Rongeurs

3 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à différents points de la cinétique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection par jour pendant cinq jours pour inactiver un gène, puis jusqu'à trois prises de sang au cours de leur vie, et développent des lésions précancéreuses de la prostate qui peuvent évoluer vers des tumeurs de taille importante. Le projet vise à cartographier cette progression et à repérer des biomarqueurs sanguins et urinaires d'un diagnostic précoce du cancer de la prostate. Deux seuils déclenchent la mise à mort avant terme, une perte de poids supérieure à 20 % et un volume de prostate qui gêne la miction.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020. Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires à l’origine de l’agressivité des tumeurs est donc requise afin d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate, développés au laboratoire, répliquent les mutations du gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines. Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'Homme. L'objectif de ce protocole, qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs, est le suivi et la caractérisation des lésions précancéreuses de la prostate. Suite à l'invalidation du ou des gènes, des lésions, nommées néoplasies intraépithéliales prostatiques (PIN), se développent. L'évolution des PIN sera surveillée pendant une période suffisante afin de détecter l'apparition de formes agressives. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes d'apparition des formes agressives du cancer de la prostate afin d’identifier des nouvelles cibles thérapeutiques et des outils diagnostiques.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de cartographier l’évolution des lésions précancéreuses et l’implication des gènes étudiés dans cette évolution. Les prélèvements de fluides (urines et sang) nous aideront à mettre en évidence des biomarqueurs du cancer de la prostate permettant un diagnostic précoce de la maladie.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 1 injection quotidienne réalisés pendant 5 jours successifs, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ces injections seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur 20 animaux à chaque point de la cinétique (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12 et 15 mois après inactivation du gène), un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Une injection prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris.

Impact sur les animaux

Suite à l'injection, une infection peut se développer dans les journées qui suivent. Lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. La taille de tumeur, vérifiée par palpation abdominale, sera donc un point limite clé. Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement. les injections et les prélèvements de sang entrainent une légère douleur de courte durée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

L’effectif demandé a été calculé afin d’obtenir les groupes des souris mutantes à différents points cinétiques de taille suffisante pour réaliser les tests statistiques de sorte à pouvoir tirer des conclusions pertinentes de nos expériences. Pour un type de souris donné et un point cinétique donné, 20 souris seront utilisées. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction de nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. En revanche, sur les points clés, des expériences supplémentaires pourront être réalisées, toujours dans la limite de 3200 souris maximum.

Raffinement

Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Après injection, les souris seront observées pour détecter les éventuels signes de douleur ou de souffrance, à savoir la posture inhabituelle, le dos vouté, le poil hérissé, les grimaces, les vocalisations. Si ces signes persistent dans la journée suivant l'injection, les souris seront sorties de l'étude. De plus, lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, elles seront observées par l'expérimentateurs et le personnel de l'animalerie d'hébergement chaque semaine afin de contrôler la taille de la prostate par palpation et l’apparence générale de la souris. Les points limites de l’expérience seront le volume de la prostate et le poids de la souris. Si le volume de la prostate gêne une miction naturelle, les souris seront mises à mort et disséquées pour analyse histologique. Si la perte de poids est supérieure à 20% et/ou si la souris présente des signes de souffrance ou de détresse (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif, léthargie), la souris sera retirée de l’expérience et sacrifiée. Après chaque prélèvement sanguin, un volume équivalent au prélèvement de sérum physiologique sera injecté en sous-cutanée. De plus, le lieu de l'injection sera surveillé dans les journées suivantes afin de détecter des signes d'une éventuelle inflammation (rougeur, gonflement).

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans des gènes les plus fréquemment mutés dans les cancers de la prostate humain pour générer nos modèles. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à l’organisme adulte. Les animaux utilisés seront adultes, les injections de tamoxifène se feront sur des jeunes adultes à partir de 8 semaines après naissance.

