Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 25/06/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-141693)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le mélanome uvéal (MU) est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. La tumeur primaire est généralement traitée par chirurgie ou radiothérapie, cependant 30 à 50% des patients développent des métastases pour lesquelles il n’existe à ce jour que très peu d’option thérapeutique. Ce cancer se développe à partir des mélanocytes, qui tapissent la couche profonde de l’œil et l’iris. Le modèle actuel de la transformation de ces mélanocytes en mélanome uvéal malin propose l’action de deux altérations successives du patrimoine génétique (ADN). Une première altération favorise la prolifération et la survie des cellules, aboutissant à une tumeur bénigne appelée naevus (grain de beauté) sur le fond de l’œil. Une deuxième altération de l’ADN peut malheureusement survenir, aboutissant au mélanome uvéal. Cette deuxième altération de l’ADN touche différents gènes, impliqués dans des processus biologiques distincts, et impliqués dans des tumeurs de pronostics très différents. Cependant, les mécanismes biologiques précis impliqués dans le développement de ce cancer et notamment dans le développement des métastases restent à élucider. Afin de vérifier le modèle actuel de transformation maligne du mélanome uvéal, et de mieux comprendre les processus biologiques sous-jacents, nous avons établi des lignées de mélanocytes normaux à partir de tissu d’yeux obtenus suite à l’énucléation de patients traités pour leur MU. Dans ces mélanocytes normaux, nous introduisons les différentes altérations de l’ADN identifiées chez les patients afin de reproduire in vitro la transformation de mélanocytes sains en cellules tumorales. Pour valider la malignité et le potentiel métastatique de ces mélanocytes modifiés in vitro, nous allons injecter ces cellules dans des souris immunodéficientes et évaluer d’une part, leur capacité à développer des tumeurs et d’autre part, leur pouvoir à développer des métastases. Les objectifs de ce projet sont de vérifier le modèle actuel de la transformation maligne et d’établir des modèles précliniques qui permettront de tester de nouveaux traitements.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le mélanome uvéal (MU) provient de la transformation maligne des mélanocytes qui tapissent une couche interne de l’œil. La chirurgie et la radiothérapie sont très efficaces pour contrôler la tumeur primaire oculaire. Cependant, plus de 30% des patients développent des métastases principalement au niveau hépatique. Malheureusement le pronostic est mauvais au stade métastatique, avec à ce jour un seul traitement ayant démontré un bénéfice, et uniquement pour une fraction des patients. Les retombées attendues des expériences in vivo proposées ici sont (i) de comprendre par l’établissement de modèles cellulaires les mécanismes biologiques en cause dans le développement de mélanome uvéal chez la souris immunodéficiente ; (ii) d’établir des modèles précliniques qui permettront de tester de nouvelles approches thérapeutiques et (iii) de comprendre certains facteurs de prédisposition à ce cancer.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Injection sur animal vigile de cellules dans le derme de la souris au niveau du flanc droit, 1 fois en début d’expérience : 10 secondes / 270 souris. Imagerie sur souris anesthésiées en gazeuse après injection de sonde colorimétrique, 1 fois toutes les 2 semaines, puis une fois par semaine tout au long de la procédure / 270 souris. Durée de l’anesthésie : 30 minutes maximum. Prélèvements sanguins sur animal vigile ou sous anesthésie gazeuse au niveau du sinus rétro-orbital / 1 fois en début d’expérience et 1 fois en fin d’expérience avant mise à mort / 270 souris – 20 secondes sur animal vigile, 3 minutes avec anesthésie.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances attendues lors des injections de cellules tumorales, d’anesthésiques ou de la molécule permettant de visualiser les métastases, seront celles liées à la piqûre elle-même (douleur légère pendant la durée d’injection :15 secondes). La croissance des tumeurs greffées sur le flanc peut provoquer une perte de poids ou une gêne pour se déplacer, et ce jusqu’à l’excision de la tumeur. Les nuisances attendues lors des procédures chirurgicales seront celles liées à l’incision de la peau (nuisance modérée) et l’exérèse de la tumeur primaire provocant de la douleur et/ou surinfection bactérienne de la plaie (très rare) durant les premières 48 heures. Par ailleurs, l’anesthésie pendant la chirurgie et l’imagerie provoque la sècheresse des yeux et une baisse de la température corporelle de l’animal (40 minutes) L’apparition des métastases peut provoquer la perte de poids rapide ou apathie chez l’animal (durée : 7 jours maximum)
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux sont euthanasiés pour des analyses post-mortem.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’efficacité de la transformation des cellules normales en cellules tumorales par les différentes combinaisons de mutations sera étudiée au préalable in vitro. Des tests classiques de migration, d’invasion et de prolifération seront conduits sur ces cellules. Ces analyses in vitro permettront de sélectionner les lignées ayant les caractéristiques recherchées pour les analyses in vivo et donc de réduire le nombre d’animaux à utiliser. Cependant, il est indispensable de valider et comparer la capacité de former des tumeurs primaires et des métastases pour ces modèles cellulaires portant différentes modifications. En effet, la souris, en tant qu’organisme vivant intégré et autonome, permet de se rapprocher au plus près du contexte dans lequel se développent les tumeurs des patients. Les modèles murins permettent de reproduire les interactions des cellules tumorales au sein d’un tissu, la croissance tridimensionnelle, ainsi qu’un environnement hypoxique avec un accès limité aux nutriments. De plus, les cellules de mélanome uvéal poussant difficilement in vitro, l’injection chez l’animal est indispensable pour obtenir un nombre suffisant de cellules pour les expériences envisagées.
