Rongeurs

112 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun commençant par une heure trente de chirurgie pour l'implantation d'un cathéter et d'un émetteur dans une artère. Soixante d'entre eux passent ensuite seize séances d'auto-administration de cocaïne ou de nicotine, quinze séances où l'appui sur le levier ne délivre plus rien, et huit séances de rechute, à raison de deux heures par séance en cage individuelle. Les cinquante-deux autres reçoivent vingt-deux injections, dont la moitié sous anesthésie. Les bénéfices annoncés, de nouvelles voies thérapeutiques contre l'addiction, restent à l'état de perspective, l'objectif immédiat étant de vérifier une hypothèse sur le rôle du rythme cardiaque et de la pression artérielle dans le déclenchement de la rechute.

Objectifs

L’addiction aux drogues est un trouble chronique aux conséquences très préjudiciables. La caractéristique déterminante de l’aspect chronique, quelle que soit la drogue, est la très forte probabilité de rechute dans la consommation même apres de longues périodes d’abstinence. Ainsi une nouvelle consommation après abstinence peut être suffisante pour faire rechuter l’individu et ceci quelquesoit la drogue reconsommée. Cette vulnerabilté permanente à rechuter vient du fait que toutes les drogues agissent sur le même circuit cérébral de la récompense et de la motivation. Néanmoins, à côté de ces effets centraux cérébraux, la drogue produit également des modifications du rythme cardiaque, du péristaltisme intestinal, de la pression artérielle…etc. Notre hypothèse de travail stipule que ces signaux périphériques perceptibles très rapidement par l’individu et spécifiques à chaque drogue (ici cocaïne et nicotine) peuvent participer à précipiter la rechute.Le projet à trois objectifs : L’objectif 1 vise à identifier et dissocier les effets périphériques des substances étudiées en utilisant leurs analogues qui ne passent pas dans le cerveau et en mesurant l’activité du cœur via l’implantation d’un capteur en intra-artériel. Nous comparerons leurs effets avec ceux des drogues elles-mêmes. Nous comparerons un état de conscience anesthésié et un état vigile et nous comparerons mâles et femelles. L’objectif 2 vise à démontrer que la cocaïne et la nicotine induisent la rechute dans la consommation de drogues, mais pas leurs analogues qui ne passent pas dans le cerveau. Pour cela nous utiliserons un modele de rechute chez le rat tres proche de ce qui se passe chez l’Homme. L’objectif 3 vise à relier l’absence de rechute observée avec les analogues qui ne passent pas dans le cerveau avec des mesures du cœur très différentes et spécifiques à chaque substance lors de l’absence de rechute. Au niveau opérationnel ces trois objectifs se déclinent en deux procédures.

Bénéfices attendus

D’un point de vue de santé publique, les résultats de ce projet apporteront des informations essentielles pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques des addictions aux drogues en mettant en évidence le rôle crucial des signaux périphériques de ces drogues dans le risque de rechute. Il sera alors possible de proposer de nouvelles voies thérapeutiques.

Procédures

112 animaux subiront une chirurgie de 1h30 avec implantation d’un cathéter et d’un implant télémétrique. Parmi ces 112 animaux, 52 animaux recevront par l’expérimentateur 11 injections (1/jour/ pendant 3 sec) en état vigile et 11 injections (1/jour/pendant 3 sec) avec 3 injections maximum par semaine en état anesthésié avant d’être euthanasiés. Soixante autres animaux s’auto administreront volontairement (durée de chaque autoadministration est de 3 sec) des drogues (cocaïne pour le groupe Cocaïne et nicotine pour le groupe Nicotine) dans des cages spécifiques en hébergement individuel au cours de 16 séances quotidiennes de 2h par jour, 5 jours sur 7. Ensuite, une procédure d’extinction sera imposée sur 15 séances quotidiennes (2h/ jour sans drogues) dans les mêmes cages, en hebergement individuel à raison de 5 jours sur 7. Chaque animal subira ensuite 8 sessions de rechute en hébergement individuel de 2 heures chacune avec injection soit de cocaïne soit de nicotine soit de leurs analogues respectifs sur une période de 13-14 jours à raison de 5 jours sur 7 et avec une séance extinction entre chaque jour d’injection de drogue. Ils seront ensuite euthanasiés. 112 animaux subiront une chirurgie de 1h30 avec implantation d’un cathéter et d’un implant télémétrique. Parmi ces 112 animaux, 52 animaux recevront par l’expérimentateur 11 injections (1/jour/ 3 secondes) en état vigile et 11 injections (1/jour) avec 3 injections maximum par semaine en état anesthésié avant d’être euthanasiés. Soixante autres animaux s’auto administreront volontairement (durée de l’auto administration est de 3 sec) des drogues (cocaïne pour le groupe Cocaïne et nicotine pour le groupe Nicotine) dans des cages spécifiques au cours de 16 séances quotidiennes de 2h par jour, 5 jours sur 7. Ensuite, une procédure d’extinction sera imposée sur 15 séances quotidiennes (2h/ jour sans drogues) dans les mêmes cages à raison de 5 jours sur 7. Chaque animal subira ensuite 8 sessions de rechute de 2 heures chacune avec injection soit de cocaïne soit de nicotine soit de leurs analogues respectifs sur une période de 13-14 jours à raison de 5 jours sur 7 et avec une séance extinction entre chaque jour d’injection de drogue. Ils seront ensuite euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie longue pouvant induire des douleurs modérées traitées par l’utilisation d’analgésiques. Ils seront ensuite soumis à la possibilité de s’auto-administrer des drogues puis à des sessions d’extinction. Ces sessions où l’animal appuiera sur le levier sans recevoir de drogues peut créer un stress modéré. Enfin la nicotine et la cocaïne peuvent provoqués des effets secondaires sur l’organisme comme des problèmes cardiovasculaires modérés. Lors de ces séances d'autoadministration et d'extinction les animaux sont placés dans des cages spécifiques et en hébergement individuel pendant 2 heures /séances ce qui peut créer un stress modéré. Ils sont ensuite remis en cages collectives jusqu'à la prochaine séance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour réaliser des prélèvements de cerveau et récupérer le capteur de télémétrie intra-artériel.

