Rongeurs

Pour chercher si une protéine du cerveau, l'hevin, prédit la réponse aux antidépresseurs, 4 696 souris vont être utilisées, 3 126 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 570 un niveau léger, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leur cerveau. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique d'environ 45 minutes sous anesthésie, puis dix jours de défaite sociale à raison d'une séance quotidienne de cinq minutes, puis jusqu'à quatre semaines de tests comportementaux et des prises de sang. Le porteur décrit les effets attendus du protocole de stress, anxiété accrue, anhédonie, retrait social et perte de poids, et signale que les mâles logés ensemble peuvent se battre et se blesser. Les souris qui servent d'agresseuses ou de partenaires d'interaction sont tuées après six à neuf mois d'utilisation.

Objectifs

L’objectif général du projet est de définir le rôle des astrocytes et de la protéine hevin dans la réponse au stress et aux antidépresseurs et de déterminer si hevin pourrait servir de biomarqueur de la réponse aux antidépresseurs dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Le projet s’intéresse aux mécanismes de la dépression, la maladie psychiatrique la plus fréquente chez l’homme (prévalence de 6 à 12 pourcent) Nos résultats attendus aideront à comprendre le rôle des glycoprotéines de la matrice extracellulaire dans la plasticité de la résilience et à identifier le réseau de protéines régulatrices et d'effecteurs qui pourraient représenter des cibles thérapeutiques pour le trouble de dépression majeure. Plus important encore, nous émettons l'hypothèse que les changements dans les biomarqueurs sanguins de ces protéines, impliqués dans la motivation, la réponse aux antidépresseurs et la neuroplasticité, seraient corrélés aux changements dans les réponses comportementales et émotionnelles chez les individus déprimés (recevant des antidépresseurs) avant et après la réponse thérapeutique. L'identification de biomarqueurs sanguins prédictifs de la réponse future aux antidépresseurs aurait un impact clinique important, permettant aux cliniciens d'optimiser les plans de traitement, d'adapter la thérapie à chaque patient et de personnaliser les plans de traitement afin d'améliorer les chances de réussite des résultats thérapeutiques dans la dépression.

Procédures

Les interventions prévues incluent une procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec réveil, d’une durée d’environ 45 minutes par souris, accompagnée d’injections d’anesthésiques et d’analgésiques en préopératoire, ainsi que de traitements anti-inflammatoires et analgésiques en postopératoire pendant 1 à 3 jours. Les souris seront également soumises à une procédure de stress répétés, consistant en des sessions quotidiennes de 5 minutes pendant 10 jours, suivie de tâches comportementales réparties sur une période maximale de 4 semaines, à raison d’un test par jour d’une durée allant de 10 minutes à 1 heure. Les souris ayant subi les stress répétés seront regroupées après la défaite sociale jusqu’à la fin des expériences. Enfin, des prélèvements sanguins et une exposition à un stress aigu pour un test de reconnaissance émotionnelle seront également réalisés.

Impact sur les animaux

La chirurgie stéréotaxique peut engendrer dans certains cas une hypothermie ou un arrêt cardio-respiratoire suite à l’anesthésie. Des douleurs post-opératoires ainsi que des risques infectieux sont possibles. Le protocole de stress peut entraîner une augmentation de l’anxiété, une prise de poids, une anhédonie (symptôme psychologique caractérisé par une incapacité ou une diminution marquée à ressentir du plaisir ou de l'intérêt pour des activités ou situations qui étaient auparavant agréables) et un retrait social chez un sous-groupe d’individus. Les souris qui seront hébergées individuellement pendant les tests de comportement pourront montrer une perte du poids (5-10 pourcent), une diminution du toilettage ou une diminution de la locomotion ainsi qu’une anxiété et une anhédonie si l’hébergement individuel dépasse 6 semaines, ce qui correspond à un stress social. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées. Le prélèvement sanguin peut entrainer une douleur légère et transitoire au moment du prélèvement ainsi qu’un hématome et un saignement incontrôlé.

