Rongeurs

800 souris vont être utilisées, chacune mise à jeun quinze à seize heures avant de subir neuf prélèvements de sang au cours d'une séance de deux à six heures, l'opération étant répétée une semaine plus tard. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leur pancréas. Après anesthésie locale, la queue est incisée, puis vient une injection de glucose et, pour certains lots, un gavage avec une solution lipidique. Le porteur reconnaît que les contentions et le jeûne stressent les animaux, que les incisions font mal et que le gavage irrite l'œsophage. Les retombées annoncées, savoir s'il suffira un jour de greffer les seules cellules productrices d'insuline chez des personnes diabétiques, restent une perspective lointaine face à ces atteintes immédiates.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de comprendre l’influence d'un type particulier de cellules des îlots pancréatiques sur le maintien du taux de sucre sanguin dans des valeurs « normales » à la fois dans les conditions physiologiques (régime normal) et dans les conditions physiopathologiques (régime gras classiquement utilisé pour mimer des conditions diabétogènes).

Bénéfices attendus

Le diabète est une maladie grave qui s’étend. Il est lié à une augmentation anormale et prolongée de la concentration de sucre dans le sang : c’est l’hyperglycémie. Les petits organes qui libèrent les hormones régulant la concentration de sucre dans le sang (la glycémie) s’appellent les îlots du pancréas. Ils sont constitués de plusieurs types des cellules, les principales cellules des îlots sécrétent l’insuline, la seule l’hormone qui diminue la glycémie. Dans le diabète de type 1, ces cellules sont absentes. Dans le diabète de type 2, elles fonctionnent mal. En ce sens, ces cellules ont toujours été au centre des études sur la régulation glycémique en conditions normales et pathologiques. On connait donc très peu le rôle des autres cellules du pancréas dans ces mécanismes et surtout la manière dont elles influencent les cellules produisant l’insuline. Une autre limite de la plupart des études est d’avoir été centrées uniquement sur les effets du sucre (le glucose). En effet, l’alimentation contient d’autres nutriments : protéines, lipides…. Dans le présent projet, les chercheurs disposent de souris dont la particularité est de pouvoir supprimer certaines des autres hormones pancréatiques que l’insuline. La manière dont ces souris régulent leur glycémie suite à une administration de glucose combiné ou non avec d’autres nutriments pourra donc être étudiée et surtout comparée avec celle des souris « normales » qui ont dans leurs îlots tous les types d’hormones. Ceci apportera des informations cruciales sur le rôle de ces cellules dans ces processus. Pour mieux comprendre les interactions entre les différents types de cellules pancréatiques dans le diabète, certaines souris seront soumises à un régime gras qui mime certaines conditions favorisant le diabète de type 2. Les informations fournies par ce projet seront aussi cruciales par rapport au diabète de type 1. En effet, dans la perspective des futures thérapies cellulaires, nous saurons s’il suffit de greffer seulement les cellules produisant l’insuline ou un mélange équilibré des différentes cellules pancréatiques.

Procédures

Pour les tests de tolérance au glucose, 2 expériences effectuées à 1 semaine d’écart (durée du test de 2 à 6h) : animaux mis à jeûn la veille au soir (durée 15 à 16h), le jour J, une incision (2 secondes) de la queue sera faite après anesthésie locale , s’en suivra une injection (10 secondes) de glucose avec ou sans autres nutriments, 6 prélèvements très légers de sang (10 à 30 secondes) pour détermination glycémie (espacés de 15min à 1h) seront effectués et 3 prélèvements (1 à 2minutes) un peu plus importants de sang pour la détermination d’hormones (espacés de 15min à 45min), prélèvements de sang effectués dans le respect de la réglementation. Pour les animaux de certains lots, 1 gavage (20 secondes) avec une solution lipidique sera effectué (après injection de glucose).

Impact sur les animaux

Les contentions pourront être sources de stress, les mises à jeûns source de faim et de stress, les injections et les incisions sources de douleur et les administrations orales d'irritation de l’œsophage. Nous veillerons à réduire le stress au maximum, tous les gestes seront effectués par une personne formée et expérimentée et un anesthésique local sera appliqué avant les incisions. Dans les 24h suivant les expérimentations, si une perte de poids >10% est constatée, une alimentation enrichie sera mise à disposition des animaux concernés. Cette alimentation enrichie sera maintenue jusqu’à ce que ces animaux aient recouvré leur poids d’avant les tests. Des souris de ce type sont actuellement en élevage pour un autre projet, et d'après notre expérience avec ce type de protocoles, aucun effet délétère n’a été observé chez ces animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, les souris seront mises à mort en utilisant une méthode réglementaire et leur pancréas sera prélevé pour diverses expérimentations ex-vivo.