Remplacement

Remplacer les animaux dans ces expériences est difficile car ces expériences mettent en jeu des systèmes biologiques complexes et des comportements spécifiques, comme la recherche de drogue et la rechute. Les interactions entre le cerveau, les organes et les signaux corporels ne peuvent pas être reproduites avec des modèles in vitro ou informatiques actuels. De plus, ces études nécessitent d’observer les effets simultanés et globaux des drogues sur l’organisme entier, ce qui est impossible avec des alternatives. Malgré les progrès dans les modèles alternatifs, les animaux restent indispensables pour comprendre ces mécanismes.

Réduction

L’utilisation d’implants télémétriques permet de multiplier les injections de molécules dans des expérimentations de screening de molécules. Cette technique permet de réduire le nombre d’animaux car il n’est plus utile de multiplier celui-ci par le nombre de molécules. de plus les tests statistiques qui seront fait pourront être pairés réduisant la variabilité inter-individuelle et permettant des tests plus puissants avec moins d’individus.

Raffinement

L’utilisation de la télémétrie permet de raffiner les protocoles éthiques en réduisant le stress et les manipulations des animaux, en permettant des mesures non invasives en continue et en augmentant la qualité des données. Non seulement elle évite d’utiliser beaucoup d’animaux comme dit précédemment mais elle évite aussi les procédures répétées invasives. La chirurgie d’implantation télémétrique est faite sous anesthésie et analgésie. Les animaux sont surveillés minimum 2 fois par jour pendant 3 jours post-opératoire puis quotidiennement. Grâce à cette technique, les animaux sont ensuite laissés libres de leurs mouvements dans la cage d’hébergement. Les animaux seront hébergés par deux minimum afin de respecter leur caractère grégaire, dans des cages de taille réglementaire avec un milieu enrichi (tunnel, matériel de nidification). Une feuille de scoring pos-opératoire a été faite : elle comporte des points limites généraux et spécifiques permettant une intervention des expérimentateurs en fonction du niveau de gravité

Choix des espèces

Le rat est le modèle le plus communément utilisé pour les expérimentations d’autoadministration. Les connaissances sur celui-ci sont solides et sa physiologie reste, malgré ses différences, proches de celle de l'humain. Enfin, le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies (pose de capteur télémétrique et cathéter intre-veineux). Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte soit entre 7 et 8 semaines. Ils devront faire 225/250gr afin d’avoir le poids recommandé pour l’implantation des capteurs télémétriques.

Injectées d'un grand volume de solution dans la circulation, ce qui dilate massivement leur foie pendant une trentaine de minutes, 2 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection unique destinée à provoquer un cancer du foie, puis sont suivies par échographie sous anesthésie pendant trois à six mois, de deux à quinze examens selon les groupes. Le porteur présente ce suivi par imagerie comme une méthode "sans douleur ni intervention lourde" qui évite des mises à mort intermédiaires, alors que les animaux développent des tumeurs hépatiques et peuvent s'affaiblir et perdre du poids. Toutes sont tuées en fin de procédure, les prélèvements post-mortem étant présentés comme la seule voie d'analyse.

Objectifs

Le cancer du foie touche chaque année plus de 900 000 personnes dans le monde et cause environ 800 000 décès, ce qui en fait la troisième cause de mortalité par cancer. Ce cancer grave reste difficile à traiter, car les thérapies actuelles sont peu efficaces, avec un taux de réponse inférieur à 20 pourcent. Cette inefficacité s’explique en grande partie par la grande diversité des tumeurs, qui varient selon les patients et même au sein d’une même tumeur. Pour améliorer la prise en charge de cette maladie, notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes précoces à l’origine du cancer du foie, en particulier ceux impliqués dans la transformation des hépatocytes (les cellules principales du foie). Nous étudions notamment le rôle de certains facteurs clés dans la stabilité du génome et dans la réponse immunitaire locale du foie. Ces recherches, menées sur des modèles animaux pendant 5 ans, pourraient contribuer à identifier de nouvelles cibles pour des traitements plus efficaces.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques actuelles contre le cancer du foie sont restreintes par notre compréhension insuffisante des processus cellulaires et moléculaires qui régulent la prolifération des hépatocytes, ainsi que du rôle du microenvironnement immunitaire dans le développement tumoral. Ce projet de recherche a pour objectif de mieux caractériser ces mécanismes et acteurs afin de concevoir de nouveaux outils de diagnostic et de pronostic pour améliorer la prise en charge des patients, et d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques prometteuses.

Procédures

Des animaux auront une injection permettant la perte d’expression de gènes d’intérêt (1 fois, 10 secondes/animal sous anesthésie générale) et recevront également une injection unique visant à mimer le cancer du foie (1 fois, 10 secondes/animal vigile). D’autres animaux recevront uniquement une seule injection visant à mimer le cancer du foie (1 fois, 10 secondes/animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront suivis par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 2 à 4 semaines ou toutes les semaines selon les conditions expérimentales (entre 2 échos minimum et 15 échos maximum) jusqu’à euthanasie à la fin de la procédure expérimentale (3-6 mois) par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L’injection intra-veineuse peut causer une légère douleur de courte durée au point d’injection et présenter un risque de saignement et/ou d’hématomes. Par ailleurs, l’injection d'un grand volume de solution dans la circulation systémique peut conduire à une douleur transitoire dans la région d'injection et conduire à une dilatation massive mais transitoire (inférieure à 30 minutes) du tissu hépatique et une augmentation de la volémie globale. Au cours de l’anesthésie gazeuse lors de l’échographie du foie, une dépression cardio-vasculaire peut se produire ainsi qu’un stress thermique. Enfin, de par le développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général (asthénie, perte de poids...).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire de l’ensemble des animaux).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant le carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 2520 animaux seront étudiés. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Nous aurons recours au suivi échographique des tumeurs du foie, une méthode d’imagerie non invasive qui permet d’observer l’évolution de la maladie de manière précise, sans douleur ni intervention lourde. Cette approche, qui permet de suivre les mêmes animaux dans le temps, évite le recours à des euthanasies supplémentaires à différents stades de l’étude. Elle contribue ainsi à réduire significativement le nombre d’animaux nécessaires. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris utilisées dans ces procédures seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Lorsque cela sera possible sans nuire au bon déroulement de l’expérimentation, une anesthésie générale courte sera réalisée avant toute intervention potentiellement douloureuse. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. Nous aurons recours au suivi échographique des tumeurs du foie, ce qui permettra de suivre l'évolution de l'état de santé des animaux au fil du temps sans nécessiter leur euthanasie à chaque étape, mais également de réduire le stress et les contraintes pour les animaux, tout en améliorant la qualité des données recueillies. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite selon une méthode réglementaire. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour ce projet de recherche, nous avons choisi la souris du fait de la disponibilité de modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 à 8 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans le développement tumoral. Une souris trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.

