Rongeurs

3 075 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à trois injections dans l'œil et une lésion du nerf optique, au cours de chirurgies de cinq minutes. Toutes sont tuées pour que leurs tissus soient analysés, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur reconnaît que ces gestes peuvent enflammer l'œil ou l'endommager, et décrit en deux phrases l'ensemble des atteintes attendues. L'effectif de 3 075 animaux n'est rattaché à aucun calcul dans le RNT, qui mentionne seulement "l'utilisation de tests statistiques optimaux".

Objectifs

Les maladies du système nerveux représentent un défi sociétal majeur. En effet, le glaucome par exemple concerne plus de 10 millions de patients dans le monde. Cette maladie entraine la dégénération du nerf optique, le seul lien entre l’œil et le cerveau ce qui induit une perte définitive de la vue. Une voie de guérison consiste à protéger les neurones de la mort et à faire repousser le nerf optique pour reformer le circuit qui traite l’information visuelle. Ce projet a pour but de comprendre l’impact de l’expression génique dans les cellules sur la neuroprotection et la régénération. Nous allons manipuler chez l’adulte l’expression de ces protéines pour induire la régénération et permettre le retour visuel.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer de nouvelles cibles thérapeutiques permettant la neuroprotection et/ou la régénération du système visuel pour combattre des maladies comme le glaucome où il faut de nouveau connecter l’œil au cerveau.

Procédures

Les souris peuvent subir jusqu'a 3 injections dans l’œil et une lésion du nerf optique. Les chirurgies durent 5 min.

Impact sur les animaux

- L’injection intraoculaire peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil -La lésion du nerf optique chez les souris adultes peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil

Devenir

les souris sont mises à mort car notre projet nécessite de récupérer les tissus pour des analyses histologiques.

Remplacement

Pour atteindre nos objectifs, les expériences sur les souris sont essentielles et non remplaçables car i) les conséquences d’une lésion du système nerveux chez la souris sont les mêmes que chez l’humain, et ii) les mécanismes de croissance nécessitent l’intervention de différents types de cellules qui ne peuvent être mimés efficacement dans un système unicellulaire ou modélisé. Le modèle souris est reconnu pour la recherche sur la régénération du système nerveux central. Il est à noter que tous les candidats d'intérèts seront seront étudiés d’abord sur des cultures cellulaires.

Réduction

Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet : - tester les candidats identifiés in vitro sur des cultures cellulaires. -L’utilisation de tests statistiques optimaux pour avoir le nombre d’animaux le plus restreint tout en gardant une valeur biologique et statistique suffisante. Seuls les candidats les plus pertinents in vitro seront utilisées chez la souris.

Raffinement

Les interventions sur l’œil sont des chirurgies et seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris recevront une injection d’un médicament antidouleur et antiinflammatoire adapté avant et apres l’opération . Après chaque anesthésie, les souris seront placées sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil.

Choix des espèces

La régénération du système nerveux est un phénomènes multifactoriels qui permettent la formation d’un circuit neuronal. La modélisation de ces processus dans un système unicellulaire (telle que la culture cellulaire) ne permet ni d’identifier correctement les voies moléculaires ni de tester efficacement les capacités de régénération. La souris représente le modèle in vivo pertinent grâce à une grande similitude anatomique avec l’homme. Ceci n’est pas possible avec d’autres modèles tels que le poisson zèbre dont le système nerveux central régénère spontanément ou la drosophile dont le système nerveux est trop éloigné de celui des mammifères. La souris permet l’utilisation de toutes les chirurgies nécessaires pour les questions scientifiques que nous nous posons. Enfin, tous les modèles transgéniques nécessaires à notre projet sont disponibles chez la souris ce qui n’est pas le cas pour d’autres modèles tels que le rat. Pour l’ensemble des expériences proposées nous utiliserons des souris dont le système nerveux est mature. Nous voulons étudier les mécanismes de régénérescence dans le système nerveux central adulte pour être le plus proche possible des lésions chez l’homme.

120 rats non consanguins de six à huit semaines vont être utilisés, tous tués au plus tard quatorze jours après le début de la procédure, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une administration unique du composé, en intraveineuse ou par sonde de gavage, puis subit huit prélèvements sanguins à la veine saphène sous anesthésie. Le protocole se déroule sur des animaux sains et mesure où va la molécule dans l'organisme, combien de temps elle y reste et comment elle en sort. Le porteur situe ce passage chez le rat dans une séquence qu'il décrit comme classique, la première étape sur "organisme entier" avant "d'envisager éventuellement d'autres études plus avancées chez le chien ou le primate".

