Rongeurs

500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour le prélèvement de leurs reins. 128 d'entre elles enchaînent l'administration d'une molécule dans l'eau de boisson, une injection suivie d'un prélèvement sanguin de trois minutes sous anesthésie locale, dix jours de récupération, sept jours de surcharge en bicarbonate et cinq jours seules dans une cage métabolique, posées sur une grille pour la collecte quotidienne de leur urine. 168 autres reçoivent une molécule activant un gène, puis une surcharge en acide ou en bicarbonate pendant sept jours. Le porteur annonce 500 souris comme un plafond et écrit qu'il est "certain que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur", sans donner d'estimation.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment des cellules rénales, régulent l’équilibre acido-basique de l’organisme. Cet équilibre est essentiel pour le bon fonctionnement des organes et des réactions biochimiques. Les reins jouent un rôle clé en ajustant la quantité d’acide ou de base excrétée dans l’urine, en réponse aux variations de l’alimentation ou du métabolisme. Nous étudierons spécifiquement le rôle d’une protéine en réponse à une surcharge de base. Des résultats préliminaires dans des cellules en culture suggèrent que cette protéine est impliquée dans la réponse des cellules du rein aux bases et plus généralement dans la régulation de l’équilibre acido-basique. Pour cela, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées, dont le gène codant pour cette protéine est inactivé. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent cet équilibre, et pourrait identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les troubles acido-basiques qui peuvent survenir dans certaines maladies rénales ou métaboliques. Le projet se déroule dans 2 animaleries distinctes.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet améliorera la compréhension des mécanismes régulant l’acidité du sang, un processus vital pour la santé. D’autre part, ils pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les désordres de l’état acido-basiques visibles chez un nombre important de patients en réanimation, chez des malades sous dialyse ayant une maladie chronique du rein. Ces prises en charge représentent un coût important pour la société en raison des hospitalisations prolongées, des traitements lourds et de la diminution de la qualité de vie des patients. À plus long terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait contribuer au développement de traitements plus efficaces, permettant de réduire les complications médicales, d’améliorer la qualité de vie des patients et de diminuer les dépenses de santé associées. Ces résultats contribueront également à la recherche fondamentale sur le fonctionnement du rein et et le maintien de l’équilibre des ions dans l’organisme.

Procédures

Nombre total d’animaux : 500 souris (adultes, mâles et femelles). Les souris seront soumises aux interventions suivantes : -> 84 souris vigiles subissent une injection (durée de l’injection quelques secondes) ainsi qu’un prélèvement de sang (30 secondes) sous anesthésie générale chimique (durée 10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 56 souris vigiles subissent un traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours, un prélèvement de sang (30 secondes) sous anesthésie générale chimique (durée 10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 64 souris transgéniques vigiles subissent l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson (5 ou 10 jours) (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 128 souris transgéniques vigiles auront l’ensemble des manipulations suivantes : (EU 2/2 ou EU 1/2) - administration d’une molécule dans l’eau de boisson pour inactiver un gène - injection d’une solution (quelques secondes) suivie d’un prélèvement sanguin (3minutes) sous anesthésie locale. - Après une récupération de 10 jours, une surcharge plus longue (7 jours) en bicarbonate est entreprise. Des mesures urinaires en cages métaboliques pendant 5 jours et prise de poids quotidienne sont réalisées. Un prélèvement sanguin (3minutes) sous anesthésie locale est ensuite réalisé à la fin de cette période. -> 168 souris transgéniques vigiles auront l’ensemble des manipulations suivantes : (EU 2/2 ou EU 1/2) - administration d’une molécule dans l’eau de boisson ou par lors d’une injection (quelques secondes) pour activer un gène. - une surcharge en acide ou bicarbonate (7 jours) sera entreprise. Toutes les souris sont mises à mort sous anesthésie générale chimique (10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2)