Remplacement

Même si des modèles in vitro à 2 organes se développent, les systèmes d’organes sur puce sont pour l’instant incapables de reproduire la complexité de l’homéostasie nutritionnelle des mammifères impliquant des interactions entre de nombreux organes (tractus digestif, îlots pancréatiques, foie, tissu adipeux, muscle, cerveau, rein…). Ces expériences ne peuvent donc se faire que sur un modèle de mammifère. Le modèle souris est le plus adapté car c’est le seul à ce jour permettant la suppression sélective des cellules dont nous voulons étudier le rôle dans les îlots pancréatiques. Il n’existe actuellement aucun simulateur modélisant l’homéostasie nutritionnelle qui est au cœur de cette étude. Toutefois, nous travaillons justement sur un simulateur de l’homéostasie glucidique. Les données acquises dans ce projet sur ces animaux seront entre autres destinées à enrichir ce simulateur renforçant ainsi la puissance de cette approche de simulation afin de réduire encore le recours à l’expérimentation animale dans le futur.

Réduction

Une réflexion approfondie a été effectuée pour réduire le nombre d’animaux tout en préservant une puissance statistique nécessaire sans laquelle il faudrait refaire l’étude. Les expériences effectuées lors de précédents tests montrent sans réserve la faisabilité du projet. Les tests in vivo décrits dans cette étude sont réalisés de manière courante depuis des années par notre équipe dans d’autres projets, mais sont aussi des tests courants largement utilisés dans les laboratoires qui travaillent sur le diabète au travers le monde, ils sont donc très standardisés. Il n’y a donc plus de mise au point technique et aucune perte d’animaux n’est à prévoir à ce niveau, ce qui contribue à limiter également le nombre d’animaux. Pour réduire encore le nombre de souris produites en élevage, nous réutiliserons les animaux d’un même lot pour 2 séries d’expériences ce qui permet de diminuer encore notre besoin total d’animaux, et enfin, après les tests in-vivo, les animaux produits seront utilisés pour récupérer leurs pancréas pour des investigations sur ces tissus au sein de la même étude. Ceci permet encore une réduction de moitié des animaux utilisés. Ainsi, 800 animaux des 2 sexes maximum avec l’application des mesures précédentes seront utilisés. Chaque lot sera optimisé pour que le nombre d’animaux utilisés assure une significativité statistique. Les règles statistiques communément admises seront appliquées (à savoir : si la répartition des résultats suit une loi normale, des tests statistiques paramétriques seront employés. Si la distribution des données ne suivait pas une loi normale, les tests non paramétriques appropriés seront appliqués).

Raffinement

Les animaux seront regroupés entre 5 et 10 animaux par cage pour éviter les effets délétères de l’isolement de ces animaux. Leur habitat sera enrichi des dômes et carrés de ouate pour la nidification. Un suivi quotidien des animaux sera effectué par le personnel de l'animalerie. Une habituation des animaux aux manipulations, contentions sera effectué la semaine précédant les tests. Les animaux seront pesés 1 fois par semaine et les 3 jours suivant les expérimentations pour les lots concernés. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue des animaux avant les incisions et une crème cicatrisante sera appliquée en fin d'expérience avec un suivi et nursing si besoin des animaux. Des points limites adaptés sont établit et seront appliqués si l'état des animaux le nécessite.

Choix des espèces

Le modèle souris adulte est le plus adapté car c’est un mammifère dont le fonctionnement de l’organisme est transposable à celui de l’Homme adulte, notamment pour la régulation du glucose sanguin. C’est aussi le seul animal à ce jour permettant une suppression sélective de certaines hormones dans les îlots pancréatiques dans le modèle transgénique que nous proposons d’étudier dans ce projet. Les études in vivo sur ces animaux seront faites au stade jeune adulte, de 14 à 22 semaines.