Objectifs

Les cancers hématologiques comme les leucémies, les myélomes et les lymphomes, sont des cancers qui se développent à partir de cellules du sang. En France chaque année, 33 000 personnes sont touchées par ces pathologies, en particulier les enfants, jeunes adultes et personnes âgées. Ils représentent 7% des cancers. Le traitement des cancers hématologiques repose en grande majorité sur la chimiothérapie à l'heure actuelle. Ces options thérapeutiques entrainent un certain nombre d’effets indésirables et leur efficacité diffère selon les patients. Malgré ces traitements, l’espérance de vie des personnes touchées par ces types de cancer varie de 2 à 5 ans après le diagnostic. Nous nous intéressons dans ce projet à un potentiel nouvel agent anticancéreux : une enzyme en tant que voie prometteuse dans les thérapies alternatives contre le cancer. Cette enzyme offre un avantage unique, sa capacité à cibler sélectivement et à inhiber la croissance des cellules cancéreuses sans nuire aux cellules saines.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine à moyen terme. En effet, il y a encore aujourd’hui des patients atteints de cancer hématologiques réfractaires aux traitements sur le marché. L’étude va permettre de développer de manière préliminaire une nouvelle molécule qui permettra au mieux de guérir les patients atteints de ce type de cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.

Procédures

Administration des traitements : contention et injection des composés en intraveineuse (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes) ou en gavage (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes). Les prélèvements de sang seront effectués à la veine saphène (anesthésie et prélèvement d’une durée de 30 secondes).

Impact sur les animaux

Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur de quelques secondes due à l'aiguille lors de l'injection intraveineuse. Les administrations par voie orale avec sonde de gavage génèrent un stress de quelques secondes lors de la contention. Les prélèvements de sang répétés vont générer un stress lors de l’anesthésie et du prélèvement (8 prélèvements au total par animal). Aucun signe de toxicité particulière lors de l'administration du composé aux doses testées dans ce projet n’a été observé chez le rat lors de l'étude préalable de tolérance.

Devenir

Tous les animaux auront été mis à mort au plus tard 14 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai afin de pouvoir réaliser les prélèvements de sang puis d’organes prévus dans la procédure.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, de nombreuses manipulations de caractérisation de notre composé d’intérêt ont été réalisées (études de cytotoxicité) ayant permis de sélectionner les types de cancers sur lesquels il serait le plus efficace. Ensuite, le passage chez le rat a permis l’évaluation de sa tolérance sur un organisme entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans l’organisme nécessitent d’être étudiés et définis sur l’organisme vivant sain avant de tester dans de futurs projets son efficacité sur organisme malade. Pour cette raison nous devons effectuer cette étude chez le rat.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de manière fiable sur cette étude préliminaire qui permettra de définir le cheminement du composé dans l'organisme. Pour la comparaison des quantités maximales du composé dans le plasma entre chaque groupe traité, nous utiliserons un test statistique fiable à multiple comparaisons. Pour le choix du nombre de rat par groupe qui nous permettra de pouvoir observer des différences entre les groupes et de choisir la dose ainsi que le mode d'administration les plus adéquats chez le rat, nous avons utilisé des logiciels statistiques reconnus. Les résultats de ce projet seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Les rats seront observés tous les jours par le personnel de l'animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des rats afin de détecter rapidement une souffrance, et 7 jours sur 7 dans le cadre de ce protocole par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des rats sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Les animaux seront hébergés en groupe de 3 rats par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, bâtonnet à ronger, tunnels pour jeux). Pour les groupes dont le composé sera administré par voie orale en gavage, des sondes de gavages en plastique flexibles évitant l'irritation et à usage unique seront utilisées.

Choix des espèces

Afin de plus tard développer cette molécule thérapeutique chez l'Homme, nous devons au préalable observer son devenir dans l'organisme chez l’animal, la première étape sur organisme entier étant classiquement réalisée chez le rat ou la souris avant d’envisager éventuellement d’autres études plus avancées chez le chien ou le primate. Pour ce faire, nous souhaitons étudier les paramètres pharmacocinétiques qui correspondent à : son absorption, sa distribution, sa métabolisation et son élimination en analysant les quantités de celui-ci dans le sang à différents temps après injection, dans les deux sexes chez le rat non consanguin. Les rats non consanguins sont utilisés pour l’évaluation toxicologique et pharmacologique des candidats-médicaments. Ainsi, les rats non consanguins présentent une plus grande diversité génétique, et sont donc plus intéressants pour les études de tolérance. Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 à 8 semaines afin que les animaux soient jeunes et en bonne santé.