Impact sur les animaux

Le stress est modéré lors des prélèvements sanguins, atténué par l’utilisation d’anesthésiques locaux (collyre) ou lors d’une anesthésie générale. L’inconfort est transitoire après des prélèvements sanguins, avec surveillance post-opératoire pour détecter tout signe de souffrance (prostration, perte de poids importante). La perte de poids lors de l’habituation aux cages métaboliques est temporaire et limitée. De plus, les souris sont isolées de leurs congénères dans ces cages et placées sur une grille permettant la collecte quotidienne d’urine. La molécule permettant l’inactivation du gène ou la stimulation d’un autre gène est mélangée à une eau légèrement sucrée pour que les souris la boivent sans difficulté. La pesée des souris pour le suivi de leur poids ou avant une anesthésie n’induira qu’un stress minime. Une anesthésie générale est réalisée par du personnel expérimenté, la douleur générée est modérée au point d’injection.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de chaque procédure. Un prélèvement des tissus rénaux pour plusieurs types d’analyses est effectué pour l’ensemble des animaux de chaque procédure. Aucune réutilisation, adoption ou remplacement n’est possible, car les prélèvements nécessitent la mise à mort de l’animal. Les prélèvements de tissus (rein) et sanguins sont nécessaires pour analyser l’impact des traitements sur l’équilibre acido-basique et l’implication de la protéine que nous étudions.

Remplacement

Ce projet nécessite l'utilisation d'animaux car il est actuellement impossible de reproduire la complexité des interactions cellulaires dans le rein, ni la réponse systémique à une surcharge alcaline et à la perturbation de l’état acido-basique.

Réduction

Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 500. Ce nombre maximal a été calculé afin d’obtenir une puissance statistique suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives entre les groupes expérimentaux. Cet effectif permet également de comparer les effets chez les mâles et les femelles. Néanmoins, il est certain que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur à ce nombre maximal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions biologiques sur ces mêmes modèles et en réalisant une étude statistique de nos résultats.

Raffinement

Les 500 souris seront pesées au moment de leur arrivée à l’animalerie. Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Pour minimiser leur stress, les souris sont progressivement adaptées aux cages métaboliques pour limiter la perte de poids (pesée quotidienne). Un enrichissement de l’environnement dans ces cages limite l’inconfort des souris. Une anesthésie chimique locale est réalisée pour certains prélèvements sanguins. D’autres prélèvements sont réalisés sous anesthésie chimique générale. Une analgésie adaptée sera systématiquement mise en œuvre pour les procédures susceptibles d’entraîner de la douleur ou de l’inconfort. Des collectes d’urine non invasives seront réalisées chez un maximum de 268 souris afin de limiter le recours aux cages métaboliques, qui peuvent être source de stress pour les animaux. Selon la nature des prélèvements sanguins réalisés, une anesthésie locale ou une anesthésie générale sera utilisée. Lorsque certains traitements sont administrés dans l’eau de boisson, un agent sucrant pourra être ajouté afin d’améliorer l’acceptabilité de l’eau traitée et de maintenir une consommation normale. Lorsque les objectifs scientifiques le permettent, la perfusion des tissus sera réalisée après la mort de l’animal plutôt que sous anesthésie terminale avant le décès, afin de réduire les interventions pratiquées sur l’animal vivant.

Choix des espèces

Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier le fonctionnement du rein. Cette espèce possède un fonctionnement du rein proche de celui de l'Homme et permet d'étudier cette fonction par les mêmes techniques, tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. De plus, ce projet inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris et permettant l’inactivation d’un gène. Cette inactivation sera déclenchée à deux âges différents car l’efficacité de cette méthode peut varier selon le stade de développement de la souris. Tester deux périodes permettra de déterminer les conditions les plus adaptées pour obtenir une inactivation efficace du gène dans les cellules rénales étudiées. Nous explorerons la fonction rénale chez des souris âgées minimum de 11-12 semaines pour lesquelles le rein est complètement développé.

Opérées trente minutes pour recevoir un cathéter dans la veine jugulaire et une pompe programmable, une partie des souris est ensuite perfusée en hormone de croissance pendant cinq jours, le débit changeant toutes les trois heures. Au total 108 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 62 nouvelles souris transgéniques et 26 issues d'un autre protocole. La glycogénose est induite chez l'adulte par cinq jours d'injections, la glycémie est mesurée après section de l'extrémité de la queue, et une partie des souris est soumise pendant un mois et demi à un régime qui provoque une fibrose du foie. Le porteur indique que l'induction à l'âge adulte évite les hypoglycémies sévères "qui peuvent être fatales", et rapporte par ailleurs 1 à 2 % de décès, généralement nocturnes, liés à ces hypoglycémies. Toutes seront tuées pour prélever leur foie, leur hypophyse, leur hypothalamus et leurs testicules.

