Rongeurs
Etude en IRM des mécanismes de causalités communs entre la douleur chronique et les maladies cardiovasculaires chez le modèle TRPM8-KO
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une douleur chronique est provoquée par injection intra-articulaire, associée à une maladie cardiovasculaire et à un régime hypercalorique, chez 200 souris dont une partie est privée d'un gène lié à la douleur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe trois tests comportementaux étalés sur trois semaines, puis deux à trois heures d'anesthésie pour cinq séquences d'IRM, avant une chirurgie terminale de prélèvement. Le porteur écrit que cette douleur ne devrait pas affecter le bien-être quotidien des animaux, et précise deux phrases plus loin qu'elle ne pourra pas être soulagée, l'étude portant sur la douleur elle-même. Même chose pour les troubles cardiovasculaires induits et le risque d'accident vasculaire cérébral qui les accompagne, auxquels les souris ne seront pas soustraites, toutes étant tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes.
Objectifs
La douleur chronique est un problème de santé majeur, souvent lié à d’autres maladies comme les maladies cardiovasculaires (MCV). Ces liens suggèrent des mécanismes biologiques communs. Cette étude fait partie d’un projet visant à mieux comprendre ces interactions. Dans une première phase du projet, nous avons déjà étudié des souris avec des techniques d’imagerie cérébrale avancées (IRM) et des tests comportementaux. Nous avons découvert que la douleur chronique associée aux MCV pouvait entraîner des troubles de la mémoire et de l’anxiété, avec des différences entre mâles et femelles. Chez les mâles, les MCV semblaient modifier l’anatomie du cerveau, tandis que chez les femelles, les troubles étaient plus liés à des changements dans certaines connexions cérébrales. En parallèle de notre étude chez la souris, une grande étude génétique sur 29 000 personnes a montré que la perte d’un gène particulier était associée à un risque plus faible de développer une douleur associée à des comorbidités. Cela suggère que ce gène pourrait jouer un rôle dans ces maladies. Nous voulons donc tester cette hypothèse en étudiant des souris dépourvues de ce gène. L’objectif est de voir si ces souris sont ainsi protégées des effets négatifs de la douleur chronique et des MCV. Nos recherches ont trois objectifs : (i) comprendre l’effet de l’absence de ce gène sur des souris saines ; (ii) voir si l’absence de ce gène induit des modifications chez les souris exposées à la douleur chronique et aux MCV ; (iii) explorer si ce gène joue un rôle dans les différences observées précédemment entre les sexes. Grâce à l’imagerie cérébrale et aux tests comportementaux, nous chercherons donc à identifier des zones du cerveau spécifiquement touchées. Cette étude pourrait aider à mieux comprendre le rôle du gène cible et ouvrir la voie à de nouvelles pistes pour traiter la douleur et ses effets associés chez l’Humain.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal attendu de cette étude est l’obtention d’une meilleure compréhension l’implication d’un gène dans le développement de la douleur et des comorbidités, et des altérations comportementales et de connectivité cérébrale associées. Cette étude mettra en lumière les mécanismes en jeu lors de l’absence de ce gène, chez des animaux souffrants, non souffrants, mâles et femelles. De telles données seront porteuses de bénéfices en santé humaine car elles dévoileront des pistes et des preuves de concept pour la mise en place de stratégies thérapeutiques spécifiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 injections réalisées sous anesthésie d'une durée de 15 minutes puis 3 tests comportementaux d'une durée de 5 minutes à 30 minutes à raison de 1 test/jour pendant 3 semaines avec 3 à 7 jours de récupération ente chaque test. Les animaux seront imagés par 5 séquences IRMs au cours d’une seule acquisition, sous anesthésie d'une durée de 120 à 180 minutes, puis subiront une chirurgie terminale pour prélèvement sous anesthésie profonde complété par une analgésie. Pour l’apprentissage des gestes, les animaux seront soumis à des injections sous anesthésie d’une durée de 5 à 30 minutes. Les animaux seront soumis à ces injections un maximum de 3 fois avec un délai d’une semaine minimum entre deux sessions
Impact sur les animaux
Le développement de la douleur chez ces souris ne devrait pas affecter le bien-être quotidien des animaux, ni induire des changements de l’apparence générale. Néanmoins, cette douleur est considérée comme modéré et une gêne au niveau de la patte affectée peut être induites menant potentiellement à des perturbations du mouvement de la patte affectée type boiterie, ou un toilettage excessif. L’étude portant elle-même sur la douleur chronique, celle-ci ne pourra pas être soulagée ce qui peut constituer une nuisance. De la même manière, l’induction d’une maladie cardiovasculaire chez les souris doit pouvoir mener à des perturbations favorisant le risque d’accidents vasculaires cérébraux, cependant l’étude portant elle-même sur la pathologie, les animaux ne pourront être soustraits à cette nuisance. Les injections caudales et intra-articulaires constituent des procédures pouvant induire une douleur légère de courte durée. Enfin, le régime hypercalorique, constitutif de la modélisation des comorbidités, pourrait mener à du surpoids chez certaines souris et donc à d’éventuelles difficultés motrices et d’atteinte de l’eau et/ou de la nourriture.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort et des organes prélevés.
Remplacement
L'étude des animaux modèles de la douleur chronique et ses comorbidités est encore indispensable pour progresser dans la compréhension des mécanismes et caractéristiques génétiques qui les lient. Il n'est pas encore possible de nos jours de modéliser les processus complexes de la douleur chronique associés à l’anxiété, à la dépression et aux maladies cardiovasculaires de façon assez fiable et complète dans un modèle in silico. Il est donc nécessaire de recourir à des modèles animaux dont on analyse la relation entre les différentes pathologies et les altérations cérébrales à l’échelle macroscopique.
Réduction
Le nombre de souris est réduit au minimum d’animaux nécessaires afin d’assurer l’efficacité des tests statistiques et donner des résultats statistiquement fiables dans toutes les expériences réalisées. Pour l'imagerie, le nombre d'animaux a été déterminé sur la base de nos études IRM antérieures. Ainsi 15/groupe/sexe sont nécessaires et suffisants pour comparer les réseaux fonctionnels et évaluer les modifications de connectivité structurelle entre les groupes. Dans le cadre de cette étude, la même cohorte de souris sera utilisée pour tout les tests (comportement puis imagerie). C'est pourquoi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons 15 animaux par groupe.
Raffinement
Les animaux bénéficieront de soins appropriés pour optimiser leur bien-être, tels que des éléments d’enrichissement (carrés de coton pour l’édification du nid, des morceaux de bois pour que les animaux usent leurs dents, et des tubes pour fournir un abri) et d’un suivi quotidien. De plus, ils seront maintenus en groupe sociaux. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience par du personnel formé, avec une observation détaillée. Durant l'examen IRM, le raffinement sera respecté par l'usage d'une anesthésie afin de réduire au maximum le stress de l'animal. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage. En cas de chute de la température et/ou de la respiration non gérable, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM. Il sera alors placé dans une cage mise sous une lumière chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Une liste de points limites ont été établi pour chaque procédure expérimentale ainsi que pour l’hébergement afin de soustraire l’animal à la souffrance. Concernant la chirurgie terminale, les souris seront sous anesthésie générale, et la couverture analgésique sera renforcée avec une injection locale 5 minutes avant la chirurgie. Dans un objectif de raffinement une analgésie locale sera aussi effectuée en plus de l’anesthésie générale, 5 minutes avant les injections.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d’utiliser des transgéniques est liée à l’absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la maladie humaine. Pour ce projet nous utiliserons des âgées de 6 à 10 semaines étant l'équivalent de l'âge adulte chez l'Homme, puisque l’étude repose sur l’exploration de l’anatomie, fonctionnelle et structurelle du cerveau mature. C’est aussi l’âge où le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont présentes.
Impact d’une exposition aux immunosuppresseurs in utero sur le développement rénal et la fertilité de la descendance, sur un modèle souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
4 317 souris vont être utilisées dans ce projet, chaque femelle traitée recevant deux immunosuppresseurs deux fois par jour pendant soixante-dix jours, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Les micro-prélèvements de sang reviennent chaque semaine pendant dix semaines, avec douze prélèvements en douze heures pour dix-huit d'entre elles, et trois mesures de tension artérielle sous contention de dix à quinze minutes. Le porteur indique que des cultures de reins fœtaux humains, réalisées dans son laboratoire, ont déjà montré un effet négatif de ces médicaments sur le développement rénal, et affirme que ces cultures ne peuvent pas reproduire une exposition longue. Les mères et leurs premiers petits sont tués pour le prélèvement des organes, et les souris de la seconde génération, issues de grand-mères traitées, sont tuées à la naissance.
Objectifs
Depuis les années 1980, de nombreuses femmes porteuses de greffes d’organes ou sous immunosuppresseurs (IS) pour une maladie auto-immune, ont mené des grossesses à terme. De plus, des greffes d’utérus sont maintenant envisageables pour des femmes nées sans utérus, souhaitant mener une grossesse. Pendant et juste avant la grossesse, le traitement IS doit être optimisé pour contrôler le risque de rejet, protéger l’immunité anti-infectieuse, et préserver le fœtus de la toxicité des médicaments. Les IS fréquemment utilisés pendant la grossesse chez les femmes porteuses de greffes d’organe ou traitées pour une maladie auto-immune sont ceux que nous allons tester. Quelques études (données épidémiologiques et travaux ex vivo) ont déjà été menées pour suivre la toxicité des IS sur le rein et sur la fertilité. Les traitements aux IS, qui ne peuvent pas être interrompus pendant la grossesse, exposent le fœtus à une concentration potentiellement élevée de ces médicaments. Après la naissance, des études ont estimé que les concentrations sanguines de médicaments étaient faibles et sans conséquence pour le développement ultérieur de l'enfant. Néanmoins aucune étude n'a été effectuée pour suivre le développement de l'enfant jusqu'à l’âge adulte et pour contrôler ses fonctions rénales et reproductives. Pourtant, cette exposition in utero pourrait provoquer une maladie rénale chronique chez l’enfant, ainsi que de l'hypertension artérielle et des problèmes de fertilité, qui sont des pathologies pour lesquelles un dépistage précoce peut amener à une prise en charge adaptée. Ce projet vise à étudier, chez la souris, l’impact de deux immunosuppresseurs sur 1) la gestation, 2) la toxicité sur le rein, 3) la fonction de reproduction des descendants exposés in utero 4) la fonction rénale des descendants exposés in utero. Cette étude doit non seulement permettre de déterminer les effets possibles des IS sur les fonctions rénale et reproductive (étude de la fertilité) de la mère, mais également un suivi de la descendance sera effectué pour déterminer si son développement est normal et si les fonctions rénales et reproductives ne sont pas altérées. Le modèle choisi (souris) pour mener ces expériences présente l’avantage d’étudier les effets des IS sur la mère et sa descendance, sur un temps court, limitant les risques liés à l'immunosuppression.
