Rongeurs

Implantés d'électrodes crâniennes au cours d'une chirurgie d'environ une heure, isolés une semaine pour que leurs congénères ne touchent pas les sutures, puis enfermés huit heures par jour dans des cages sans accès à l'eau, des rats sont exposés six heures durant à des composés organiques volatils. La séquence se répète cinq à sept fois par animal, deux jours par semaine, pour chacun des treize composés testés, soit 416 rats dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend de la somnolence, des troubles de l'équilibre et des problèmes de coordination, qu'il décrit comme réversibles. L'objet est de situer les seuils d'effet sur l'activité cérébrale par rapport aux limites réglementaires de l'air des ateliers. Tous sont tués par prélèvement final du sang et du cerveau.

Objectifs

Dans l’industrie, de nombreux Composés Organiques Volatils (COV) sont utilisés. Lorsqu’ils se dispersent dans l’air des ateliers, ils peuvent être inhalés par les travailleurs, passer dans le sang et s’accumuler dans certains organes, notamment le cerveau. Ce projet s’inscrit dans la continuité d’études précédentes et vise à mieux comprendre les effets immédiats de certains des COV sur le cerveau, encore mal connus. L’objectif est double : d’une part, comparer la toxicité de plusieurs substances appartenant à une même famille chimique, et d’autre part, confronter les seuils d’effet aux limites réglementaires existantes et aux mesures réalisées en milieu professionnel.

Bénéfices attendus

Les Composés Organiques Volatils (COV) sont des substances qui peuvent provoquer des effets immédiats sur l’activité du cerveau comme la somnolence, une sensation d'ébriété ou des troubles de la concentration. Cependant, pour de nombreuses substances, nous ne savons pas exactement à partir de quelle concentration ces effets apparaissent. C’est pourquoi des rats seront exposés à diverses concentrations de COV alors que leur activité cérébrale est enregistrée, afin de déterminer la concentration au-dessus de laquelle l’acitivté du cerveau est modifiée. Si certaines substances s’avèrent dangereuses à des niveaux proches de ceux retrouvés dans l’air des lieux de travail, ces résultats permettront d’alerter sur un risque potentiel pour la santé des travailleurs. En parallèle, des analyses sanguines et cérébrales seront menées après l’exposition. Cela nous aidera à faire le lien entre la quantité de COV dans l’organisme et les conséquences de cette imprégnation sur l’activité du système nerveux central. Ces données, aujourd’hui majoritairement absentes de la littérature scientifique, permettront d’apporter de nouvelles connaissances sur les risques liés à l’utilisation des COV dans l’industrie, ainsi que sur la toxicité aiguë de ces substances chez l’animal.

Procédures

Treize COV seront testés dans le cadre de ce projet. Les nombres d’animaux indiqués s’entendent pour chaque COV. Pour chaque COV testé, des animaux différents sont utilisés. Ils sont répartis en deux groupes suivant deux procédures différentes. Les animaux de la première procédure (10 mâles et 10 femelles) sont tout d’abord implantés avec des électrodes à demeure permettant de recueillir l’activité du cerveau pendant l’exposition au COV. Cette implantation requiert une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie qui dure environ 1 heure. Après une semaine de récupération, au cours de laquelle les animaux seront en hébergement individuel afin d’éviter que les congénères n’explorent les sites d’incision ou de suture, ils seront exposés deux jours par semaine à diverses concentrations de COV (à raison de 6h par jour). Pendant ces journées d’exposition, la durée totale dans les cages d’exposition est de 8 heures, car l’exposition au COV est précédée et suivie de deux périodes d’une heure lors desquelles l’air n’est pas chargé en COV. Au total, ces journées d’exposition se répètent entre 5 et 7 fois par animal. Enfin, les animaux sont mis à mort par prélèvement final du sang et du cerveau (5 minutes maximum, sous anésthésie profonde). Les animaux de la deuxième procédure (6 mâles et 6 femelles) suivent la même séquence d’interventions, à l’exception de la chirurgie crâniènne.

Impact sur les animaux

Les substances étudiées ici peuvent affecter l’activité du cerveau. Il est donc possible qu’on observe des effets comme de la somnolence, des troubles de l'équilibre ou des problèmes de coordination. Ces effets, bien que réversibles, seront attentivement surveillés. À la suite d’une intervention chirurgicale prévue pour une partie des animaux, un hébergement individuel sera temporairement mis en place pendant environ une semaine, afin d’éviter que les autres animaux ne touchent les zones opérées. Pendant cette période, les animaux seront logés dans des cages transparentes et grillagées leur permettant de rester en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Des éléments d’enrichissement (tunnels, matériaux à ronger et à manipuler) seront ajoutés dans les cages pour réduire le stress lié à l’isolement. Pendant les expositions, les animaux seront placés dans des cages qui ne permettent pas l’accès à l’eau. Il est possible que cette contrainte puisse provoquer du stress chez eux, raison pour laquelle ils seront habitués progressivement à cette situation.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures, afin de prélever les tissus nécessaires pour les analyses.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable ici car on essaye de comprendre comment les COV altèrent la fonction cérébrale et comment ils s'accumulent et sont éliminés dans un organisme entier ; il faut ainsi un organisme avec un métabolisme fonctionnel. Les tests en laboratoire sur des cellules ou des tissus isolés, ou les modèles mathématiques, ne permettent donc pas de répondre à ces questions.