Rendus parkinsoniens par l'injection d'une neurotoxine directement dans le cerveau, 2 025 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après cette première chirurgie de trente minutes, certains reçoivent sous la peau une pompe à diffusion continue, puis des injections quotidiennes d'une molécule proche de la dopamine pendant six semaines, jusqu'à deux fois par jour, destinées à provoquer les mouvements anormaux involontaires que développent les patients. Ces mouvements sont ensuite observés une minute toutes les vingt minutes pendant trois heures, une fois par semaine. Le porteur annonce trois tests de comportement sous contention pour classer les rats selon la sévérité de leur atteinte, sans préciser lesquels, et jusqu'à huit prélèvements sanguins en 72 heures. Tous les rats sont tués à la fin, pour récupérer leur cerveau, après un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre de l’étude de l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à réduire les effets secondaires induit par un des médicaments le plus utilisé dans la maladie de Parkinson (MP). La MP se caractérise par un syndrome moteur défini par une lenteur d’initiation des mouvements associée à un tremblement de repos, une rigidité musculaire et une instabilité posturale. La principale caractéristique de la maladie de Parkinson est la mort progressive et massive des neurones produisant la dopamine (un messager chimique permettant la communication entre les neurones) dans le cerveau, impliqués dans la coordination des mouvements. Les évènements qui sous-tendent cette mort restent mal connus. Ceci rend le diagnostic de la maladie de Parkinson difficile, d’autant que l’apparition des symptômes ne se produit qu’après une perte neuronale importante. À l’heure actuelle, le traitement de la maladie est donc essentiellement symptomatique et vise à compenser le déficit en dopamine par l’administration d'une molécule semblable. Néanmoins, à long terme l’efficacité de cette molécule s’atténue et des effets secondaires très invalidants, caractérisés notamment par des mouvements anormaux involontaires appelés « dyskinésies », apparaissent. Compte tenu de ces complications, des stratégies médicamenteuses visent à atténuer le caractère invalidant de ces dyskinésies. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité de ces nouvelles thérapies dans un modèle préclinique de la maladie de Parkinson chez le rat. Ce modèle repose sur une injection de toxine dans le cerveau en ciblant spécifiquement les neurones produisant la dopamine afin de mimer la mort des neurones entraînant la pathologie. Au cours du protocole, des tests comportementaux sont utilisés pour évaluer la sévérité des troubles moteurs « parkinsonien » et classer les animaux selon la sévérité de leur atteinte. Des injections journalières d’une molécule semblable à la dopamine sont ensuite effectuées sur plusieurs semaines pour reproduire les mouvements anormaux involontaires observés chez le patient en réponse à ce type de traitement. Ainsi, l’efficacité de chaque nouvelle molécule thérapeutique sera testée sur ces mouvements anormaux involontaires et pourra être comparée aux traitements de référence, c’est-à-dire à ceux déjà utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Le modèle de toxine utilisé dans ce projet apparaît comme un modèle élaboré, mimant la mort des neurones produisant la dopamine observée dans la maladie de Parkinson et permettant l’induction des mouvements anormaux involontaires retrouvés chez les patients à la suite d’un traitement chronique avec une molécule semblable à la dopamine. Il permet de tester l’efficacité des nouvelles molécules thérapeutiques sur les mouvements anormaux involontaires. Ainsi, à terme, l’utilisation de ce modèle animal permettra de sélectionner des composés présentant des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques

Procédures

Les animaux subissent une première chirurgie afin d’injecter la neurotoxine dans le cerveau (durée environ 30 minutes). Une deuxième chirurgie pourra être réalisée afin d’implanter sous la peau un dispositif permettant de diffuser un traitement en continu (durée environ 15 minutes). Les animaux seront soumis à 3 tests de comportement effectués sous contention ou non (selon le test) par l’expérimentateur (durée totale : 20min) jusqu’à 2 fois au cours du protocole afin d'évaluer la sévérité de leurs troubles fonctionnels. Les animaux subiront des injections journalières (sur 6 semaines maximum, 2 fois par jours maximum, 1min par injection) sous la peau d'une molécule semblable à la dopamine pour induire des mouvements anormaux involontaires. Ces derniers pourront être analysés et quantifiés 1 fois par semaine sur 6 semaines. Chaque session d'observation inclut 1min d'observation toutes les 20min durant 3h. Des prélèvements répétés de sang pourront être réalisés sur animal vigile, à la veine de la queue (durée : 5min) ainsi qu’un prélèvement terminal sur animal anesthésié. Lors de prélèvements multiples, jusqu’à 8 prélèvements pourront être réalisés sur 72h, ou encore 4 prélèvements maximum par semaine tous les 28 jours (1min/prélèvement). Des administrations quotidiennes de molécules thérapeutiques ou de traitement de référence pourront être effectuées pendant toute la durée du protocole (8 semaines au maximum, 2 fois par jour au maximum). Un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien (liquide entourant le cerveau) sous anesthésie pourra être réalisé. A la fin du protocole, les animaux seront mis à mort afin de prélever le cerveau.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration de la nouvelle molécule thérapeutique testée. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. -Les animaux seront soumis à une administration dans le cerveau de la toxine nécessitant une chirurgie. Cette étape peut engendrer des douleurs durant les 24-48h suivant la chirurgie et peut être source d'une infection. Une perte de poids des animaux peut être observée ainsi qu’une altération de la mobilité avec des rotations contraires au site d’injection pendant quelques jours après la chirurgie. -Une chirurgie d’implantation de pompe diffusant des subtances liquides sera réalisée nécessitant une anesthésie gazeuse pouvant être source de douleur et/ou une gêne au réveil. -Lors des sessions de tests de comportements ou d’évaluation des mouvements anormaux involontaires, les animaux devront être régulièrement placés en isolements pour de courtes durées et/ou être maintenus sous contentions pouvant générer du stress. -L’induction des mouvements anormaux involontaires, présents jusqu’à 3h après l’injection de la molécule semblable à la dopamine, entraine une altération de l’activité motrice des pattes et de la face et peut limiter l'alimentation/hydratation. -Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile soumis à une contention pouvant être à l’origine 1) d’une douleur légère de courte durée, 2) de stress et 3) d’un écoulement sanguin persistant. -Les rats subiront un prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie/analgésie générale pour effectuer une chirurgie et accéder à la zone ou se trouve ce liquide (sous les muscles de la nuque).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est necessaire de récupérer le cerveau de l'animal pour faire des analyses sur ce dernier.

Remplacement

L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composé in vivo. Afin d’évaluer l’effet de nouveaux composé sur les mouvements anormaux involontaires, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions comportementales associées aux mouvements anormaux involontaires.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu par groupe pour ce projet est basé sur des données préalables obtenues au sein de l’entreprise sur ce modèle préclinique (n=15-20 pour assurer n=12 animaux inclus dans l’analyse finale, nécessaires pour observer une différence significative entre les groupes). Ce nombre se justifie pour les raisons suivantes : après la chirurgie induisant la lésion, environ 20% des animaux ne présentent pas de lésion sévère, paramètre essentiel pour induire une réponse aux traitements permettant d'induire les mouvements anormaux involontaires. De plus, parmi les animaux sévèrement lésés, seulement 80% sont sensibles à ce traitement chronique et exprimeront ces mouvements anormaux involontaires. Cela nous assure donc d’avoir 12 animaux par groupe avec 5-8 animaux de sécurité par groupe.

Raffinement

Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés par 2-3 par cage selon leur poids. Des enrichissements multiples leur sont proposés (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Par ailleurs, les animaux seront habitués à la manipulation par l'Homme ainsi qu’aux environnements nouveaux dans lesquels seront réalisés les tests comportementaux afin de réduire le stress relatif à cela. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire durant 48h. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie. Un tapis chauffant rétrocontrôlé est utilisé pendant toute la durée de l’anesthésie pour maintenir la température corporelle des animaux à 38°C. Les zones d’injections en sous-cutanée pour les traitements récurrents avec la molécule semblable à la dopamine seront alternées entre les flancs gauches et droits.