Devenir

Chaque animal sera euthanasié et le cerveau collecté pour analyse histologique de l'injection virale ou analyse anatomique. Les souris utilisées pour la défaite ou l’interaction seront euthanasiée après 6 à 9 mois d’utilisation

Remplacement

Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro, les effets du stress se produisent à l’échelle de l’organisme. Les procédures décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre la signification des évènements causés par le stress sur des circuits neuronaux intacts. Il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. Les résultats obtenus au laboratoire sont toutefois complémentaires à ceux obtenus chez l’homme. L’anatomie, la physiologie et les comportements murins sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques récentes pour l’étude de la fonction des gènes et des circuits cérébraux dans le cerveau.

Réduction

Un nombre important d’animaux est nécessaire, au total 4696, car, pour plusieurs tests, une seule tâche doit être effectuée par cohorte du fait de l’interférence entre différents tests. Nous avons cependant réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental grâce à une analyse prédictive du nombre d’animaux en réalisant un calcul de puissance. Nos travaux passés nous indiquent aussi que ces études comportementales nécessitent entre 40 et 60 souris par groupe expérimental pour atteindre une puissance statistique satisfaisante. Lorsque cela sera possible, un même groupe d’animaux sera utilisé dans plusieurs tests comportementaux. Ainsi un même groupe d’animaux passera par une séquence de comportements allant du moins stressant au plus stressant : 1- Interaction sociale 2- Anxiété 3- Anhédonie 4- Reconnaissance d’objet

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupe dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les souris hébergés individuellement seront également dans des cages avec du nid végétal et un igloo. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure (acclimatation et manipulation par l’experimentateur puis expériences). Une pesée bi-mensuelle sera effectuée. Un tapis chauffant après la chirurgie stéréotaxique est utilisé. La durée de l’anesthésie est de 60 min. Elles commencent à se réveiller au bout de 60 min et sont réveillées au bout de 90 min. La souris revient à elle peu de temps après la chirurgie. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une euthanasie pour éviter toute souffrance. Pour nos chirurgies, nous utilisons : a) analgésiques et lubrifiant (protecteur ophtalmique) pendant la procédure chirurgicale b) anesthésiques pour les procédures qui entrainent de la douleur lors de l’injection stéréotaxique. Pour le prélèvement de sang, la procédure ne dure que quelques econdes et ne nécessite pas d’endormissement. Dans le cas où la souris n’est pas controlable, elle sera anesthésiée. La lancette pour éliminer les problèmes liés à l'utilisation d'un scalpel ou d'une aiguille pour prélever du sang sur la joue au niveau submandibuliare. Elle facilite la procédure de prise de sang et permet d'obtenir des quantités constantes de sang, sans risque de blesser la souris.

Choix des espèces

L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. L'avantage du modèle murin est qu'il peut être utilisé afin de tirer profit des techniques de transgénèse (souris transgéniques et transgénèse induite par des virus). En effet, l’intérêt croissant pour la souris comme modèle a alimenté le développement de techniques sophistiquées pour l’étude de la fonction des gènes dans le cerveau de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux utilisés seront tous adultes (âge entre 8 et 20 semaines), pour étudier la plasticité neuronale induite par les drogues chez l’adulte.

Six minutes suspendues par la queue, six minutes de nage forcée, trente minutes dans une arène très éclairée, quatre heures par jour de séparation d'avec leur mère pendant dix jours pour les souriceaux de trois à douze jours. 1 434 souris vont être utilisées, 894 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 540 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Le porteur cherche à déclencher chez elles des états qu'il rapproche de la schizophrénie et de l'autisme, par le bruit, la litière mouillée, la surpopulation, la contention ou des injections quotidiennes, avant de mesurer le toilettage, l'enfouissement de billes et la réaction à un son fort. Il écrit que l'induction d'un stress étant l'objectif, aucun raffinement n'est prévu pour ces procédures.