Réduction

Le protocole a été construit de telle sorte que le nombre d’animauxrequis soit réduit à son minimum, tout en incluant à la fois des mâles et des femelles afin d’avoir des résultats représentatifs des deux sexes. Au lieu d’utiliser un groupe d’animaux pour chaque condition expérimentale, nous avons mis en place un système où chaque rat est soumis séquentiellement à toutes les conditions expérimentales. Il est donc son propre témoin. Cela permet de s’affranchir des différences de sensibilité entre les animaux, d’augmenter la puissance statistique et d’utiliser beaucoup moins d’animaux.

Raffinement

Tout au long du projet : Les animaux seront manipulés avec soin par du personnel qualifié et surveillés chaque jour pour évaluer leur état de santé et leur comportement. Ils seront hébergés par deux dans des cages enrichies (tunnels en carton, blocs à ronger, matériaux de nidification), avec un accès libre à la nourriture et à l’eau, sauf durant les phases d’habituation et d’exposition (maximum 8 h). Autour des chirurgies : Un analgésique sera administré avant l’intervention, et un anti-inflammatoire deux fois à 24 h d’intervalle après. L’induction de l’anesthésie sera réalisée à l’isoflurane à 5 % dans un mélange air/oxygène, puis maintenue à une concentration de 2 à 3 % pendant toute la durée de l’intervention. Un gel ophtalmique évitera le dessèchement des yeux, une pommade cicatrisante sera appliquée sur les plaies, et une injection de sérum physiologique assurera la réhydratation. Le réveil aura lieu en armoire chauffée à 28 °C sous surveillance, avant le retour en hébergement. Une alimentation en bouchons et sous forme gélifiée facilitera l’accès à la nourriture. Pendant les 5 jours suivant la chirurgie, les animaux seront observés (douleur, comportement) et pesés quotidiennement. Ils seront logés seuls pour éviter que leurs congénères ne touchent les zones opérées ou n’abîment le dispositif implanté, mais dans des cages transparentes pour maintenir un contact visuel. Si possible, ils seront ensuite remis par deux, avec un environnement enrichi. Pendant l’exposition aux COV : Une habituation progressive aux cages compartimentées et aux enceintes d’inhalation réduira le stress. Les animaux seront aussi entraînés à la manipulation pour la pose/retrait de l’appareil d’enregistrement de l’activité cérébrale. Lors des expositions, ils seront placés individuellement dans des compartiments grillagés, permettant un contact visuel et olfactif entre eux. Ils seront observés toutes les 2 heures, et une fiche consignera tout signe clinique. Si un score d’arrêt est atteint, l’exposition s’arrêtera et les animaux seront surveillés pendant 2 heures pour vérifier leur bien-être. Les données des appareils d’enregistrement seront transmises en direct aux ordinateurs des expérimentateurs, afin de détecter rapidement un signal plat ou des interférences liées à des mouvements anormaux.

Choix des espèces

Le rat a été sélectionné parce que son métabolisme traite les COV de façon similaire à celui de l’humain. Cela permet d’obtenir des résultats plus pertinents pour comprendre leurs effets sur l’Homme. Nous avons choisi une souche de rats pigmentés, qui possèdent de la mélanine, un pigment également présent chez l’Homme. La mélanine joue un rôle protecteur contre certaines substances toxiques. À l’inverse, les rats albinos, qui n’en ont pas, sont plus sensibles à certaines substances. De plus, cette souche a déjà été utilisée dans nos études précédentes, et nous allons continuer à l’utiliser pour assurer la cohérence des résultats entre les différentes expériences. Des animaux des deux sexes sont étudiés ici car il pourrait exister des différences entre mâles et femelles sur l’effet des COV sur l’activité du cerveau, ainsi que sur la distribution et l’élimination de ces polluants par l’organisme. Les rats seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 3 mois), période à laquelle le système enzymatique hépatique, impliqué dans le métabolisme des substances testées ici, est considéré comme pleinement fonctionnel. Ces choix nous permettront d’obtenir des données plus précises et applicables à l’Homme.

Nourries au régime gras, gavées, injectées chaque jour pendant vingt-huit jours dans l'abdomen puis insérées dans un tube étroit pour l'imagerie, 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 325 sont tuées pour les analyses post-mortem et 65 réutilisées. Un seul test impose sept prélèvements de sang en deux heures, chacun par une incision de la queue. Le projet cherche par quels mécanismes un double agoniste des récepteurs aux incrétines améliore le sucre et les graisses, dans une famille de médicaments déjà largement commercialisée. Le porteur écrit que le régime gras peut altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l'anxiété, et classe l'ensemble du projet en souffrance modérée.