Une partie des souris porte un phénotype dommageable reproduisant la maladie de Marfan, avec scoliose, prolapsus rectal et hernie diaphragmatique. 16 200 souris vont être utilisées au total, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour analyse de l'aorte. Au sevrage, chacune subit une biopsie d'oreille et la pose d'une bague, puis selon les groupes des échographies sous anesthésie, jusqu'à vingt injections intrapéritonéales hebdomadaires, jusqu'à dix prélèvements sanguins submandibulaires en état vigile et l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique sous la peau. Ce chiffre englobe l'élevage des lignées déficientes pour les gènes étudiés, dont les animaux qui ne seront retenus pour aucune expérience.

Objectifs

Ce projet a pour but de comprendre le rôle de l'inflammation dans l’anévrisme de l’aorte. Pour cela, des modèles de souris présentant des anévrismes dans différentes régions de l’aorte seront utilisés. La dilatation de l’aorte, la survenue d’anévrismes, le remodelage de la paroi aortique et l'inflammation seront étudiés chez ces souris. Ce projet a également pour objectif d'étudier l'effet de la déficience et de l'activation de certains acteurs moléculaires et cellulaires de l’inflammation sur la survenue et la gravité des anévrismes.

Bénéfices attendus

Ce projet participera à une meilleure compréhension rôle de l’inflammation dans l’anévrisme de plusieurs régions de l’aorte. En particulier, l’identification des mécanismes moléculaires activés au sein des cellules immunitaires et des cellules de la paroi aortique est essentielle pour le développement à plus long terme de stratégies thérapeutiques innovantes.

Procédures

Ce projet comporte une partie d'élevage de souris déficientes pour certains gènes d'intérêt. Lors du sevrage, ces animaux subiront une biopsie d'oreille pour génotypage et la pose d’une bague d’identification. Des échographies non-invasives et indolores du thorax et de l’abdomen seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 15 minutes. Une partie des animaux va subir des injections intrapéritonéales d'une durée maximale de 30 secondes (au maximum 1 injection par semaine pendant 20 semaines). Une partie des animaux subira un prélèvement sanguin toutes les deux semaines par voie submandibulaire en étant vigile, d'une durée maximale d'une minute (maximum 10 prélèvements). Une partie des animaux va subir une procédure chirurgicale de 5 minutes au cours de laquelle une pompe osmotique est implantée sous la peau. Cinq injections sous- cutanées d’analgésiques (durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire.

Impact sur les animaux

- Effets indésirables liés à la biopsie pour génotypage : inconfort lié à la préhension et la contention des animaux. Le niveau de douleur est estimé léger et de courte durée. - Effets indésirables liés aux injections et aux prélèvements : inconfort lié à la préhension et la contention des animaux. Stress/potentielle douleur au point d'injection et prélèvement. Le niveau de douleur est estimé léger et de courte durée. - Effets indésirables spécifiques à la chirurgie : les souris sur lesquelles seront implantées des pompes osmotiques risquent de subir l’inconfort de la pompe et de la plaie. Le niveau de douleur est estimé modéré. - Effets indésirables liés aux modèles : la survenue d’anévrismes est inhérente à ce projet. Le niveau de douleur est estimé modéré. - Effets indésirables liés au phénotype dommageable d’une partie des souris dont les symptômes récapitulent ceux des patients atteints de la Maladie de Marfan : scoliose, prolapsus rectal et hernie diaphragmatique. Le niveau de douleur est estimé modéré.

Devenir

A la fin des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques ou d’inflammation dans l’aorte.

Remplacement

L'étude expérimentale sur des animaux est une étape incontournable pour comprendre les mécanismes intervenant dans le développement des anévrismes. En effet, ces phénomènes complexes impliquent une multitude de types cellulaires, ce que les modèles de culture cellulaire ne peuvent reproduire complètement. Le modèle animal permet d'étudier les diverses interactions cellulaires et tissulaires qui se produisent lors de la dilatation de l’aorte et qui peuvent aboutir à sa rupture. Ces modèles précliniques de souris sont également un préalable indispensable pour valider les stratégies thérapeutiques avant leur application chez les patients atteints d'un anévrisme de l'aorte. En parallèle des études sur modèle animal, des études sur modèles cellulaires sur des lignées cellulaires de cellules inflammatoires ou tissulaires permettront d’obtenir des résultats complémentaires qui ne nécessitent pas l’utilisation de plus d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. En tenant compte des aléas inhérents à la survenue de ruptures des anévrismes étudiés, la taille de groupe est estimée à 20 animaux. Pour réduire le nombre d’animaux, plusieurs paramètres seront étudiés sur le même animal. En ce qui concerne l'élevage, la stratégie de croisement des animaux permet d'optimiser la génération des animaux en fonction des groupes nécessaires pour les expériences et pour la gestion des lignées, à l'aide des tableaux de croisement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Par ailleurs, il y aura un enrichissement complémentaire dans certains cas particuliers. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées, et par, l’établissement et l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière et renforcée par les expérimentateurs confirmés et par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en œuvre du projet.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées mutantes nécessaires. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications vasculaires dans un espace de temps raisonnable. Grace à ces modèles de souris, d'importants résultats pourront être obtenus rapidement, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. Ce projet comprend différents modèles d’anévrisme, touchant différentes régions de l’aorte. Pour les modèles d’anévrisme qui le permettent, les souris seront incluses à l’âge adulte une fois le système cardio- vasculaire arrivé à maturité. Cela permet de réduire la variabilité entre les individus. Pour les modèles d’anévrisme évoluant plus rapidement, les animaux seront inclus plus tôt, au stade de jeune adulte.