Objectifs

Modif.11/05/26] Alors que le diabète se caractérise par trop de sucre (hyperglycémies) dans le sang, la glycogénose de type 1 est une maladie métabolique rare qui entraine des hypoglycémies (baisse du sucre dans le sang) pouvant être fatales. Elle est due à des mutations génétiques qui empêchent l’organisme de produire du sucre entre les repas, pour maintenir une glycémie stable. Une prise en charge nutritionnelle est basée sur la consommation de sucres complexes comme la Maïzena et sur une prise alimentaire régulière y compris la nuit. Ces patients développent aussi un foie gras, et environ 80% de ces patients présentent des tumeurs du foie, quel que soit le sexe. Cependant, la maladie hépatique n’évolue pas vers le stade de cirrhose (fibrose importante du foie) alors que 80% des tumeurs se développent sur un foie cirrhotique chez les patients diabétiques, avec une prédominance chez les hommes. Grâce au développement d’un modèle de souris viables reproduisant fidèlement la pathologie hépatique de la glycogénose, il a été montré un défaut de sécrétion de l’hormone de croissance. Cette hormone, produite par l’hypophyse, présente une sécrétion différente selon le sexe biologique, ce qui influence son action sur le foie. Notre projet consiste à évaluer l’effet de la libération contrôlée de l’hormone de croissance chez des souris mâles atteintes de glycogénose, afin d’étudier son impact sur l’évolution de la maladie hépatique. Ceci sera réalisé grâce à une mini-pompe programmable délivrant régulièrement l’hormone dans la circulation sanguine ou par des injections quotidiennes sous-cutanées, similaires aux traitements administrés chez l’humain. Les premières observations montrent que ce traitement permet de rétablir partiellement certaines caractéristiques d’un foie sain, et ce, quel que soit le protocole de traitement utilisé. En revanche, ce traitement n’a pas agi sur les gènes liés à l’inflammation ou la fibrose. Pour aller plus loin, de nouvelles expériences ajoutées à ce projet [Modif.11/05/26] incluront des souris soumises à un régime alimentaire déséquilibré connu pour favoriser la fibrose du foie, en comparaison à un régime normal. Les objectifs sont 1) de vérifier si le traitement par injections quotidiennes reste efficace dans ces conditions et peut moduler le développement de la fibrose, et 2) observer les effets après une durée de traitement prolongée.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie hépatique associée à la glycogénose. A partir de nos données préliminaires démontrant un défaut de sécrétion de l’hormone de croissance, nous avons émis l’hypothèse que le rétablissement de sa sécrétion à des rythmes physiologiques devrait permettre de retrouver un contexte hépatique similaire à ce qui est observé chez les patients diabétiques obèses qui présentent aussi un foie gras. Dans le cadre de la glycogénose, quelques rares données suggèrent des perturbations hormonales, en particulier une diminution de la sécrétion de l’hormone de croissance. Ceci explique les retards de croissance observés chez ces patients. Notre étude devrait mettre en évidence que ces perturbations hormonales ont un impact plus large, en particulier sur la progression de la maladie hépatique. Nos résultats pourraient être importants pour la prise en charge d’autres pathologies puisque la pulsatilité de la sécrétion de l’hormone de croissance n’est jamais prise en compte dans les traitements chez l’homme. Une délivrance plus physiologique de cette hormone pourrait éviter les effets secondaires liés à son injection chronique à des doses supra-physiologiques.

Procédures

Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un petit morceau (1mm) de tissu sera prélevé à l’extrémité [Modif.11/05/26] de la pina de l’oreille pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. A l’âge de 6-8 semaines, les souris subiront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes/souris). Environ 4 mois après le développement de la glycogénose, une partie des souris subira une chirurgie afin de poser un cathéter en veine jugulaire et une pompe programmable permettant la délivrance pulsatile d’hormone de croissance. La chirurgie devrait durer au maximum 30 min. Après une période de récupération post-opératoire d’au moins 1 semaine, les souris seront perfusées soit avec une solution d’hormone de croissance, soit avec du sérum physiologique, de façon pulsatile (changement de débit toutes les 3h), pendant 5 jours. [Modif.11/05/26]: Un autre lot de souris subira 1 injection quotidienne d’hormone de croissance pendant 5 jours ou 15 jours (quelques secondes/souris). Un groupe de souris saines et un groupe de souris atteintes de glycogénose seront injectés avec du sérum physiologique et constitueront les groupes de référence (quelques secondes/souris). L’étude sera réalisée sur des animaux nourris en régime standard et sur des animaux nourris pendant 1,5 mois avec un régime connu pour induire de la fibrose au niveau du foie (stade avant le développement de la cirrhose). En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. Le prélèvement durera environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