Objectifs

Afin d’améliorer la quantité trop importante de sucre dans le sang, chez le diabétique de type 2, plusieurs approches médicamenteuses sont possibles. Parmi elles, il existe une famille de molécules proches d’hormones naturellement produites par l’intestin. A l’heure actuelle, les médicaments de cette famille sont nombreux sur le marché, mais ne cible généralement qu’un seul site d’action. La molécule de cette étude est la première capable de cibler deux sites à la fois, lui conférant ainsi un potentiel thérapeutique plus important que les médicaments actuellement le marché. L’avantage d’avoir deux cibles réside dans le fait que des mécanismes d’action différents et complémentaires pourraient exister et donc permettre une efficacité supérieure. L’étude de l’action de ce type de médicament a mis en lumière le fait qu’en plus d’améliorer le diabète, elles étaient capables d’améliorer le métabolisme des graisses, souvent perturbé chez le diabétique. En effet, l’accumulation de graisses dans le foie, est un phénomène courant chez le diabétique et a des effets délétères sur l’organe mais aussi sur le diabète en général. Le but de ce projet est d’identifier comment la molécule étudiée dans ce projet ciblant deux sites améliore le métabolisme à la fois du sucre et des graisses chez un modèle de souris obèse/diabétique et en particulier d’identifier quels sont les mécanismes d’action permettant ces améliorations au niveau du foie en essayant de discriminer l’implication de l’un ou l’autre site d’action. Pour permettre la mesure des paramètres pertinents pour cette étude, ce projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

La prise en charge et le traitement du diabète de type 2 et de ses complications est un enjeu de santé publique de plus en plus prégnant. Les stratégies médicamenteuses bien que multiples voient leurs limites dans le fait qu’elles ne ciblent généralement qu’un site d’action et donc qu’un point précis du métabolisme, limitant ainsi les effets. Les études préliminaires sur les effets de la molécule de cette étude semblent montrer une efficacité accrue en raison de sa capacité à cibler simultanément les deux sites d’action. L’intérêt d’un tel ciblage est que l’activation des deux sites entraîne des effets différents et complémentaires. Là où deux molécules étaient nécessaires, avec la molécule de notre étude une seule serait suffisante. De plus, d’un point de vue « pratique », les études montrent qu’une prise hebdomadaire chez l’Homme est suffisante pour permettre d’avoir les effets escomptés. Néanmoins, certains effets bénéfiques en relation avec le métabolisme lipidique et notamment avec un site d’action particulier restent à déterminer En résumé, le développement et la compréhension du mécanisme de la molécule de cette étude devrait permettre de contrôler plus efficacement le diabète de type 2 et d’apporter un confort au patient par l’administration d’une prise hebdomadaire unique de la molécule.

Procédures

Pour les tests nécessitant un gavage, les animaux vigils recevront un bolus unique par gavage. Cette manipulation prendra une dizaine de secondes. Pour chaque test nécessitant des mesures sur le sang, un prélèvement de sang se fera sur animaux vigiles et consistera : - en un prélèvement unique de 100 µl sur 2 minutes à J-4. - ou de 7 prélèvements de 30 secondes sur 2h à J+25 ou J+27 selon le test utilisée Pendant les 28 jours de traitements, les drogues seront administrées par injection dans la partie abdominale sur les animaux vigils, qui auront été habitués à leur manipulateur. Cette intervention prend moins de 10 secondes par animal. En ce qui concerne l’imagerie, les souris, vigiles, seront insérés dans un tube permettant la contention et la mesure indolore durera 3 minutes. Toutes les interventions citées ici exceptée la dernière se tiendront dans l’EU1, La technique d’imagerie se tiendra dans l’EU2.

Impact sur les animaux

En plus d’une perturbation du métabolisme, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer la capacité des animaux à se Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété. Les gavages nécessitent la contention de la souris, celui-ci peut provoquer un stress. De plus le gavage peut provoquer une fausse route. Les prélèvements de sang au cours des différents test de tolérance (glucose, insuline et lipides) nécessitent une petite incision à la queue qui peut provoquer une douleur légère et passagère. L’imagerie se fera par insertion de la souris dans un tunnel sombre qui permet la mesure. Cet environnement étroit et nouveau, peut entraîner un stress durant la mesure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux. Les animaux qui ne seront pas entrés dans le protocole de traitement, suite au régime serviront pour l’enseignement ou des mises au point techniques.

