (souris db/db, souris sauvages soumises à un régime HFD, souris NOD souris sauvages traitées par la Streptozotocine) sont les modèles standards couramment employés pour étudier l’efficacité thérapeutique de la méthode (baisse de la glycémie recherchée). Il est important de travailler avec des animaux dont le stade de développement est terminé, sans pour autant travailler avec des animaux trop âgés pour ne pas biaiser les résultats. Ainsi, les protocoles démarreront avec des souris âgées d’au moins 5-6 semaines pour les souris db/db et les souris C57Bl6N. Pour le modèle des NOD, il sera préférable de travailler avec des souris agées de 12 semaines minimum.

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, présentent du sang dans les selles ou restent voûtées en permanence sont mises à mort. 5 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines reçoivent une injection intrapéritonéale tous les deux jours pendant quatorze jours, d'autres un gavage à l'âge de deux semaines, une instillation intranasale sous anesthésie ou des prises de sang hebdomadaires, et une partie est rendue immunodéprimée avant une greffe de moelle osseuse. Le porteur cherche à comprendre comment le microbiote intestinal du nouveau-né éduque son système immunitaire, sans expliquer ce qui fixe l'effectif à 5 400 animaux au-delà de la variabilité du microbiote et des effets de portée et de cage.

Objectifs

L’objectif global de ce projet est de comprendre comment le microbiote intestinal, par la production de métabolites, éduque le système immunitaire pendant la période néonatale et permet de maintenir un état symbiotique. Pour se faire, le projet visera à : (i) comprendre quelles cellules, bactéries, produits bactériens et molécules immunitaires sont impliqués pendant la réaction de sevrage pour diminuer la susceptibilité de développer des pathologies inflammatoires ; (ii) comprendre par quels mécanismes les métabolites microbiens participent à la persistance des effets bénéfiques de la période néonatale jusqu’à l’âge adulte. Répondre à ces deux objectifs permettrait d’identifier de nouveaux traitements comme des pro/pre/post-biotiques, ainsi que de nouveaux biomarqueurs au début de la vie afin de diminuer la prévalence aux maladies inflammatoires.

Bénéfices attendus

Le projet devrait faire progresser les connaissances scientifiques et profiter à la santé humaine. On sait peu de choses sur la façon dont le microbiote intestinal au début de la vie forme l'immunité à l'infection tout au long de la vie. Ce projet a le potentiel d'ajouter des données importantes au domaine scientifique en fusionnant l'immunologie et la recherche sur le développement précoce de la vie. Ce projet vise à identifier à la fois les biomarqueurs d'une formation immunitaire saine ou perturbée, ainsi que les composés potentiels qui peuvent restaurer une empreinte immunitaire saine. En recherchant et en testant différentes bactéries, métabolites et composés immunitaires, ce projet a le potentiel d'identifier des agents thérapeutiques qui pourraient être utilisés en médecine humaine comme de nouvelles thérapies de prévention de la dysrégulation immunitaire.

Procédures

- Prélèvement sanguin 1 ou 2 fois maximum par procédure ou 1 fois par semaine pendant trois semaines et terminal sous anesthésie. Quelques secondes à chaque fois - Injection par voie intrapéritonéale une fois tous les deux jours, par animal, pendant 14 jours ou 1 ou 6 fois maximum par procédure. Durée : quelques secondes - une instillation intranasale. Durée : 2 min sur souris anesthésiée - Gavage 1 fois à l’âge de 2 semaines. Durée : quelques secondes - Injection intraveineuse 1 fois à l’âge adulte. Durée : quelques secondes sur souris anesthésiées

Impact sur les animaux

L’introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires pour les administrations et les prélèvements induisent une douleur et un inconfort de courte durée. Le gavage de substances, effectué conformément aux bonnes pratiques de gestion des animaux, peut causer inconfort de courte durée. Certains traitements entraînent une pathologie intestinale avec diarrhée transitoire et une perte de poids qui peut varier de 10 à 20%. Un traitement peut entraîner une perte de poids au jour 4 chez certains individus (

Devenir

Toutes les expériences nécessitent l'analyse des cellules dans les tissus intestinaux et d'autres organes. La seule façon d'évaluer cela est de mettre les animaux à mort à la fin de chaque expérience.