Objectifs

Nous étudions des pathologies cérébrales associées à des mutations dans les gènes codant pour des canaux ioniques laissant passer le sodium. Nous avons identifié un patient porteur d’une mutation qui présente une schizophrénie à début précoce. La schizophrénie est une maladie psychiatrique chronique grave chez l’humain et caractérisée par l’apparition de symptômes positifs (délires, hallucinations et discours ou comportement désorganisé) avant l’âge de 13 ans ; il est associé à d’autres troubles comportementaux, comme les Troubles du Spectre Autistique et le trouble du déficit de l’attention. Chez les souris modèle de la même mutation que le patient cité ci-dessus, les jeunes souris présentent des déficits de type autistique associés à des altérations des processus émotionnels et cognitifs, tandis que les souris adultes ne présentent qu'un déficit de communication sociale. Les souris mutantes présentent aussi de la schizophrénie qui est apparemment déclenché par un stress. En particulier, ces souris présentent des signes de psychose aiguë après le transport. Pour ce projet, nous souhaitons approfondir la caractérisation comportementale de ce modèle et d’un second modèle de mutation du même canal ionique servant de contrôle, en mettant spécifiquement l'accent sur les caractéristiques schizophréniques. Nous utiliserons des stress chronique ou aigu chez des souris juvéniles pour tenter d'induire la schizophrénie. Nous ferons ensuite une surveillance comportementale hebdomadaire et une validation finale de la schizophrénie à l'âge adulte. Les évaluations comportementales comprendront des tests pertinents pour les troubles du spectre autistique et pour la schizophrénie. L’objectif du projet est de déterminer si la mutation identifiée chez la patiente schizophrène permet d'observer les symptômes décrits chez les patients humains (troubles du spectre autistique et schizophrénie) alors qu'une autre mutation contrôle ne devrait pas déclencher de schizophrénie. Cela permettra de mieux comprendre les mécanismes pathologiques et d'en déduire de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal est de comprendre comment les mutations du même canal ionique contribuent différemment à l’autisme et à la schizophrénie, ce qui fournira des informations précieuses sur les mécanismes distincts et superposés sous-jacents à ces conditions. Ces connaissances pourraient aider à identifier les interactions génétiques (les mutations) et environnementales spécifiques (les procédures de stress utilisées) qui conduisent au développement de ces troubles et à approfondir dans des études futures les mécanismes cellulaires aboutissant à un comportement normal ou anormal. En fin de compte, les connaissances acquises grâce à ce projet pourraient ouvrir la voie au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées pour l’autisme et la schizophrénie. En identifiant et en caractérisant les voies affectées par les mutations, nous pourrions découvrir de nouveaux points d’intervention pour les thérapies pharmacologiques ou comportementales. De telles avancées ont le potentiel d’améliorer les résultats cliniques et la qualité de vie des patients touchés par ces troubles neuropsychiatriques complexes.

Procédures

Tous les animaux subiront une biopsie de la queue (5 s) afin de connaitre leur génotype. La majorité des animaux seront ensuite soumis à une procédure, et les animaux restants seront utilisés comme simple partenaire. Etant l’objectif du projet, dans chacune des procédures les souris seront soumises à une unique forme de stress parmi un des 4 suivants : - Bruit et cage sur un support mouvant pendant 3h sur 3 jours (souris âgées de 25 à 28 jours), - Répétition d’un unique stress léger parmi plusieurs possibles (litière neuve, mouillée, ou absente, cage, inclinée, contention, présence de congénères inconnus, cage surpeuplée) 1h à 4h chaque jour pendant 24 jours (souris âgées de 25 à 49 jours), - Isolement maternel de souriceaux pendant 4 heures par jour pendant 10 jours (souris âgées de 3 à 12 jours), - Injection quotidienne (durée 3 à 5 s) pendant 10 jours (souris âgées de 25 à 35 jours). Puis une évaluation du comportement afin d’évaluer les conséquences du stress et des mutations sera effectuée à partir de l’âge de 70 jours avec une série de tests. Un unique test utilisé par jour parmi les suivants. Les premiers tests permettent d'évaluer les comportements de type schizophrénique : l’exploration d’une arène très éclairée pendant 30 min, une contention dans un tube pendant deux séances d'habituation de 10 min et pendant la durée du test (environ 20 min) qui consiste en une exposition à un bruit fort précédent un autre son standard, une analyse de comportement automatisée ou les souris seront isolées pendant 3 jours dans une cage classique, une unique injection (durée 3 à 5 s) qui déclenche une hyperlocomotion. La seconde série de tests permet d'évaluer le comportement autistique: mesure du toilettage (20 min) et de l'enfouissement de billes (20 min). La dernière série de tests permet d'évaluer de l'anxiété ou de la dépression: une suspension par la queue pendant une 6 minutes, 6 min de nage forcée dans de l'eau, et 5 fois la possibilité de nager pendant 3 minutes.