Bénéfices attendus
Aujourd’hui, il n’existe pas de données épidémiologiques concernant le risque d’hypertension artérielle ou de maladie rénale chronique à long terme et en particulier à l’âge adulte après exposition in utero à ces médicaments, alors que la santé des enfants nés de femmes transplantées d’organe est une préoccupation majeure des parents et des praticiens qui les suivent. L’impact des IS in utero sur la fertilité de la descendance est quant à lui totalement inconnu et non étudié à ce jour. Ce projet se concentre sur deux IS et pourrait permettre de mettre en évidence l’existence d’une hypertension artérielle, d’anomalies de la fonction rénale ou de troubles de la fertilité chez les descendants et de caractériser les anomalies dans les reins, et les organes reproducteurs. A plus long terme, d’autres études sur l’impact de nouveaux IS pourront être menées ultérieurement par l’équipe pour étudier l’effet séparé ou en combinaison de ces différents traitements. Les résultats escomptés permettront d’améliorer le conseil prénatal des femmes qui envisagent une grossesse sous IS, de favoriser le dépistage et la prévention chez les enfants et les jeunes adultes qui ont été exposés in utero à ces traitements IS
Procédures
Administration douce (volontaire) de deux immunosuppresseurs, 1-2 minutes,deux fois par jour pendant 70 jours. Micro-prélèvements sanguins (30 secondes) 1 fois par semaine , pendant 10 semaines et pour un groupe de souris (n=18), 12 micro-prélèvements additionnels,sur 12 heures. Mesure de la tension artérielle, induisant une contention de 10 à 15 minutes, 3 fois par animal. Prélèvement d'urine par contention (10 secondes, 1 fois)
Impact sur les animaux
Effets des IS sur les mères traitées et sur leur descendance : 1- risque de néphrotoxicité : le dosage de la créatinine, mesuré par des micro prélèvements répétés de sang, permet de faire le dépistage de l'insuffisance rénale. Ces micro-prélèvements de sang répétés entraineront du stress, une douleur légère. Recueils d’urine : léger stress de la contention. 2-risque d'hypertensension artérielle : léger stress de la contention pendant la mesure de la pression artérielle.
Devenir
Tous les animaux traités et les premiers descendants sont euthanasiés pour prélèvement des organes nécessaires aux analyses. Les animaux de seconde génération, issus de grand-mères traitées, seront euthanasiés à la naissance.
Remplacement
Des études réalisées chez des femmes exposées aux IS suite à une transplantation rénale, ont estimé que les concentrations sanguines de médicament chez le nouveau-né était très faible et sans conséquence pour son développement ultérieur dans les premières années de vie. Par ailleurs, des études ex vivo de reins fœtaux humains exposés aux IS et réalisés au laboratoire, ont montré un effet négatif sur le développement rénal, après 7 jours d’exposition. Ces cultures ex vivo ne peuvent cependant pas mimer un temps long d’exposition aux IS. Pour connaitre l’impact des expositions in utero des IS, et mettre en évidence l’existence d’une hypertension artérielle, d’anomalies de la fonction rénale ou de troubles de la fertilité chez les descendants, le modèle souris présente l’avantage de pouvoir réaliser une exposition avant, pendant et après la gestation couvrant toute la période de l’allaitement, ce qui n’est pas possible sur le modèle ex vivo de la culture d'organes déjà réalisée. De plus il permet d’étudier sur un temps court les effets des IS sur la mère et sa descendance.
Réduction
Pour l’expérience pilote , le nombre de souris femelles utilisées est restreint au minimum soit 3 souris par traitement IS. Trois doses différentes par IS seront distribuées aux souris. Par conséquent, pour les deux IS testés, 18 souris femelles de 5 semaines seront utilisées. Pour l’expérience complète , le nombre de souris est ajusté en utilisant un test statistique et correspondant au nombre minimal d’animaux nécessaires pour des analyses statistiques valides. La procédure pliote permettra d’établir la dose à administrer dans la seconde procédure ce qui limitera à un seul groupe de traitement. Comme les deux IS seront repris dans le même mélange huile de tournesol/lait concentré, un seul groupe placebo pourra être exploité et utilisé comme contrôle pour les deux IS.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe. De l’enrichissement est ajouté : matériel de nidification et un objet pour se mettre à l’abri. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront de prévenir la survenue de problèmes potentiels. Une grille du suivi du bien-être des animaux est établie et inclue les critères de poids corporel, d’’apparence générale et de comportement. Le comportement maternel (allaitement, déplacement et toilettage des petits) sera également contrôlé. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques à chaque procédure seront appliqués, comme la perte de poids ou une altération de l'apparence et du comportement. Pour limiter le stress des animaux, l’administration des médicaments se fera par une nouvelle méthode volontaire, par voie orale, alternative douce à la technique du gavage ; Après 2 semaines d’entrainement, aucune contention n’étant nécessaire pour la prise du médicament, le stress est diminué. Le volume de sang nécessaire aux analyses nous permet de réaliser des micro prélèvements, peu invasifs ; le recueil des urines et la mesure de la tension artérielle nécessitent une légère contention de l’animal (avec isolement des animaux pendant 15 minutes comprenant la préparation de l’animal, son acclimatation à l’environnement et la mesure).
Choix des espèces
Le modèle choisi pour mener ces expériences est la souris car il présente l’avantage d’étudier sur un temps court les effets des IS sur la mère et sa descendance. Afin de conserver une variabilité inter-individus comme cela est observée chez l’Homme, nous utiliserons l’espèce non consanguine qui est couramment utilisée pour étudier l’effet de substances chimiques ou pharmacologiques. Cette lignée possède également d’autres avantages comme une taille de la portée au sevrage d'environ 12 souriceaux et une faible mortalité post-natale, ce qui augmente la puissance statistique. Des souris adultes et matures sexuellement (femelles traitées aux IS) et leur petits (mâles et femelles) sont suivies pour déterminer leur capacités reproductrices.
Etude du rôle de CD99 au cours de la vascularite à anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles (ANCA) (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
120 souris sont tuées sous anesthésie, sans reprise de conscience, pour fournir les cellules souches du sang greffées à d'autres souris préalablement irradiées. Au total 920 souris vont être utilisées dans ce projet, toutes tuées à l'issue, 800 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les receveuses et les témoins, transportées entre deux établissements, reçoivent trois injections sur cinq jours pour déclencher une vascularite avec atteinte rénale, puis subissent deux mesures de fonction rénale avec un capteur fixé sur le dos pendant une heure et deux échographies cardiaques, avant d'être tuées douze ou trente jours plus tard. Le porteur affirme le recours aux souris "indispensable", cette maladie étant selon lui impossible à reproduire en laboratoire, et décrit sa recherche d'alternatives comme une veille bibliographique et une présence en congrès.
Objectifs
Récemment, la protéine CD99 a été identifié comme un marqueur urinaire qui aide à prédire la survenue d’une insuffisance rénale aigüe (IRA) chez les patients, ainsi qu’un facteur protecteur face à une agression des reins chez les souris. Cette protéine est présente à la surface à la fois des globules blancs et des vaisseaux. Il a été découvert (travaux non encore publiés) une localisation inconnue de cette protéine dans l’organisme : au niveau d’un type particulier de cellules rénales qui jouent un rôle central dans le déclenchement de maladies rénales sévères, comme la vascularite associées aux anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles (ANCA). Cette maladie grave, pouvant affecter plusieurs organes (dont le rein, le poumon, le cœur et la peau), est responsable d’une défaillance rénale complète et définitive chez 20 % des patients dans les 5 ans suivant le diagnostic, et s’avère même mortelle chez près de 15 % des patients dans la première année de la maladie. Compte-tenu de ces découvertes récentes concernant CD99, il apparait pertinent de caractériser comment les deux « versions » de cette protéine (« globule blanc » et « vaisseau ») influencent le risque de vascularite à ANCA grave, avant de développer des traitements ciblant CD99. Ce projet aura lieu au sein de deux établissements utilisateurs : EU1/2 et EU2/2.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre les mécanismes de la vascularite à ANCA. Mieux comprendre le rôle de la protéine CD99 dans l’atteinte rénale par la vascularite à ANCA, dans l’objectif de développer des traitements de la vascularite à ANCA ciblant CD99.