690 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever organes et échantillons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux à quatre immunisations par voie nasale ou intramusculaire sous anesthésie, jusqu'à cinq prélèvements sanguins, des lavages vaginaux, des lavages nasaux et un prélèvement de salive obtenu grâce à un médicament qui force la salivation, les femelles voyant leur cycle hormonal synchronisé avant inoculation du virus. Le projet teste des formulations d'ARN encapsulé censées déclencher une réponse immunitaire dans les muqueuses génitales contre le VIH. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids sont mises à mort, et le porteur précise qu'aucun analgésique ni anti-inflammatoire ne sera administré, ces produits risquant d'interférer avec la réponse immunitaire mesurée.

Objectifs

L'objectif est de développer un vaccin intranasal à ARN contre le VIH. Le VIH est un virus ciblant le système immunitaire, rendant les patients plus vulnérables à d’autres infections et maladies. Le virus se propage pendant les rapports sexuels non protégés (sans préservatif ou sans médicament spécifiques), ou lors du partage d’équipement d’injection de drogues. Si non traité, le VIH peut mener au SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquis). Malgré de nombreuses années de recherche, le développement d’un vaccin efficace contre le VIH reste un défi. Le point critique est d'induire une réponse immunitaire efficace et durable aux sites de l'infection. Notre but est de tester l’efficacité de formulations vaccinales administrées par voie intranasale afin d'induire une réponse génitale étant donné que les sites muqueux communiquent entre eux. De nouvelles technologies vaccinales comme celles de l’ARN (utilisé avec succès contre le COVID-19) est une solution prometteuse. Cependant, administrés par des méthodes traditionnelles comme une injection, ces vaccins ne déclenchent pas une forte réponse au niveau génital. Dans cette étude, nous utiliserons des vaccins ARN encapsulés dans des lipides qui permettront le passage muqueux et amélioreront la réponse immunitaire. Nous testerons différentes formulations vaccinales contenant des ARN. Nous testerons différentes voies d'administration. Nous mesurerons les réponses immunitaires dans le sang et dans les parties génitales, en s’intéressant notamment à la durabilité de la réponses immunitaire. Enfin, nous étudierons l'efficacité de notre stratégie vaccinale en infectant les souris. Le VIH n’infecte pas naturellement la souris, donc nous utiliserons un virus non pathogène qui a certaines caractéristiques du VIH et qui sera administré par voie génitale.

Bénéfices attendus

Le développement de vaccins ciblant les antigènes du VIH reste compliqué et a échoué dans la plupart des essais cliniques. Le problème principal est la difficulté d'induire des anticorps neutralisants à large spectre et la haute variabilité génétique du virus. Il est donc nécessaire de développer une stratégie efficace et robuste contre le VIH. Ce projet a pour objectif de développer de nouvelles formulations vaccinales, administrées par voie intranasale qui induisent une forte réponse immunitaire dans les muqueuse vaginales, rectales et orales. Nous évaluerons la réponse anticorps, qui se développe dans la muqueuse et au niveau systémique. Les données générées dans ce projet seront essentielles pour tester par la suite la protection induite par la formulation la plus prometteuse. De plus, ce projet apportera de nouvelles connaissances dans le développement des réponses immunitaires durables dans le contexte du VIH. Ce projet permettra de déterminer la meilleure stratégie pour améliorer la réponse immunitaire au niveau génital. La voie intranasale qui est sans aiguille permettrait aussi de rendre la vaccination plus accessible et confortable.

Procédures

1) Les souris seront identifiées à leur arrivée 2) Vaccination par voie nasale ou dans le muscle sous anesthésie. Il y aura entre 2 et 4 immunisations par souris. Les prélèvements suivants seront effectués avant chaque immunisation et avant la mise à mort (5 fois maximum) 3) prélèvement d'un petit volume de sang: c’est un geste qui dure 30 secondes. 4) Lavages vaginaux avec une solution saline : geste qui dure 5 minutes. 5) Prélévement des fèces: les souris selon isolées dans des boîtes qui n’entravent pas leurs mouvements jusqu’à la collecte d’un nombre suffisant de fèces (20 minutes). 6) Lavage nasal (sous anesthésie) : En utilisant une pipette, un petit volume de solution saline sera doucement déposée au goutte à goutte sur une narine, permettant au fluide de sortir par l’autre narine pour le prélèvement. 7) Prélevement de la salive : Ce prélèvement sera fait lors de la même anesthésie que pour le lavage nasal (4) ). La sécrétion de salive sera stimulée avec un médicament qui fait saliver utilisé chez l'humain pour collecter une quantité suffisante de salive pour les analyses. La procédure sera réalisée sur un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle des souris. 8) pour les souris femelles, le cycle hormonal sera synchronisé avant l'infection virale pour faciliter l’accès du virus au tissu génital. 1 seule fois, pour les expériences d'infection. 9) Administration virale sous anesthésie: une seule fois pour les expériences d'infection 10) un anticorps sera injecté en intra-veineux quelques minutes avant la mise à mort. Ce geste sera fait une seule fois avant la mise à mort. 94% des souris (n=620) subiront ces gestes sur un intervalle de 9 semaines. Seulement 40 souris (6%) participeront à l’étude longitudinale pour évaluer la durabilité de l'immunité et subiront ces techniques sur une durée de 18 mois.

