Rongeurs

Des cellules cancéreuses sont injectées dans la glande mammaire de souris femelles, qui reçoivent ensuite trois injections d'immunoliposomes et trois injections d'un anticorps d'immunothérapie. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leurs tissus. La tumeur est mesurée au pied à coulisse, et le porteur indique que son développement métastatique peut entraîner une altération progressive de l'état général, une perte de poids et une gêne respiratoire, moins de 5 % des souris pouvant aussi développer une nécrose partielle de la tumeur. La description des procédures place ces injections "sur animaux vigiles", alors que la description des effets indésirables les dit réalisées "sous anesthésie légère (isoflurane) pour minimiser l'inconfort".

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent dans le monde, avec environ 1,8 million de nouveaux cas par an en 2016, dont 50 000 en France. Une femme sur huit recevra un diagnostic au cours de sa vie. Bien que les avancées thérapeutiques aient amélioré la prise en charge, les rechutes restent fréquentes. Les traitements actuels, bien que plus efficaces, montrent encore des limites, en particulier chez les patients en rechute. Afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques, nous avons développé et validé des immunoliposomes. L’objectif de ce projet est d’évaluer leur efficacité dans un modèle préclinique de cancer du sein connu pour être résistant à l’immunothérapie. Nous utiliserons des souris, greffées avec une lignée cellulaire cancéreuse murine très utilisé dans la recherche préclinique et reproduisant ainsi un cancer du sein de stade IV. Les animaux recevront un traitement à base d’immunoliposomes et d’un anticorps d’immunothérapie utilisé dans le domaine clinique afin d’évaluer leur impact sur l’activation de l’immunité antitumorale et la croissance tumorale. Nous prévoyons aussi d’étudier des transplantations de cellules spécifiques que nous avons identifiées dans les ganglions drainant la tumeur des souris dans des souris receveuses. Cette étude préclinique s’inscrit dans la continuité de nos travaux précédents et vise à améliorer les approches thérapeutiques existantes pour les cancers résistants aux traitements standards.

Bénéfices attendus

Nos premiers essais sur le modèle murin de cancer du sein ont montré que l’administration d’immunoliposomes permettait une diminution significative de la croissance tumorale, voire une régression complète des tumeurs dans certains cas. Ces résultats prometteurs suggèrent un fort potentiel thérapeutique de notre approche. Dans cette nouvelle étude, nous souhaitons approfondir nos investigations afin d’évaluer l’impact des immunoliposomes sur la formation et la progression des métastases. L’objectif est de déterminer si notre traitement peut limiter efficacement la dissémination tumorale, un enjeu majeur dans la prise en charge des cancers avancés. Par ailleurs, nous comparerons l’efficacité des immunoliposomes avec celle d’une immunothérapie, actuellement utilisée en clinique. Si nos immunoliposomes s’avèrent plus efficaces ou permettent une meilleure activation du système immunitaire, ils pourraient représenter une alternative innovante aux traitements existants, réduisant potentiellement les effets secondaires liés aux immunothérapies classiques. A terme, ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients atteints de cancers du sein, en particulier ceux en rechutes ou résistants aux traitements actuels.

Procédures

L’injection des cellules cancéreuses se fera sur animaux vigiles au début des expérimentations, la durée sera de moins de 5 secondes. Une seconde injection sera effectuée au jour 40 uniquement chez les souris présentant une régression tumorale. Les injections des immunoliposomes se feront sur animaux vigiles trois fois, la durée des injections sera de moins de 5 secondes. L’injection d’un anticorps d’immunothérapie se fera trois fois sur animaux vigiles, la durée sera de moins de 5 secondes.

Impact sur les animaux

L’injection sera réalisée dans la glande mammaire (voie orthotopique) chez des souris femelles. Cette injection entraîne un stress modéré et une douleur locale. L’intervention est réalisée sous anesthésie légère (isoflurane) pour minimiser l’inconfort. Les injections par voie intra péritonéale peuvent causer un inconfort temporaire. Le risque de réactions locales ou de difficulté d’injection est limité par une manipulation soigneuse. Une surveillance post-injection est assurée. L’évolution tumorale sera suivie par la mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse. Le développement tumoral métastatique peut induire une altération progressive de l’état général, une perte de poids et une dyspnée. Lors de l’expérimentation sur la mémoire immunitaire, la première exposition tumorale pourrait avoir induit une mémoire immunitaire, limitant la croissance tumorale et entraînant une réponse inflammatoire locale et un inconfort transitoire. Parfois certaines souris (dans moins de 5% des cas) peuvent développer une nécrose partielle de la tumeur, celle-ci sera traitée par une suspension cutanée commerciale destinée au traitement protecteur des plaies.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie à l’issue des expériences afin de permettre l’analyse des effets du traitement sur les tissus et cellules d’intérêt dans différents organes.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler in vitro, sur des cellules ou des tissus. Les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testés in vitro par des méthodes alternatives. Ceci nous permet d’être sûrs que les composés qui vont être étudiés in vivo ciblent bien les cellules du système immunitaire. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche. L'efficacité thérapeutique des immunoliposomes repose sur l'implication du système immunitaire. Il est donc essentiel, à ce stade de nos recherches scientifiques, d'évaluer leur efficacité in vivo sur un organisme entier, en utilisant des modèles murins porteurs de cancers.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour le modèle du cancer du sein, nous testerons lors d’une première expérimentation, la capacité des immunoliposomes à diminuer le nombre de cellules immunitaires favorisant le développement des tumeurs. Si nous obtenons une bonne efficacité, l’effet des immunoliposomes sur le ralentissement de la croissance tumorale sera alors réalisé, dans une seconde expérimentation.