Procédures
Dans un premier temps, au sein de l’établissement utilisateur n°1 (EU1/2), des animaux chimériques possédant la protéine CD99 soit à la surface de leurs globules blancs, soit à la surface des vaisseaux, seront produits. Pour se faire, des souris (« receveuses ») seront irradiées durant quelques minutes puis recevront une injection de cellules souches du sang par une injection au total de 10 secondes sous anesthésie générale gazeuse. Ces cellules souches proviennent d’autres souris préalablement euthanasiées (120 « donneuses » au total). Dans un second temps, les souris « receveuses » ainsi que des souris contrôles n'ayant pas été irradiées (représentant un total de 800 animaux) seront transportées vers l’établissement utilisateur n°2 (EU2/2) pour y développer une vascularite à ANCA avec atteinte rénale, à l’aide au total de trois injections (plusieurs anticorps et une molécule pro-inflammatoire) de 10 secondes chacune sous anesthésie générale gazeuse réparties sur 5 jours. Ces animaux seront soumis à des mesures de leur fonction rénale (2 mesures par animal) : sous anesthésie générale gazeuse, un capteur est fixé sur le dos de l’animal pendant 60 minutes maximum et une molécule est administrée par une seule injection de 10 secondes. Ces animaux seront aussi soumis à des mesures non-invasive de la fonction cardiaque par échographie (2 mesures par animal) pendant 10 minutes maximum, sous anesthésie générale gazeuse, sans injection nécessaire. Les prélèvements d’urine (maximum 5 répartis sur 8 semaines) auxquels tous les animaux seront soumis se feront de façon vigile mais indolore et non-invasive, puisqu’ils reposeront sur la collecte d’urine émise de façon réflexe par l’animal lors de sa préhension. Les animaux seront mis à mort 12 jours (modèle précoce) ou 30 jours (modèle tardif) après le début de l’induction de la vascularite, avec une injection de 10 secondes sous anesthésie générale gazeuse d’un agent léthal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles de l’irradiation sont une légère baisse de l'alimentation avec perte de poids minime durant les premiers jours post-irradiation. Les animaux peuvent ressentir un léger stress du fait de l'enfermement et du bruit au cours de la procédure. L'irradiation ne procure aucune douleur. Les prélèvements sanguins et les injections des agents provoquant la vascularite à ANCA peuvent provoquer du stress ou de la douleur. Le modèle de vascularite à ANCA provoque une altération attendue de la fonction rénale. Les effets indésirables possibles sont une baisse de l’alimentation avec perte de poids modérée mais stable, et des lésions cutanées de type dermites ou ulcères (néanmoins très rarement rapportés avec ce protocole) liées à la vascularite.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vue de l'analyse de leur sang, de leur urine et de leurs organes.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable car la glomérulonéphrite liée à la vascularite à ANCA est impossible à reproduire en laboratoire. Une veille bibliographique est réalisée régulièrement par les responsables du projet pour prendre connaissance d’éventuelles nouvelles méthodes alternatives (plateforme de référencement des publications Pubmed, journaux de néphrologie comme Kidney International, participation à des congrès annuels internationaux de recherche de néphrologie comme l’European Renal Association, etc.).
Réduction
Notre équipe a noué une collaboration avec l’équipe ayant créé et publié cette version du modèle d’atteinte rénale par vascularite à ANCA, ainsi qu’une autre collaboration avec une équipe de recherche bordelaise utilisant ce protocole en routine depuis un an, ce qui nous permet de limiter certaines étapes de mise au point coûteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle de sorte à obtenir des résultats statistiquement pertinents pour chaque paramètre principal et secondaire. De plus, nous valorisons l'ensemble de notre élevage de souris à l’EU1, puisque nous utilisons les deux sexes. Il est prévu de recourir à un maximum de 920 souris. Les résultats seront interprétés en utilisant des tests statistiques communément utilisés en biologie.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature et les observations réalisées par nos collaborateurs ayant créé ou importé ce protocole de vascularite à ANCA. Les animaux seront hébergés dans des services de zootechnie agréés par le ministère, par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau à volonté. Ils seront observés scrupuleusement (apparence générale, comportement, absence de plaies...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés deux fois par semaine. Pour les changes et les manipulations, les souris seront tenues dans la main de l’expérimentateur mais ne seront jamais suspendues par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures, euthanasie si signes de souffrance irrémédiables). Une échographie cardiaque permettra de dépister une atteinte du cœur de façon précoce. Concernant le transport (maximum 20 minutes) des animaux entre l'EU1/2 et l'EU2/2, il sera effectué sur des souris aptes à supporter le voyage et dans des conditions telles qu’elles ne puissent être blessées ou subir des souffrances inutiles. Le transport sera effectué suivant une procédure déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport), impliquant une société agréée qui effectue de manière régulière la navette entre l'EU1/2 et l'EU2/2.
Choix des espèces
L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données scientifiques et qu’il existe un nombre important de modèles de souris adaptés à l’étude de maladies affectant le rein. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 7 à 13 semaines au début du protocole expérimental. À cet âge, les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.
Caractérisation et évaluation pharmacologique sur des tumeurs dérivées de patient résistantes à des thérapies innovantes.
- Recherche appliquée
- Cancers
6 500 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau une greffe de tumeur prélevée sur un patient, puis jusqu'à 160 injections de médicament par étude, certaines molécules étant administrées deux fois par jour pendant seize semaines, avec des prélèvements de sang hebdomadaires. Un même animal peut rester trente-six semaines dans le protocole. Ces modèles de tumeurs résistantes, le porteur les met à disposition de la communauté scientifique et les emploie dans des collaborations académiques et industrielles pour valider ou réfuter des hypothèses sur des composés, et il affirme qu'il est "indispensable" de créer de nouveaux modèles sur un "organisme complexe" comme la souris.
Objectifs
Depuis plusieurs années, le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses a permis des avancées notables, notamment pour améliorer la survie des patients atteints de cancers difficiles à traiter. Cependant, la résistance aux traitements, phénomène appelé résistance acquise, demeure un défi majeur en oncologie, limitant l’efficacité à long terme des thérapies. Ce problème survient généralement après quelques mois de traitement, entraînant la progression de la maladie. Les échecs thérapeutiques résultent souvent d’un manque de compréhension des mécanismes d’action des médicaments et des voies biologiques impliquées dans l’échappement des cellules tumorales. Mutations génétiques, altérations de la signalisation cellulaire ou modifications du microenvironnement tumoral influencent la réponse aux traitements. Une meilleure connaissance de ces mécanismes permettrait d’identifier de nouvelles cibles et de développer des thérapies plus efficaces, personnalisées et durables. Dans cette optique, les modèles issus de greffes de tumeurs humaines chez la souris, jouent un rôle clé. Ces modèles conservent les caractéristiques génétiques et pharmacologiques des tumeurs humaines, offrant une reproduction réaliste des réponses cliniques et des mécanismes de résistance. Ils sont ainsi devenus des outils indispensables pour évaluer les effets de nouveaux traitements et combinaisons thérapeutiques. Notre projet vise à développer des modèles de greffes de tumeurs de patients à partir de biopsies de patients ayant développé des résistances à des thérapies innovantes en développement. Ces modèles permettront d’étudier les mécanismes de résistance et d’action des médicaments, ainsi que de tester de nouvelles stratégies, notamment des combinaisons thérapeutiques. À ce jour, notre équipe a généré de nombreux modèles de ce type, utilisés pour des recherches approfondies sur les mécanismes de résistance et le développement de nouveaux traitements. L’objectif de ce projet est de caractériser pharmacologiquement ces modèles, de tester des composés innovants et de mener des études pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. Ces travaux contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes de résistance et à l’optimisation des thérapies contre le cancer.
Bénéfices attendus
L’utilisation des modèles de greffes de tumeurs de patients sur aimaux permet de mieux comprendre les mécanismes de résistance aux thérapies, contribuant ainsi à l’avancée des connaissances scientifiques. Au sein de notre équipe, nous avons développé une activité de recherche dédiée à l’identification des mécanismes de résistance et des modes d’action de thérapies innovantes. Au cours des dernières années, nous avons lancé plusieurs projets de recherche, notamment sur la résistance précoce aux thérapies. Ces travaux ont permis de générer de nouvelles connaissances sur les mécanismes de résistance et d’action des médicaments, avec des implications directes pour améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer. Nos modèles sont également mis à la disposition de la communauté scientifique et peuvent être intégrés dans des projets de recherche fondamentale, préclinique et translationnelle. Par exemple, les tests pharmacologiques réalisés dans le cadre de collaborations académiques et industrielles ont permis de valider ou de réfuter les hypothèses sur des modèles plus sophistiqués que les lignées cellulaires, et plus représentatifs des caractéristiques humaines. Un autre avantage majeur de ces modèles réside dans leur capacité à conserver les caractéristiques pharmacologiques, génétiques et histologiques des tumeurs des patients. Cela offre la possibilité de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques ou de nouveaux composés sur des tumeurs issues de patients en progression sous thérapies innovantes. À terme, ces recherches ouvrent la voie à des essais cliniques pour de nouveaux médicaments. À ce jour, notre équipe a validé, grâce à ces modèles, des combinaisons thérapeutiques capables de surmonter la résistance ainsi que de nouveaux inhibiteurs, dont certains sont déjà en cours d’évaluation clinique.
Procédures
Chaque souris incluse dans l’étude fera l’objet d’une greffe tumorale sous-cutanée sous anesthésie générale, représentant une intervention unique d’environ 10 à 15 minutes. Un sous-groupe recevra également, au moment de la greffe, un implant hormonal, inséré sans intervention supplémentaire, en sous-cutané, durant la même anesthésie générale. À l’issue de la phase de croissance tumorale, une partie des souris sera traitée selon différents protocoles expérimentaux. Les traitements seront administrés pendant une période pouvant aller jusqu’à 16 semaines, à une fréquence variant de 1 à 5 jours par semaine, selon les groupes. Certains médicaments nécessiteront une administration biquotidienne, portant le nombre maximal d’injections médicamenteuses à 160 par animal et par étude. La durée moyenne de chaque procédure (de l’implantation tumorale jusqu’à la fin du traitement) est estimée à 20 semaines, tandis que la durée maximale est fixée à 36 semaines par animal. Des prélèvements sanguins ponctuels ou séquentiels pourront être réalisés au cours de l’étude. Chaque prélèvement durera environ 5 minutes. Lors de cinétiques courtes (sur une semaine), jusqu’à 3 prélèvements maximum seront effectués. Pour des cinétiques longues, un prélèvement par semaine pendant une durée maximale de 6 semaines sera réalisé.
Impact sur les animaux
Les nuisances découleront des interventions et greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress chez l’animal et les croissances tumorales en sous-cutanée peuvent entraîner des douleurs locales et modérées. Une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids modérée peuvent apparaître chez la souris suite aux traitements médicamenteux. Les prises de sang peuvent entraîner une douleur locale modérée transitoire.
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue de chaque procédure afin de permettre la récupération des échantillons tumoraux et/ou tissulaires pour les analyses post-traitement (pharmacologiques, histologiques, ou génétiques).