Remplacement

L’obésité et le diabète de type 2 sont des maladies multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du sucre dans le sang, ce qui a des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences de cette pathologie, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. Par ailleurs l’utilisation de modèles cellulaires in vitro, issus des animaux obèses diabétiques nous permettra de mieux comprendre l’impact direct des traitements sur les différents organes et évitera l’utilisation d’un certain nombre d’animaux supplémentaires pour les études in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur les molécules antidiabétiques, nous avons pu au cours des projets réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de tester beaucoup de doses, ni de multiplier les temps de traitements pour ce type de molécule. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux. Ainsi des tests in vivo et des prélèvements d’organes seront réalisés chez les mêmes animaux. Pour ces raisons, avec une seule dose et un seul temps de traitement, nous avons réduit le nombre d’animaux pour mener à bien ce projet et obtenir un puissance statistique suffisante. En ce qui concerne le travail in vitro nous avons essayé d’optimiser le nombre pour permettre de travailler sur l’ensemble des tissus d’intérêts aux différentes doses et temps escomptés. Grâce à notre expérience de ce type de traitement et au nombre important d’animaux issu de la partie préliminaire (suite au régime et avant la division en groupe pour le traitement), nous pourrons limiter les tests à une partie seulement des souris : petit nombre d’animaux pour avoir des résultats significatifs. Notre expérience dans ces techniques in vitro nous permet de rationaliser ce nombre pour ne pas multiplier les conditions expérimentales.

Raffinement

Par expérience, nous appliquerons des conditions optimales à l’obtention du modèle en permettant de maintenir le bien-être nécessaire. Afin d’éviter le stress de l’isolement, les animaux seront plusieurs par cage (5 à 10). De plus, les animaux auront à disposition dans les cages des objets permettant l’enrichissement nécessaire : des tunnels en plastique permettront de diminuer le stress et de réduire l’ennui en stimulant l’activité et permettant un sentiment de sécurité. De plus de la « frisette »de carton, permettra aux animaux de créer un nid et de s’y réfugier, renforçant le bien-être et ce sentiment de sécurité. Les animaux auront libre accès à un biberon d’eau et des objets d’enrichissement de milieu seront placés dans les cages. Une partie de la nourriture pourra directement être placée dans la cage pour permettre aux souris obèses ayant des problèmes de mobilité d’avoir accès à la nourriture plus facilement. Les tunnels d’enrichissement seront aussi placés à proximité de la nourriture et l’eau pour permettre aux souris de monter sur ces objets et de leur donner un accès plus facile. Pour ce qui est de l’anesthésie, nous utiliserons un anesthésique chimique lors des procédures 2, 3 et 4 qui se tiendront dans l’EU 1 et un gaz anesthésiant lors de la procédure 1 qui se tiendra dans l’EU 2. Pour le transport des animaux entre les deux EU (fin de procédure 1), les souris seront mises dans une cage contenant du coton avec un couvercle filtrant et transportées dans l’EU2 qui se trouve en face du lieu où les souris sont hébergées (EU1). Le temps de trajet estimé est de moins de 5 minutes. Au cours de ce transport, les cages seront mises dans un sac noir afin de préserver les souris de l’environnement extérieur en termes de température et de stress. Nous veillerons aussi au points limites du projet engendré par le diabète de type 2 qui consiste principalement en une déshydratation, en veillant à réhydrater ces derniers en cas de besoin. Enfin, en ce qui concerne les traitements et prélèvements, le personnel maitrise très bien les gestes techniques nécessaires au bon déroulement du prélèvement de sang servant à la mesure de la glycémie ainsi que la mise en œuvre des injections intrapéritonéales. Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la structure chargée du Bien-être Animal du Centre de zootechnie.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie est le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Leur métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Les animaux utilisés seront des jeunes males de 4 semaines. L’utilisation d’animaux jeunes se justifient par le fait qu’à cet âge, l’efficacité du régime est optimale car ils sont en pleine croissance. Ceci permet donc de limiter le temps de régime et donc le stress et les nuisances engendrées. Par conséquent, les traitements qui auront lieu par la suite seront réalisés sur ces mêmes souris devenus adultes (20 semaines)

600 rats et 480 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun suivi jusqu'à vingt-quatre mois, tous tués pour prélever leurs organes. À 3, 6, 12, 18 puis 24 mois, ils subissent trois prises de sang dans une même journée sur animal vigile, une quatrième sous anesthésie, et jusqu'à seize heures d'isolement pour recueillir leurs urines, les rats étant privés de nourriture. Des tumeurs apparaissent, spontanées ou provoquées par le produit testé, et le porteur indique que les animaux sont gardés en vie tant qu'elles ne remettent pas en cause leur déplacement, leur capacité à boire ou à manger, et qu'aucune ulcération n'apparaît. Le produit peut aussi provoquer chez le rat une opacité de la cornée et une cécité. Cette étude sert à faire entrer une molécule chimique sur le marché, et le porteur précise que les deux groupes supplémentaires exigés par les lignes directrices chinoises ne seront pas utilisés puisque la molécule n'y est pas destinée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les risques pour la santé liés à l’exposition à un produit chimique spécifique tout au long de la vie de l’espèce considérée, avant sa mise sur le marché. Pour cela, nous réaliserons une étude combinée de toxicité chronique et de cancérogénicité. Ce projet permet de recueillir des informations sur les effets toxiques de la substance, y compris son potentiel cancérogène, tout en identifiant les potentiels organes cibles et la possibilité d’accumulation du produit dans ces derniers. De plus, il peut fournir une estimation de la dose sans effet nocif observé pour les effets toxiques, ainsi que, dans le cas de substances cancérogènes non génotoxiques, des réponses tumorales. Ces estimations sont cruciales pour établir des critères de sécurité concernant l'exposition humaine et donc le potentiel effet cancérogène pour l’homme. Pour caractériser et évaluer la cancérogénicité potentielle ainsi que la toxicité chronique de ce produit chimique, l’installation d’essai intègre toutes les informations disponibles sur la substance à tester.