Raffinement

Pour minimiser la douleur et le stress des animaux, les protocoles expérimentaux sont soigneusement planifiés, avec des critères d’arrêt anticipé définis afin d’éviter toute souffrance excessive. Les souris sont hébergées en groupes de 5 à 10 dans des cages enrichies de structures en carton ou en plastique, leur permettant de se cacher et de se regrouper, favorisant ainsi leur bien-être. Les manipulations, y compris les injections et les mesures de la tumeur, sont réalisées par du personnel formé afin de réduire au maximum la contrainte et le stress. Pour les injections intra veineuses, les animaux sont placés sous une lampe chauffante pour faciliter la dilatation des vaisseaux, ce qui permet une manipulation plus rapide et moins invasive. La contention est limitée au strict nécessaire et ne dépasse pas trois minutes. Pour limiter le stress des injections, nous mettrons en place une habituation à ces gestes avant de les faire. Les souris sont surveillées régulièrement pour détecter tout signe de détresse, de douleur ou de souffrance excessive. Des critères stricts sont mis en place, notamment une perte de poids excessive, une altération du comportement, une détresse respiratoire ou une difficulté à se déplacer, déclenchant l'arrêt anticipé de l’expérimentation pour l’animal concerné. Afin d’assurer un suivi optimal, le personnel de l’animalerie est informé des critères d’arrêt et des signes de détresse à surveiller. Toute anomalie détectée entraîne une prise en charge immédiate, qui peut inclure un soulagement de la douleur ou l’arrêt de l’expérimentation pour l’animal. En dernier recours, une mise à mort de l’animal est réalisée.

Choix des espèces

Nous utilisons une lignée cellulaire murine établie et reconnue, injectée dans des souris immunocompétentes pour garantir une réponse immunitaire fonctionnelle. Le modèle murin femelle est indispensable pour le cancer du sein, car la tumeur se développe au site d’injection dans la glande mammaire, reproduisant ainsi la progression tumorale observée chez l’humain. Le système immunitaire des souris est similaire à celui de l’homme en termes de réponse antitumorale, rendant ce modèle pertinent pour évaluer l’efficacité des immunoliposomes et leur potentiel en thérapie anticancéreuse. Il est couramment utilisé en recherche préclinique pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules cancéreuses et l’obtention d’un système immunitaire fonctionnel.

Les deux reins de certaines souris sont privés de circulation sanguine pendant vingt-cinq minutes, sous anesthésie générale, pour provoquer une insuffisance rénale aiguë. 1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des dosages et des analyses, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent des injections de molécules toxiques pour les reins, qui peuvent entraîner prostration et perte de poids, et toutes passent des mesures de fonction rénale exigeant deux anesthésies générales successives, répétées à plusieurs jours d'intervalle. La question posée est de comprendre pourquoi deux sous-lignées issues de la même souche réagissent différemment, et le porteur y adosse un argument de coût : la dialyse et la transplantation représenteraient "un coût annuel de quatre milliards d'euros", ce qui rend selon lui "urgent et vital" de développer de nouvelles stratégies.

Objectifs

Le projet s'intéresse à deux sous-lignées de souris (appelées B6J et B6N) qui, bien qu’issues de la même souche de base, ne réagissent pas de la même façon à une insuffisance rénale aigue . Par exemple, après une interruption temporaire de la circulation sanguine dans les reins (ischémie), les souris B6J développent une insuffisance rénale aigue sévère, tandis que les B6N sont peu ou pas affectées. Pourtant, ces deux lignées ne diffèrent que par leur patrimoine génétique. Depuis 15 ans, des chercheurs ont identifié des variations génétiques entre B6J et B6N, mais aucune n’explique à elle seule cette différence de sensibilité à l’insuffisance rénale aigue. Notre objectif est de comprendre pourquoi les souris B6J et B6N ne réagissent pas de la même manière à l’insuffisance rénale aigue. En identifiant les gènes responsables, nous pourrions découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter l’insuffisance rénale aigue chez l’humain. Pour y parvenir, nous explorons trois pistes principales : 1. La sensibilité à l’insuffisance rénale aigue dépend-elle de sa cause ? Est-ce que la différence entre B6J et B6N s’observe uniquement pour les insuffisance rénale aigue causées par une ischémie, ou aussi pour d’autres causes (comme une toxicité médicamenteuse) ? 2. La sensibilité dépend-elle du fournisseur des souris ? Est-ce que cette différence entre B6J et B6N est universelle, ou est-elle liée à des souris provenant d’un éleveur spécifique ? 3. La sensibilité à l’insuffisance rénale aigue se transmet-elle aux descendants ? Si nous croisons des souris B6J (sensibles à l'insuffisance rénale) avec des B6N (résistantes), est-ce que leurs descendants héritent de cette sensibilité ? Cela nous permettrait de localiser plus précisément les gènes impliqués dans la protection ou l’aggravation de l’insuffisance rénale aigue.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet ont un impact à la fois social et médical. L’insuffisance rénale aiguë est bien plus qu’une simple défaillance passagère des reins. C’est une urgence médicale qui frappe dix à vingt pour cent des patients hospitalisés, et jusqu’à un patient sur deux en réanimation. Si, dans certains cas, les reins parviennent à retrouver une fonction normale, l’insuffisance rénale aigue laisse souvent des séquelles durables. En effet, elle multiplie le risque de développer une maladie rénale chronique, une pathologie lourde, invalidante et coûteuse à long terme. Aujourd’hui, aucune thérapie spécifique n’existe pour traiter l’insuffisance rénale aigue. Les seuls recours disponibles — la dialyse et la transplantation rénale — sont des solutions lourdes, invasives et extrêmement onéreuses. En France, ces traitements représentent un coût annuel de quatre milliards d’euros, ce qui en fait le premier poste de dépense de la Sécurité sociale. Face à ce constat, il devient urgent et vital de développer de nouvelles stratégies pour prévenir l’insuffisance rénale aigue, limiter ses conséquences et éviter son évolution vers des formes chroniques. Notre projet s’inscrit dans cette dynamique. En identifiant les mécanismes génétiques et moléculaires à l’origine de la sensibilité à l’insuffisance rénale aigue, nous espérons ouvrir la voie à de nouvelles cibles thérapeutiques. Ces avancées pourraient non seulement améliorer la prise en charge des patients, mais aussi réduire le fardeau économique que représente cette maladie pour notre système de santé.