Deux injections, une incision de la peau sous anesthésie, la pose d'un implant de titane recouvert d'un polymère, deux points de suture, puis une plaie inspectée chaque jour pendant trois jours et deux fois par semaine jusqu'à la mise à mort. 27 souris femelles de huit semaines suivent ce parcours, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour un prélèvement de tissu. Le porteur attend surtout des effets locaux, retard de cicatrisation, nécrose, infection, œdème ou hématome, et indique avoir réduit les groupes de cinq à trois animaux au vu de l'homogénéité des résultats antérieurs. Le choix de l'espèce vient d'une commande, le RNT précisant que "la demande de l'industriel a porté sur l'utilisation de la souris femelle âgée de 8 semaines".

Objectifs

Les infections bactériennes associées à la présence d’un biofilm représentent l'une des complications les plus graves suite à l'implantation de dispositifs médicaux. En particulier, les infections sur prothèse orthopédique sont particulièrement redoutées en clinique car elles sont associées à des échecs thérapeutiques et une morbi-mortalité importante. En effet, le biofilm qui recouvre ces prothèses est une matrice composée d’exopolysaccharides et de bactéries en dormance, présentant une sensibilité réduite aux antibiotiques et une faible accessibilité mécanique, ce qui donne lieu à des infections chroniques, extrêmement difficiles à combattre. Ainsi, l’inhibition de la formation de biofilm est un élément clé de la prévention des infections ostéoarticulaires sur matériel. Dans ce cadre, différents matériaux constituant les prothèses et présentant des caractéristiques antibactériennes sont actuellement à l’étude. Plusieurs polymères ont déjà montré des résultats intéressants in vitro. Toutefois, des essais doivent maintenant être conduits chez l’animal pour en vérifier la tolérance locale (et par la suite l’activité antibactérienne, en fonction des résultats obtenus). L’objectif du présent projet vise donc à évaluer la tolérance locale d’implants en titane, recouverts de différents polymères antibactériens, chez la souris, après implantation sous-cutanée.

Bénéfices attendus

A long terme, le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir développer un matériel innovant, permettant de d’inhiber l’apparition d’un biofilm bactérien sur un matériel étranger chez l’homme (ex : dispositifs médicaux ou prothèses). Avant cela, il est nécessaire d’en vérifier l’innocuité. Aussi, à court terme, le bénéfice attendu est de pouvoir sélectionner un ou plusieurs polymères antibactériens n’ayant pas de toxicité chez la souris parmi plusieurs candidats.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Deux injections (durant 2 secondes chacune) avant le geste chirurgical - Incision cutanée et suture sous anesthésie fixe

Impact sur les animaux

S’agissant d’un matériel étranger implanté en sous-cutané, les effets indésirables attendus pourraient principalement être de nature tissulaire (retard de cicatrisation, nécrose ou infection au site d’implantation, œdème, hématome, altération de la morphologie tissulaire). Les implants en titane sont déjà largement utilisés en pratique clinique et sont parfaitement tolérés. L’atteinte tissulaire chez les animaux serait davantage due au polymère recouvrant le titane mais les essais in vitro ne montrent pas de toxicité particulière de ces différents polymères. Par ailleurs, des essais similaires ont déjà été réalisés (implant titane recouverts d’autres polymères) et aucun effet indésirable n’a été enregistré.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux (27). Un prélèvement tissulaire sera réalisé post-mortem.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité des différents polymères de cette étude a déjà fait l’objet d’investigations menées in vitro sur des modèles cellulaires. Également, l’environnement complexe (tissu sous-cutané, cellules immunitaires …) est difficilement modélisable dans un autre système que le modèle animal. Aussi, l’utilisation du modèle animal est requise.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé pour établir la preuve de concept et discriminer rapidement un échantillon relevant de polymères. Les travaux précédents sur un modèle similaire avait requis l’utilisation de 5 animaux par groupe ; les résultats de l’analyse histopathologique ont montré une très bonne homogénéité et de ce fait, il a été décidé de n’utiliser que 3 animaux par groupe dans cette nouvelle étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à 3 par cage dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Lors de la mise en place de l’implant, les souris recevront une analgésie de palier 2 et une anesthésie fixe. Après l’incision, deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant du début de la chirurgie jusqu’à leur réveil. La plaie sera observée quotidiennement et désinfectée sur les 3j suivant la chirurgie puis 2 fois par semaine jusqu’à la mise à mort. Nos expériences précédentes nous informent que les souris reprennent une activité normale dès leur réveil et ne présentent pas de signes de souffrance particuliers. Toutefois, une grille de score nous permet de suivre individuellement chaque animal et d’établir un point limite défini par un score égal ou supérieur à 8.