Bénéfices attendus

Les études d’exposition chroniques et de cancérogenèse vont permettre : l’identification des propriétés cancérogènes d'un produit chimique susceptible d'augmenter les risques de tumeurs, la fréquence de survenue de tumeurs bénignes ou malignes ou la diminution du temps nécessaire à leur apparition, par rapport au groupe témoin non traité ; l’identification de la toxicité chronique d’un produit chimique ; l’identification d'un ou de plusieurs organes cibles de la toxicité chronique et de la cancérogenèse ; la caractérisation de la relation dose-effet ; l’identification d’un niveau de dose sans effet nocif observé ou du point de départ de l’effet pour l’établissement d'une dose de référence ; l’extrapolation des effets cancérogènes aux niveaux d’exposition humaine correspondant à de faibles doses ; la prévision des effets de toxicité chronique aux niveaux de doses représentatifs de l'exposition humaine ; l’obtention de données permettant de vérifier les hypothèses concernant le mode d’action de la molécule. Toutes ses données seront rapportées, soumises aux autorités internationales et serviront à l’analyse du risque pour l’homme.

Procédures

Aprés 3, 6, 12 et 18 et/ou 24 mois environ, 3 prélèvements sanguins sont réalisés au cours d'une même journée en moins de 2 minutes sur animaux vigiles. Aprés 3, 6, 12 et 18 et/ou 24 mois environ, 1 prélèvement sanguin est réalisé en moins de 2 minutes sur animaux anesthésiés. Aprés 3, 6, 12 et 18 ou 24 mois environ au cours de l’étude, les animaux peuvent être isolés pour une durée maximale de 16h (avec mise à jeun pour les rats) pour le recueil de leurs urines. La mise à mort précédée par une administration d'un analgésique et d'une anesthésie.

Impact sur les animaux

Les niveaux de doses sont fondés sur les résultats des études précédentes. Le choix de la forte dose doit permettre l’évaluation d’une dose bien tolérée par les animaux et induisant une toxicité légere à modérée. Les prelevements de sang peuvent induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prelevement. Pour la mesure et le prelevement d’urines, les animaux sont isolés pendant 16h maximum (avec mise à jeun pour les rats). La veille des autopsies prévues, les rats n’ont plus accès à la nourriture pendant 16 h maximum ce qui peut induire un stress léger ainsi qu’une baisse de poids. Compte tenu de l’objectif de l’étude et de sa durée, des tumeurs bénignes ou non , spontanées ou induites par le produit peuvent apparaitre, les animaux seront gardés en vie tant que la taille des tumeurs ne remet pas en cause leur déplacement, et leur capacité à boire ou à s'alimenter(

Devenir

En raison du but de l’étude qui est d’évaluer l’atteinte au niveau des tissus, des organes de l’animal et l’apparition de tumeurs, tous les animaux seront mis à mort pour prelevement d'organes .

Remplacement

Malgré les nombreux tests in silico ( évaluation grace à des calculs/modéles complexes informatisés), in-vitro (essais réalisés sur micro-organismes, organes ou cellules) , et in-vivo conduits lors du developpement de cette molecule qui ont permis de mettre en évidence le mode d’action et les organes cibles de la molécule, ces études animales restent une obligation avant la mise sur le marché d’une nouvelle molécule chimique. Il n’existe pas aujourd’hui de tests substitutifs validés et acceptés par les autorités relatifs à l’évaluation de tumeurs après une exposition chronique.

Réduction

L'essai combiné dans l’étude rat ou l’ajout d’un sous-groupe pour mise à mort intermédiaire (phase chronique) dans l’étude souris permet une meilleure efficacité en temps et en coûts, et un moindre recours aux animaux, par rapport à la conduite de deux essais séparés, et ne compromet pas la qualité des données de la phase chronique ou de la phase de cancérogenèse. La taille des groupes est la taille minimale requise par la ligne directrice. La molecule n’étant pas destinée au marché chinois, les groupes supplémentaires requis par les guidelines chinoises (2 groupes de 10 animaux par doses et par sexes mis à mort après 6 et 18 mois d’exposition) ne seront pas nécessaires.