Remplacement
Il s'agit ici d'un projet de recherche dont l'objectif est d'étudier les mécanismes de résistance aux thérapies, de mieux comprendre les mécanismes d'action des médicaments innovants et de développer de nouvelles thérapies pour les patients. Les tumeurs greffées dérivées de patients que nous avons générés, et que nous continuons à développer à partir de biopsies de patients résistants à des thérapies innovantes (saisine valider), constituent des modèles précieux et uniques. Ils offrent une opportunité essentielle pour approfondir notre compréhension des résistances et des mécanismes sous-jacents. Ces modèles, plus proches à la fois génétiquement, pharmacologiquement et histologiquement des tumeurs humaines, permettront d’augmenter le succès du développement de traitements efficaces en clinique. Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments pour des populations bien définies (médecine personnalisée), il est indispensable de créer de nouveaux modèles sur un organisme complexe tel que la souris, avec une activité métabolique pouvant modifier la distribution et l’efficacité thérapeutique. La complexité biologique des organismes vivants est extrêmement élevée, et certaines interactions entre différents systèmes biologiques sont impossibles à reproduire en dehors d'un organisme vivant. Les modèles animaux peuvent fournir des informations cruciales sur la physiologie, la pathologie et les mécanismes de la maladie qui ne peuvent pas être obtenues par d'autres moyens. De plus, ils représentent beaucoup mieux les processus biologiques humains que les modèles cellulaires ou informatiques. De plus, les interactions entre différents organes et systèmes de l'organisme ne peuvent être étudiées que chez les animaux vivants.
Réduction
En parallèle du développement de tumeurs greffées dérivées de patients, et afin de réduire le nombre d'animaux utilisés en expérimentation (respect des 3R), nous développons des organoïdes et des lignées cellulaires. Ces modèles in vitro permettront des études mécanistiques et un large criblage de médicaments, limitant ainsi l'utilisation d'animaux en validant les résultats in vitro avec des modèles de greffes de tumeurs de patients sur souris plus proches de la biologie humaine. Les effectifs d'animaux ont été calculés au plus juste en utilisant des calculs de psuissance. Les résultats seront exploités grâce à des tests statistiques (modèles linéaires non non-linéaires).
Raffinement
Lors des interventions, telles que les greffes sous-cutanées ou l'ajout de pastille hormonale, les souris sont anesthésiées (anesthésie générale) et reçoivent un médicament contre la douleur. Elles sont surveillées quotidiennement pour évaluer leur état de santé. La taille des tumeurs est mesurée régulièrement à l'aide d'un pied à coulisse, pour surveiller la taille des tumeurs. L'alimentation des souris sera adaptée à leur prise alimentaire et remplacée par une alimentation appétente et plus facilement préhensile en cas de perte d'appétit. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
L'utilisation de souris est justifiée: par la facilité d’utilisation des modèles murins pour le développement préclinique. Par la nécessité d’utilisation de modèles immunodéprimés afin de faciliter la croissance tumorale. Des souris âgées de 5 à 9 semaines seront utilisées pour standardiser la procédure et ainsi réduire la variabilité intra-expérience. Par ailleurs, l’utilisation de souris âgées de 5 à 9 semaines permet d’améliorer le taux de prise des greffes.
Rôle de NLRP3 dans la biologie de lymphocytes T CD8 et son impact sur la réponse aux traitements anti-tumoraux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Greffées sous la peau du flanc d'une tumeur sous anesthésie, puis traitées par quatre injections dans l'abdomen à l'état vigile, 2 560 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour analyser les cellules immunitaires de leurs tumeurs, de leur rate et de leurs ganglions. Le projet cherche à savoir si l'absence d'une protéine dans certains globules blancs rendrait les traitements anticancéreux plus efficaces, question que le porteur juge hors de portée des expériences in vitro. Les 2 560 animaux ne sont justifiés que par une ligne, le nombre ayant "été déterminé par une méthodologiste", et la surveillance annoncée pour des souris porteuses de tumeurs se limite à trois passages par semaine.
Objectifs
Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de comprendre comment cette maladie fonctionne afin de trouver des traitements les plus efficaces possibles. NLRP3 est une protéine largement décrite pour ses fonctions dans l’inflammation, dans des globules blancs appelés myéloïdes. Nos données préliminaires obtenues montrent que d’autres globules blancs appelés lymphocytes, possèdent également la protéine NLRP3. En l’absence de NLRP3, ces globules blancs ont une activité antitumorale marquée contre différents types de tumeurs. Ce projet a pour but d’évaluer si l’absence de NLRP3 dans ces globules blancs permettrait de rendre plus efficace les traitements anticancéreux
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont les suivants : - D’apporter des connaissances nouvelles sur le rôle de NLRP3 dans les globules blancs appelés lymphocytes - D’évaluer si NLRP3 pourrait être une cible thérapeutique ou un complément à l’immunothérapie
Procédures
Les animaux recevront une injection de cellules tumorales en sous cutanées sur le flanc sous anesthésie générale. Les différents traitements seront réalisés en intrapéritonéal sur souris vigiles (4 doses par souris, chaque injection dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les tumeurs seront injectées en sous cutanées dans le flanc. De ce fait, une des nuisances pouvant être observée dans de très rares cas est la formation nécrose. De plus, la manipulation des souris et la contention de ses dernières peuvent engendrer un stress. L’injection des cellules tumorales en sous cutanées peut induire une légère douleur chez l’animal. Ces dernières se feront donc sous anesthésie à l’isofluorane. De même, l’injection des traitements en intrapéritonéal peuvent induire une légère douleur chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience car nous étudierons les cellules immunitaires présentes dans les tumeurs, rate et ganglions.
Remplacement
Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les cellules. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires. Une fois que nous aurons obtenus les résultats de cette étude chez la souris, le décryptage des mécanismes moléculaires mis en œuvre sera réalisé in vitro.
Réduction
Dans un souci de réduction, les expériences ne seront réalisées que deux fois et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience de croissance tumorale sera accompagnée d’une analyse de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences. Le nombre d'animaux a été déterminé par une méthodologiste.
Raffinement
Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance. Les injections sous cutanées se feront sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.
Etude du rôle d’un canal protéique spécifique dans l’épilepsie et la maladie d’Alzheimer à l’aide de modèles murins.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
775 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 145 d'entre elles et modéré pour 546, les 84 dernières étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Une partie subit à sept à dix jours d'âge un prélèvement de l'extrémité de la queue sur animal vigile pour le génotypage, et un autre groupe une chirurgie de deux heures suivie, au moins dix jours plus tard, d'une seconde chirurgie sans réveil. Les souris porteuses des mutations Alzheimer sont tuées à six mois, avant l'apparition du phénotype dommageable, une perte de poids, que la lignée développe avec l'âge. Le bénéfice annoncé, une nouvelle stratégie thérapeutique pour les patients, est renvoyé au long terme et conditionné à des résultats concluants, alors que le porteur a déjà éprouvé ses hypothèses en culture cellulaire et sur un modèle biophysique de neurone.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative affectant 15 pourcents de la population après 80 ans. L’épilepsie, caractérisée par la présence de crises et d’activités épileptiformes visibles à l’aide d’électroencéphalogramme, est une comorbidité fréquente de cette maladie. Or, les patients atteints des deux pathologies voient leurs capacités cognitives se dégrader plus rapidement. Il a été décrit, qu’un canal protéique, responsable du passage d’ions potassium à travers la membrane cellulaire, est impliqué dans certains types d’épilepsie : les encéphalopathies épileptiques. Cependant le rôle de ce canal dans le contrôle de l’activité neuronale n’est que partiellement connu. Ce projet a pour objectif de vérifier si les modifications de l’expression, de localisation et de fonction de ce canal pourraient contribuer à la suractivité des neurones, observée précocement dans la maladie d'Alzheimer et dans l'épilepsie, participant ainsi à l'altération du tissu nerveux et des fonctions cérébrales.
Bénéfices attendus
Bien qu’il existe des traitements visant à réduire l’excès d’activité neuronale et les crises dans les encéphalopathies épileptiques, ces traitements n’améliorent pas véritablement les fonctions cognitives. De même, dans la maladie d’Alzheimer les traitements existants ont des résultats qui restent modestes. Notre projet vise à proposer une alternative thérapeutique ciblée sur la restauration de l’activité normale des neurones responsables de l’apprentissage et la mémoire. Ainsi à plus long terme, si les résultats s’avèrent concluants, ce projet pourrait participer à l’identification d’une nouvelle stratégie thérapeutique pour les patients atteints de la maladie d’Alzheimer et donc améliorer leur prise en charge.
Procédures
Afin de connaitre leur patrimoine génétique une partie des souris aura un petit prélèvement de l’extrémité de la queue, réalisé sur l’animal vigile (une fois, moins d’une minute). Un groupe de souris sera ensuite euthanasié au cours d’une chirurgie sans réveil (durée inférieure à 15 minutes) sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Un autre groupe sera soumis à une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée (2 heures maximum, une fois). Au moins 10 jours après elles seront euthanasiées au cours d’une chirurgie sans réveil (durée inférieure à 15 minutes) sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Le prélèvement à l’extrémité de la queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux induit une brève douleur lors du prélèvement et un léger saignement est possible. Les manipulations et contentions nécessaires au cours des procédures pourront générer un stress chez les animaux. Les injections peuvent induire une légère douleur et un inconfort au point d’injection. Les anesthésies peuvent provoquer une détresse respiratoire, une sécheresse des yeux et une perte de chaleur de l’animal (hypothermie). Les chirurgies seront associées à un risque d’inconfort et de douleurs pendant quelques jours. Nous utilisons une lignée de souris génétiquement modifiées qui peuvent présenter un phénotype dommageable à partir de l’âge de 6 mois (perte de poids), cependant nous les euthanasierons avant son expression.