Impact sur les animaux

Un inconfort léger et transitoire peut arriver pendant l’administration du vaccin, en particulier lors de l’injection intramusculaire qui peut causer une douleur ou une inflammation locale au site d’injection. L’administration intranasale peut induire une légère irritation. Certains animaux peuvent avoir un comportement modifié pendant un petit moment. Des réactions physiologiques peuvent survenir comme une augmentation de la température corporelle ou une perte de poids temporaire, ceci rentre dans l'ordre dans les 24-48 heures. Une manipulation répétée pour les rappels vaccinaux peuvent induire un stress léger, cependant toutes les procédures seront faites par des personnes qualifiées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour préléver des échantillons et des organes. Ces échantillons seront utilisés pour analyser les réponses immunitaires pour établir l’immunogénicité des formulations vaccinales testées

Remplacement

Avant de tester les formulations chez les souris, nous étudierons in vitro la passage des ARN dans les capsules lipidiques sur des modèles cellulaires. Cependant, aucun modèle animal ne permet de tester la réponse vaccinale, en particulier la durabilité des réponses immunitaires. Cela peut seulement être étudié dans un animal vivant récapitulant tous les systèmes biologiques.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous inclurons autant de groupes test que possible pour un groupe contrôle, tout en gardant les expériences réalisables et les données robustes. Nous utiliserons des tests statistiques standards pour s’assurer de la validité des résultats. Si un ou plusieurs groupes démontrent une réponse immunitaire plus forte que les souris contrôles, nous répèteront l’expérience trois fois pour confirmer les résultats.

Raffinement

Après chaque vaccination et anesthésie, les souris seront surveillées pendant 30 à 60 minutes, puis 3, 24, 48 et 72 heures après vaccination. Nous surveillerons l’apparition de douleur ou d'inconfort comme une difficulté à bouger, une boîterie ou une sensibilité accrue au site d’injection. Pour la vaccination intranasale, nous vérifierons l’absence d'une forte irritation nasale ou de problèmes respiratoires. La température corporelle et le poids seront vérifiés aux temps mentionnés. Si une souris présente un signe de souffrance comme une extrême fatigue, absence de mouvement, un gonflement, des problèmes de respiration ou perd plus de 20% de son poids initial, elle sera immédiatement mise à mort. Étant donné que nous étudions une réponse immunitaires après une vaccination, nous ne pouvons pas donner d’analgésiques ou d’anti-inflammatoires car ils pourraient interférer avec les réponses immunitaires.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus adapté pour étudier les réponses immunitaires spécifiques à un vaccin. La plupart des expériences d’immunogénicité seront réalisées avec des souris âgées de 7 semaines à 6 mois car avant 7 semaines les souris n’ont pas un système immunitaire mature et après 6 mois la réponse immunitaire peut être altérée. Étant donné qu’il a été démontré que l’âge peut modifier les réponses vaccinales, certaines expériences avec la formulation vaccinale la plus prometteuse chez les souris jeunes seront répétées chez des souris âgées de plus de un an.

Deux heures d'IRM sous anesthésie, la tête maintenue par des barres d'oreilles : 240 souris et 40 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour confronter les images aux analyses histologiques. Avant cela, chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique de 45 minutes pour recevoir dans le cerveau un vecteur viral ou une protéine pathologique, avec douleur et perte de poids possibles pendant un à trois jours. Une lignée de souris présente en outre un risque de crises d'épilepsie vers l'âge de deux mois. Le porteur défend le choix des rongeurs en concédant que ces modèles des maladies d'Alzheimer et de Parkinson sont "imparfaits", tout en les qualifiant d'"indispensables".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer, la maladie de Huntington ou la maladie de Parkinson appartiennent à une classe de maladies neurodégénératives (les protéinopathies) causées par des protéines mal repliées ou mal dégradées qui s’agrègent dans le cerveau. Outre leur perte de fonction initiale due au mauvais repliement, ces protéines solubles acquièrent des fonctions toxiques, notamment en s’agrégeant et se propageant dans le cerveau. De plus, il existe actuellement un débat scientifique sur la nature des agrégats de ces protéines qui présentent des degrés variables de toxicité et des caractéristiques de propagation conduisant à différentes formes de maladies. De plus en plus de personnes âgées souffrent de protéinopathies, et en particulier de la maladie d’Alzheimer et de la maladie de Parkinson. Il est d’un intérêt considérable de pouvoir distinguer les formes solubles et agrégées des protéines impliquées dans les maladies d’Alzheimer et de Parkinson, de quantifier leur agrégation précocement et de surveiller leur propagation de manière non invasive. Cela permettra de mieux comprendre la physiopathologie de ces maladies neurodégénératives en recherche fondamentale et préclinique, et à terme, de disposer d’un outil de diagnostic et de suivi. Une modalité d'IRM relativement récente appelée CEST (Chemical Exchange Saturation Transfer) a été proposée pour imager les protéines avec une excellente résolution spatiale. Elle pourrait notamment permettre de distinguer les protéines solubles des agrégats de protéines. Ainsi, l'objectif principal de notre projet est d'établir un outil de surveillance et de diagnostic des maladies d’Alzheimer et de Parkinson reposant sur l'imagerie non invasive d'agrégats protéiques spécifiques impliqués dans ces maladies neurodégénératives. Notre deuxième objectif est de mieux comprendre les voies pathologiques (agrégation, propagation à travers les structures cérébrales) de chaque type de protéines, et comment celles-ci, selon leurs propres caractéristiques, peuvent provoquer des formes de maladies différentes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de faire de l’IRM-CEST une nouvelle modalité diagnostique pour les maladies neurodégénératives. Cette approche offrirait des avantages significatifs à la recherche fondamentale et préclinique pour une meilleure compréhension des processus pathologiques impliqués dans ces maladies et en fournissant des biomarqueurs pertinents pour l’évaluation des traitements futurs. Elle profiterait également à la recherche clinique, puisque toutes les méthodes développées sont transférables sur des scanners cliniques.