Raffinement

Compte tenu de la durée de l’étude, une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée et une attention particulière sera portée à l’apparition de tumeurs spontanées ou induites par le produit. Ces tumeurs seront recherchées, observées et mesurées au moins 1 fois/semaine afin de suivre leur progression et/ou l’apparition de zone de nécrose. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Lors des prises de sang en cours d’étude l’usage d’un tapis chauffant pourra être utilisé pour maintenir la température corporelle des animaux sous anesthésie. Des micro prélèvements seront utilisés pour l’évaluation des paramètres toxicocinétiques. Le jour précédent leur mise à mort les animaux sont déplacés dans une salle proche de la salle de nécropsie pour éviter le stress du transfert le jour même. Les prélèvements de sang sont réalisés dans une salle séparée et différente de celle utilisée pour la mise à mort. Afin d’éviter toute douleur, les animaux seront mis à mort après une analgésie à l’aide d’un opioïde de type méthadone suivi d’une anesthésie gazeuse à l’isoflurane.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les modèles expérimentaux choisis en raison de leur durée de vie relativement courte, de leur utilisation fréquente dans les études pharmacologiques et toxicologiques, de leur sensibilité à l'induction de tumeurs et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Les rongeurs sont recommandés par la communauté scientifique et les instances réglementaires. Des données historiques issues des études précdemment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec les espèces et souches choisies (Rat Wistar et souris C57Bl6J). Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Les animaux utilisés sont de jeunes animaux sevrés à l’arrivée sur le lieu de l’expérimentation dont l’âge après la période d’acclimatation doit être inférieur à 8 semaines compte tenu de l'objectif et de la durée de l'étude (exposition pendant toute la vie de l'animal). Cet age est requis par les lignes directrices internationales.

Six gestes d'administration répétés chaque jour pendant deux semaines sur des animaux vigiles maintenus en contention, et trois gestes de prélèvement sanguin : 300 souris et 300 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau. Ces gestes ne répondent à aucune question scientifique, ils entraînent des expérimentateurs à les maîtriser et à valider leur habilitation. Le porteur affirme que cet apprentissage sur des animaux vivants est "indispensable" et ne peut être remplacé, les simulateurs et mannequins ne reproduisant pas selon lui les conditions réelles. Les neuf gestes concernés ne sont jamais nommés, et rien n'explique pourquoi un projet de formation se conclut par le prélèvement de 600 cerveaux.

Objectifs

Pour assurer le bien-être des animaux, la réussite des projets et la qualité des résultats scientifiques, il est crucial que les expérimentateurs soient compétents dans l’exécution des gestes techniques. Cela signifie qu'ils doivent être formés et maintenir leurs compétences au fil du temps, que ce soit pour les employés actuels ou les nouveaux arrivants. Un bon encadrement par un personnel qualifié permet de former les expérimentateurs et d'améliorer le bien-être des animaux en réduisant les erreurs et en augmentant la rapidité des gestes, ce qui limite le stress et la douleur des animaux. Cela garantit également des études fiables et solides, avec suffisamment de données pour les analyses, réduisant ainsi les risques de remettre en question les résultats et d'avoir à faire des études complémentaires, ce qui diminue le nombre d'animaux utilisés.

Bénéfices attendus

L’habilitation des expérimentateurs aux gestes techniques améliorera la qualité et la fiabilité des procédures expérimentales et des résultats, tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires pour les études. Cela permettra d'avoir suffisamment de données pour les analyses, réduisant ainsi les risques de remettre en question les résultats et d'avoir à faire des études complémentaires.

Procédures

Durant ce projet, 6 gestes techniques d’administration et 3 gestes techniques de prélèvement sanguin seront effectués. Les gestes techniques d’administration effectués quotidiennement pendant 2 semaines se feront sur animaux vigiles, les animaux étant si nécessaire maintenus en contention par du personnel qualifié pour limiter les mouvements lors de l’exécution des gestes. Certains gestes techniques d’administration et de prélèvement sanguin seront effectués 1 seule fois sous anesthésie gazeuse. Le temps passé à effectuer un geste technique d’administration ou de prélèvement sur un animal sera de 1 minute maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux seront temporaires et principalement dues aux administrations répétées et aux prélèvements sanguins effectués. Les animaux ressentiront une légère gêne, ainsi qu'une douleur similaire à une piqûre d'aiguille lors de certains gestes techniques d’administration et de prélèvement. Les animaux vigiles maintenus immobiles pour la réalisation de ces gestes pourront également ressentir un stress léger mais temporaire.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

L’utilisation d'animaux pour l’acquisition et la maîtrise des gestes techniques par les expérimentateurs est indispensable et ne peut être remplacée par d’autres méthodes. Les simulateurs ou mannequin peuvent compléter la formation de base, mais ne reproduisent pas les conditions réelles nécessaires à l’acquisition des gestes techniques sur des animaux vivants. De tels gestes nécessitent une pratique directe pour observer et appréhender le comportement spécifique à chaque espèce, afin d’assurer la précision de leur réalisation. Selon la réglementation, l’habilitation implique d’acquérir et de valider les compétences sur des animaux, garantissant la qualité des procédures et l’amélioration du bien-être animal. Utiliser des animaux dans un cadre contrôlé minimise les risques de souffrance tout en assurant la maîtrise des gestes techniques avant de les appliquer en recherche.