Impact sur les animaux

L’utilisation de tests comportementaux permettent de révéler des troubles de type autistique caractérisés par des degrés variables de déficits dans l'interaction sociale et la communication, qui peuvent ou non être accompagnés de comportements stéréotypés et d'anomalies sensorielles. Les différentes interventions vont provoquer un stress et nous nous attendons également à observer des caractéristiques schizophréniques pour un des deux modèles de mutation. Pour évaluer ces symptômes, nous effectuerons une série de tests spécifiques ciblant les comportements de type schizophrénique. Tous les animaux subissent une biopsie sur la queue qui peut provoquer des saignements et un stress léger et passager. Les injections quotidiennes sur 10 jours consécutifs peuvent induire un stress léger et passager ainsi que des irritations cutanées., L'hébergement individuel pendant 3 jours pour un des tests comportementaux peut induire un stress léger des animaux.

Devenir

Tous les animaux produits subissent un prélèvement sur la queue, puis la moitié subiront une procédure modérée puis seront mis à mort. Les animaux restant seront mis à mort.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro et ex vivo sur des cellules exprimant des canaux ioniques porteurs des mutations citées ci-dessus, et identifié des mécanismes associés aux mutations. Les modèles animaux sont essentiels pour ce projet car ils nous permettent d'étudier les interactions génétiques (mutations) et environnementales (différents stress) qui causent l'autisme et la schizophrénie dans un contexte d'organisme entier qui ne peut pas être reproduit in vitro. La caractérisation du comportement de souris porteuses des mêmes mutations est une étape essentielle pour valider in vivo ce mécanisme.

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser a été calculé par une analyse de puissance statistique. Dans toutes les procédures, nous n’utiliserons que les souris mutantes et comparerons les résultats obtenus avec les deux lignées. Les souris non mutées seront utilisées comme souris partenaire. Nous utiliserons les souris mâles et femelles des portées.

Raffinement

Une fois sevrés, les animaux seront élevés dans un environnement enrichi : avec matériau de nidification, buchette en bois et igloo en polycarbonate offrant un abri sombre dans lequel les animaux peuvent se rassembler. Les animaux seront régulièrement manipulés pour réduire le stress dû à la présence d’un humain et une feuille de score sera utilisée pour évaluer les nuisances et apporter les réponses adéquates. Des périodes d’habituation seront réalisées pour diminuer le stress provoqué par les appareils et lors de la séparation maternelle les souriceaux sont maintenus sur une plaque chauffante et couverts par du papier absorbant pour éviter un refroidissement. L'induction d'un stress pendant les différentes procédures étant l'objectif il n'y a pas de raffinement prévu. Utilisation d'une liste de points limites avec des actions précises à mettre en oeuvre.