Procédures

(1) Injections : L’induction des modèles expérimentaux nécessite 1-2 injections à l’état vigile (durée : 10 secondes). (2) Chirurgie : Une petite partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 25 minutes. Elle s'accompagne d'injections pour l'analgésie et l'anesthésie générale. Ce protocole a une durée de 40 minutes. (3) Prélèvements : Un prélèvement de sang sera réalisé sur tous les animaux, sous anesthésie générale, sur un plateau chauffant (durée 5 à 10 minutes). (4) Mesure de la fonction rénale : elle sera mesurée chez tous les animaux par une technique qui nécessite une anesthésie générale pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie générale est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent être générées par : (1) Les injections : Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et un stress lors de la contention pour la bonne administration. Une infection est possible aux points d’injection mais assez rare cependant. Certaines injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation oculaire. (2) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins sont celles associées à l’induction d'une insuffisance rénale sévère qui peut entrainer une altération de l'état général, une prostration et une perte de poids. (4) Les complications liées à la chirurgie pouvant provoquer des douleurs et des saignements (5) Les complications liées à l'anesthésie au moment de la chirurgie, de la mesure de la fonction rénale et l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique).

Devenir

Afin d’effectuer des dosages et analyses spécifiques, tous les animaux du projet (1080) seront euthanasiés à la fin des procédures par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée

Remplacement

Nous cherchons à comprendre pourquoi deux lignées de souris répondent différemment à l'induction d'une insuffisance rénale aigue. Il est donc extrêmement compliqué d'utiliser un autre modèle que la souris. Il faut également souligner que le rein est un tissu complexe, qui comporte des dizaines de types cellulaires. Les cellules inflammatoires circulantes participent également. Etant donné que nous ne savons pas encore quelles cellules sont impliquées dans la sensibilité différentielle, il est compliqué d'utiliser des modèles cellulaires, surtout qu'il n'existe pas de lignée isolée à partir des ces lignées de souris. Une fois que nous aurons identifié le ou les types cellulaires impliqués, nous pourrons utiliser des cultures de ces cellules isolées à partir des reins des deux lignées afin de disséquer plus finement les mécanismes, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux. Les organoïdes rénaux ne sont pas encore optimaux, notamment car il est encore impossible d'y réaliser une circulation sanguine. Il n'est donc pas possible d'y mesurer la fonction rénale, c'est-à-dire la fonction de filtration du sang par le rein qui est le paramètre principal dans notre étude.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle dans nos modèles d'insuffisance rénale. Des lots de 20 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Les effectifs ont été calculés à partir d’un module statistique. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants (2 lots de 10). Nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour valider les résultats. Le nombre total d'animaux est de 1080 souris.

Raffinement

Des points limites ont été définis et sont intégrés dans le processus de raffinement. (1) Raffinement hébergement et surveillance : Les animaux sont acclimateés dans l'animalerie une aà deux semaines avant le début de la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que par une pesée régulière pendant toute la durée des protocoles. Le bien-être des animaux est également assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de taille différente (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. De la nourriture humidifiée est mise à disposition des animaux dans la cage. En dehors d'une courte période limitée à deux heures pendant une mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. (2) Raffinement injections : Les injections sont réalisées avec une aiguille très fine, ce qui limite les risques hémorragique. Si plusieurs injections doivent être réalisées, le site d’injection sera alterné d’une injection à l’autre. Pour certaines injections, les souris reçoivent un collyre anesthésiant et sont placées sous anesthésie générale sur un plateau chauffant. Un gel ophtalmique est appliqué pour limiter l’irritation oculaire. Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté. (3) Raffinement Chirurgie : Pour assurer le bien-être des animaux, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur et d'une anesthésie appropriée. Les souris seront placées dans une couveuse pour faciliter la phase de réveil dans leurs cages initiales. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés. (4) Raffinement anesthésie : Pour limiter les complications liées à l’anesthésie les souris sont placées sur un plateau chauffant.

Choix des espèces

Notre laboratoire travaille depuis de nombreuses annés sur des modèles expérimentaux de maladies rénales chez la souris en raison de l'existence de très nombreuses lignées génétiquement modifiées qui permettent de tester les rôles joués par un gène donné dans ces maladies. Les protocoles expérimentaux décrits ici sont bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire. Enfin, ce projet repose sur une différence de susceptibilité à l'insuffisance rénale de deux lignées de souris. Il n'est donc pas possible d'utiliser un autre modèle. Les souris seront livrées à l'âge de 2 à 3 mois. A cet âge, elles ont atteint leur maturité sexuelle, présentent un système glomérulaire mature, ne présentent pas encore de lésions de vieillissement. De plus, à ce stade, cela permet d’éviter l'accumulation de tissu adipeux autour du pédicule vasculaire rénal, qui peut gêner l'interruption de la circulation pour le modèle d'ischémie reperfusion.

Identifiées par tatouage d'une phalange une semaine après leur arrivée, 456 souris reçoivent une injection de cellules tumorales ou une greffe de fragments de tumeur, puis vivent seules dans une cage équipée d'une roue pendant quatorze ou vingt et un jours. Elles passent cinq tests de préhension sur grille, quatre analyses de leur démarche sur un tapis filmé et trois échocardiographies sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce un affaiblissement musculaire, une baisse possible de la fonction cardiaque, une douleur modérée liée au développement de la tumeur et un stress social lié à l'hébergement seul, et qualifie le test de préhension et l'analyse de la démarche de gestes qui ne provoquent "aucune douleur". Toutes seront tuées pour prélever tumeurs, cœur et muscles, quand les retombées annoncées, des cibles contre la fonte musculaire et des molécules qui imiteraient l'exercice physique, sont situées à plus long terme.