Choix des espèces

Les modèles de biofilm sur implant utilisent le plus souvent le cochon d’Inde ou la souris. Dans notre cas, la demande de l’industriel a porté sur l’utilisation de la souris femelle âgée de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel de 22g (+/- 2g) et un système immunitaire mature. Également, dans un souci de comparaison avec les résultats antérieurs d’une autre étude, la souris sera choisie comme modèle dans cette étude.

Les expérimentateurs excluent de l'étude et mettent à mort tout animal dont l'état ne s'améliore pas, selon une grille de score prévue pour chaque procédure. 2 000 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à la fin pour prélever tissus et sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de six semaines et pendant une quarantaine de semaines, elles reçoivent un régime hypercalorique et des boissons au fructose qui les rendent obèses, diabétiques et porteuses d'une stéatose hépatique, avec une à deux administrations de composés par jour, des jeûnes de six heures, une épilation sous anesthésie pour l'échocardiographie et jusqu'à trente semaines d'hébergement seule en cage. La finalité déclarée est de disposer de modèles reproductibles, utilisables ensuite pour tester des candidats thérapeutiques contre l'obésité et la stéatose.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (environ 40 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possible. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (1 fois, durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement (max 3 fois). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes (1 fois). Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique (3 fois).

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (environ 40 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère (quelques minutes) . Pour pouvoir relever la consommation alimentaire et hydrique, nous pourrons être amené à héberger les souris de façon individuelle pendant une partie ou toute la durée du projet (jusqu'à 30 semaines). Les souris seront stressées par cet hébergement, même si elles voient et entendent leur congénères. Pour palier le stress engendré, du sur-enrichissement (petits tunnels suspendus, boule de bois notamment) sera ajouté dans les cages et le personnel est formé à l'approche délicate des animaux, aux gratouilles lors des préhensions. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h. Lors des mesures de composition corporelle, l'animal peut ressentir un stress léger modéré , cela dure environ 2 minutes.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Pour les animaux immunodéficients, nous mettrons en place une zone dédiée et un process clair pour garantir leur statut sanitaire. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique pour chaque procédure est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et le mettront à mort. Les prélèvements de sang seront fait sous couverture analgésique.

Choix des espèces

Les souris sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques et des comorbidités associées. Les animaux sont utilisés à partir de 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

Tuées à la fin du protocole pour vérifier au microscope la position des électrodes implantées dans leur cerveau, 455 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux chirurgies, la seconde durant de deux à quatre heures et demie, puis des séances d'enregistrement en contention pouvant atteindre trois heures par jour pendant une semaine. Une partie d'entre elles reçoit jusqu'à sept administrations de molécules anxiogènes ou panicogènes utilisées en psychiatrie, pendant que leur rythme respiratoire est manipulé, ce que le porteur décrit comme une physiologie inhabituelle source de stress. L'effectif tient en partie à un choix de méthode assumé dans le RNT, où la puissance statistique repose sur le nombre de neurones enregistrés plutôt que sur le nombre d'animaux.

Objectifs

La perception que nous avons de notre rythme respiratoire peut réguler nos états émotionnels. En effet, se concentrer sur sa respiration est une méthode de relaxation répandue et, au contraire, un emballement de la respiration peut provoquer des crises de panique. Cependant, le rythme respiratoire est lié à d’autres variables, comme l’activité physique, rendant difficile son analyse spécifique et limitant nos connaissances sur les mécanismes neuronaux de la perception respiratoire. Ce projet, réalisé chez la souris, a 4 objectifs (1) Développement d’une méthode de manipulation du rythme respiratoire pour pouvoir étudier spécifiquement la perception de la respiration. (2) Mesurer comment le cerveau représente l’information respiratoire. Pendant les stimulations respiratoires, nous enregistrerons chez la souris de grandes populations de neurones. Ces mesures permettront de relier l’activité neuronale aux stimulations respiratoires. (3) Evaluer le rôle du cortex dans l’utilisation de l’information respiratoire. Nous nous intéressons au cortex car les études chez l’humain ont mis en évidence son implication dans les dérégulations de la percéption du corps liée à l’anxiété. Nous effectuerons 3 tâches permettant de mesurer différents aspects de l’impact de la respiration : la perception respiratoire, l’effet de la respiration sur la prise de risque et sur l’apprentissage respectivement. (4) Evaluer l’impact de molécules utilises en psychiatrie dans l’utilisation de l’information respiratoire. Dans les trois même tâches que (3), nous évaluerons si 4 agents pharmacologiques impliqués dans l’anxiété ou la panique modifient l’impact du rythme respiratoire sur le comportement de l’animal. Ces objectifs contribueront, à plus long terme, à une meilleure compréhension de l’impact de la respiration sur les émotions et certaines maladies psychiatriques.