Remplacement

Aucune alternative non-animale n’est disponible pour accomplir ce projet. L’interaction complexe que représentent les milliards de bactéries du microbiote intestinal et son hôte ne peut être reproduite in vitro. Les nouveaux modèles organoïdes tridimensionnels ne peuvent pas représenter la grande variété de cellules immunitaires dans l’intestin ainsi que le recrutement de ces dernières, ou encore mimer les différents signaux produits par notre système nerveux central, qui joue un rôle prépondérant dans l’éducation du système immunitaire. De ce fait, pour répondre aux questions de ce projet, il est toujours essentiel et nécessaire d’utiliser des modèles animaux.

Réduction

D'après la littérature et nos résultats antérieurs, les effectifs par groupe prévus permettent d'atteindre des tailles d'effet compatibles avec la question biologique, en prenant en compte la forte variabilité des données (microbiote) et étant donné que le projet inclut des effets portée et cage. Le calcul de ce nombre tient compte d'un minimum de sang, de cellules et d'organes à prélever pour analyse et inclut pour chaque série d'expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il prend également en compte la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure les artefacts expérimentaux et donc les erreurs d'interprétation. De plus, les expériences ont été conçues afin d’utiliser un maximum d’organes de la même souris afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons utilisé une aide statistique pour déterminer le nombre minimum de souris à utiliser par groupe pour obtenir des résultats significatifs, en tenant compte de la variabilité inhérente à l'expérience. Ces tests ont été développés à partir d'outils référencés. Les données seront analysées grâce à des modèles ajustés sur plusieurs facteurs (âge, sexe de l’animal, traitement). Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à prendre en compte tels que l’effet portée, cage et répétition de l'expérience.

Raffinement

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles les animaux sont inclus est léger ou modéré. Le degré de souffrance modéré concerne les expériences entrainant une maladie inflammatoire, dont la sévérité peut être précisément suivie par une perte de poids, l’aspect général et un marqueur d’inflammation présents dans les fèces. De cette façon, l’expérimentateur peut estimer la douleur. Au cours de procédures comportant des maladies inflammatoires l’état des souris sera monitoré chaque jour visuellement et tous les 2 jours par une pesée, un contrôle de l’aspect général et l’inspection des selles. Lors de procédures comportant des maladies inflammatoires, l'utilisation de gel hydrique ou/et une réhydratation sous-cutanée sera pratiquée en cas de besoin. Si la perte de poids excède 20%, si la souris présente des signes de détresse clinique grave (léthargie, posture voûtée permanente, piloérection marquée, absence de toilettage), ou qu’une présence de sang dans les selles est observée, l’expérience sera interrompue et les souris présentant un ou plusieurs de ces symptômes seront mises à mort. Pour certains gestes, l’anesthésie sera aussi utilisée.

Choix des espèces

Ce projet vise à explorer et comprendre les interactions complexes, dans le temps, entre les cellules du système immunitaire et le microbiote. Il est donc impossible de modéliser de telles interactions in vitro ou in silico, d’autant plus que relativement peu de choses sont connues dans ces interactions. De plus, les traitements antibiotiques ont déjà été validés dans cette espèce. Le modèle de choix est la souris, qui se prête idéalement aux expériences sur le système immunitaire et le microbiote intestinal, bien connus dans cette espèce. Les souris que nous utiliserons seront des jeunes souris entre la période postnatale et le péri-sevrage (0-4 semaines), des souris adultes (8-15 semaines) et des souris âgées (plus de 6 mois). Ce projet étudie l'influence du microbiote au début de la vie sur les résultats de l’inflammation de différents organes à l'âge adulte. Il est donc nécessaire d'utiliser des souris gestantes et de tester leur progéniture tout au long de la vie jusqu'à l'âge de 15 semaines et à un âge avancé.

Pour mesurer si un insecticide perturbe la formation de la myéline dans le cerveau en développement, 1 636 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes reçoivent de la deltaméthrine dans leurs croquettes du septième jour de gestation au vingt-deuxième jour après la naissance, leurs petits sont séparés d'elles vingt minutes pour être comptés et sexés, puis testés à l'âge adulte sur l'activité locomotrice pendant vingt-quatre heures, l'anxiété, les interactions sociales et la mémoire spatiale. Les descendants et les mères sont tués pour prélever les cerveaux, seules seize souris servant d'inconnues dans le test social pouvant être réutilisées ailleurs. Le porteur attend des effets modérés sur le développement cérébral et le comportement des souriceaux exposés, sans impact selon lui sur leur bien-être général, et annonce une surveillance toutes les 48 heures assortie de points limites déclenchant la mise à mort.