Procédures

- Tous les animaux (280) seront scannés à l’IRM sous anesthésie (durée : 2h00). - L’injection d’un vecteur viral (qui permet d’introduire dans les cellules cérébrales un gène codant pour la protéine pathologique) sous anesthésie profonde (durée de la chirurgie : 45 min) sera réalisée sur 40 animaux et sous conditions stériles. - L’injection de la protéine d’intérêt ou d’un liquide contrôle sous anesthésie profonde (durée de la chirurgie : 45 min) sera réalisée sur 240 animaux et sous conditions stériles. L’analgésie est toujours utilisée avec l’anesthésie lors des chirurgies.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à ce que certaines chirurgies puissent causer de la douleur, du stress ou une perte de poids temporaire. Des effets indésirables (stress ou douleur) peuvent durer pour un temps variable d’une journée à 3 jours après l’opération. Un risque de stress cardio-respiratoire est aussi présent lors de l’anesthésie. Cetrtaines souris peuvent présenter un risque de crise d’épilepsie vers l’âge de 2 mois.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de confronter les mesures in vivo aux résultats histologiques.

Remplacement

Ce projet fait appel à deux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer ainsi qu’un modèle rat de la Maladie de Parkinson déjà caractérisés. A l’heure actuelle, ce projet ne peut pas être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des techniques informatiques. En effet, les symptômes neurologiques cognitifs de la maladie ne peuvent être répliqués que chez l’animal. Par ailleurs, les régulations hormonales ou les réactions inflammatoires liées aux maladies d’Alzheimer et de Parkinson ne peuvent pas être reproduites dans des modèles cellulaires 2D ou des organoïdes. Enfin, l’étude de la diffusion des protéines Tau dans le cerveau requiert toute la complexité des réseaux neuronaux qui se mettent en place au cours de la maturation et du vieillissement du cerveau. Il est donc nécessaire de réaliser ce projet sur des espèces modèles mammifères comme la souris et le rat, présentant le plus possible de similitudes avec la physiologie humaine, c’est-à-dire possédant un cerveau complexe permettant d’exprimer des comportements sophistiqués.

Réduction

Le nombre maximal d’animaux utilisés pour ce projet (280 animaux dont 240 souris et 40 rats) a été défini au plus juste pour atteindre les objectifs scientifiques et être statistiquement pertinent compte-tenu de nos connaissances au début du projet. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation d’un logiciel in vivo, approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis. Par ailleurs, les techniques de neuro-imagerie développées dans ce projet permettent un suivi des animaux au cours du temps. Ceci permet d’augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre l’objectif scientifique.

Raffinement

- Examens IRM (sous anesthesie) : la douleur liée à l’utilisation de barres d’oreilles pour stabiliser l’animal est minimisée par application locale d'analgesie 5 minutes avant. - Stéréotaxies (sous anesthésie) : Un analgésique est administré 30 min avant la chirurgie ainsi qu’en post-opératoire. Une analgésie locale est mise en place 5 minutes avant l’incision chirurgicale et la douleur liée à l’utilisation de barres d’oreilles pour stabiliser l’animal est minimisée par application locale d'analgésie 5 minutes avant. Les animaux sont thermorégulés durant toute l’anesthésie jusqu’au réveil complet après réversion de l’anesthésie. - Points limites établis pour réduire la souffrance et le stress des animaux. En cas de perte de poids des animaux, une administration d’eau gélifiée enrichie en vitamines et glucose sera mise en place. - Des points limites spécifiques sont également prévus pour couvrir le risque de crise convulsive d'une lignée souris . Une surveillance quotidienne sera également mise en place pour minimiser les risques de crises d’épilepsie non détectées. - Les animaux sont hébergés en groupe, dans environnement à température contrôlée, avec un cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Les animaux sont examinés quotidiennement par les donneurs de soin, sous supervision permanente du vétérinaire du centre, également en charge du bien-être animal. L’environnement est enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire.

Choix des espèces

Les modèles rongeurs sont pertinents car ils peuvent être observés in vivo par des scanners IRM à haute performance et ce, malgré la petite taille de leur cerveau. Par ailleurs, le projet de recherche est basé sur des modèles reconnus de la maladie d’Alzheimer et de la maladie de Parkinson. Bien qu'imparfaits, les modèles rongeurs de ces maladies neurodégénératives permettent d'étudier certains aspects de la pathologie et sont indispensables pour progresser dans la compréhension des mécanismes qui lui sont associés. Les animaux seront adultes afin de se placer dans des conditions expérimentales qui permettent de reproduire l’évolution de la maladie qui touche des adultes.

Pour tester si des molécules déjà administrées à des êtres humains améliorent la fonction musculaire dans la myopathie à cores centraux, 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit cinq injections abdominales quotidiennes destinées à déclencher la maladie, puis est transporté pendant une demi-journée vers un second établissement. Il y subit trois explorations RMN de 45 à 60 minutes sous anesthésie générale, espacées de quinze jours. Le porteur affirme que le traitement n'induira pas d'effet indésirable puisque ces molécules ont déjà été utilisées sans effet observé, ce qui n'empêche pas de provoquer chez les souris une perte de poids et de force musculaire.

Objectifs

La myopathie à cores centraux est une maladie causée par des mutations dans un gène codant pour une protéine essentielle à la contraction musculaire dont l'absence est mortelle. Chez l'homme, nos études précédantes ont montré qu'une réduction de sa quantité en dessous de 50% conduit à une myopathie à cores centraux dont la sévérité augmente avec la quantité de protéines manquantes. Nous avons développé et caractérisé un modèle de souris qui reproduit cette maladie et ses mécanismes. Il n’existe actuellement aucun traitement contre cette maladie. Cependant, différentes molécules, déjà testées chez l'homme ou la souris pour d'autres pathologies, présentent un potentiel thérapeutique fort pour la myopathie à core car elles agissent sur les mécanismes identifiés dans ce modèle. Il apparaît donc opportun d'évaluer les répercussions fonctionnelles au niveau du muscle de l'administration de ces molécules dans un modèle animal parfaitement caractérisé de cette pathologie. C'est l'intérêt de ce projet qui vise à étudier chez l'animal dans son intégrité les effets des traitements sur le métabolisme et la fonction musculaire chez un modèle de souris souffrant de cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester des approches thérapeutiques susceptible d’améliorer les performances musculaires chez un modèle de souris de la myopathie à cores centraux. Sachant qu’il n’existe encore à l’heure actuelle aucun traitement curatif contre cette myopathie, ce projet est une première étape indispensable avant l’application à l’homme.