Choix des espèces

Les rongeurs, classiquement utilisés en laboratoire, présentent plusieurs similitude sur l'anatomie cérébrale et l'activité des neurones produisant la dopamine que celles que l'on retrouve chez l'Homme. Le modèle de lésion induite par l'injection dans le cerveau d'une toxine s'est rapidement imposé comme un modèle préclinique de référence pour le test de nouveaux médicaments car ils reproduisent la mort des neurones produisant la dopamine. Des rats adultes d'environs 7 semaines (pesant entre 250 et 320g) le jour de la chirurgie de la lésion seront utilisés dans ce projet car la grande majorité des résultats de la littérature concernant ce modèle a été obtenue sur des rats appartenant à cette gamme de poids. De même, les coordonnées exactes utilisées pour procéder à la lésion dans le cerveau proviennent de données issues d'un livre qui a également été réalisé sur la base d’observations faites sur des rats entre 250-300g. En fonction des objectifs de l’étude et des composés à tester, des rats mâles ou femelles pourront être utilisés puisque cette pathologie touche aussi bien les hommes que les femmes.

960 souris vont être utilisées, toutes injectées de cellules cancéreuses puis tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tumeurs poussent sur leurs flancs, avec un œdème possible au point d'injection qui peut gagner les pattes arrière et gêner la marche, et des métastases dont le porteur reconnaît ne pas savoir évaluer les effets sur les organes touchés. Elles reçoivent un traitement par la bouche cinq jours sur sept et une prise de sang à la queue chaque semaine sous anesthésie, pour tester une association de deux médicaments déjà approuvés contre les rechutes du cancer du poumon. L'effectif, lui, est calé sur "le nombre d'animaux communément accepté pour une publication".

Objectifs

Les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) présentent, chez environ 15% des patients, des altérations dites primaires de l'EGFR, un Récepteur du facteur de croissance EGF. Malheureusement, après traitement par thérapie ciblée, une récidive de la tumeur est observée avec apparition, dans plus de 50% des cas, d'une mutation secondaire de l'EGFR pour laquelle un inhibiteur de dernière génération a été développé, l'osimertinib. Finalement, de nouveaux mécanismes de résistance ont été constatés chez des patients traités plusieurs mois avec l'osimertinib, tels qu'une amplification d'autres récepteurs à activité tyrosine kinase, des mutations touchant des acteurs des voies de signalisation contrôlant la survie et la prolifération cellulaire, ainsi que l'apparition d'une mutation tertiaire de l'EGFR pour laquelle il n'y a pas encore de traitement spécifique utilisé en clinique. Par des méthodes de génie génétique, nous avons généré plusieurs modèles cellulaires de résistance du cancer bronchique humain en introduisant, dans une petite sous-population de cellules de CBNPC humaine, différentes mutations de l'EGFR décrites chez les patients. Sur ces modèles cellulaires, nous avons réalisé un criblage de molécules potentiellement capables d'inhiber l'émergence de clones résistants. Finalement, un inhibiteur déjà approuvés en clinique, le sorafenib, utilisé en combinaison avec l'osimertinib, s’est montré efficace in vitro pour limiter la croissance cellulaire des lignées arborant plusieurs mécanismes de résistance décrits chez les patients récidivant. Ces résultats ont aussi été obtenus in vivo sur l’inhibition de la pousse tumorale de ces lignées dans des souris immunodéprimées. Au vu de l'importance du contexte physiologique, de la toxicité des inhibiteurs utilisés en thérapie et du microenvironnement tumoral, nous avons créé un modèle syngénique murin de cancer du poumon qui n’existait pas. Nous avons généré 6 lignées cellulaires qui récapitulent les principaux mécanismes de résistances observés dans les CBNPC. Les études in vitro menées sur ces nouvelles lignées cellulaires ont révélé des caractéristiques de croissance et de résistance à la thérapie ciblée similaires à celles observées précédemment sur les lignées humaines. Ces nouveaux modèles murins vont nous permettre désormais d'étudier l'implication du système immunitaire dans la tumorigenèse et dans la réponse au traitement, avant d'envisager tout essai clinique.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations permettront tout d’abord de déterminer la capacité de ces nouvelles lignées cellulaires à former des tumeurs chez l’animal ; il sera possible alors de comparer les résultats de croissance tumorales de ces lignées cellulaires murines à ceux déjà obtenus avec les lignées cellulaires humaines dans des souris immunodéficientes, et confirmer ainsi l'intérêt de ce nouveau modèle d’étude syngénique de cancer du poumon chez la souris. Dans la littérature, l’implication d’EGFR muté dans l’installation d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur reste controversé ; notre étude va nous permettre de mesurer et caractériser l’éventuelle infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs en fonction des mécanismes de résistance mais aussi des traitements. La possibilité de mesurer la bioluminescence des cellules cancéreuses à l'aide d'un imageur du petit animal va nous premettre de détecter et suivre le développement de foyers tumoraux secondaires qu'il aurait été difficile de mettre en évidence par des méthodes d'analyses macroscopiques traditionnelles. Ces métastases pourront être mieux caractérisées (culture cellulaire, analyses génétique et moléculaire) et identifier d'éventuels nouveaux mécanismes de résistance. L'intérêt de notre étude est de mieux comprendre les mécanismes responsables de la rechute tumorale de la tumeur primaire et des métastases en fonction du contexte immunitaire et des traitements.