Objectifs

Les troubles du neurodéveloppement tels que les déficits d’apprentissage, les troubles de l’attention et les troubles du spectre autistique touchent de nombreux enfants et représentent un problème de santé publique majeur. Souvent associés à des handicaps durables, ils sont en partie attribués à l’exposition aux polluants environnementaux durant le développement cérébral qui s’étend de la vie fœtale à l’adolescence. Parmi ces polluants, les pesticides, largement utilisés en agriculture pour améliorer les rendements et assurer la sécurité alimentaire, sont aussi couramment employés dans les habitations pour lutter contre les nuisibles. Leur usage intensif n’est pas sans conséquences pour la santé humaine et l’environnement. Des initiatives visent à réduire leur usage et à remplacer les substances les plus toxiques. Cela a conduit à une utilisation accrue d’insecticides plus récents. Ils contaminent désormais une grande partie de la population, y compris les femmes enceintes et les enfants. Certaines études indiquent un lien entre exposition précoce à ces insecticides et des troubles du neurodéveloppement, mais les mécanismes restent inconnus. Parmi les étapes clés du développement cérébral, la myélinisation est un processus par lequel une gaine riche en lipides se forme autour des fibres nerveuses. Toute perturbation de la mise en place de la myéline peut contribuer aux troubles du neurodéveloppement. Ce projet étudiera l’impact d’une exposition précoce à un insecticide récemment développé sur la myélinisation cérébrale chez la souris. Le pesticide sera administré aux souris pendant la gestation et l’allaitement par l’alimentation. Ses impacts seront évalués chez les descendants à différents stades de développement par plusieurs approches expérimentales. Ces travaux visent à mieux comprendre les effets de ces composés pour éclairer les décisions concernant la régulation des pesticides.

Bénéfices attendus

L’utilisation croissante de certains insecticides dans l’agriculture a conduit à une exposition généralisée de la population, y compris les femmes enceintes et les enfants. C’est pourquoi il est nécessaire de mieux comprendre leurs effets possibles sur la santé, notamment pendant les périodes où le cerveau se développe rapidement. Ce projet vise à combler une lacune importante : on en sait encore très peu sur la manière dont ces insecticides pourraient perturber la formation de la myéline, une gaine protectrice qui entoure les fibres nerveuses et joue un rôle clé dans le bon fonctionnement du cerveau. Une myéline anormale peut contribuer à l’apparition de troubles du développement. Ces recherches permettront d’apporter de nouvelles informations sur les effets des insecticides sur le cerveau en développement. Elles aideront aussi à mieux évaluer les risques liés à ces substances et à mieux protéger les personnes les plus vulnérables comme les enfants. Enfin, les résultats pourront éclairer les décisions des autorités pour une utilisation plus sûre des pesticides.

Procédures

Les souris seront soumises à une série de tests comportementaux à l’âge adulte, répartis sur plusieurs jours. Les tests incluent l’évaluation de l’activité locomotrice (24 h), de l’exploration et de l’anxiété (environ 10 min), des interactions sociales (5 min) et de la mémoire spatiale (4 jours consécutifs de test d’environ 10 min/jour). Lors de la mise à mort, l’anesthésie et l’analgésie seront réalisées par injection sous-cutanée (moins d’une minute chacune). La perfusion intracardiaque dure environ 7-8 minutes.

Impact sur les animaux

Les croquettes contenant le pesticide pourraient perturber la prise alimentaire et entraîner une perte de poids. Un stress pourra être engendré par la séparation des souriceaux nouveaux-nés de leurs mères pendant environ 20 minutes lors de l’étape de comptage des souriceaux, de détermination de leur sexe et d’homogénéisation des portées le jour suivant la naissance. La contention des souris pour réaliser les injections sous-cutanées pourrait également être source de stress correspondant à la durée du geste c’est à dire moins d’une minute. Chez les souriceaux exposés, des effets modérés sur le développement du cerveau sont attendus, pouvant influencer leur comportement (anxiété, mémoire, relations sociales), sans impact sur leur bien-être général ni sur leurs fonctions vitales.