Choix des espèces

La souris permet un élevage rapide avec une période de gestation de 21 jours et un sevrage également après 21 jours. Sa petite taille permet également d’optimiser le nombre d’animaux dans le volume contraint des animaleries. Plusieurs tests comportementaux sont disponibles pour une caractérisation approfondie du phénotype de type schizophrénique chez les souris. Nous travaillons déja avec les deux lignées de souris que nous avons au laboratoire, par conséquent nous connaissons bien ce modèle. Dans une des procédures, les animaux seront utilisés dès le 3e jour postnatal, car le stress induit consiste a séparer les nouveau-nés de la mère pendant quelques heures. Pour les autres procédures, les souris seront utilisées entre les 25e et 49e jours postnataux, ce qui correspond à l'adolescence chez l'humain. Cette fenêtre d'âge est la plus sensible au développement potentiel de la psychose et est pertinente pour la schizophrénie humaine à début précoce. Les tests comportementaux seront effectués sur les souris à l’âge adulte (à partir du 70e jour postnatal) afin de laisser le temps à un éventuel phénotype de type schizophrénique de se mettre en place.

Entre le cinquième et le onzième jour de vie, un fragment de queue est coupé aux ciseaux chirurgicaux sur des souriceaux séparés de leur mère jusqu'à dix minutes, pour le génotypage. Les nouveau-nés subissent ensuite deux gavages, parfois des injections, et les souris adolescentes deux semaines d'injections quotidiennes, l'excipient pouvant irriter la peau. 784 souris vont être utilisées, 624 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 160 un niveau léger, pour comprendre comment le drainage lymphatique gouverne le développement du ganglion. Toutes sont mises à mort en fin de projet pour l'analyse post-mortem de leurs organes.

Objectifs

Les cellules immunitaires circulent à travers des ganglions lymphatiques afin d’y rencontrer des pathogènes provoquant une réponse immune. Les pathogènes sont amenés dans les ganglions par le réseau lymphatique qui draine le tissu. Ce projet vise à mieux comprendre comment le drainage affecte le développement du ganglion lymphatique en utilisant des modèles de souris.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné qu’une thérapie visant une des molécules étudiée est actuellement utilisée en thérapie contre la sclérose en plaque, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’auto-immunité, l’infection ou le cancer.

Procédures

Des souris nouveau-nés seront soumises à 2 gavages et dans certains cas à des injections pour une meilleure prise des traitements. Les souris adolescentes seront soumises selon les lots à des injections pendant 2 semaines pour une meilleure action du médicament. Un prélèvement de sang est effectué sur certains animaux. Les nouveau-nés (entre jour 5 et jour 11 après naissance) seront soumis à une biopsie de queue pour déterminer une mutation génétique.

Impact sur les animaux

Pour le génotypage, une séparation de la mère et de sa portée pendant quelques minutes (10 au maximum), ainsi qu’une contention légère pour chaque animal sont nécessaires, cela peut donc être une source de stress pour les animaux. Une douleur légère de courte durée peut être ressentie par l’animal lors du prélèvement de l’extrémité de la queue à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicale. Le geste dure moins d’une minute par animal. Le gavage, l’injection des produits et le prélèvement sanguin nécessite une contention qui est source d’inconfort et de stress pour l’animal pendant quelques secondes. L’excipient peut provoquer une irritation cutanée. Les injections induisent une douleur légère de courte durée.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le développement du système immunitaire ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Les sites et la fréquence des injections ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale, car elles assurent la bonne prise du médicament. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible douleur, stress ou inconfort sont entrepris (tapis chauffant, gavages avec des canules adaptées, antidouleur, apport de nourriture humidifiée). En cas ou le point limite est atteint l’animal est mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La structure du ganglion lymphatique, la circulation sanguine et le drainage de la lymphe sont identiques entre l’homme et la souris. La souris Mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour ces travaux. De plus, des modèles de souris génétiquement modifiées invalidées pour l'expression des molécules d’intérêt existent et leur utilisation permet d'aborder directement le rôle des protéines d'intérêts dans la formation du ganglion lymphoïde. Les souris seront étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux étudier le développement du réseau et des ganglions.