Une grille de cotation de la douleur fixe le seuil au-delà duquel un rat sera mis à mort avant terme. 80 rats porteurs d'une mutation analogue à celle de la maladie de Huntington vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun subit une neurochirurgie d'environ une heure pour implanter des électrodes non amovibles, puis des enregistrements de douze à quarante-huit heures deux fois par mois pendant dix mois, des stimulations sonores mensuelles, et vit seul en cage pendant neuf mois avec un accès à la nourriture contrôlé. L'objet déclaré est de trouver des marqueurs électriques cérébraux transposables entre le rat et le patient, pour servir de test dans la mise au point de médicaments.

Objectifs

Les patients atteints de la maladie de Huntington, souffrent, en plus des symptômes moteurs et d'une altération de certaines capacités intellectuelles, de troubles du cycle veille-sommeil, ces perturbations du sommeil pouvant déjà être présentes au stade précoce (présence de symptômes avant-coureurs) de la pathologie. L'électroencéphalographie (EE) représente un outil de choix lors des tests précliniques en raison de son caractère transposable entre le rat et l’Homme car les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères ce qui permet donc l’application chez le rongeur d’observations faites chez le patient et inversement. Un modèle de rat porteur d’une mutation analogue à celle identifiée chez les patients atteints de la pathologie est disponible et a été caractérisé d’un point de vue comportemental. Il présente des troubles moteurs proches de ceux décrits chez l’Homme. Il est donc pertinent d’explorer les autres caractéristiques de la maladie décrites chez le patient afin de confirmer la pertinence de ce modèle dans l’étude de la maladie et la recherche de nouvelles solutions thérapeutiques. Dans ce projet, nous étudierons donc les phases de veille-sommeil et les oscillations cérébrales spontanées et évoquées dans un modèle de la maladie de Huntington.

Bénéfices attendus

La découverte et l’optimisation de nouveaux médicaments nécessite d’identifier des signes de la maladie dans le cerveau et des tests transposables entre les études cliniques et précliniques. Ils doivent permettre d’évaluer de façon fiable et robuste l’efficacité des molécules testées. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des rats modélisant la maladie de Huntington et chercherons à mettre en évidence des marqueurs de la maladie qui pourront par la suite être applicables à l’Homme et permettre de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux seront tous soumis à des enregistrements longs (12 à 48 heures) qui seront réalisés sur l’animal éveillé de façon bimensuelle avec un intervalle minimum d’une semaine, sur une durée de 10 mois maximum. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores qui seront réalisées sur l’animal éveillé une fois par mois (durée de quelques heures) sur une durée de 10 mois maximum (entre l’âge de 6 mois et de 15mois). Les stimulations sonores intermittentes dureront au maximum 2h. Les animaux sont hébergés de façon individuelle sur la totalité du projet à partir de la chirurgie (9 mois maximum). L’accès à la nourriture est contrôlé pendant la totalité du projet à l’exception des 2 semaines suivant la chirurgie.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress sur les animaux. Après implantation des électrodes, les animaux seront hébergés en cages individuelles, avec un contact social réduit (plusieurs semaines) ce qui peut engendrer du stress. Des troubles de la démarche et de la coordination sont décrits dans la littérature sur cette lignée.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électriques du cerveau qui ne sont pas amovibles. De plus, des analyses des tissus cérébraux sont nécessaires pour compléter la caractérisation du modèle et vérifier le positionnement des électrodes les animaux doivent donc être mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle étudie des mécanismes physiopathologiques complexes, comme le sommeil, qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou informatique).

Réduction

Les études sur le long terme présentent un avantage significatif en permettant à chaque animal de servir de contrôle pour lui-même, réduisant considérablement le nombre d'animaux nécessaires par groupe. Cette approche méthodologique nous a permis de déterminer le nombre d'animaux de manière à minimiser celui-ci, tout en veillant à préserver la validité scientifique et la fiabilité des résultats des expériences menées. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à nos études, les protocoles combineront un ensemble de recueil de mesures permettant de faire un suivi et d’obtenir plusieurs informations chez le même rat.