Objectifs

Le muscle squelettique et cardiaque sont des tissus qui peuvent adapter leur taille et leur fonction à l'environnement et à la demande fonctionnelle. Ainsi, la surcharge de travail, l’activité neuronale, les hormones et la disponibilité en nutriments sont des facteurs qui influencent le fonctionnement des muscles. Comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la masse musculaire et le remodelage cardiaque est crucial pour traiter des conditions de fonte musculaire et d'insuffisance cardiaque associées au cancer et à d’autres maladies chroniques. D’un point de vue clinique, plusieurs conditions pathologiques sont caractérisées par une diminution de l’activité musculaire due à la fonte musculaire et à la fatigue. Une altération de la fonction cardiaque aboutit aussi à la détérioration de la fonction musculaire et affecte la qualité de vie des patients. En effet, il a été montré que l’activité physique décline chez les patients atteints de cancer. L’activité physique améliore le pronostic de ces patients. Ces atteintes musculaires et cardiaques associées à des maladies chroniques sont responsables de la mort de 20 pour cent de patients atteints de cancer. Ainsi, l'objectif de ce projet est de comprendre l'impact du cancer sur le muscle et le coeur au niveau fonctionnel, moléculaire et morphologique. L'effet bénéfique de l'exercice physique sera aussi évalué dans le cadre du projet.

Bénéfices attendus

Les maladies cardiovasculaires et le cancer sont les 2 principales causes de mortalité par maladie non-transmissible à travers le monde et représente un enjeux majeurs de santé. La cachexie liée au cancer est un syndrome multifactoriel caractérisé par une fonte de la masse musculaire et le remodelage cardiaque. Elle aggrave le pronostic vitale des patients atteints de cancer et est la cause directe du décès de 2 millions de patients par ans. Ainsi, la mise en évidence des mécanismes moléculaires impliqué dans la cachexie musculaire et cardiaque permettront d'identifier des cibles thérapeutiques pour contrer la cachexie et améliorer le pronostic vital de patients atteints de cancer. L'identification de facteurs secrétés par l'exercice permettront aussi de développer à plus long terme des molécules mimétiques de l'exercice physique et améliorer ainsi l'état des patients cachexique. Ces découverte pourront aussi avoir un impact pour des patients âgés souffrant de sarcopénie (fonte de la masse musculaire) et/ou atteints d'insuffisance cardiaque.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront 1-Injection de cellules sur une partie des animaux (réalisés en quelque seconde sur animaux vigiles), les animaux seront par la suite euthanasiés par une méthode réglementaire pour prélèvement de tumeurs et organes 1fois. 2- Implantation des fragments de tumeurs sur une partie des animaux (réalisés en quelques secondes sur animal anesthésié ayant reçu de l'analgésique) 1fois 3-Exercice physique volontaire en continu (animaux vigiles dans cage équipée de roue) pendant 14 et 21 jours 4- Test de préhension (Fréquence 5; Durée 2 minutes) qui consiste à mesurer la capacité de la souris à s'agripper sur une grille et de ce fait nécessite que l'animal soit éveillé. Cet examen n'est pas invasif et ne provoque donc aucune douleur chez l’animal. 4- Echocardiographie permettant d'analyser la fonction cardiaque, réalisée sous anesthésie (fréquence 3, durée 20 minutes). 5- Analyse de la démarche pour analyser la marche des souris sur un tapis équipé de caméra et senseurs pour détecter les pas et de ce fait nécessite que l'animal soit éveillé. Cet examen n'est pas invasif et ne provoque donc aucune douleur chez l’animal (Fréquence 4; Durée 2-3 minutes). 6- Prélèvement sanguin réalisé en fin de procédure sous anesthésie profonde suivi d'euthanasie par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables consistent en l'affaiblissement musculaire et une réduction modérée possible de la fonction cardiaque. L'implantation tumorale et son développement pourraient engendrer une douleur modérée avec une altération de l’état général des animaux. L'hébergement individuel pour analyser les bénéfices de l'exercice volontaire peut générer un stress social. L'anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux.

Devenir

A l'issue des expériences, l'ensemble des souris sera euthanasié par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les croissances tumorales ainsi que les différents tissus (coeur, muscles) pour procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et recueillir ainsi les donnés indispensables pour évaluer l'efficacité de l'exercice physique sur le muscle et le coeur dans le contexte de la cachexie.

Remplacement

Pour le présent projet, le choix de l’expérimentation animale se justifie par le fait qu’il n’est pas possible de reproduire en culture la fonction musculaire et cardiaque, telle qu’elle se retrouve dans l’animal entier (organisation structurale, régulations neuro-hormonale, thermorégulation, influence de la dépense énergétique globale de l’organisme, interaction cellule-matrice extracellulaire). Il n'est pas, non plus, possible actuellement de déterminer l'impact bénéfique de l'exercice physique dans des systèmes de culture cellulaire, en intégrant les signaux (facteurs, vésicules) provenant de différents tissus (muscle, foie, coeur). En parallèle à cette partie in vivo, nous mettrons en place un système de co-culture en 3D entre cellule tumorale et cellules cardiaques ou musculaires pour analyser l'impact direct des cellules tumorales sur les cellules musculaires et cardiaques. A long terme, ce système de co-culture pourrait devenir un outil fiable pour explorer le phénomène de cachexie par une approche in vitro et contribuer ainsi à remplacer ou réduire le nombre d'animaux pour étudier le phénomène de cachexie.

Réduction

Toutes les interventions sur les souris seront réalisées dans des conditions de reproductibilité maximale afin de minimiser la variabilité et donc le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de souris utilisé sera de 456. La taille des effectifs de souris par groupe a été établie grâce à un calcul de puissance. Suite à l'analyse des données, des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. L’utilisation du même matériel biologique pour 3 types d’analyse permet de diviser par trois le nombre de souris nécessaire.