Procédures

Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs, avec, pour chaque animal, un seul transport entre les deux établissements dans un véhicule dédié (durée environ 1/2 journée) . Etablissement utilisateur 1/2: chaque animal subira cinq injections (une par jour, durée: moins de 15s/injection) dans l'abdomen. Etablissement utilisateur 2/2: chaque animal subira trois explorations strictement non invasives par RMN. Ces explorations, espacées entre elles de 15 jours, auront une durée de 45-60 minutes et seront réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

1/ Les injections dans l'abdomen pour induire la pathologie pourront entrainer une petite irritation au site d'injection et un stress léger. 2/L’induction de la pathologie pourra engendrer un stress modéré lié à la perte de poids et de force musculaire. 3/ Le transport des animaux d'un établissement à l'autre pourra engendrer un stress modéré. 4/Les explorations RMN pourront provoquer un stress léger de l’animal pendant les phases d’induction de l’anesthésie et de réveil. Le traitement n'induira pas d'effet indésirable car les molécules testées ont déjà été utilisées chez l'homme ou l'animal sans effet indésirable observé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet afin de réaliser des prélèvements post-mortem de muscles sur lesquels seront réalisées des analyses. Cette étape est indispensable pour caractériser chez chaque animal l’état d’avancement de la pathologie.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer de façon non invasive et à différents temps lors du développement de la maladie si les molécules testées permettent d’améliorer les performances des muscles atteints de myopathie à cores centraux. Le métabolisme et la force musculaire que nous allons étudier mettent en oeuvre une communication entre différents organes, et ne sont donc pas reproductibles avec des cultures de cellules musculaires. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.

Réduction

Notre approche non invasive offre la possibilité d’explorer les animaux au cours de l'évoution de la pathologie ce qui permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Le recours à la RMN réduira également le nombre d’animaux utilisés car elle permettra d’obtenir pour chaque animal les mesures dans différentes conditions (repos, activité musculaire, récupération post-activité) au cours d’un seul examen, contrairement aux techniques classiques qui auraient nécessité d'euthanasier des animaux à différents temps pour chacune de ces conditions afin de réaliser les mesures sur muscles. Le nombre d'animaux nécéssaire dans chaque groupe a été déterminé par une approche statistique et avec nos expériences précédantes. Lorsque cela est possible, les mêmes animaux controles seront utilisés pour le test de deux molécules afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les injections seront réalisées par du personnel formé, le geste sera rapide et précis. Le transport des animaux entre les deux établissements sera réalisé par un transporteur agréé avec une livraison dans la foulée du chargement. Le suivi en RMN sera réalisé sur animaux anesthésiés afin de réduire le stress des animaux. Enfin, une grille de score spécifique à ce modèle de souris de la myopathie à cores centraux a été établie et permettra l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui ait une physiologie proche de l’Homme et qui soit génétiquement modifiable, c'est pour cela que la souris a été choisie. Les animaux seront utilisés au stade adulte (ils seront âgés de 8-10 semaines au début du projet) afin de pas avoir d'interférence avec le développement musculaire, et parce que l’induction de la pathologie ne peut se faire que dans les fibres musculaires adultes.

130 souris vont être utilisées, chacune soumise à vingt semaines de régime riche en graisses avant d'être tuée à l'âge de 24 semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatorze fois par animal, la veine caudale est incisée sous anesthésique local pour prélever deux à deux microlitres et demi de sang. Pendant douze jours, trois composés bloquant un récepteur sont administrés par gavage, l'obésité provoquée pouvant gêner l'accès à la nourriture et à l'eau et entraîner des dermatites. Le porteur présente ces bloqueurs comme prometteurs au vu d'un essai clinique de phase II déjà évalué positivement chez l'être humain pour un composé de la même famille.

Objectifs

L’obésité et ses conséquences métaboliques sont de plus en plus répandues et souffrent d’un manque de traitements pharmacologiques fiables. Nous développons de nouveaux composés à but thérapeutique ciblant le récepteur X et l’objectif de ce projet est de testé le potentiel anti-obésité de trois nouveaux composés chez la souris rendue obèse suite à une alimentation riche en graisse.

Bénéfices attendus

L’obésité représente un véritable enjeu de santé publique ; cette pathologie étant classée parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir son évolution. L’étude, le développement et la caractérisation de nouvelles cibles et de nouveaux agents pharmacologiques apparaît donc primordial afin de remédier à ce besoin médical non satisfait. Les bloqueurs des récepteurs X présentent un intérêt certain, l’un deux ayant récemment été évalué de manière positive lors d’une étude clinique de phase II pour l’obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime riche en graisse pendant 20 semaines. Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et n’aura lieu que 14 fois par animal. Les injections de glucose d’insuline n’auront lieu qu’une seule fois et nécessiteront l’immobilisation de l’animal pour une durée de 5 secondes. Pendant les 12 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage. Pour chaque gavage, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes.

Impact sur les animaux

Tout au long de ce projet, l’état général des animaux obèses sera surveillé quotidiennement car bien que cette pathologie ne soit pas un point limite, ses conséquences peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi une prise de masse trop importante peut entraîner une difficulté d’accès à la nourriture et à l’eau de boisson. De plus un excès d’apport alimentaire en lipides peut également entraîner le développement passager de dermatite. Aucune autre nuisance n’est attendue mis à part un potentiel stress des animaux lors des tests métaboliques.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

L’obésité est une pathologie multifactorielle entraînant une résistance à l’insuline, des dépôts ectopiques de graisse, une élévation du glucose sanguin, le tout ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur ce type de molécules, nous avons pu au cours des projets réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de réaliser des effets doses, ni de multiplier les temps de traitements, pour un large spectre de molécules, dont celles utilisées dans ce projet. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux et le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Depuis leur arrivée en provenance du fournisseur, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 2 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Toutes les précautions sont prises en terme d’analgésie, d’euthanasie et d’application stricte des points limites spécifiques au modèle d’étude et au type d’interventions prévues dans ce projet.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Son métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction de l’obésité sera réalisée chez des souris de 6 semaines. Les souris seront âgées de 22 semaines au du début des traitements pharmacologiques et de 24 semaines lors de la mise à mort. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte.