Réduction

Des animaux utilisés dans des études précédentes seront réutilisés autant que possible, afin de réduire le nombre d’animaux commandés spécifiquement pour la réalisation de ce projet de tutorat et d’habilitation. Cela permettra d’utiliser au maximum les animaux disponibles. Pour ce projet, le nombre minimum de souris et de rats a été choisi pour que les expérimentateurs à habiliter puissent se former, un animal étant utilisé pour la réalisation de plusieurs gestes techniques.

Raffinement

Chaque expérimentateur sera supervisé par un personnel qualifié (tuteur) maîtrisant parfaitement les gestes techniques auxquels les expérimentateurs devront être habilités. L’objectif est de garantir une exécution correcte des procédures expérimentales, minimisant ainsi le stress et les erreurs potentielles d’exécution des gestes sur les animaux. Les animaux seront observés 2 fois par jour en semaine par du personnel qualifié, avant et après l’exécution d’un geste technique, et 1 fois par jour le week-end et jours fériés inclus. Pour gérer la douleur de certains gestes techniques, une anesthésie gazeuse sera utilisée. De plus, un suivi de poids avec au moins 2 pesées par semaine sera réalisé au cours du projet. Si l’atteinte d’un point limite est constatée, l’animal sera euthanasié dans des conditions éthiques.

Choix des espèces

Le rat et la souris étant les deux espèces utilisées dans notre établissement, il est donc primordial que le personnel soit habilité à effectuer les gestes techniques sur ces deux espèces. Nous allons réutiliser autant que possible les animaux d’études précédentes menées dans notre établissement. Les animaux réutilisés seront âgés d’au moins 10 semaines.

Gavées cinq jours d'affilée, opérées pour certaines, échographiées et piquées jusqu'à deux fois par semaine pendant cinq semaines, 3 864 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une modification génétique qui leur fait développer spontanément un cancer du pancréas. Toutes sont tuées pour analyser leurs tumeurs, leur foie, leurs poumons et leur diaphragme, le projet cherchant à comprendre pourquoi les chimiothérapies atteignent mal ces tumeurs. Le porteur écrit que "le développement des tumeurs n'a pas d'impact sur l'animal", sauf au moment où un point limite est atteint.

Objectifs

Les animaux utilisés dans ce projet correspondent à des modèles d’étude du cancer du pancréas pour lequel aucun traitement efficace n’est à l’heure actuelle disponible et qui est le 4ième cancer le plus mortel. Quatre-vingt-dix pour cent des patients diagnostiqués sont décédés à 5 ans, qu’ils aient été opérés ou non, et l’incidence de ce cancer est en hausse. Il s’agit donc d’une pathologie de santé publique. Comprendre la résistance aux traitements est un axe de recherche qui devrait permettre d’améliorer ce terrible pronostic. Des études récentes démontrent que l’inaccessibilité des drogues à la tumeur serait au moins en partie responsable de l’absence d’effet thérapeutique des chimiothérapies dans ce cancer, et ce du fait d’une très faible vascularisation de ces tumeurs. Cette faible vascularisation serait la conséquence d’une fibrose (la transformation du tissu en un tissu composé de fibres) dont l'origine est l'activation des fibroblastes. Le projet proposé consistera en l’identification de potentielles cibles thérapeutiques (exprimées soit par les cellules tumorales, soit par les cellules stromales) impliqués dans la résistance aux traitements du cancer du pancréas. Notre objectif est de tester l'hypothèse du rôle clé du microenvironnement tumoral du cancer du pancréas, et plus particulièrement des fibroblastes, dans la résistance aux traitements, et d'identifier et comprendre le rôle de chacun des types cellulaires impliqués (notamment les cellules immunitaires) afin de développer de nouvelles thérapies. Dans ce contexte nous avons déjà identifié, in vitro, plusieurs potentielles cibles thérapeutiques exprimées par les fibroblastes (soit les pancreatic stellate cells (PSC) soit les cancer-associated fibroblasts (CAFs)) et impliquées dans la résistance aux traitements.

Bénéfices attendus

Identifier et comprendre les processus mis en place dans le microenvironnement tumoral aboutissant au développement de résistances aux thérapies afin de développer de nouvelles stratégies.

Procédures

Dans cette étude, un traitement est donné par la bouche (gavage) aux souris pendant cinq jours (moins de 30 secondes). Certaines souris subissent une chirurgie (30 min). Une échographie pourra être réalisée une à 2 fois par semaine (10 minutes). Les animaux pourront recevoir jusqu’à deux injections par semaine pdt cinq semaines maximum (3 à 5 minutes). Une prise de sang pourra être réalisée, maximum une fois par semaine (1 à 2 secondes ou 2 min pour prélèvement terminal.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, certaines souris développeront naturellement des tumeurs du pancréas en raison de leur modification génétique. Le développement des tumeurs n’a pas d’impact sur l’animal, sauf possiblement au moment de l’atteinte d’un des seuils critiques (appelés "points limites") où une modification de l’état général pourrait être observée. La chirurgie pourra provoquer un léger inconfort. Les traitements par chimiothérapie peuvent provoquer certains effets secondaires chez les souris, comme une perte de poids, de la douleur ou dans certains cas rares une atteinte cutanée de la queue.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de procéder à l’analyse des tissues. En effet, nos recherches nécessitent l’analyse des organes des animaux. Les expériences sont conçues pour permettre la récupération de la tumeur ainsi que des organes de métastases. Les tumeurs seront collectées soit pour des analyses histologique, soit pour l’analyse des cellules immunitaires présentes dans la tumeur.