Bénéfices attendus

La perception que nous avons de l’état de notre corps, et en particulier notre respiration, repose sur un sens, appelé intéroception. Ce sens nous permet de répondre aux besoins de notre corps (repos, alimentation, régulation cardio-vasculaire…) mais participe aussi à nos prises de décision et à nos états émotionnels. En effet, se concentrer sur sa respiration est une méthode de relaxation répandue et, au contraire, un emballement de la respiration peut provoquer des crises de panique. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’intéroception sont mal connues. Le bénéfice principal de ce projet est d’établir un modèle animal de la perception intéroceptive respiratoire ce qui permettra d’adresser trois questions importantes sans réponse à l’heure actuelle : - Quelle est la précision de la perception intéroceptive respiratoire en comparaison avec les autres sens (audition) ? - Comment la respiration influence-t-il le comportement émotionnel et il y a-t-il un lien avec les maladies psychiatriques? - Quelles zones cérébrales sont fonctionnellement impliquées dans la perception respiratoire ? L’impact du contrôle de la respiration est très variables entre individus. Avoir un modèle animal de cette perception permettra donc d’une part d’identifier les bases neuronales pour mieux comprendre et contrôler la variabilité chez l’humain et de tester des hypothèses mécanistiques.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies. La première chirurgie dure 1heure, la deuxième entre 2 et 4h30. Les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement chez l’animal éveillé allant jusqu’à 3h pendant un maximum de 7 jours avec maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux feront également des tâches comportementales d’une à trois heures sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. Il y a au maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant les sessions d’enregistrement, certains animaux reçoivent l’administration d’un agent pharmacologique utilisé en psychiatrie (anxiogène, anxiolytique, panicolytique ou panicogène). Nous effectuons au plus une administration par jour chaque session étant espacée d’au moins 12h. Il y aura au maximum 7 administrations par animal.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques qui pourraient augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Pendant le projet, nous allons modifier le rythme respiratoire ce qui pourrait imposer une physiologie inhabituelle pour l’animal et donc un stress et réaliser des tests comportementaux qui peuvent induire une gêne aux animaux.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour pouvoir effectuer l’analyse histologique sur le cerveau afin de vérifier la position des électrodes implantées.

Remplacement

Ce projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible d’utiliser des neurones en culture ou tout autre modèle in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’activité respiratoire à l’état émotionnel et la prise de décision, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue des tâches de décision.

Réduction

Utilisation de méthodes à haut rendement : Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement de l’activité éléctrique du cerveau et de leurs variables corporelles qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaires pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Utilisation de statistiques adaptées : Dans cette étude, beaucoup de statistiques sont basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux ce qui permet d’acquérir une grande puissance statistique car les neurones sont enregistrés par centaines. Pour les tests qui nécessitent de comparer des groupes d’animaux, nous calculons la taille des cohortes basé sur ce qui est attendu d’après la littérature pour ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaires. Dès que possible, les expériences sont conçues pour effectuer des tests appariés (chaque animal est son propre contrôle) ce qui diminue la variabilité dans nos groupes et diminue donc le nombre d’animaux. Nous utilisons de méthodes accélérant l’apprentissage des tâches que nous avons montré efficace et qui permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des mesures comportementales.

Raffinement

Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. Hébérgement : Les animaux sont hébergés à plusieurs dans des cages enrichis (dôme, coton). Ils sont suivis quotidiennement par le personnel de l'animalerie et après chirurgie par l'expérimentateur grâce à la grille de suivis. Les animaux sont habitués progressivement à la manipulation. Points limites : Pour le suivi postchirurgical, une grille d’évaluation permet de donner un score de l’animal et donc d’implémenter des points limites gradués. Pendant les expériences comportementales l’observation du comportement de la physiologie de l’animal permettent d’implémenter des points limites gradués liés à l’inconfort de l’animal. Nous utilisons également les doses minimales d’agents pharmacologiques pour avoir l’effet escompté afin d’éviter des effets secondaires

Choix des espèces

Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles. La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal. De plus, la stratégie expérimentale nécessite l’utilisation de lignées transgénique (ayant une modification génétique qui nous permet de cibler des sous-types cellulaires) qui n’existent que chez la souris. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.