Raffinement

Le raffinement a été appréhendé à travers les conditions d'expérimentation et d'hébergement qui sont optimisées afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales. Les rats qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Les animaux seront regroupés dans une grande enceinte lors d’une session hebdomadaire afin de favoriser les contacts. Le projet prévoit des recueils des mesures engendrant des douleurs post-opératoires modérées. Toutefois, les animaux recevront un protocole de soins post-opératoires comprenant une évaluation clinique quotidienne, des antidouleurs et des anti-inflammatoires. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir le point limite, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. De plus, nous appliquerons des actes expérimentaux les moins invasifs possibles aux rats testés comme le choix d’une anesthésie gazeuse (par rapport à une injection). L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. La prise en compte de ces points permettra de juger du bien-être et d'éviter l'inconfort des animaux au cours de l'expérimentation de manière à garantir la qualité des résultats. Les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité sonore en dessous de l’intensité dommageable.

Choix des espèces

Nous utiliserons une lignée de rats dont la mutation est similaire à celle présente chez les patients de la maladie de Huntington. Le choix de l’espèce est donc directement lié à cette similarité : la mutation de ce même gène chez l’homme et le rat induit en effet des troubles similaires dans les deux espèces. Les animaux sont manipulés au minimum à l’âge de 6 mois puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. Les animaux seront gardés jusqu’à l’âge de 15 mois maximum. A ce stade, le cerveau est mature et présente des caractéristiques intéressantes pour reproduire les troubles observés chez le patient humain.

Jusqu'à vingt-six mesures d'audition sous anesthésie générale, de deux heures chacune, et treize injections à travers le tympan sur cent quatre-vingts jours : 560 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste des candidats médicaments contre la perte d'audition liée à l'âge chez des lignées qui développent une pathologie proche de la maladie d'Alzheimer, pour vérifier si traiter l'oreille ralentit le déclin cognitif. Chez ces souris, le porteur décrit des agressions plus fréquentes entre congénères, une baisse des interactions sociales et une masse corporelle réduite dès cinq à six mois. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever le cerveau et l'oreille interne, et parce que leur modification génétique interdit, selon lui, tout replacement ou réutilisation.

Objectifs

Des pertes d’audition même modérées ou légères peuvent augmenter à long terme un déclin cognitif et accélérer l’évolution négative des maladies neurodégénératives. Ceci est particulièrement vrai pour les cas de démences. A ce jour on estime que 4 millions des 50 millions de cas de démences dans le monde peuvent être en relation avec une perte d’audition liée à l’âge non traitée. Les différents mécanismes qui vont entrer en interaction entre les pertes d’audition liés à l’âge et le déclin cognitif vont être les suivants : - des dysfonctionnements du métabolisme énergétique des cellules nerveuses et de certaines voies de signalisation. - la privation sensorielle prolongée qui va avoir un impact sur diverses région cérébrales et accélérer le déclin cognitif. - une occupation des ressources cognitives plus importante pour traiter l’information auditive afin de compenser la dégradation de l’audition. Ce qui va réduire la ressource disponible pour les autres fonctions cognitives supérieures. - des modifications dans la relation structure/fonction de certaines zones du cerveau. Ainsi l’activité de certaines zones du cerveau sera modifiée du fait de la perte d’audition. Or certaines des zones qui seront modifiées sont des zones qui sont importante dans le traitement de la mémoire. Donc ces modifications pourront dégrader le traitement de la mémoire car les neurones disponibles dans ces zones seront affectés au traitement de l’information auditive. Dans le cadre de ce projet nous souhaitons évaluer l’efficacité de candidats médicament des pertes d’audition dans le contexte d’une maladie neurodégénérative qui est la maladie d’Alzheimer. Nous souhaitons donc traiter les animaux contre les pertes d’audition liées à l’âge suivre l’audition des animaux sur une période de 6 mois et enfin évaluer le stade de développement de la maladie ainsi que l’efficacité du traitement sur les pertes d’audition. Ce travail sera réalisé sur plusieurs lignées génétiquement modifiées. Les différentes lignées ont été choisies car celle-ci ont déjà fait l’objet de travaux de recherche dans l’audition.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de déterminer si un traitement des pertes d’audition liées à l’âge peut permettre d’améliorer le stade de développement d’une pathologie neurodégénérative. En validant cette stratégie thérapeutique sur des modèles animaux nous pourrons poursuivre le développement de ce projet chez l’homme. L’objectif étant de ralentir le développement de cette pathologie afin d’améliorer la durée de vie en bonne santé des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Anesthésie injectable pour réaliser les mesures d’audition chaque semaine depuis l’inclusion jusqu’à la fin de la procédure sur les 80 animaux inclus dans cette procédure. -Mesure d’audition sous anesthésie générale au maximum 26 fois sur une période de 180 jours. -Chaque mesure d’audition dure environ 2h. -Euthanasie des 80 animaux en fin de procédure. -Anesthésie injectable pour réaliser les mesures d’auditions chaque semaine depuis l’inclusion jusqu’à la fin de la procédure sur les 480 animaux inclus dans cette procédure. -Mesure d’audition sous anesthésie générale au maximum 26 fois sur une période de 180 jours. Chaque mesure d’audition dure au maximum 2h. -Traitement transtympanique sous anesthésie générale gazeuse chaque 15 jours depuis l’inclusion jusqu’à la fin de la procédure sur les 480 animaux inclus dans cette procédure. Cela représente un maximum de 13 injections sur une période de 180 jours. Chaque injection dure au maximum 45min. -Euthanasie des 480 animaux en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui sont attendus pour ce projet : Les animaux qui vont développer la pathologie de démence vont être atteint des symptômes suivants : Des pertes d’audition liées à l’âge. Des comportements d’agression plus fréquent envers leurs congénères chez les deux sexes et une diminution des interaction sociales. Une masse corporelle réduite par rapport aux animaux contrôle à partir de 5 à 6 mois d’âge.