Procédures

Les animaux seront injectés avec une aiguille adaptée de petite taille et de petit diamètre et sous anesthésie et analgésie. Des prélèvements sanguins au bout de la queue seront réalisés sur animaux anesthésiés chaque semaine. Les animaux recevront 5 jours par semaine un traitement par voie orale. Cet acte est rapide et non douloureux pour l'animal.

Impact sur les animaux

Peu d'effets indésirables sont attendus sur les animaux injectés en sous-cutané. Il pourrait être observé cependant dans de rares cas des démangeaisons ou un œdème au point d’injection qui s’il s’étend aux pattes arrière pourrait perturber la locomotion quelques jours, le temps qu’il se résorbe. La croissance des tumeurs sur les flancs de la souris, ne perturbe pas la vie de la souris, il n'y a normalement pas de modification du comportement individuel ou social. Une nuisance possible serait que la tumeur, dans sa croissance, puisse gêner les déplacements de l’animal ou altérer sa souplesse entrainant un défaut d'alimentation ou de sa toilette. Concernant les animaux développant des métastases, il est difficile d'évaluer leurs effets sur la fonction des organes touchés, mais un suivi très régulier permettra de détecter le moindre signe clinique défavorable et de procéder à l'arrêt immédiat de l'expérimentation.

Devenir

La totalité des animaux de l'étude sera injectée avec des cellules cancéreuses puis mise à mort pour études.

Remplacement

L’utilisation des animaux est indispensable pour confirmer in vivo l’efficacité de la combinaison d’inhibiteurs identifiée in vitro sur les lignées humaines. Dans le protocole présenté ici, la souris est utilisée comme modèle préclinique obligatoire pour évaluer l'implication du système immunitaire dans la croissance tumorale. Ceci n’est pas possible autrement que chez l’animal vivant, et nécessaire avant toute évaluation chez l’Homme.

Réduction

Les transplantations de nos modèles cellulaires seront réalisées sur l'animal uniquement après obtention de résultats in vitro significatifs permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux par groupe en fonction de l'importance de l'effet obtenu. L'objectif est de collecter un nombre suffisant de données pour respecter le nombre d'animaux communément accepté pour une publication, et appliquer des tests statistiques fiables et adaptés. Les traitements ne concerneront que les lignées cellulaires pour lesquelles une croissance tumorale significative aura été observée. A noter que s'il n'y a pas de différence statistique entre mâles et femelles, la taille des effectifs pourra être réduit à 6 au lieu de 10 animaux (3 mâles et 3 femelles).

Raffinement

Afin d'éviter toute souffrance ou stress, les animaux seront hébergés dans une zone exempte de germe pathogène, à 5 maximum par cage (530 cm2 au sol) dans un environnement enrichi (tube en polycarbonate rouge et Arbrocel Roll), et anesthésiés avant chaque intervention. Nous serons vigilants pour évaluer chaque jour l'apparition d'éventuels signes de souffrance (perte de poids, poils hérissés, prostration) et dans le cas de critères présents, une prise en charge analgésique appropriée sera mise en place ; et dans le cas d'une non amélioration des symptomes, l'animal serait mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour l'étude de la croissance tumorale car il permet de mimer les conditions de formation des tumeurs de manière assez proche de celles rencontrées chez l'Homme. La greffe récapitule les évènements se déroulant lors d'une tumorigenèse : croissance 3D, interaction avec le stroma et le système immunitaire, angiogenèse et métastase. Enfin la souris est le modèle d'étude le plus utilisé dans la communauté scientifique, cela permet des échanges à un niveau international. Les injections de cellules tumorales seront réalisées comme classiquement décrites dans la littérature sur des animaux âgés de 6 à 8 semaines.