2. Réduction
Dans un premier temps, nous évaluerons le taux de prise tumorale de nos modèles ayant subi toutes les étapes de la transformation maligne. Si le taux de prise tumorale est satisfaisant (greffe d’au moins 2 souris sur 5), nous estimons l’utilisation de 5 souris par groupe comme étant le minimum suffisant pour comparer la croissance tumorale et la dissémination métastatique. Sinon, la greffe sera faite sur 5 souris supplémentaires par groupe (10 au total), en considérant comme positive la greffe d’au moins 2 souris sur les 10). Si ce taux n’est pas atteint, l’expérience sera considérée comme négative et arrêtée. Dans le cas où ces cellules modifiées ne donnent pas de tumeur in vivo, les cellules normales ou partiellement modifiées (par la seule mutation GNAQ) ne seront pas injectées. Les animaux ayant une prise tumorale sur le flanc au niveau de l’injection seront suivis à long terme, pendant 6 mois après exérèse de la tumeur primaire, par l’utilisation d’imagerie longitudinale pour rechercher une diffusion métastatique. Ceci sera mis en œuvre afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Aucun test statistique n’est mis en œuvre. La réponse recherchée est la prise ou non de la greffe, en fonction des modèles. La taille des cohortes a été déterminée sur le taux d’échec expérimental lors de projets similaires, pour minimiser le taux de faux négatifs tout en minimisant le nombre total d’animaux utilisés.
3. Raffinement
Les différentes procédures seront mises en œuvre de façon à engendrer le minimum de contraintes et de douleur aux animaux : Utilisation systématique d’anesthésiques et d’analgésiques lors des chirurgies. Prévention du dessèchement des yeux lors de l’anesthésie par application du gel ophtalmique. Réduction de l’hypothermie lors de la chirurgie : utilisation de tapis ou lampe chauffants. Addition d’alimentation hydratée en post-opératoire si besoin, hydratation supplémentaire par injection des solutés de réhydratation tel que Ringer lactate à l’animal si perte de poids ou difficulté à se déplacer après chirurgie. Si l’animal montre des signes de douleur, des antalgiques lui seront administrés. Les animaux seront surveillés pendant 24h en post-chirurgie et, si besoin, la surveillance peut être prolongée pendant 7 jours, au moins une fois par jour. Si l’animal montre des signes de souffrance (posture anormale persistante, surinfection bactérienne), il sera mis à mort. Par la suite, les animaux sont surveillés au minimum 1 fois par semaine par le personnel. Pour faciliter le suivi des métastases, nous allons utiliser l’imagerie technique non-invasive sous anesthésie générale. Si l’animal montre des signes de souffrance (posture anormale persistante, surinfection bactérienne ou ulcération qui durent >72h malgré les soins), il sera mis à mort. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de définir les points-limites au-delà desquels les animaux seront mis à mort
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le choix de l’espèce a été fait pour plusieurs raisons : – La souris est un mammifère comme l’Homme et sa physiologie est proche de celle de l’Homme. – La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en cancérogenèse – L’existence de souris immunodéficientes permet la greffe de cellules humaines sans risque de rejet. Le taux de succès des greffes de ce type de cellules humaines dans d’autres espèces comme le poisson-zèbre est trop faible pour envisager leur utilisation dans ce projet. Utilisation de jeunes adultes entre 5 à 8 semaines. Les souris ont ainsi fini leur croissance, mais sont suffisamment jeunes pour que la tumeur greffée puisse prendre sur les animaux. De plus le temps de croissance des cellules tumorales de mélanome uvéal est long, ainsi que l’apparition des métastases. Les animaux à cet âge supportent également mieux le transport à partir de l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que l’anesthésie, la chirurgie et les traitements.