Devenir

A la fin de chacune des procédure les animaux sont euthanasiés. Tout d’abord afin de collecter les tissus du cerveau et de l’oreille interne afin de réaliser des analyses pour évaluer l’efficacité du traitement et pour évaluer le stade de développement de la maladie d’Alzheimer. De plus cette euthanasie est justifiée car les animaux sont génétiquement modifiés donc ils ne peuvent pas faire l’objet d’un replacement ou d’une réutilisation dans un autre projet.

Remplacement

Le recourt à l’animal de laboratoire est nécessaire dans ce projet car nous souhaitons évaluer le bénéfice d’un traitement de l’audition dans le développement d’une maladie neurodégénérative. Ceci ne peut pas être réalisé sur des culture de cellules ou d’explant puisque nous étudions la synergie entre deux pathologies. Toutefois les candidats médicaments que nous allons tester ont été préalablement sélectionné par rapport à leurs effets positifs dans des modèles vitro, ex-vivo voir même in vivo.

Réduction

Afin de limiter les effectifs un calcul d’effectif est réalisé en amont. Ce calcul d’effectif a été en considérant le seuil d’audition comme variable principale. Ce calcul a été fait pour rechercher l’effectif nécessaire par groupe pour une amélioration de 20 décibels ou plus (en fonction de la fréquence) du seuil d’audition par rapport aux groupes contrôles.

Raffinement

Le contenu de ces études intègre les impératifs éthiques tels que : les modalités d’administration et de prélèvement, d’hébergement et d’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. Mais aussi la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal. Lors des procédures d’anesthésie de plus de 15minutes les animaux sont placés sur des tapis chauffants. Une hydratation par administration de sérum physiologique est mise en place après les anesthésies qui vont avoir une durée supérieure à 30 minutes. Des protocoles d’analgésie adaptés sont mis en place lorsque nécessaire par exemple pour les exsanguinations sous anesthésie générale avec laparotomie. Pour la réalisation des injections transtympaniques nous utilisons des endoscopes de très petite taille avec des aiguilles de très petite taille de diamètre afin de limiter la taille de la perforation du tympan. De plus lors de ces administrations répétées nous allons pouvoir vérifier l’apparition d’une inflammation de l’oreille externe ou le développement d’une otite de l’oreille moyenne. Mise en place de points limites précoces et adaptés. comme par exemple :l’absence prolongée de toilettage, tremblements, perte de poids …

Choix des espèces

Les lignées génétiquement altérées qui développent la pathologie neurodégénérative qui concernent ce projet n’existent que chez la souris. Les animaux seront tous des jeunes adultes ceci afin de démarrer les procédures avant le développement de la pathologie neurodégénérative. En fin d’expérimentation les animaux auront 8 mois d’âge afin d’arriver au stade précoce ou médian de développement de la maladie d’Alzheimer chez ces souches de souris.