Devenir

A la fin de la procédure visant à vérifier l’absence de modification de l’appétit des souris nourries aux croquettes contenant l’insecticide, tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux seront prélevés. Du sang sera également prélevé pour mettre au point le dosage de l’insecticide. A la fin de la procédure d’exposition pendant la gestation et l’allaitement, tous les descendants seront mis à mort et leurs cerveaux seront prélevés pour réaliser différentes analyses. Les mères seront mises à mort au moment du sevrage. Les animaux utilisés comme « souris inconnues » dans le test d’interactions sociales pourront être réutilisés dans un autre projet.

Remplacement

La myélinisation est un processus développemental long et complexe impliquant de nombreuses interactions cellulaires entre les différents types cellulaires cérébraux et dépendant également de facteurs circulants tels que les hormones. Pour cette raison, son étude ne peut être envisagée qu’« in vivo ». De plus, l’exposition par voie orale chez l’animal constitue à ce jour le modèle le plus pertinent pour reproduire la principale voie d’exposition chronique à la deltaméthrine dans la population humaine.

Réduction

Au début du projet, une première étude sera réalisée pour vérifier que la présence de l’insecticide dans la nourriture n’affecte pas l’appétit des souris. Ceci permettra d’éviter d'utiliser inutilement un grand nombre d'animaux si les conditions ne sont pas optimales. Le nombre d'animaux prévu a été calculé en fonction de notre expérience pour chaque type d’analyse prévue. Ce nombre d’animaux sera suffisant pour appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions pour analyser les résultats obtenus. Plusieurs analyses seront réalisées à partir du même animal pour limiter leur nombre.

Raffinement

Les souris adultes non gestantes, les mères et les souriceaux après sevrage seront hébergés en groupes sociaux stables, afin de limiter tout stress et modification de hiérarchie. Les souris femelles utilisées présentent d’excellentes qualités maternelles, ce qui permettra de minimiser le stress et la souffrance des petits. La méthode d’exposition des animaux à l’insecticide par incorporation dans les croquettes, non invasive, ne générera pas de stress ou de souffrance. Au cours des tests comportementaux, des précautions seront prises pour minimiser le stress des animaux et assurer la qualité et l’exploitabilité des résultats, incluant des sessions d’habituation aux enceintes. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale et après administration d’un analgésique. Des points limites sont définis pour anticiper et prendre en charge la détresse et la douleur. Une surveillance toutes les 48h (ou 72h du vendredi au lundi), sera mise en œuvre incluant l’observation de l’apparence, de signes cliniques et du comportement des animaux. Un score sera établi pour évaluer un éventuel stress et/ou douleur et le prendre en charge de manière adaptée selon la gravité à l’aide de grilles pour lesquelles des points limites ont été définis. Si les points limites sont atteints, nous procéderons au renforcement de la surveillance ou à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Les souris sont couramment utilisées pour ce type d’étude. De plus, le laboratoire dispose d’une expertise spécifique sur ce modèle, ainsi que des outils nécessaires à l’étude des anomalies de la myéline. Au début du projet, des souris femelles adultes âgées d’environ 3 mois seront utilisées afin de vérifier que l’incorporation de l’insecticide dans les croquettes n’a pas d’influence sur l’appétit de souris. Ce stade a été choisi car, par la suite, les souris exposées directement à l’insecticide seront des femelles adultes gestantes d’un âge comparable. L’exposition à l’insecticide sera réalisée pendant la gestation et l’allaitement, de la 7ᵉ journée de gestation jusqu’au 22ᵉ jour postnatal. Cette période a été choisie pour cibler le développement cérébral. Elle couvre également une période critique où le cerveau est particulièrement sensible aux influences extérieures. Les stades auquels seront réalisées les différentes analyses ont été choisis en fonction des périodes auxquelles se produisent les évènements étudiés. Pendant les 3 premières semaines après la naissance, les cellules responsables de la synthèse de myéline seront étudiées. La formation de myéline sera suivie jusqu’à l’âge adulte. Enfin, des tests comportementaux seront réalisés chez les souris adultes afin d’évaluer les impacts à long terme de l’exposition pendant le développement.

Injectées dès la naissance d'un vecteur viral, puis soumises trois ou quatre fois à des tests de force d'agrippement, de coordination, de fatigabilité musculaire et de capacité respiratoire, 2 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont toutes tuées, les unes avant sevrage parce qu'elles n'ont pas le génotype recherché, les autres en fin de procédure pour prélever leurs tissus. Le modèle porte une délétion du gène ColQ qui reproduit un syndrome myasthénique congénital, avec faiblesse musculaire généralisée dès les premiers jours de vie. Une précédente tentative de thérapie génique menée par la même équipe a provoqué une toxicité inattendue, fait que le résumé rapporte tout en présentant les prélèvements sanguins comme une douleur équivalant à l'introduction d'une aiguille.