Devenir
A l’issue du projet, tous les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire soit pour réaliser les prélèvements d’intérêts pour répondre à notre question scientifique, soit parce qu’ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés du fait de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Nous avons déjà étudié les effets de la surexpression du canal protéique de phénotype sauvage et muté dans des cultures cellulaires et nous avons également utilisé un modèle biophysique de neurone pour pourvoir prédire l’effet sur les phénomènes de plasticité (capacité du cerveau à se réparer et se restructurer). Cependant, le test de ces prédictions nécessite l’utilisation d’un modèle animal de la maladie d’Alzheimer ou une injection de virus permettant d’exprimer les mutants du canal protéique chez l’animal. En effet, il n’existe pas à notre connaissance de modèles autres que les souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du projet. C’est-à-dire de caractériser le canal protéique dans un modèle se rapprochant le plus possible de la physiologie réelle d’un mammifère et permettant une bonne transposition des résultats obtenus à ce que l’on attendrait chez l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans les procédures expérimentales est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux étant définie pour obtenir une puissance statistique suffisante. Il sera en effet nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Nous analyserons nos résultats avec les tests statistiques appropriés. Nous estimons devoir utiliser 775 animaux au total dans le cadre de ce projet. Nous élèverons les souris génétiquement modifiées mais ne produirons que le nombre strictement nécessaire d’animaux pour permettre de réaliser les procédures expérimentales.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes et disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification, d’un bâtonnet de bois à ronger. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Tout le long des procédures, nous assurerons une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Nous nous assurerons de maintenir la température tout au long de l’anesthésie. Un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux pour éviter tout dessèchement des cornées. Après les chirurgies, les souris seront surveillées et gardées au chaud pendant la phase de réveil avant d’être remises en groupes sociaux. L’observation des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance et l’analgésie est maintenue sur 48h après l’opération. Nous évaluerons la possibilité de remplacer la chirurgie sans réveil par une procédure réalisée après une euthanasie médicamenteuse de l’animal. Dans le cas d’euthanasie médicamenteuse l’animal sera sédaté au préalable pour éviter tout stress. Concernant la lignée de souris modélisant la maladie d’Alzheimer, les animaux sont euthanasiés à 6 mois avant l’apparition d’un phénotype dommageable. Pour la partie élevage seuls les mâles seront susceptibles de développer un phénotype dommageable. Les animaux sont mis en accouplement en trio afin d’utiliser moins de mâles à phénotype dommageable. Le prélèvement de la queue pour génotypage est un geste rapide et maitrisé, fait chez l’animal très jeune pour limiter la douleur et favoriser une cicatrisation rapide. Sa taille est réduite au strict nécessaire. Le matériel utilisé est propre et désinfecté entre chaque animal pour éviter tout risque de contamination. Le geste est réalisé au calme dans une pièce dédiée. Une surveillance des animaux prélevés est assurée immédiatement après le geste, puis 30 minutes environ après.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix afin d’étudier le développement du cerveau ainsi que les connexions neuronales chez l’adulte. En effet il s’agit d’un modèle présentant des similarités du développement du système nerveux entre la souris et l’humain. De plus, l’organisation du cerveau chez l’adulte est très similaire chez la souris et l’humain. Nous disposons par ailleurs d’outils adaptés à cette espèce ainsi que d’une expertise sur ce modèle. Pour la partie du projet portant sur la maladie d’Alzheimer (MA), nous utiliserons comme modèle de la pathologie des souris transgéniques dans lesquelles des mutations responsables de la MA chez l’humain ont été insérées. C’est un modèle largement utilisé et validé pour la recherche fondamentale sur cette pathologie. Dans le cas du modèle transgénique de la MA, l’augmentation de l’expression de la protéine d’intérêt a été observé chez des jeunes souris d’un mois. Cependant, les conséquences de cette augmentation sur l’activité neuronale n’ont pas encore été explorées dans ce modèle. De plus, les études réalisées aux stades très précoces de la MA sont limitées. Nous avons donc choisi la fenêtre de 1 à 3 mois. Nous utiliserons les mêmes âges pour étudier les effets dus aux mutations de la protéine d’intérêt pour comparer les résultats entre eux. Les animaux sont prélevés pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et de connaitre leur génotype avant leur sevrage pour l’inclusion dans les procédures expérimentales.
Exploration de la physiopathologie des lésions colorectales induites par une irradiation localisée à dose fractionnée dans un modèle de souris C57BL/6JRj.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Irradiées trois fois au niveau du côlon sous anesthésie, à deux ou trois jours d'intervalle, puis traitées par jusqu'à vingt-cinq injections, 1 248 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 1 094 d'entre elles et sévère pour 154. Toutes sont tuées à l'issue pour le prélèvement des tissus coliques. Le projet porte sur les séquelles intestinales tardives des radiothérapies pelviennes et sur ce qu'y ajoute l'immunothérapie, en irradiant des tissus sains. Le porteur écrit qu'à cette dose les animaux ne perdent pas de poids, et indique quelques lignes plus loin qu'environ 20 % d'entre eux meurent avant la date prévue de mise à mort dans le protocole à douze semaines.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au niveau du côlon qui sont responsables des séquelles tardives des irradiations de la zone pelvienne occasionnés par la radiothérapie et la combinaison de traitements d’immunothérapie et radiothérapie.
Bénéfices attendus
La radiothérapie externe est l’un des traitements incontournables dans la prise en charge des cancers (60% des patients en bénéficient). L’objectif est la recherche d’un compromis entre le contrôle du volume de la tumeur et les dommages aux tissus sains, situés autour de la tumeur. En effet, l’irradiation des tissus sains de la zone pelvienne entraîne de nombreux effets toxiques au niveau de certains organes tels que le côlon, le rectum ou l’intestin grêle dits « organes radiosensibles » du fait d’une forte capacité d’auto-renouvèlement des cellules et aussi d’une forte sensibilité aux rayonnements ionisants. La toxicité radio-induite du tissu intestinal peut entrainer chez certains patients des séquelles à long terme, altérer fortement la qualité de vie du patient voire même dans les cas les plus sévères engager son pronostic vital. L’ensemble et la complexité des séquelles induites suite à une radiothérapie pelvienne ont amené à la définition d’une nouvelle maladie, la « Pelvic Radiation Disease » ou PRD. Aujourd’hui, les traitements combinés, radiothérapie et immunothérapie, par l’utilisation d’inhibiteur de checkpoint, ont montré des bénéfices majeurs dans certains cas de cancers. Ce projet étudiera les conséquences de ces traitements sur le développement des lésions à court et long terme.
Procédures
Les animaux seront irradiés localement sous anesthésie : 3 irradiations de 7-8 min à deux ou trois jours d’intervalle (soit 10 min d’anesthésie au maximum). Pour chaque irradiation, les animaux sont transférés sur la plateforme (5 min aller, 5 min retour). Les souris recevront un traitement par injection (produit aqueux) 3 fois par semaine pour le protocole aigu (soit 6 injections maximum) et 2 fois par semaine pour le protocole tardif (soit 25 injections maximum).
Impact sur les animaux
Suite à l’irradiation locale du côlon en dose fractionnée, certaines souris vont présenter une dépilation au niveau de la zone d’irradiation et d’autres uniquement une décoloration des poils. A cette dose, les animaux ne perdent pas de poids. Pour le temps d’étude tardif (12 semaines) certains animaux peuvent décéder juste avant la date d’euthanasie. Les expériences précédentes montrent un taux de décès d’environ 20% selon les lots d’animaux. Les injections nécessitent une piqure pouvant entrainer une douleur légère et de courte durée. Ces actes seront réalisés dans le respect des bonnes pratiques. Il n’est pas attendu d’effet secondaire des produits administrés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires indispensables aux analyses ultérieures.
Remplacement
Le développement des séquelles coliques nécessite l’interaction entre différents compartiments tissulaires (vasculaire, stromal, inflammatoire et épithélial), conditions retrouvées chez le modèle animal intégré. A ce jour, il n’existe pas d’alternative au modèle animal pour étudier les processus physiopathologiques des séquelles des radiothérapies pelviennes. Ce projet in vivo chez l’animal sera complété par des analyses chez l’homme dans le cadre d’une étude clinique cognitive de ce projet financé et par des analyses in vitro sur des organoïdes issus de colon de souris.
Réduction
Les modèles d’expérimentation pour l’étude tardive des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques, cellulaires et moléculaires des groupes de 10 à 20 animaux sont nécessaires en fonction du modèle et des mesures réalisées. Des tests statistiques seront réalisés afin de comparer tous les groupes entre eux.
Raffinement
Différentes mesures spécifiques sont prises pour réduire au maximum l’impact sur le bien-être des animaux - Hébergement en petit groupe (3 animaux par cage) avec enrichissement (coton et igloo en carton) - Observation quotidienne des animaux suivi du comportement et de leur aspect physique (aspect du poil, mobilité, prostration, pesée) - Pesée hebdomadaire (voire plus fréquente aux temps tardifs) - Mise à disposition des animaux, si besoin, de poches d’eau gélifiée (avec ou sans vitamines) et/ou croquettes humides selon l’état général de l’animal - Mise en place d’une ceinture pour limiter les risques d’irradiation de zone radiosensible.
Choix des espèces
Les modèles d’irradiation chez la souris permettent de reproduire des lésions colorectales et similaires à celles que l’on peut observer chez des patients ayant des séquelles graves des radiothérapies pelviennes. De nombreux outils pour les études moléculaires sont disponibles chez la souris. Pour reproduire la pathologie humaine, des animaux au stade jeune adulte sont utilisés (12 semaines).
Imagerie fonctionnelle par IRM du cerveau chez le rat (Rattus norvegicus) lors de tests comportementaux de résolution de problèmes : contribution à l’étude de l’évolution des fonctions cognitives de haut niveau chez les vertébrés.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tués à la fin de l'acquisition IRM parce que le manganèse qui leur a été injecté les exposerait à une dégradation rapide de leur état de santé, 60 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est hébergé seul, entraîné jusqu'à vingt sessions d'une heure à ouvrir une boîte munie de loquets, puis contenu pour recevoir l'injection de manganèse avant deux heures d'IRM sous anesthésie générale. Un rat qui montre des signes de douleur reçoit un antidouleur mais sort alors de l'expérience, l'analgésie faussant les résultats d'imagerie. L'effectif, lui, ne vient d'aucun calcul exposé ici, seulement d'études d'imagerie antérieures que le porteur ne cite pas.