Pour comprendre comment certains globules blancs entretiennent la parodontite, 64 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées au bout de quatorze jours. Une ligature est posée autour d'une dent sous anesthésie générale profonde, renouvelée quatre fois en deux semaines, et deux radiographies 3D des mâchoires s'y ajoutent, soit cinq anesthésies par animal. Le porteur indique que des douleurs gingivales et des abcès peuvent réduire la mastication et la prise de poids. Les nuisances décrites incluent des accidents de gavage, fausse route ou blessure de l'œsophage, alors qu'aucun gavage n'apparaît dans la description des procédures.

Objectifs

La parodontite est une maladie fortement prévalente qui entraine une destruction des tissus de soutien des dents, des édentements précoces et a des liens avec de nombreuses maladies inflammatoires chroniques. Elle est déclenchée par un déséquilibre de la flore bactérienne. La concentration de certains globules blancs dans la gencive est en corrélation avec la gravité de la parodontite. Inhiber certaines de leurs fonctions permettrait de diminuer l’inflammation. Notre projet vise inhiber certaines fonctions de ces cellules, dans un modèle de parodontite expérimentale chez la souris pour mieux comprendre le développement de cette maladie Le projet concerne 64 souris mâles et femelles, sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet peut permettre de mieux comprendre les mécanismes de la parodontite et ainsi d’ouvrir de nouvelles perspectives pour éviter la destruction tissulaire caractéristique de cette pathologie.

Procédures

Les souris seront soumises au modèle de parodontite : pose d’une ligature (5 minutes) par souris sous anesthésie générale profonde (4 anésthésies + 1 anésthésie avant la mise à mort, par animal), renouvelés tous les 3 jours pendant 14 jours (4 poses de ligature). Avant et à la fin de la mise en œuvre de ce modèle, une radiographie 3D (2 fois par souris) des machoires sera réalisée pour toutes les souris sous anesthésie légère gazeuse (2 fois par souris, durée 5 minutes/souris). Les animaux seront mis à mort après 14 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour tous les animaux pourraient être : - exceptionnellement pour les souris recevant la pose de ligature des douleurs gingivales post-opératoires, voir des abcès gingivaux, diminuant la mastication et la prise de poids des animaux. - une hypothermie au cours de l’anesthésie. - une résistance à l’anesthésie. - un éventuel accident pourrait survenir au cours des gavages, tel qu’une fausse route ou des blessures au niveau de l’oesophage. - Le gavage pourrait induire un stress modéré des animaux

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux sont mis à mort permettant le prélèvement des tissus nécessaires à nos travaux.

Remplacement

Nous développons une recherche sur modèle expérimental chez le petit animal, car c'est le seul moyen à l'heure actuelle d’étudier les différents aspects de notre projet. En effet les modèles animaux sont les seuls à reconstituer la complexité des interactions entre le système immunitaire, les pathogènes et le parodonte dans son ensemble. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives (in vitro, in silico) pour l’étude de la parodontite dans son ensemble.

Réduction

Nous utiliserons une lignée consanguine dont le fond génétique est contrôlé et homogène pour minimiser la variabilité des phénotypes et donc le nombre d’animaux à utiliser. Plusieurs paramètres expérimentaux (résorption de l’os alvéolaire par micro-scanner, analyses de l’infiltrat inflammatoire par histologie) ont déjà été determinés dans nos expériences précédentes. Basé sur nos études précédentes nous avons pu déterminer un nombre d’animaux minimum pour constituer des groupes statistiquement significatifs. Il est estimé qu’une réponse sur un nombre de 16 animaux (mâles et femelles) est suffisante pour obtenir une différence statistique.