Raffinement

Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. L’hébergement individuel est limité au maximum, en effet une partie des souris sera en hébergement individuel et ceci afin de récolter les données liées à l'exercice physique pour chaque souris et pouvoir déterminer de manière claire l'effet bénéfique de l'exercice. Dans ce cadre, les souris concernées par l'exercice seront hébergées en cage individuelle équipée d'une roue. Cette dernière représente un enrichissement environnemental et peut compenser le fait que chaque souris sera seule dans la cage pour la durée de l'expérience. Pour l'ensemble des souris, le milieu est enrichi avec deux enrichissements au minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. En cas de besoin (affaiblissement musculaire constaté) de la nourriture hydratée sera déposée au fond de la cage pour permettre aux souris de se nourrir plus facilement. Lors des anesthésies, les souris seront maintenues sur une plaque chauffante afin de maintenir leur température corporelle. Une administration d'analgésique sera envisagée si nécessaire. Ainsi, la douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Pour atteindre notre objectif, nous sommes amenés à utiliser des souris car aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité de la réponse intégrée de l'organisme à la cachexie. En effet, il n’est pas possible à l'heure actuelle de reproduire en culture la fonction musculaire et cardiaque, telle qu’elle se retrouve dans l’animal entier (organisation structurale, régulations neuro-hormonale, thermorégulation, influence de la dépense énergétique globale de l’organisme, interaction cellule-matrice extracellulaire). Il n'est pas, non plus, possible actuellement de détérminer l'impact bénéfique de l'exercice physique dans des systèmes de culture cellulaire, en intégrant les signaux (facteurs, vésicules) provenant de différents tissus (muscle, foie, coeur). L'utilisation de la souris est liée au fait qu'elle permet la croisssance tumorale et la cachexie qui s'en suit. Cette espèce est pértinente aussi en raison de sa propension naturelle à faire de l'exercice de manière volontaire. Les animaux utilisés auront 8 à 10 semaines d'âge en début de protocole. En effet, à partir de 2 mois, les souris sont considérées comme ayant accompli leurs croissances cardiaques. Une semaine après leur arrivée, les animaux seront identifiés (numérotés) par tatouage à une phalange spécifique pour chaque souris selon le système de codage utilisé à l'animalerie

Les souris dont le score d'évaluation reste élevé, ou qui ne se rétablissent pas malgré un score plus faible, sont mises à mort avant la fin du protocole. 120 souris hémophiles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une aiguille est introduite dans leur genou pour provoquer un saignement intra-articulaire reproduisant celui des patients, sous gaz anesthésiant et avec un analgésique administré une demi-heure avant puis les trois jours suivants, l'observation se prolongeant jusqu'à vingt-trois jours, avec deux prises de sang. Le porteur indique que l'atteinte articulaire peut rendre les déplacements difficiles, donc l'accès à la nourriture et à l'eau, et que les pattes arrière seront prélevées après la mise à mort pour observer les tissus par coupes fines.

Objectifs

L’hémophilie A et B sont des maladies avec lesquelles on naît. Elles empêchent le sang de s’arrêter facilement lorsqu’on se blesse. Normalement, le sang forme un caillot pour arrêter le saignement. Chez les personnes hémophiles, ce caillot se forme difficilement parce qu'il manque une substance dans le sang qui favorise sa formation. Les saignements durent alors plus longtemps et peuvent parfois arriver sans raison. En France, environ 7 000 personnes sont atteintes d’hémophilie, et la moitié d’entre elles ont une forme grave de la maladie. Les traitements actuels consistent surtout à remplacer la substance qui manque dans le sang. Un gros problème chez les personnes hémophiles, ce sont les saignements répétés dans les articulations, comme les genoux ou les coudes. À force, cela abîme les articulations et peut rendre les mouvements difficiles. Aujourd’hui, l’un des principaux objectifs est de prévenir les saignements dans les articulations afin de les préserver. Nous proposons une nouvelle approche : étudier une molécule qui, en temps normal, limite la coagulation du sang. En bloquant cette molécule, le sang pourrait alors former plus facilement un caillot. Chez des souris atteintes d’hémophilie, l’absence de cette molécule a permis de réduire les saignements. Nous voulons maintenant savoir si cela peut aussi protéger leurs articulations. Dans un précédent projet, nous avons suivi des souris pendant une courte période — jusqu’à 14 jours — après un saignement intra-articulaire. Nous avions constaté que les souris dépourvues de notre molécule d’intérêt semblaient mieux récupérer que celles qui la possédaient. Nous souhaitons désormais prolonger l’observation jusqu’à 23 jours afin de mieux comprendre les mécanismes de réparation de l’articulation. Nous répéterons également certaines analyses au 14e jour pour confirmer nos résultats initiaux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'établir si le ciblage de notre molécule d'interêt pour soigner l'hémophilie pourrait également permettre de diminuer les complications articulaires .

Procédures

L'intervention consiste en l'introduction d'une aiguille dans le genou pour provoquer des saignements reproduisant ceux observés chez l'homme. De plus, les souris auront des prélèvements sanguins en début (J2) et à la fin de l'expérimentation (J14 ou J23). Les souris seront endormies grace à un gaz et soulagées de la douleur grâce à un produit administré 30 min avant l'intervention. L'intervention ne prendra que quelques minutes (3 à 5 min). Le produit permettant de soulager la douleur sera aussi administré durant les 3 jours qui suivent l’intervention. De plus, cette administration sera poursuivie si l’état de l’animal le nécessite.

Impact sur les animaux

À cause des problèmes aux articulations, les animaux pourront avoir des difficultés pour se déplacer qui pourraient entrainer une difficulté pour s’alimenter et s’hydrater. Toute manipulation pourra générer un stress. Il est possible également que les animaux perdent du poids.

Devenir

À la fin de l’expérience, tous les animaux seront euthanasiés. Les pattes arrières seront ensuite prélevées et étudiées afin d’observer les tissus à l’intérieur grâce à des coupes fines et des colorations spéciales.

Remplacement

Pour comprendre le rôle de notre molécule d'interët dans les problèmes d’articulations liés à l’hémophilie, il est indispensable de faire l’étude sur un être vivant entier. Il n’est pas possible de remplacer cette étude par des expériences sur ordinateur ou sur des cellules seules, car l’articulation est un système très complexe. Grâce à notre expérience et aux études déjà publiées, nous utiliserons des souris spéciales qui sont hémophiles, avec ou sans notre molécule afin de comparer leurs articulations.