448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées sous la peau ou dans l'os, la tumeur osseuse provoquant une boiterie qui s'aggrave à mesure qu'elle grossit, puis un composé immunostimulant est injecté dans la veine de la queue avant un PET scan de vingt minutes sous anesthésie. Le composé dérive d'une molécule dont l'usage clinique est limité par sa toxicité, et l'étude vise à savoir où il se concentre dans l'organisme avant d'envisager des essais chez l'être humain. Sur l'effectif, le porteur indique seulement qu'un logiciel statistique a permis de déterminer le nombre strictement nécessaire.

Objectifs

L’immunothérapie, qui vise à stimuler le système immunitaire pour lutter contre le cancer, est une approche prometteuse dans ce domaine. Un composé immunostimulant a longtemps été utilisé pour activer la réponse immunitaire contre les cancers. Cependant, son utilisation clinique est limitée car il est très toxique, même à faible dose. Pour contourner ce problème, un dérivé de ce composé immunostimulant, moins toxique et plus efficace, a été développé. Ce composé est transformé chimiquement pour réduire sa toxicité et est encapsulé dans de petites particules de graisse appelées liposomes. Ces liposomes permettent de l’administrer par injection intraveineuse. Ce traitement a montré des résultats prometteurs pour freiner la croissance des tumeurs chez les souris, que ce soit seul ou en combinaison avec d’autres immunothérapies, et sans effets secondaires graves. L’avantage de l’injection intraveineuse est qu’elle permet au médicament de se répartir dans tout le corps, ce qui est particulièrement utile pour cibler les organes impliqués dans l’immunité et les tumeurs qui sont difficiles à atteindre par un traitement local. L’étude vise à suivre comment ce composé se distribue dans l’organisme à l’aide d’imagerie (sur une plateforme située à 5mn à pieds du module principal de l'animalerie) et à évaluer son effet sur la réponse immunitaire à court terme. Ces tests seront réalisés sur deux types de cancers chez la souris : le cancer osseux et le cancer du pancréas.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre de comprendre ce qui se passe juste après l’injection du composé dans l’organisme : où va-t-il se concentrer ? Est-ce qu’il se dirige vers des organes spécifiques, vers la tumeur, et est-ce que cela change selon le type de tumeur (implantée dans l’os ou sous la peau) ? Les résultats de cette localisation seront comparés avec ceux obtenus dans une autre partie de l’étude qui analyse l’évolution du composé au fil du temps. L'objectif est de préparer les essais cliniques sur l’Homme qui viendront ensuite. Plus globalement, les résultats de cette étude aideront à mieux comprendre les mécanismes à cibler dans la lutte contre le cancer.

Procédures

Dans le module principal de l'animalerie : - 1 injection de cellules tumorales sous anesthésie – durée

Impact sur les animaux

• Stress dû à la manipulation des animaux. • Stress lié à la randomisation (changement de cages/congénaires) • Douleur lors des injections : o Lors de l'implantation des cellules tumorales sous la peau ou dans l'os (durée quelques minutes, 1 fois). o Lors de l’injection du traitement ou des contrôles dans la veine (durée quelques minutes, 1 fois). • Difficulté à se déplacer pour les animaux avec le modèle de tumeur dans l’os. La tumeur peut causer une boiterie au fur et à mesure de son développement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude, afin de prélever les organes pour étude.

Remplacement

Avant le passage sur modèle animal, l’efficacité de ce composé et sa formulation ont été préalablement validées au laboratoire. Des tests plus poussés doivent être réalisés sur modèle animal pour évaluer l’effet de ce composé sur un organisme entier et plus complexe. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux molécules anticancéreuses dépend fortement du système immunitaire et de ses interactions complexes. Par ailleurs, plusieurs paramètres jouant sur la diffusion du composé dans le sang et les différents organes, la mise en place de la réponse immunitaire activée par le composé, sa migration et son effet sur la tumeur nécessitent de travailler sur un organisme entier. Pour ces raisons, les études chez le modèle souris s’avèrent essentielles.

Réduction

Selon les précédentes expériences, le nombre d’animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a pu être déterminé grâce à un logiciel statistique.

Raffinement

Les souris seront observées quotidiennement en surveillant leur état général, leur comportement critères physiques, ou le moindre signe de douleur. L’altération de ces critères éventuels sera annotée sur une fiche de suivi, et comparée à une grille de score pour détecter le moindre signe de souffrance et prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Les souris seront sous anesthésie générale et un antidouleur leur sera administré avant implantations des tumeurs. Lors de l’anesthésie, les yeux seront protégés du dessèchement et la baisse de température corporelle sera palliée. Les copeaux de litières seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs. Les souris ont différents types d’enrichissement régulièrement renouvelé : maisons, tunnels, nids de cotons et paillage. Pour réduire le stress du transport : il se fera à pied, et les cages seront maintenues à l’obscurité. Une partie de la litière et de l’enrichissement sera conservé dans les nouvelles cages pour garder un environnement similaire à l’hébergement.

Choix des espèces

Les souris sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs, et permettent de constituer des groupes avec un nombre de souris suffisant, compatibles avec des résultats suffisamment représentatifs. Les souris seront utilisées entre 5 et 8 semaines. Cette tranche d’âge permet aux souris d’avoir un système immunitaire mature tout en ayant une prise tumorale optimale. Des femelles et des mâles seront utilisés afin de s’affranchir des différences d’effet du traitement qui pourraient être liés au sexe.