Les souris de ce projet développent seules une maladie neurologique, avec perte de poids, retard de croissance, faiblesse musculaire et troubles de l'équilibre ou de la marche. 180 d'entre elles vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tuées à un âge choisi ou dès qu'un point limite est atteint, pour que leurs organes soient examinés. Le porteur écrit pourtant que "les animaux ne vont pas subir d'intervention", la procédure consistant à les laisser tomber malades et à les observer. Leurs géniteurs, eux, retournent à l'accouplement pour produire d'autres animaux atteints.

Objectifs

Il existe plus de 1 000 maladies neurologiques d'origine génétique, dont plus de 500 affectent l’appareil neuromusculaire. La grande majorité d’entre elles ne disposent d’aucun traitement. Pour une fraction significative des cas (>30 %), l'origine moléculaire reste inconnue. L'objectif de ce projet est d'identifier de nouveaux modèles de maladies neurogénétiques apparaissant spontanément chez les souris de laboratoire élevées couramment pour d'autres projets. L’identification des défauts moléculaires chez la souris est partiellement facilitée par l’uniformité du fond génétique des souris de laboratoire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont l’identification des nouveaux défauts moléculaires responsables de maladies neurologiques utilisables comme nouveaux modèles de maladie neurologique pour la recherche biomedicale. L’identification de nouveaux modèles de maladies neurogénétiques est une étape indispensable pour progresser dans la compréhension des mécanismes des maladies et pour favoriser le développement de nouveaux traitements.

Procédures

Les animaux ne vont pas subir d'intervention. Ils seront suivis régulièrement afin mettre en évidence l'apparition ou non de phénotypes dommageables puis ils seront mis à mort dès qu'ils atteindront l'âge requis pour un prélèvement d'organes post-mortem ou s'ils atteignent les points limites établis dans cette procédure. Leurs géniteurs seront remis en accouplement afin de générer d'autres animaux malades.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet pourront développer des problèmes neurologiques se manifestant avec une perte de poids, un retard de croissance, une faiblesse musculaire, des troubles locomoteurs ou de l'équilibre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure et prélevées à différents âges pour vérifier les changements histologiques et biochimiques associés à leur pathologie.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle in vitro, car les modèles cellulaires ne peuvent pas reproduire des problèmes neurologiques.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser, en nous limitant à utiliser seulement la fratrie, ainsi que les géniteurs des animaux développant des nouveaux phénotypes neurologiques d’apparition spontanée qu’on avèrera être d’origine génétique. Les fratries composées d'aucun animal à phénotypes dommageable ne seront pas étudiées.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la SBEA (Structure chargée du Bien-Être Animal), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent. En cas d’apparition de symptômes, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement. Si l'état des animaux atteint les points limites fixés, ils seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies neurologiques humaines, car l'organisation de son système nerveux est très similaire à celles de l'homme. A priori, il est impossible de savoir si les nouvelles souches auront une diminution de l’espérance de vie. Il est donc impossible d'établir à quel âge les animaux vont développer un phénotype neurologique, quel phénotype neurologique, ni si cela sera sévère. Il sera nécessaire de poursuivre une étude d’observation clinique dans le temps pour déterminer ces éléments. Les souris seront utilisées à divers stades post-naissance, avant qu’elles ne développent les points limites définis.

3 496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut recevoir jusqu'à cinq gavages de bactéries, jusqu'à trois vaccinations, et une chirurgie d'ouverture de l'abdomen pour qu'on injecte des cellules tumorales dans la paroi de son cæcum. D'autres se voient déclencher un cancer colorectal par trois injections de produits chimiques, avec des douleurs abdominales, des diarrhées et une perte de poids attendues, plus une gêne de l'œsophage à chaque gavage. Le vaccin testé est fabriqué à partir d'organoïdes intestinaux, que le porteur décrit par ailleurs comme "ce qui se rapproche le plus d'un modèle de remplacement", tout en concluant que l'animal vivant reste "indispensable".