Réduction

Nous avons calculé le nombre de souris nécessaires à cette étude pour être sûrs que nos résultats soient fiables, grace à des tests statistiques.

Raffinement

Les cages des animaux seront enrichies, avec du papier doux pour qu’ils puissent faire leur nid. Pour chaque intervention,les animaux seront endormis avec un gaz et auront un médicament pour ne pas ressentir de douleur. Nous surveillerons régulièrement leur poids et leur comportement pour vérifier qu’ils vont bien (par exemple, s’ils ne restent pas isolés ou agressifs). Les animaux vivront en groupe dans un environnement enrichi pour réduire leur stress. En plus de l’observation quotidienne par le personnel, les animaux seront suivis de près après chaque intervention aux jours 2, 5, 10, 14 et 23 pour s’assurer qu’ils se rétablissent correctement. Nous observerons les animaux en nous basant sur des critères précis, comme une perte de poids ou une diminution de leur mobilité. À l’aide d’une grille d’évaluation, chaque critère sera noté afin de repérer facilement d’éventuels signes de douleur ou d’inconfort. Si de tels signes sont repérés, un médicament sera administré pour limiter la douleur. En cas d’atteinte d’un score élevé ou si pas d’amélioration de l’état général de la souris avec un score intermédiaire ou faible, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Ce modèle de souris met en évidence des anomalies comparables à celles constatées chez les patients. Les expériences seront faites sur des souris adultes, âgées de 12 à 20 semaines correspondant à l'âge adulte chez l'humain.

Une solution de chlorure de fer ou d'aluminium est appliquée sur l'artère cérébrale moyenne, au terme d'une chirurgie de la tête de quinze à vingt minutes, pour provoquer l'occlusion de l'artère et un accident vasculaire cérébral. 924 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, hébergées seules, avec cinq passages en IRM à 7 teslas jusqu'à quarante-cinq minutes et une batterie de trois tests comportementaux, non nommés, répartis sur trois semaines. Le porteur qualifie les déficits fonctionnels de "léger" à court et moyen terme et écrit que l'animal "peut aisément continuer à s'alimenter, s'abreuver et se fabriquer un nid", tout en décrivant des pertes d'équilibre, une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion, et une mise à mort par dislocation cervicale en cas de dépassement des points limites. Toutes finissent ouvertes du ventre au thorax pour une ponction cardiaque, puis tuées pour le prélèvement du cerveau.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA ainsi que de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi riches en fibrine, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les 924 animaux de cette demande d’autorisation de projet seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête pour appliquer une solution de chlorure de fer ou de chlorure d'aluminium au niveau de l’artère cérébrale moyenne (ACM) pour aboutir à l’occlusion de l’ACM. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 1 heure. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux indolores visant à tester les déficits et la récupération sensorimotrice au cours du temps, jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 10 minutes pour chacun des trois tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales au niveau du cortex somatosensoriel et prémoteur. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris arriveront au laboratoire en groupes sociaux puis seront stabulés à une par cage le temps de l’expérimentation pour éviter les conflits entre les souris et faciliter la phase de récupération post-opératoire. Au sein de chaque cage, les animaux auront accès à divers types d’enrichissements : sizzle-dri kraft, BUCHETTE EN BOIS et demi-sphère de cellulose ainsi qu’accès illimité à la nourriture et à l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine au minimum. Le jour de l’induction de l’AVC (J0), les animaux seront pesés et installés dans une armoire ventilée permettant de maintenir leur rythme nycthéméral. Pendant l’opération chirurgicale induisant l’AVC ischémique, l’animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique à base de buprénorphine administrée en s.c ENTRE 30 MINUTES ET 1 HEURE AVANT LA PREMIERE INCISION CHIRUGICALE. L’ADMINISTRATION SERA REPETEE EN FIN DE JOURNEE DE FACON A PROLONGER LA DUREE D’ACTION JUSQU’AU LENDEMAIN MATIN OU UNE TROISIEME ADMINISTRATION SERA REALISEE. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Chaque site d’incision sera précédé d’une tonte du pelage et d’une désinfection à la CHLORISEPTINE ET D’UNE INJECTION EN SOUS CUTANEE DE LUROCAINE (5mg/kg). La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée et à une couverture isothermique placée sur le dos de la souris EN CAS d’HYPOTHERMIE. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil et pendant les jours suivant l’opération chirurgicale. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites de souffrance ou de stress fixés en amont de l’étude, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs comme les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable car elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats avec ceux obtenus dans notre laboratoire et ailleurs, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de 45g. Nous effectuerons notre modèle sur des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

De quatre à douze semaines de croissance tumorale, selon les lignées de cellules cancéreuses humaines greffées : 896 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est anesthésiée au gaz pour recevoir l'injection dans le flanc, puis pesée et mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, avec un contrôle quotidien du frottement de la tumeur quand elle se développe dans la région ventrale et peut saigner ou gêner les déplacements. Le projet cherche à savoir si la surexpression, puis l'invalidation, d'une liste réduite de gènes augmente ou diminue la capacité de ces cellules à déclencher une tumeur, ce que le porteur dit ne pas pouvoir reproduire en culture cellulaire. Les xénogreffes sont pratiquées sur des souris immunodéficientes de huit semaines, et le porteur écrit que toutes vont développer des tumeurs "qui ne permettent pas la survie de l'animal après la fin du projet".