Objectifs
De nombreuses espèces de mammifères, d’oiseaux, et même de poissons, possédant des cerveaux bien différents, présentent des capacités cognitives complexes comme la résolution de problème. Ces capacités sont apparues dans un petit nombre d’espèces de chaque groupe de façon indépendante au cours de l’évolution. Cette étude, utilisant le rat comme modèle mammifère, nous servira de point de comparaison avec les données chez les oiseaux et les poissons, et permettra ainsi de mieux comprendre comment les cerveaux de rongeurs, d’oiseaux et de poissons, bien différents morphologiquement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires Notre projet consiste à identifier les régions du cerveau impliquées dans ces comportements. En parallèle d’un projet en cours visant à étudier la résolution de problèmes chez les oiseaux et les poissons téléostéens (un très grand groupe de poissons osseux), nous souhaitons étudier les bases neuroanatomiques de la résolution de problèmes chez les mammifères en utilisant le rat (Rattus norvegicus) comme modèle. En effet, ces rongeurs sont connus comme étant capables d’accéder à des sources de nourriture pourtant bien protégées, notamment en utilisant leur intelligence. Pour tester ces capacités, nous avons mis au point un test comportemental (ouverture de boite puzzle munie de plusieurs loquets pouvant être assemblés les uns aux autres pour augmenter la complexité de la tâche ; et nécessitant la manipulation fine de ces objets ainsi que la compréhension du lien logique entre chaque élément de la boite pour résoudre le problème). Nous voulons désormais identifier les régions cérébrales activées chez le rat lors de la résolution de plusieurs versions, plus ou moins complexes, de ce test, en utilisant l’IRM fonctionnelle comme modalité d’imagerie.
Bénéfices attendus
Les projets sur la neuroanatomie fonctionnelle de la résolution de problèmes chez les oiseaux et les poissons téléostéens montrent qu’il existe plusieurs organisations cérébrales différentes susceptibles de produire des comportements similaires. En élargissant notre étude à un modèle rongeur, le rat, nous complèterons les connaissances fondamentales sur l’évolution du cerveau et de la cognition chez les vertébrés, en identifiant les structures cérébrales impliquées dans la résolution de problèmes chez les mammifères. Cette étude sera à mettre en miroir avec des études similaires chez les primates (y compris l’Homme) pour identifier les potentielles différences entre les rongeurs et les primates.
Procédures
Entrainement à la tache de comportement : jusqu’à 20 sessions (1 heure par session, une session par jour). Contention puis injection de manganèse (moins de 5 minutes), indispensable pour l’acquisition d’images d’IRM fonctionnelle, test comportemental (une session d’1 heure) et, à la suite de la session de comportement, imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie générale durant environ 2 heures. Chaque animal est soumis à la procédure une seule fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont le stress lié à l’hébergement individuel, de l’injection de manganèse et à l’anesthésie, ainsi qu’à la douleur potentielle liée à l’injection de manganèse
Devenir
Etant donné la toxicité potentielle à moyen terme du manganèse, les animaux sont euthanasiés à la fin de l’acquisition IRM. Leur réutilisation, adoption ou replacement n’est pas possible, le risque d’une dégradation rapide de l’état de santé de l’animal dans les semaines suivant la fin de la procédure étant très important.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, l’usage d’animaux est essentiel, puisque nous étudions l’évolution du système nerveux et de la cognition. Le rat est un modèle rongeur adapté à notre question scientifique, étant donné ses capacités cognitives (capable de résoudre le test comportemental) et la possibilité de réaliser de l’imagerie fonctionnelle par résonance magnétique.
Réduction
Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux stricts besoins de nos analyses statistiques. Des études IRM précédemment publiées chez les rongeurs nous ont permis de déterminer le nombre d’individus nécessaire et suffisant.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux sont pris en charge et leur bien-être est évalué régulièrement par des zootechniciens compétents. La température de la pièce est surveillée. Aussi, la communication entre le personnel de zootechnie et les expérimentateurs est optimisée pour permettre un suivi adéquat des animaux. Pour cela nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la présence d’un pelage sale, de posture anormale ou de comportements susceptibles d’indiquer une douleur. En cas de douleur, une analgésie est appliquée (injection d’antidouleurs), mais l’animal devra être sorti de la procédure, l’analgésique pouvant impacter les résultats d’imagerie fonctionnelle Enfin, la présence de lésions visibles (plaies, fracture) sera également surveillée. De nombreux éléments permettant la construction de nids seront ajoutés à l'hébergement pour fournir de l'enrichissement. Les animaux étant isolés afin de suivre la performance individuelle de chaque rat (la boite puzzle ne doit être accessible qu’à un seul rat à la fois), les cages seront placées les unes à côté des autres pour permettre un contact visuel entre les animaux et réduire les effets du stress qu’un isolement serait susceptible de causer. De plus, il sera possible aux animaux d’entendre les vocalisations de leurs congénères, ainsi que de sentir leur odeur. Les IRMs, non invasives et indolores, seront réalisées sous anesthésie par un opérateur qualifié.
Choix des espèces
Nous utilisons des rats pour plusieurs raisons : d’une part, il s’agit d’une espèce connue pour son intelligence et la facilité avec laquelle elle peut être entrainée à réaliser une tâche comportementale. D’autre part, notre scanner IRM est adapté aux rongeurs et plusieurs articles précédemment publiés attestent de la possibilité d’utiliser ce type d’imagerie chez le rat. Enfin, des atlas et outils de traitement d’images IRM spécialement développés pour le rat nous permettent d’analyser nos résultats de façon optimale et de les comparer facilement aux données de la littérature. Nous travaillons sur des animaux adultes, car il nous est nécessaire d’étudier un cerveau pleinement développé.
Elevage de souris immunodéficientes
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Privées de lymphocytes T et B par une mutation génétique, 1 065 souris sont élevées dans une pièce en pression positive, avec litière et aliments irradiés, pour compenser un risque infectieux permanent. Le phénotype de la lignée est déclaré dommageable, dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, sans autre intervention que la manipulation par les zootechniciens. Le porteur affirme qu'on ne peut pas recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et présente le recours à ces souris comme "indispensable". 108 d'entre elles sont utilisées pour maintenir la lignée puis tuées à huit mois, quand leur fertilité décline, et les 957 autres sont versées entre quatre et vingt-quatre semaines d'âge dans d'autres projets, dont ce résumé ne décrit pas les interventions.
Objectifs
Ce projet consiste à élever une lignée murine immunodéficiente afin de générer les animaux nécessaires à la réalisation de plusieurs projets scientifiques. Ces souris possèdent une mutation génétique qui conduit à l’absence d’une partie du système immunitaire dans l’organisme : les lymphocytes T et les lymphocytes B. L'intérêt d'utiliser de tels animaux immunodéficients dans des études scientifiques en immunologie est majeur. En effet, dans diverses études, un sous type cellulaire d'intérêt va être injecté et son devenir sera étudié (activation, prolifération, interaction avec les organes, etc) sans interactions avec d'autres cellules du système immunitaire. Ainsi seule le sous type cellulaire injecté sera étudié et analysé.
Bénéfices attendus
L’utilisation de ce modèle de souris immunodéficientes va permettre de mieux comprendre le rôle de sous populations du système immunitaire étudiées, et en particulier des sous populations de lymphocytes T. Ces rôles seront étudiés dans un contexte non pathologique dans un premier temps afin d’étudier leur fonctionnement élémentaire. Dans un second temps, elles seront étudiées dans un contexte pathologique comme certaines maladies auto-immunes afin de comprendre leur rôle dans le contrôle de la pathologie. Les cellules étudiées dans ce modèle sont très semblables à celles présentes chez l’homme. Une meilleure compréhension de ces cellules immunitaires pourrait donc servir à mieux comprendre les maladies auto-immunes chez l’homme et donc à pouvoir proposer des thérapies en clinique.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à une intervention mais il s'agit d'un projet d'élevage dont le phénotype des animaux est considéré comme dommageable. Des interventions seront réalisées dans le cadre d'autres projets expérimentaux autorisés. Cependant, la manipulation par les zootechniciens (change, contrôles, sexage, etc) pourrait aussi provoquer un léger stress chez les animaux.
Impact sur les animaux
Les souris présentent une immunodéficience acquise ce qui implique un risque accru aux infections. La manipulation par les zootechniciens pourrait aussi provoquer un léger stress chez les animaux.
Devenir
Les animaux reproducteurs seront euthanasiés à l'âge de 8 mois car leur fertilité décline à partir de cet âge. Les autres animaux seront inclus dans d'autres projets dans le cadre d'une utilisation continue entre 4 et 24 semaines d'âge.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable pour étudier le rôle d’une population cellulaire au sein du système immunitaire, dans différents contextes pathologiques auto-immuns. Dans la mesure du possible, un maximum des questions scientifiques de nos projets font appel à des expériences in-vitro comme des tests de suppressions d'une population cellulaire vis à vis d'une autre, ou des tests de sécrétion cytokiniques après activation. Cependant, les organes et les réponses immunitaires étudiés sont complexes et il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu.
Réduction
1065 animaux seront utilisés dans le cadre de ce projet d'élevage. Nous devons renouveller les accouplements tous les 6 mois. Les animaux produits seront 1) dédiés à la reproduction pour maintenir la lignée (108 souris) 2) inclus dans un projet expérimental autorisé et dans de futurs projets (957 souris). Pour ce projet d'élevage, il n'y aura pas de tests statistiques effectués. En revanche nous nous basons sur les données de notre logiciel de gestion.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi avec 2 enrichissements : un pour la nidification et changé toutes les semaines et un bâton de bois pour la mastication. Pour protéger les animaux immuno-déficients, les animaux sont hébergés dans une pièce dédiée en pression positive, la litière, l'aliment et les enrichissements sont irradiés, l'eau est purifiée. Les animaux sont observés tous les jours par les membres qualifiés de l’animalerie afin de garantir un monitoring sanitaire régulier et tout comportement anormal est directement communiqué à la personne responsable du projet. L’état sanitaire des animaux est aussi contrôlé trimestriellement afin de garantir l’absence de pathogènes. Des points limites suffisament prédictifs ont été établis.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé pour les études dans le domaine de l’immunologie car son système immunitaire est proche de celui de l’homme. Par ailleurs il existe de nombreux outils (anticorps, dosages de cytokines, modèles pathologiques, etc) qui nous seront nécessaires pour ces études et sont développés quasiment seulement chez la souris. Les animaux utilisés pour les accouplements pourront être mis en duo à partir de 8 semaines d’âge, âge de bonne maturité sexuelle. Les accouplements seront renouvelés au maximum tous les 6 mois, soit lorsque les animaux seront âgés de 8 mois. Les animaux issus des accouplements seront inclus dans des projets de recherche entre 4 et 24 semaines d’âge.