Objectifs

Le cancer colorectal est l'une des tumeurs malignes les plus courantes et la principale cause de morbidité associée au cancer dans le monde. De nouvelles stratégies sont justifiées pour prévenir ce cancer. Nous avons montré dans une étude précédente que la combinaison d'entéroïdes traités à l'oxaliplatine et de bactéries pro-inflammatoires pouvait induire une immunité contre les cellules de ce cancer dans des modèles murins, ce qui indique que les organoïdes dérivés de l'intestin pourraient constituer un nouveau vaccin pour la protection contre ce cancer. De nouvelles données indiquent que les patients atteints avec des tumeurs à forte instabilité ont une réponse supérieure au blocage des points de contrôle immunitaire. Nous avons également constaté un enrichissement différentiel de la composition du microbiote intestinal dans les biopsies de patients atteints du syndrome de Lynch par rapport à ceux qui n'en sont pas atteints. L'infection des entéroïdes par certaines espèces bactériennes a entraîné une mort cellulaire immunogène. Ainsi, la combinaison d'organoïdes et d'espèces du microbiote pourrait déclencher une réponse immunitaire anti-tumorale et servir de vaccin pour protéger l'hôte contre ce cancer.

Bénéfices attendus

Plusieurs stratégies de vaccinations seront utilisées ici, en combinaison avec ou sans immunothérapies, avec ou sans gavage oral de bactéries, avec ou sans antibiotiques, pour voir si le vaccin est capable de protéger la souris du cancer. Ce projet permettra de développer un vaccin visant à protéger les patients atteints du syndrome de Lynch du cancer colorectal.

Procédures

Les souris recevront jusqu'à 5 gavages oraux (bactéries ou sérum physiologique espacé de 3 jours entre chaque), durée 10 secondes, et jusqu'à 3 vaccinations (1 semaine de délai entre 2 vaccinations), durée 15 secondes sous anesthésie locale, Les souris auront une chirurgie pour la tumeur en orthotopique, par incision de la paroi abdominale antérieure pour injection sera réalisée dans la sous séreuse du caecum, sous analgésie et anesthésie générale, durée maximum 10 minutes. Certaines souris auront une induction de cancer colo-rectal par produits chimiques, 3 injections, durée 10 secondes, anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les chirurgies abdominales, impliquant une incision dans la peau et le péritoine, peuvent provoquer des douleurs postopératoires modérées et de courte durée. Le traitement inducteur de cancer colorectal peut entraîner divers symptômes, tels que des douleurs abdominales, des changements dans les habitudes alimentaires, des diarrhées, une perte de poids et une altération de l'état général de l'animal, de façon transitoire, avec dese symptômes de gravité modérée. L'injection tumorale orthotopique, en raison de sa localisation, peut également provoquer des douleurs abdominales modérées. De plus, les antibiotiques peuvent induire des diarrhées d'intensité modérée et de courte durée, tandis que les gavages oraux provoquent une gêne légère et passagère au niveau de l'œsophage de la souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossible à reproduire in vitro. Les organoides sont ce que ce qui se rapproche le plus d'un modèle de remplacement, mais à l'heure actuelle, ce n'est pas encore assez développé pour comprendre toutes les interactions impactantes ayant lieu avec l'organisme, ainsi que le micro-environnement tumoral spécifique in vivo.

Réduction

Le nombre de a été déterminé au minimum nécessaire et suffisant par calcul de puissance. Les résultats seront analysés par tests de comparaison de moyenne ou analyse de variance non paramétriques.

Raffinement

Une surveillance quotidienne sera effectuée, et des mesures spécifiques de suivis seront appliquées suivant les procédures. Toutes les interventions seront faites sous anesthésie locale ou générale avec analgésie adpatée aux gestes. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation de souris est dicté par le fait que les organoïdes utilisées dans cette stratégie de vaccination sont développés sur souris. De plus, les souris présentent des similitudes génétiques et physiologiques importantes avec les humains, en particulier dans le domaine de la biologie du cancer. Le tractus gastro-intestinal des souris, bien que plus petit, fonctionne de manière similaire à celui des humains, et les structures cellulaires et tissulaires des intestins murins sont très proches de celles des humains, ce qui permet de reproduire de manière réaliste les processus tumoraux observés dans le cancer colorectal humain. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines, ce qui correspond à leur maturité sexuelle et assure une stabilité hormonale. Cet âge est optimal pour garantir une réponse biologique cohérente et réduire les variations liées aux fluctuations hormonales. De plus, leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui est essentiel pour l’étude de la progression tumorale et des réponses aux traitements, tout en permettant des interventions expérimentales.