Objectifs

Ce projet vise à caractériser les cellules souches cancéreuses (CSC) mammaires afin de mieux comprendre leur nature et leurs mécanismes d'action. Les CSC jouent un rôle majeur dans l'initiation et la progression des cancers du sein. Elles sont également impliquées dans la résistance aux traitements et, par conséquent, dans les rechutes observées chez les patientes. Comparées aux autres cellules tumorales, les CSC possèdent une capacité nettement supérieure à initier une tumeur, propriété qui constitue leur principale caractéristique fonctionnelle. L'évaluation de ce potentiel tumorigène nécessite une approche expérimentale in vivo reposant sur la greffe de cellules dans des souris receveuses. Lors de travaux antérieurs, nous avons identifié une liste de gènes dont l'expression est augmentée dans une population de CSC mammaires isolées chez la souris. Cette surexpression suggère que certains de ces gènes pourraient contribuer aux propriétés biologiques des CSC, notamment à leur capacité d'initiation tumorale. L'objectif du présent projet est d'évaluer, pour un nombre limité de gènes issus de cette liste, leur implication dans le potentiel tumorigène des cellules cancéreuses. Plus précisément, nous déterminerons si la surexpression de chacun de ces gènes dans une lignée de cellules cancéreuses mammaires humaines augmente leur capacité à initier une tumeur après greffe chez une souris receveuse. À l'inverse, nous évaluerons si l'invalidation de ces mêmes gènes réduit cette capacité. L'identification de gènes capables de moduler le potentiel tumorigène des cellules cancéreuses permettra de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles et de sélectionner les gènes les plus prometteurs pour des études fonctionnelles ultérieures.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d'identifier des gènes dont l'expression est spécifique des cellules souches cancéreuses (CSC) mammaires et de déterminer leur rôle dans les propriétés biologiques de ces cellules. Les connaissances acquises permettront de mieux comprendre les mécanismes qui confèrent aux CSC leur capacité d'auto-renouvellement, leur potentiel d'initiation tumorale ainsi que leur résistance aux traitements anticancéreux. L'identification de ces gènes pourrait également conduire à la mise en évidence de nouveaux marqueurs moléculaires, notamment de marqueurs de surface permettant une meilleure identification et caractérisation des CSC. Ces gènes constituent par ailleurs des candidats susceptibles de représenter de nouvelles cibles thérapeutiques visant spécifiquement cette population cellulaire, considérée comme responsable de la persistance de la maladie et des rechutes après traitement. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de stratégies thérapeutiques plus ciblées, destinées à améliorer l'efficacité des traitements du cancer du sein en limitant la survie des CSC. Les résultats obtenus dans ce projet viendront alimenter la sélection des gènes les plus pertinents pour des études précliniques ultérieures. L'évaluation du rôle de ces gènes dans le potentiel tumorigène des cellules cancéreuses nécessite une analyse dans un organisme vivant, permettant d'étudier les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. À ce jour, cette propriété ne peut pas être reproduite de manière suffisamment fidèle par les modèles expérimentaux in vitro. Le recours au modèle murin constitue donc une étape indispensable pour établir le rôle fonctionnel de ces gènes dans les propriétés des CSC.

Procédures

Tous les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse afin de procéder à l’injection (aiguille 29G - 0,33 x 12,7 mm) des cellules tumorales au niveau de leur flanc (durée de l’anesthésie: 10 minutes). Toutes les souris seront pesées 3 fois par semaine (1 minute) et la croissance des tumeurs sera mesurée 3 fois par semaine avec un pied à coulisse (2 minutes). Le développement tumorale se déroule entre 4 et 12 semaines, selon les lignées cancéreuses humaines utilisées

Impact sur les animaux

Le type de greffe de cellules tumorales se fait par injection sous-cutanée . Les tumeurs qui se développent peuvent potentiellement gêner la mobilité des souris si la tumeur se développe dans la région ventrale. Une fois la tumeur apparue, les souris concernées seront suivies plus régulièrement que les autres et l’on vérifiera journellement que le frottement de la tumeur n’induit pas de saignement ni de gène sévère à la mobilité. Si c’est le cas, l’expérience sera arrêtée et l’animal mis à mort. Au regard de notre expérience acquise au cours de plusieurs années d'utilisation de ce type de souris, ce type de nuisance est rare, mais ne doit pas être sous-estimée.

Devenir

Toutes les souris vont développer des tumeurs qui ne permettent pas la survie de l'animal après la fin du projet.

Remplacement

À ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant de remplacer totalement l'utilisation de l'animal pour évaluer le potentiel tumorigène des cellules cancéreuses mammaires. Cette propriété correspond à la capacité des cellules à initier et développer une tumeur dans un organisme vivant. Ce type de propriété ne peut pas être reproduites de manière satisfaisante par les modèles expérimentaux in vitro. L'équipe utilise néanmoins de façon systématique des approches alternatives en culture cellulaire avant toute expérimentation animale. Les effets de la modulation des gènes étudiés sont d'abord évalués sur des cultures cellulaires afin de sélectionner uniquement les gènes présentant un phénotype d'intérêt. Les expériences de xénogreffe chez la souris ne sont réalisées qu'en dernière étape, pour valider les observations obtenues in vitro et déterminer leur impact sur le potentiel tumorigène.Cette stratégie expérimentale, développée et optimisée par l'équipe grâce à sa longue expérience des modèles de xénogreffe, permet de limiter le recours à l'animal aux seules expériences indispensables et contribue ainsi à l'application du principe de remplacement chaque fois qu'une méthode alternative est scientifiquement appropriée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé de manière à répondre aux objectifs scientifiques du projet tout en respectant le principe de réduction. Cette estimation s’appuie sur l’expertise de l’investigateur principal, sur les données de la littérature obtenues avec des modèles cellulaires et animaux similaires, ainsi que sur les résultats générés dans le cadre de notre précédent projet. L’expérience acquise au cours de ces travaux a permis d’optimiser le plan expérimental, de limiter le nombre de groupes et d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables et statistiquement exploitables.