Objectifs

Le syndrome myasthénique congénital est une maladie rare d’origine génétique, ayant une incidence estimée à 1 personne sur 250 000. Elle présente des caractéristiques cliniques et génétiques hétérogènes, puisque différents gènes déficients peuvent être individuellement associés à ce type de pathologie. Ces gènes sont impliqués dans le bon fonctionnement des jonctions neuromusculaires, qui est la structure permettant la transmission de l’information nerveuse vers les muscles et donc la contraction musculaire. L’un des syndromes myasthéniques congénitaux est associé à des mutations dans le gène COLQ, pour collagène Q. Les patients souffrent de faiblesse musculaire sévère, de fatigue, de scoliose importante, d’insuffisance respiratoire et ont une espérance de vie réduite. Pour le moment, il n’existe pas de traitement curatif mais uniquement des traitements symptomatiques. Le but du projet est de concevoir une approche de thérapie génique innovante pour le syndrome myasthénique congénital lié à ColQ, consistant à l’introduction du gène sain dans les cellules à l’aide de vecteurs. Pour cela, nous disposons d’un modèle murin déficient en ColQ qui reproduit les symptômes observés chez l’Homme. Dans une étude précédente, nous avons administré un vecteur viral non optimisé, porteur du gène sain COLQ, pour une première preuve de concept à un stade post-symptomatique et qui a provoqué une toxicité inattendue. Nous souhaitons, dans ce projet, traiter les animaux avec un vecteur viral que l’on optimisera pour une meilleure spécificité et efficacité pour le transfert du gène COLQ et son expression en protéine essentiellement dans le muscle squelettique, en tenant compte des résultats obtenus précédemment dans l’équipe. Nous avons sélectionné à partir d’études sur cellules en culture, 6 vecteurs différents. Le phénotype des souris traitées avec ces vecteurs à différentes doses sera analysé jusqu’à 3 mois ou 1 an, en évaluant l’état général des souris, la force musculaire et globale, la capacité respiratoire, l’état des jonctions neuromusculaires et la structure des fibres musculaires.

Bénéfices attendus

Grâce à l’étude de différents vecteurs, à différentes doses, ce projet pourrait permettre d’identifier chez la souris, un vecteur efficace pour traiter à une dose la plus faible possible le syndrome myasthénique congénital liée à l’absence de collagène Q, tout en réduisant le risque de toxicité. Ce vecteur optimisé pourra être utilisé pour le développement préclinique et clinique d’un candidat médicament pour cette pathologie mais pourra également être utilisé pour traiter d’autres syndromes myasthéniques congénitaux, en changeant uniquement le gène responsable de la pathologie.

Procédures

Injection des traitements : injection unique, environ 2min par souris. Mesure de l’activité des animaux : 1h30, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Mesure de la force d’agrippement : 2min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Test de coordination et de force musculaire : 10min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Test de fatigabilité musculaire : 5min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Mesure de la capacité respiratoire : 1 fois 10 min par souris. Mesure de la force globale : 1 fois 10 min par souris. Analyse de la transmission de l’information nerveuse vers les muscles : 1 fois 20 min par souris. Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés : 4 fois, environ 5 min par souris.

Impact sur les animaux

Les nuisances que ce modèle peut rencontrer sont liées au fait qu’il n’exprime pas la protéine collagène Q. Les animaux malades développeront des troubles du comportement moteur liés à une faiblesse musculaire généralisée. Suite aux traitements, dans le cas d’une injection à dose suboptimale, les nuisances seront liées à celles du modèle. Les injections intraveineuses ou les prélèvements sanguins provoquent une douleur légère équivalente au seuil de douleur lié à l’introduction d’une aiguille sous bonne pratique vétérinaire. L’animal subira, au cours des évaluations fonctionnelles, un stress lié à la manipulation. Très rarement, certains animaux pourront souffrir de blessures des griffes/doigts, de petites plaies ou d’altérations des fonction locomotrices suite aux tests fonctionnels.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés avant sevrage s’ils ne possèdent pas le génotype nécessaire pour être inclus dans les études. Le reste des animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever les tissus qui nous permettront de déterminer l’efficacité des traitements.