Importance de l’activité mitochondriale des hépatocytes dans la progression des pathologies du foie liées à un dysfonctionnnement métabolique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Une partie des souris de ce projet est opérée sous anesthésie générale et tuée avant tout réveil, pour que les cellules de leur foie soient isolées et mises en culture. 408 souris, mâles et femelles, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur foie. Les autres, réparties en trois lots, reçoivent pendant 16 semaines un régime riche en graisses, l'un d'eux conçu pour provoquer une inflammation et une légère fibrose du foie, avec selon les lots des tests métaboliques après six heures de jeûne, cinq à six prises de sang en deux heures et 72 heures en cage individuelle, pour vérifier chez les femelles la protection contre la stéatose observée chez des mâles privés d'une protéine des mitochondries du foie. Sur le remplacement, le porteur invoque "la règle des 3R" et cite ses cultures d'"hépatocytes primaires de souris", pour lesquelles il prévoit 4 groupes de 50 souris.
Objectifs
Les maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) débutent par la stéatose (une accumulation de graisse dans le foie) et peuvent progresser vers la stéato-hépatite (MASH) qui présente un état inflammatoire et un début de fibrose au niveau du tissu hépatique, et ce jusqu’à la fibrose/cirhhose. Au-delà des dysfonctionnements métaboliques du foie, ces pathologies sont également associées à la mortalité d’origine cardiovasculaire et à la survenue de carcinomes hépato-cellulaires. Il est donc important de comprendre les mécanismes qui amènent à leur progression. De nombreuses études soulignent un rôle de l’activité des mitochondries (organites intra-cellulaires entre autres responsables de la production d’énergie) dans le métabolisme du foie et dans la progression des MASLD. Mais la manière dont l’activité mitochondriale est potentiellement responsable de la progression des MASLD n’est pas clairement élucidée. Nous disposons d’un modèle dans lequel l’absence d’une protéine située au niveau de la membrane des mitochondries dans les hépatocytes de souris mâles a la capacité d’intensifier le processus de respiration mitochondriale couplée à la production d’énergie dans ces cellules et est corrélée avec une protection de ces animaux vis-à-vis de l’apparition d’une stéatose induite par un régime riche en graisse. Notre objectif est à présent de vérifier si ces résultats, initialement obtenus chez des mâles, peuvent également être confirmés chez des souris femelles, ce qui nous parait particulièrement important dans un contexte clinique où la survenue des MASLD a une fréquence différente en fonction du sexe des patients. Nous cherchons également à déterminer si une modulation de l’activité respiratoire mitochondriale, une fois la stéatose hépatique installée, a des vertus curatives, ce qui permettra d’envisager des voies thérapeutiques dans l’avenir. Enfin nous souhaitons déterminer si cette modulation de l’activité respiratoire mitochondriale a des vertus préventives également vis-à-vis de la progression de la stéatose en MASH. Enfin nous utiliserons des hépatocytes primaires en culture, afin d’élucider les mécanismes à l’origine des observations effectuées in vivo.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’importance de notre protéine d'intérêt pour la fonction du foie. Ils permettront également de mettre en évidence des différences de réponses cellulaires entre mâles et femelles vis-à-vis de la progression des MASLD (maladies du foie liées à un dysfonctionnement métabolique), en particulier comment survient l’apparition d’un foie dit gras et comment cela peut évoluer en un foie inflammé et fibrosé . Nous résultats pourraient également permettre le développement de nouveaux médicaments ciblant les mitochondries, permettant ainsi de prévenir ou freiner le développement des maladies métaboliques et hépatiques chez les patients.
Procédures
Un premier lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse (animal vigile, 16 semaines), période au cours de laquelle une moitié d’entre eux sera soumise à deux tests métaboliques pendant que l’autre moitié sera soumise à un test métabolique et à une mesure de la dépense énergétique. Les tests métaboliques sont tous précédés d’une mise à jeun de 6h et sont constitués d’une administration d’une solution (animal vigile, 5 sec, 1 fois), suivie de 5 à 6 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h. La mesure de la dépense énergétique implique un hébergement individuel temporaire (animal vigile, 72h). En fin de procédure, tous les animaux de ce premier lot seront soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois) pour la mesure de leurs paramètres biochimiques. Un second lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse (animal vigile, 16 semaines), période au cours de laquelle chaque animal sera soumis à un prélèvement sanguin (animal vigile, 30 sec, 1 fois), à une injection intra-veineuse (animal anesthésié, 30 sec, 1 fois), et à un hébergement individuel (animal vigile, 72h). En fin de procédure, chacun des animaux du lot sera soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois). Un troisième lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse capable d’induire une inflammation et une légère fibrose du foie (animal vigile, 16 semaines). Il sera également soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois). Enfin un quatrième lot d’animaux sera soumis à une procédure chirurgicale sans réveil (animaux sous anesthésie générale et analgésie, 1 fois 20 min).
Impact sur les animaux
Les régimes spéciaux peuvent faire varier le poids des animaux ce qui peut induire une modification de leurs déplacements et de leur mobilité. Les challenges métaboliques impliquent une mise à jeun de 6h en période diurne (période où les animaux ne se nourrissent normalement pas) qui ne provoque en général pas d’hypoglycémie mais les administrations de solutions en lien avec les challenges métaboliques peuvent en elles-même être source d’hyper- et d’hypoglycémies transitoires. Les prélèvements de sang peuvent induire une douleur légère de courte durée. Les injections peuvent engendrer une douleur légère de courte durée au site d'injection. L’hébergement individuel de courte durée pour la mesure de la dépense énergétique peut induire un stress chez les animaux. Les anesthésies comportent un risque de détresse respiratoire et d’arrêt cardiaque.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour des analyses post-mortem. Concernant les 3 premiers lots d’animaux, les foies entiers seront collectés et leur analyse nous permettra d’évaluer la santé du foie en réponse aux différents régimes alimentaires et aux traitements à visée curative. Concernant le quatrième lot, une procédure chirurgicale sans réveil, réalisée sous anesthésie et analgésie, nous permettra d’isoler les cellules du foie pour effectuer des analyses plus poussées sur le fonctionnement de ces cellules, en présence ou absence de notre protéine d’intérêt. Ces résultats complémentaires devraient nous permettre d’expliquer les différents états de santé du foie observés chez les animaux.
Remplacement
Selon la règle des 3R, la caractérisation de notre protéine d'intérêt a d’abord été réalisée in vitro et dans un modèle invertébré. Ces modèles n’étant pas basés sur des pathologies des grands systèmes chez l’humain, ils ne permettent pas d’étudier son importance in vivo. Certaines questions d'intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux. Bien que nous réalisions des expériences sur les hépatocytes primaires de souris maintenus en culture, ainsi que l’exploration de certains mécanismes par simulation informatique, nous ne pouvons pas étudier la physiopathologie des maladies mitochondriales ex vivo car les phénomènes sont multifactoriels. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer in vivo au cours de plusieurs mois le développement des altérations pathologiques propres aux organes en question.
Réduction
408 animaux seront utilisés pour ce projet. L’utilisation de souris génétiquement modifiées permettra de démontrer l’importance hépatique de notre protéine d'intérêt et son rôle potentiel dans la progression des maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (MASLD pour metabolic-associated steatotic liver disease) à la fois chez les mâles et femelles. Pour chaque condition de régimes, des groupes de 8 à 10 souris seront créés afin d’obtenir une puissance satisfaisante à la fin de l’étude pour des résultats significatifs. Pour l’isolement d’hépatocytes et leur mise en culture, 4 groupes de 50 animaux seront nécessaires afin de reproduire de manière fiable une variété d’expériences en culture cellulaire.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs ventiles avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Les animaux sont acclimatés à l’animalerie et sont habitués à être manipulés avec un suivi de poids hebdomadaire qui permet de s’assurer du bon état de santé des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Nous n’attendons l’apparition d’aucun signe clinique. En particulier, les régimes alimentaires, déjà testés par notre équipe, ont été développés en vue de circonvenir aux effets délétères des précédents régimes qui engendraient d’importantes pertes de poids chez les animaux. Néanmoins, nous veillerons à détecter les premiers signes de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité qui pourraient être induits : respiratoire, abattement, perte de poids, dysfonctionnement hépatique. Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Lorsque cela est nécessaire une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. Les prélèvements sanguins et les injections seront réalisés sous anesthésie locale ou générale. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie/analgésie.
Choix des espèces
Le choix de la souris est lié à deux considérations : 1) tous les gènes de la dynamique mitochondriale sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations. Les modèles murins proposés présentent plusieurs avantages notamment la possibilité d’étudier le fonctionnement du foie dans un contexte physiologique où il communique avec tous les organes ainsi que d’étudier la réponse du foie et de l’organisme aux stress hépatiques comme la fibrose hépatique dans le cadre des MASLD (maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique) et le diabète. Les souris seront mises en conditions expérimentales à partir de l’âge adulte de 8-10 semaines pour ne pas interférer avec leur développement.