Raffinement

Le projet sera conduit dans des conditions d’hébergement optimales afin de limiter le stress et de préserver le bien-être des animaux. Les souris seront maintenues en animalerie SOPF, dans des cages appropriées et réglementaires, avec un enrichissement adapté de leur environnement et un suivi sanitaire permanent assuré par le personnel qualifié de l’animalerie. Le développement des tumeurs sous la peau au niveau de la région mammaire sera suivi régulièrement par inspection visuelle, palpation et mesure au pied à coulisse. Les animaux seront également pesés régulièrement afin de détecter précocement toute altération de leur état général. L’expérience acquise avec ces modèles nous permet de connaître l'évolution des tumeurs, ce qui facilite l’adaptation du suivi des animaux et l’application précoce des critères d’arrêt prédéfinis. Les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée afin de détecter rapidement tout signe de douleur, de souffrance ou d’altération de l’état général, conduisant, si nécessaire, à l’interruption de l’expérience conformément aux critères d’arrêt établis. Lorsque des procédures susceptibles d’induire une douleur ou un inconfort seront réalisées, une prise en charge analgésique adaptée sera mise en œuvre conformément aux recommandations vétérinaires. Afin de réduire le stress lié aux manipulations expérimentales, les animaux seront progressivement habitués à la présence et aux manipulations de l’expérimentateur au cours des semaines précédant l’étude. Les manipulations seront réalisées préférentiellement selon une méthode non aversive (prise à l’aide d’un tunnel ou dans le creux de la main), afin de limiter le stress associé à la contention.

Choix des espèces

La souris est le modèle d’étude du potentiel tumorigène des cellules du cancer du sein. Combiné avec toutes les approches in vitro, les xénogreffes dans des souris immunodéficientes est le modèle de référence pour les cellules cancéreuses humaines. Animaux adulte âgés de 8 semaines ; c’est l’âge choisi classiquement pour des xénogreffes tumorales, pour avoir des souris jeunes adultes qui permet une bonne prise de greffe.

Tuées à des points définis du développement pour prélever leurs tissus musculaires, 72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souriceau reçoit peu après la naissance une injection dans les muscles d'une patte arrière, contenant soit du sérum salé, soit une substance qui bloque la contraction musculaire. L'atteinte annoncée est une paralysie des membres postérieurs à cinq jours de vie, dont le porteur ne précise ni la durée ni la prise en charge, tout en affirmant qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit les interactions entre contraction, attache tendineuse et maturation des tissus. Les retombées annoncées, mieux comprendre les maladies musculaires et les lésions tendineuses, sont renvoyées au conditionnel et au long terme, quand la paralysie des souriceaux est l'objet même du protocole.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment une région spécialisée du muscle, appelée jonction myotendineuse, se forme après la naissance. Cette jonction relie le muscle au tendon et assure la transmission des forces lors des mouvements. Bien que cette structure soit essentielle au fonctionnement normal du muscle, les mécanismes de son développement au début de la vie restent encore mal connus. Nos observations préliminaires montrent que des changements moléculaires importants surviennent dans cette région au cours des deux premières semaines après la naissance, période correspondant également au moment où les jeunes animaux commencent à se déplacer et à utiliser leurs muscles. Nous émettons l’hypothèse que la contraction musculaire elle-même joue un rôle clé dans le déclenchement de la formation et de la maturation de la jonction myotendineuse. Pour tester cette hypothèse, nous bloquerons temporairement la contraction musculaire chez des souris nouveau-nées et analyserons les conséquences de cette perturbation sur le développement de cette jonction, aux niveaux moléculaire et structural.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la manière dont les muscles s’adaptent aux contraintes mécaniques au cours du développement précoce. Comprendre comment la jonction myotendineuse se forme pourrait aider à expliquer pourquoi cette région est particulièrement vulnérable aux lésions et aux maladies. À plus long terme, ces résultats pourraient contribuer à une meilleure compréhension des maladies musculaires, des lésions tendineuses et des pathologies dans lesquelles les connexions muscle–tendon sont fragilisées, et ainsi orienter le développement de futures stratégies thérapeutiques.

Procédures

Les animaux recevront une unique injection intramusculaire dans les muscles du membre postérieur peu après la naissance. Cette injection contiendra soit une solution de NaCl, soit une substance permettant de bloquer transitoirement la contraction musculaire. Aucune procédure chirurgicale ne sera réalisée. Les animaux seront ensuite suivis au cours du développement normal, puis euthanasiés à des points temporels définis, afin de permettre le prélèvement des tissus pour analyse.

Impact sur les animaux

Notre expérience induira une paralysie des membres postérieurs chez des souriceaux au stade néonatal (P5).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever les tissus musculaires nécessaires aux analyses moléculaires et structurales. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants et sont indispensables à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle alternatif sans recours aux animaux ne permet de reproduire les interactions complexes entre la contraction musculaire, l’attache tendineuse et la maturation tissulaire qui se produisent au cours du développement précoce. Les systèmes de culture cellulaire in vitro ne permettent pas de générer une jonction myotendineuse fonctionnelle. Par conséquent, l’utilisation d’animaux est nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été soigneusement réduit au minimum grâce à l’optimisation du design expérimental. Les deux membres postérieurs de chaque animal sont utilisés pour différentes analyses, ce qui diminue le nombre total d’animaux nécessaires. De plus, les analyses les plus coûteuses en ressources ne sont réalisées que lorsque les résultats préliminaires justifient des investigations supplémentaires.

Raffinement

Toutes les procédures sont conçues pour minimiser la douleur et le stress. Les injections sont réalisées rapidement par du personnel formé, à l’aide d’aiguilles fines adaptées aux souriceaux. Les animaux sont étroitement surveillés afin de détecter tout signe d’inconfort ou de modification du comportement, et des points limites sont appliqués lorsque cela est nécessaire. Les conditions d’hébergement et de soins respectent les normes institutionnelles et réglementaires afin de garantir le bien-être des animaux tout au long du projet.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées dans ce projet car elles constituent un modèle bien établi pour l’étude du développement musculaire, et les analyses antérieures de l’expression génique et de la structure tissulaire ont été réalisées chez cette espèce. Cela permet une comparaison directe avec les données existantes. L’étude se concentre sur les stades postnataux précoces, car il s’agit d’une période critique au cours de laquelle la jonction myotendineuse subit une maturation rapide. Ces stades ont été sélectionnés sur la base d’observations préliminaires précises mettant en évidence d’importants changements moléculaires et structuraux durant cette fenêtre temporelle.