Raffinement

Afin d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur les éléments suivants sont mis en place : (1) Les animaux seront hébergés en groupe sociaux, en milieu enrichi pour minimiser leur stress (2) Avant chaque examen radiologique, sans intervention chirurgicale, une anesthésie légère mais dont l’efficacité est validée, sera effectuée (3) Le gavage sera réalisé par des personnes formées et compétentes pour ce geste (4) Avant chaque pose de ligature les souris seront anesthésiées profondément (5) Après chaque anesthésie, les souris seront placées dans un environnement chauffé et surveillées jusqu’à leur réveil (6) Les animaux seront surveillés quotidiennement par personnel dédié de l'animalerie ou/et les responsables de projet (7) Des points limites ont été établis. (8) La mise à mort anticipée sera effectuée selon les méthodes réglementaires, en cas d’atteinte de points limites. (9) Une analgésie est administrée avant la mise à mort

Choix des espèces

Le modèle de parodontite induite par ligature chez la souris est un modèle d’étude pertinent permettant de reproduire plusieurs caractéristiques de la pathologie humaine (inflammation et resorption osseuse). Ce modèle est validé par la littérature scientifique. 3 mois – âge adulte avec croissance des maxillaires achevée

Les souris reçoivent une irradiation de 3 minutes et 4 secondes, une greffe de cellules de mélanome, de lymphome ou d'adénocarcinome, des injections tous les trois à quatre jours pendant quatre semaines, un gavage quotidien sur la même durée et un prélèvement de sang mandibulaire par semaine. 963 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie la douleur induite par ces manipulations de "faible intensité" et "très transitoire", tout en décrivant des tumeurs sous-cutanées qui se nécrosent et des métastases pulmonaires provoquant un déficit d'oxygénation. Aucun analgésique ni anti-inflammatoire n'est prévu, au motif qu'ils interféreraient avec les processus inflammatoires étudiés.

Objectifs

En France, le cancer est la première cause de décès. Pour mieux le soigner, de nouvelles méthodes, comme l’immunothérapie, ont été développées. L’immunothérapie aide le système immunitaire à combattre le cancer, notamment grâce à des cellules appelées lymphocytes T. Ces cellules peuvent être modifiées en laboratoire (on les appelle alors cellules CAR-T) ou stimulées avec des anticorps pour mieux attaquer la tumeur. Cependant, il arrive que ces cellules n’arrivent plus à détruire les cellules cancéreuses et deviennent "épuisées". Comprendre ce phénomène d'épuisement des lymphocytes T est donc très important pour améliorer les traitements d'immunothérapie du cancer. Ce projet de recherche cherche à mieux comprendre ce phénomène d’épuisement des lymphocytes T, en étudiant le rôle de deux molécules , Id2 et Msc, qui pourraient influencer ce processus. Les objectifs sont : 1. Déterminer si modifier ces molécules dans les cellules CAR-T permet de mieux ralentir la croissance des tumeurs. 2. Comprendre comment Id2 et Msc agissent sur le fonctionnement et l'épuisement des cellules CAR-T. En résumé, ce projet vise à rendre les traitements par immunothérapie plus efficaces contre le cancer, en empêchant les cellules immunitaires de s’épuiser.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet contribueront à l’optimisation de nouvelles approches thérapeutiques visant à améliorer l’efficacité des immunothérapies contre le cancer et aussi potentiellement pourraient permettre la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris subiront un pré-condionnement correspondant à une irradiation non léthale à une dose de 350 rads (3.5Gy) pour une durée de 3 min 4 s dans un irradiateur à rayon X. Elles subiront des injections sur le flanc d’une lignée tumorale (mélanome, Lymphome, adenocarcinome) ou dans le coussinet graisseux mammaire (lignée tumorale mammaire), ainsi que des injections de lymphocytes T et d'anticorps (1 injection tous les 3-4 jours pour un maximum de 4 semaines), des gavages (1 par jour pour un maximum de 4 semaines) et des prélèvements de sang mandibulaire (1 par semaine-maximum de 3 semaines). Toutes les injections ne durent que quelques secondes et s'effectuent sur animaux anesthesiés à l'exception des injections d'anticorps et des gavages qui s’effectuent sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les souris subiront un pré-conditionnement correspondant à une irradiation non léthale (3 min 4s d'irradiation). Elles seront aussi soumises à des injections, des gavages ainsi que des prélèvements de sang. Ces manipulations peuvent potentiellement induire un stress, une angoisse ou un inconfort et/ou une douleur de faible intensité et de manière très transitoire (secondes) . Certaines tumeurs sous-cutanées peuvent se nécroser dans ce cas les animaux sont mis à mort, occasionnellement les animaux peuvent subir une perte de poids. L'immunothérapie peut induire un peu de diahrée et perte de poids transitoire. Dans le cas des tumeurs mammaires des métastases pulmonaires peuvent être observées à un temps tardif pouvant engendrer un deficit d'oxygénation.