Remplacement

L'identification des phénomènes de résistances aux thérapies ne peut être réalisée que directement chez l’animal car il met en jeu des intéractions entre de nombreuses populations cellulaires (interactions cancer / microenvironnement (réaction fibreuse) / réaction de l’hôte) qui ne peuvent pas encore être mimées in vitro, notamment le rôle complexe du système immunitaire. Cependant, dès que possible, nous remplacerons les études faites sur les modèles murins par des expérimentations réalisées sur des cultures de cellules isolées de nos modèles murins, qui peuvent être maintenues plusieurs semaines en culture et permettront de tester nos hypothèses. Ce projet est multidisciplinaire et vise à mieux comprendre le rôle des cellules du système immunitaire dans le contrôle d'un modèle murin mimant le cancer du pancréas. De ce fait nous devrons travailler avec des animaux vivants afin de pouvoir analyser le rôle des différents organes et différents types cellulaires suspectés d'être impliqués dans le développement de cette pathologie et dans l'immuno- et chimioresistance.

Réduction

Nous avons calculé que le nombre minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables, reproductibles et statistiquement interprétables est de 8 souris par groupe, avec trois répétitions indépendantes de chaque expérience afin de valider la robustesse des résultats. Nous avons pris plusieurs mesures pour réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés, tout en maintenant la qualité des données : 1- maximisation des analyses par animal en réalisant plusieurs types d’analyses sur un même animal afin d’optimiser chaque inclusion expérimentale, incluant des analyses histologiques sur plusieurs tissus atteints (pancréas, foie, poumon, diaphragme), des analyses immunologiques multiparamétriques par cytométrie en flux pour caractériser la nature, le phénotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires post-mortem, ainsi que des analyses sanguines ; 2- optimisation du design expérimental, avec un protocole conçu pour limiter la variabilité inter-individuelle, permettant ainsi d’avoir un nombre réduit d’animaux par groupe tout en conservant une puissance statistique suffisante ; 3- réutilisation de données biologiques, les mêmes échantillons biologiques (sang, tissus) pouvant dans certains cas être utilisés pour plusieurs types d’analyses complémentaires. Le nombre total d’animaux a donc été défini en tenant compte d’un équilibre rigoureux entre nécessité scientifique, réduction des effectifs animaux et qualité des données attendues.

Raffinement

Afin de minimiser les effets indésirables liés aux procédures expérimentales, plusieurs mesures spécifiques de raffinement sont mises en œuvre à chaque étape du protocole. À leur arrivée, les animaux sont placés en pièce d’acclimatation et observés quotidiennement par le personnel zootechnique. Ils sont logés par groupes de 5 dans des cages enrichies (abris, matériaux de nidification, objets à ronger), favorisant leur bien-être et réduisant le stress. Tous les actes expérimentaux sont réalisés par du personnel formé et expérimenté. Le gavage est effectué avec des sondes souples à extrémité arrondie, réduisant les risques de lésion œsophagienne. L’administration par gavage est limitée à 5 jours consécutifs avec un volume adapté au poids de l’animal. Lors des greffes, les animaux sont prémédiqués avec un antalgique et une anesthésie locale est réalisée. L’anesthésie générale est assurée par inhalation avec contrôle du plan anesthésique et prévention de l’hypothermie grâce à un tapis chauffant. Une pommade oculaire est appliquée pour prévenir le dessèchement des yeux. Les chirurgies sont limitées à une seule par animal. En postopératoire, les animaux sont surveillés jusqu’à reprise complète d’activité, et une seconde injection d’antalgique est prévue 8h plus tard, puis selon les besoins. Les injections sont réalisées avec du matériel adapté et par du personnel entraîné. Les volumes administrés respectent les seuils recommandés. L'apparition d'effets secondaires (perte de poids, masses tumorales) est anticipée par un scoring de la douleur permettant une intervention rapide (analgésie, traitement local, ou mise à mort si seuil critique atteint). Le suivi des tumeurs par échographie est non invasif et réalisé sous anesthésie légère, deux fois par semaine au maximum. Des prélèvements sanguins de faible volume sont réalisés selon des intervalles sécurisés pour limiter la perte sanguine. Chaque animal est utilisé de façon optimale pour collecter un maximum de données afin de limiter le nombre total d’animaux requis.

Choix des espèces

Les études antérieures de la littérature et de notre équipe de recherche ont démontré que les modèles murins décrits dans ce projet étaient très proches de la pathologie humaine, et récapitulent la complexité du microenvironnement tumoral, ce qui n’est pas le cas des modèles in vitro ou ex-vivo. L'utilisation des souris permet d'avoir acces à des modèles proches de la pathologie humaine. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.