Efficacité et toxicité de candidats médicaments impliqués dans le traitement du cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Environ 309 études de 50 souris, pour tester des candidats médicaments contre le cancer, sont prévues sur trois ans, un volume estimé d'après l'activité des années précédentes et la croissance prévue au plan commercial. 15 480 souris, immunodéficientes, immunocompétentes ou dotées d'un système immunitaire ou d'un foie humanisés, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tuées en fin d'étude ou aux points limites, 1 200 d'entre elles étant déclarées réutilisables dans un projet de formation interne. Les procédures prévues comprennent des greffes de tumeurs humaines ou murines, des injections répétées de traitements, des castrations, des prélèvements vaginaux quotidiens pendant au moins cinq jours et des injections intraveineuses hydrodynamiques de plasmides, qui peuvent provoquer des troubles cardio-respiratoires et "une altération marquée de l'état général". Parmi les risques de la chirurgie, le porteur cite le cas où "la souris se réveille en cours de procédure", et il précise pour l'effectif : "Aucune approche statistique n'a été réalisée".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments en oncologie. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines ou murines sur des souris immunodéficientes, immunocompétentes ou avec un système immunitaire et/ou un foie humanisé. Différentes stratégies d’implantation des tumeurs pourront être mises en œuvre en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament sur la croissance tumorale mais également d’analyser sa toxicité et l’implication du système immunitaire dans la réponse. Des souris sans tumeurs pourront également être utilisées dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutiques en oncologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la fonctionnalité de candidats médicaments dans des modèles se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'humain.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlée par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les administrations de traitements ou de cellules seront réalisées par injections qui pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Certaines procédures nécessiteront des actes chirurgicaux pour la castration, l’implantation de fragments de tumeurs et/ou de dispositifs sous-cutanés, réalisés sous anesthésie gazeuse avec une analgésie préopératoire et un suivi post-opératoire rigoureux. L’implantation durera environ 8 minutes et pourra être répétée selon les besoins de l’étude. Concernant la castration, celle-ci durera moins de 10 minutes. Le suivi de la croissance tumorale pourra se à l’aide d’un pied à coulisse pour une durée de quelques secondes et/ou par imagerie pour une durée comprise entre 10 et 45 minutes. À l’issue des études, les animaux devant être euthanasiés le seront selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.
Impact sur les animaux
-Injection(s) hydrodynamique(s) intraveineuse(s) de plasmides : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. -Prélèvements vaginaux : peut engendrer une irritation locale, une inflammation ou un stress temporaire. -Chirurgie : douleur, hémorragie, un défaut du système d’anesthésie / analgésie (ex : la souris se réveille en cours de procédure), un état clinique détérioré au réveil (ex : hypothermie), mauvaise cicatrisation. -Administration de traitements ou de cellules cancéreuses : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire (ajout de gel ophtalmique en prévention). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne voire potentiellement douleur si présence de tumeurs au niveau abdominal. -Prise de température corporelle à l’aide d’une sonde : irritation, inflammation, stress. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû à la contention, le développement des tumeurs et des éventuelles métastases. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Tous les animaux en fin d'étude, ayant atteints les points limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire. Ceci ne pourra être envisagé que dans les cas ou des animaux ont subi seulement une partie de la procédure (ex : animaux du groupe contrôle négatif) et ne présentant pas d’altérations résiduelles de leur état de santé.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 15480 souris seront utilisées, couvrant une période de 3 ans et permettant de réaliser environ 309 études précliniques de 50 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée, pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques. La variabilité de la croissance tumorale dépend fortement du modèle tumoral. Le nombre de souris par groupe est fonction de la variabilité de croissance historique sur un modèle déterminé.
Raffinement
En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant de creuser, se cacher et réaliser un nid. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles pour synchroniser le cycle œstral. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, elles bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée avant intervention chirurgicale ou toute procédure potentiellement douloureuse. Un relais dans l’eau de boisson pourra ensuite être réalisé. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement sous anesthésie sans réveil, suivi d’une euthanasie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie, une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites sont définis selon l’état général (score clinique), perte de poids ou volume tumoral.
Choix des espèces
90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain, ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente, permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures d’un point de vue physiologique. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang. Les animaux humanisés avec des cellules modifiées seront inclus à partir de 5 semaines, âge auquel la greffe de cellules dans le sang est la plus efficace.
Rétinopathie diabétique chez le rongeur
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
Rats : 740
Jusqu'à huit instillations oculaires par jour et des injections dans l'œil une à deux fois par semaine sous microscope chirurgical : 740 souris et 740 rats rendus diabétiques vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Au bout d'un mois de diabète, les rats malades ne pèsent plus que 50 à 60 % du poids des rats témoins du même âge, boivent et urinent davantage, perdent leur tonus et se voûtent. Presque tous sont tués à l'issue pour les analyses histologiques, 80 animaux écartés avant l'étude pour un défaut de l'œil pouvant être réutilisés ailleurs. Le porteur retient le rat et la souris pour la rapidité d'apparition des signes de rétinopathie, et annonce un modèle destiné à tester des traitements, dont la mise au point occupera la première des cinq années du projet.
Objectifs
L’objectif du projet est d’utiliser un modèle de rétinopathie chez le rat et la souris diabétique afin de tester l'efficacité de traitements potentiels. La rétinopathie diabétique est une complication du diabète qui atteint l'œil au niveau de la rétine et serait la première cause de cécité avant 65 ans. Le taux élevé de sucre dans le sang entraine une cascade d’évènements qui conduisent à la dégradation des cellules neuronales et des petits vaisseaux sanguins de la rétine. Ces vaisseaux deviennent poreux, ils perdent leur étanchéité ce qui conduit à des hémorragies et des exsudats qui lèsent la rétine. La maladie peut évoluer vers une rétinopathie proliférative avec une production anormale de nouveaux vaisseaux peu fonctionnels, des décollements de la rétine et des saignements dans le vitré. Un œdème au niveau de la macula, zone de la rétine responsable de la bonne acuité visuelle, peut survenir à tout moment et entrainer la perte de la vision. Le diabète a également des conséquences sur la cornée et le cristallin, structures dont la transparence est nécessaire pour la vision. Le projet s'étale sur 5 ans, après une période de mise en place des modèles dans notre établissement pendant la première année, nous estimons que pourront se dérouler des études de test d'efficacité de traitement. Ces études comporteront au maximum 5 groupes de 10 animaux, pour comparer l'efficacité de plusieurs concentrations d'une molécule ou plusieurs molécules entre elles par rapport à un traitement placebo. Nous estimons pouvoir réaliser 2 études par an, pendant 4 ans.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements des complications du diabète au niveau de la rétine qui sont invalidantes pour les patients et peuvent aboutir à la cécité. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et préserver au mieux la visions des patients.
Procédures
L’induction du diabète chez les rats et les souris se fait par injection d’un produit qui agit sur le pancréas. Le taux de glycémie sera contrôlé sur bandelette une à deux fois dans l'étude par le prélèvement d'une goutte de sang à la queue de l'animal. Les examens ophtalmologiques qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par injections. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les animaux sont rendus diabétiques, leur glycémie augmente. L’hyperglycémie altère les vaisseaux sanguins et les nerfs avec une répercussion sur différents organes, ce qui peut entrainer notamment des troubles cardiovasculaires, au niveau des reins, et au niveau de l’œil. Les animaux diabétiques ont un besoin de boire et des urines accrus, et perdent du poids. Ils perdent du tonus et prennent un aspect vouté au cours du temps. Les animaux n’ont plus ou peu de gain de poids malgré une consommation d’eau et de nourriture accrue. Au bout d’un mois de diabète, le poids des rats malades représente 50 à 60 % du poids des rats contrôles du même âge, la différence semble moins importante chez la souris qui serait plutôt autour de 80% du poids des souris contrôles non induites au bout d'un mois de diabète. Les examens qui seront pratiqués pour la réalisation du projet ou les administrations de produit par instillations (gouttes oculaires), ou par injections seront rapides (quelques minutes) et ne devraient pas porter atteinte au bien-être de l'animal, elles impliquent le maintien de l'animal manuellement afin de l'immobiliser, cette manipulation est transitoire et sans impact sur sa locomotion future. Certains examens ou administration de produits, notamment au niveau de l'œil, nécessitent l’immobilisation complète pendant plusieurs minutes de l'animal, seront pratiqués sous anesthésie légère. L’animal est replacé rapidement dans son environnement habituel, sans conséquences majeures sur son état, si ce n’est la gêne transitoire due à l’injection de produits. Des prélèvements pourront être réalisés sur animal vigile et la durée de l'action ne dépassera pas les 5 min, le volume sera adapté au minimum pour ne pas nuire à l’animal. Le stress dû au maintien de l'animal, à la piqûre de l'aiguille, une rougeur peut apparaitre au site de prélèvement, ne doit pas impacter le mode vie de l'animal une fois l'action finie.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Pour les études d’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure (estimé à environ 10%, hormis ceux exclus pour cause de points limites) pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire. Ces animaux sont des animaux qui sont exclus de l'étude en raison d'un défaut anatomique ou physiologique détecté aux examens de baseline au niveau de l'œil avant le début de l’étude. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie.
Remplacement
Compte tenu des particularités physiologiques et anatomiques de l’organe concerné et l’absence pour l’instant de modèle alternatif pour ce type de projet, nous aurons recours à des animaux. Les lignées cellulaires ou les systèmes alternatifs comme les organoïdes ne permettent d’étudier qu’une partie des mécanismes. L’œil est un organe complexe soumis à de nombreuses interactions. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Les souris permettent d’étudier les effets systémiques de la maladie sur les structures de l’œil. Les études in vivo permettent d’observer les réponses physiologiques d’un traitement dans un organisme vivant en tenant compte des pharmaco cinétiques, des métabolites générés. Les souris et les rats permettent de suivre l’évolution de la maladie au cours du temps.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe avec de l’enrichissement adapté à l'espèce. En raison de la polydipsie et de la polyurie des animaux diabétiques, une couche plus épaisse de litière sera déposée dans la cage et elle sera changée plus fréquemment, un biberon supplémentaire sera ajouté ; Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Lors des anesthésies des substituts de larmes sont régulièrement instillés sur les cornées pour éviter le dessèchement, un dispositif est prévu pour éviter l’hypothermie (enceinte chauffante, coussin, ou lampe). Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.
Choix des espèces
L’apparition des signes cliniques recherchés de la rétinopathie est rapide selon les articles de la bibliographie. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Dans la littérature, les rats et les souris ont une sensibilité durable dans le temps à la perméabilisation vasculaire rétinienne en réponse au diabète. Les animaux, rats et souris, seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de 6 semaines minimum à l'induction du diabète conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.