Devenir

Tous les animaux intégrés dans chaque procédure expérimentale seront mis à mort en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de cette pathologie humaine. En effet l’utilisation de modèles expérimentaux intégrés est essentielle à ce projet. En effet, l’environnement tumoral et l’organisation tri-dimensionnel de la tumeur sont des paramètres clés qui réguleront le recrutement, l'activation et les fonctions des lymphocytes T. A ce jour, cette complexité ne peut être entièrement reproduite in vitro. De même les différents types de cellule du système immunitaire patrouillent par voie sanguine dans l’ensemble de l’organisme et leur recrutement dans la tumeur est défini par l’anatomie de la tumeur. Cette régulation de l'adressage tissulaire des cellules immunitaires, n'est à ce jour pas reproduit fidèlement par les systèmes de microfluidique.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux nous utilisons des modèles de tumeurs transplantées robustes dans des conditions expérimentales optimisées pour une prise de tumeur chez plus de 90% des animaux. Nous avons également pu valider certaines approches expérimentales in vitro permettant d’optimiser l’utilisation des animaux. Afin d’assurer la fiabilité de nos résultats, nous travaillerons avec des groupes tests et contrôles d’au minimum 5 animaux et répéterons nos experiences 3 fois. Le nombre d’animaux utilisés correspond dans nos expériences et dans celles des groupes travaillant sur des modèles équivalents au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Ceci garantira la valeur statistique de l'étude en intégrant les variations expérimentales et les variations inter-individus. Les tests statistiques varient suivant les expériences et sont réalisés avec un logiciel de statistique adapté.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux par le personnel de la zootechnie qui évaluera leur état général (toilettage, mouvements), l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage); et tous les deux jours-trois jours par l'expérimentateur qui vérifiera leur poids et apportera une aide à l’alimentation en cas de besoin (ajout dans la cage d'aliment et d'eau sous forme de gelée (gel-diet et water-gel)), et qui évaluera le développement de la tumeur et l'état de santé globale des animaux (comportement, prostration, plaies) . Des points limites ont été mis en place. Ainsi pour évaluer précisément l'etat général des animaux nous utiliserons une fiche de scoring afin de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites définis sur la fiche de scoring. Si immédiatement après ou le lendemain d’un gavage ou d’une injection, un animal cesse de s’alimenter et devient prostré, il sera mis à mort. Le projet ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ils risquent d’interférer avec les processus inflammatoires au cours de notre expérimentation. Même les anti-douleurs de type morphinique ont des propriétés immunomodulatrices.

Choix des espèces

La possibilité de générer des modèles soit sur-exprimant soit déficient pour une molécule d’intérêt font des souris un modèle de choix pour mieux comprendre les interactions entre le système immunitaire et les tumeurs naissantes. Par ailleurs, les modèles murins pré-cliniques ont montré leur pertinence dans la découverte et le développement de nouvelles immunothérapies. La disponibilité d'anticorps spécifiques d'un nombre conséquent de molécules permet d'analyser finement les différentes composantes du sytème immunitaire et de leur environnement par cytométrie en flux ou par imagerie. De plus, nombre de ces anticorps sont des agonistes ou antagonistes des voies de signalisations induites par ces récepteurs, ils peuvent donc être utilisés afin de moduler le système immunitaire ou de préciser les mécanimes impliqués dans le processus biologique étudié. Des souris adultes, agées de 2 mois seront utilisées afin de pouvoir étudier les effets des manipulations sur un système immunitaire mature. Les souris sont considérées comme adultes entre 6-8 semaines d’âge. Avant toute procédure elles auront une semaine d’acclimatation.