Remplacement

Dans ce projet, une présélection de vecteurs a été réalisée en mesurant l’efficacité de ces vecteurs à délivrer le gène thérapeutique dans les cellules musculaires, et à produire la protéine d’intérêt. Cependant, ces modèles en laboratoire ne nous permettent pas d'observer comment le vecteur se répartit dans tout le corps ni d'étudier les effets thérapeutiques, car ils ne peuvent pas simuler les problèmes de fonctionnement des muscles, comme la perte de force. Pour évaluer l’efficacité et la spécificité d’un vecteur administré dans l’ensemble du corps, l’utilisation d’animaux est indispensable. Notre modèle de souris reproduit la pathologie musculaire avec fidélité, ce qui nous permet de mesurer dans le temps et de façon prédictive de la clinique (c’est-à-dire chez l’Homme) l’efficacité des traitements sur l’ensemble des muscles squelettiques et la distribution du vecteur dans les différents tissus pour analyser leur spécificité. Ils permettent d’étudier les défauts liés à la fonction du muscle et de la jonction neuromusculaire ou encore les niveaux de biomarqueurs dans le sang.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à partir de tests statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux pour observer des différences entre un animal sain et un animal traité. En amont de cette étude expérimentale sur des modèles animaux, nous avons sélectionné grâce à des études sur cellules les 6 meilleurs vecteurs viraux capables d’exprimer fortement la protéine COLQ dans les cellules musculaires. La première étape de ce projet nous permettra d’évaluer l’efficacité de ces 6 vecteurs à 3 doses différentes pour cibler l’ensemble des muscles et traiter la pathologie à moyen terme, sur 3 mois. Les 2 meilleurs candidats seront sélectionnés afin de déterminer la dose thérapeutique optimale sur une période de 1 an. Dans l’étude à 3 mois, nous procèderons par étape, en injectant en premier les animaux avec la plus forte dose de vecteurs. Si des animaux injectés avec une certaine dose d’un vecteur donné montrent des signes d’absence d’efficacité, nous n’injecterons pas les doses plus faibles pour ce vecteur. Si un des vecteurs injectés dans l’étude à 3 mois a un effet thérapeutique nettement supérieur aux autres, l’étude de dose à un an se fera uniquement avec ce vecteur. La toxicité d’un médicament est évaluée avec la dose thérapeutique optimale sur des animaux sains. Dans cette étude, des animaux sains seront injectés avec les 3 doses de ce vecteur car la portée est entièrement injectée à la naissance. Par conséquent, nous utiliserons ces animaux pour l’étude de toxicité, au lieu d’injecter ultérieurement de nouvelles portées lorsque nous serons capables de déterminer la dose thérapeutique optimale. Nous réduisons ainsi le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

D’une façon générale, toutes les mesures possibles permettant d’améliorer les conditions de vie des animaux seront prises. Les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies à l’aide de coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. S’il s’avère qu’un seul animal se retrouve dans une cage, au sevrage, puisqu’il est le seul à devoir être suivi sur la période d’étude, un animal compagnon sera ajouté pour éviter l’isolement. Pour éviter des bagarres entre mâles, le compagnon sera un frère de la même portée si possible. Sinon un autre mâle du même âge sera ajouté dès le sevrage, ce qui réduira les risques. Après sevrage, les souris mutantes traitées ou non seront observées quotidiennement avec attention et des mesures de poids seront effectuées 2 fois par semaine. Avant sevrage, la fréquence est réduite à une fois par semaine pour limiter les manipulations et donc le stress pour la portée et la mère. Un aliment hydratant et nourrissant sera appliqué dès constatation que les animaux éprouvent des difficultés à se mouvoir. Des points limites adaptés ont été mis en place afin d’éviter toute souffrance animale. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress de l’animal lié à l’acte et assurer son immobilité.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène ColQ (pour collagène Q), responsable d’un syndrome myasthénique congénital, ce qui en font le plus petit modèle animal présentant les signes cliniques et pathologiques caractéristiques de cette maladie. Afin de favoriser l’expression de la protéine COLQ le plus tôt possible et de ralentir la progression de la maladie, les animaux seront traités dès la naissance, sachant que les animaux malades présentent des signes de la pathologie dès les premiers jours de vie. Les animaux seront suivis sur une période de 3 mois ou de 1 an, pour déterminer l’efficacité des traitements à moyen et long terme.