A l’âge de 7 jours, les souris transgéniques subissent une biopsie [Modif.11/05/26] de la pina de l’oreille afin de les génotyper. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. L’induction de la glycogénose sera obtenue après une série d’injections en sous-cutané pendant 5 jours, à l’âge de 6-8 semaines, pouvant engendrer une légère douleur. L’immobilisation de la souris ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Ces souris peuvent développer des hypoglycémies sévères si elles ne s’alimentent pas régulièrement. Dans ce cas, les souris présentent un mal-être important lié à l’hypoglycémie. Actuellement, la gestion de l’élevage permet de limiter les décès liés aux hypoglycémies sévères, mais 1 à 2% de décès peuvent être rencontrés généralement durant la nuit. Les hypoglycémies peuvent être plus fréquentes lors de l’anesthésie et lors de la mise à jeun en fin de protocole. La glycémie sera mesurée à partir d’une goutte de sang obtenue après section de l’extrémité de la queue ce qui entraine de la douleur Au-delà de 15 mois de maladie, ces souris peuvent développer des tumeurs du foie. Dans ce projet, les souris seront mises à mort au plus tard 6 mois après l’induction de la maladie. Après 4 mois d’induction de la maladie, certaines souris subiront une chirurgie permettant la pose d’un cathéter en veine jugulaire et d’une pompe programmable permettant la délivrance pulsatile d’hormone de croissance. Le risque d’hémorragie lors de la chirurgie est très faible et la chirurgie est susceptible de provoquer de la douleur. [Modif.11/05/26] Un autre lot de souris subira 1 injection/jour pendant 5 ou 15 jours, ce qui peut induire une légère douleur. Le régime qui induit une fibrose du foie peut entrainer une légère perte de poids et, au-delà de 3 mois, ce régime peut avoir des effets délétères sur les fonctions du foie, entrainant un mal-être important chez la souris. L’immobilisation de la souris pour ces injections ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. La piqure entraine une légère douleur et la contention de l’animal entraine un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement du foie, de l’hypophyse, du cerveau (hypothalamus) et les testicules afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires

Remplacement

Même s’il est maintenant possible de produire des petits organes en culture qui intègrent les différents types de cellules du foie, la pathologie hépatique de la glycogénose met en jeu un dialogue complexe entre ces cellules du foie et les cellules du système immunitaires de la circulation sanguin ainsi que des régulations hormonales. Une étude préliminaire réalisée in vitro sur des cellules du foie de souris traitées avec de l’hormone de croissance de façon cyclique a permis de valider notre hypothèse de travail. Cependant, il est important maintenant de conserver la physiologie de l'organisme pour comprendre les mécanismes initiés par la pulsatilité de l’hormone de croissance sur le foie. Ce projet nécessite donc de travailler avec un modèle animal permettant de maintenir les interactions inter organes. Dans le cadre de cette étude, l’hypothalamus, l’hypophyse, les testicules, le foie et le sang seront prélevés pour étudier en détail l’ensemble des régulations à l’échelle de l’organisme

Réduction

-Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, des modèles animaux, du métabolisme et grâce aux connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 10 souris maximum, permettront de réaliser à la fois les études moléculaires et histologiques. Des tests statistiques permettront de comparer les différents groupes de souris entre eux. -Dans le but de réduire le nombre d’animaux à produire, certains animaux sont des souris déjà utilisées dans un autre protocole, sans avoir subi de procédures sévères entrainant un mal-être ou une douleur importante. [Modif.11/05/26] -Au total, ce projet réalisé sur 5 ans nécessitera au maximum 108 souris, incluant l’obtention de 62 nouvelles souris transgéniques et de 26 souris « réutilisées ».

Raffinement

-La pathologie est induite uniquement dans le foie des souris à l’âge adulte ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies sévères qui peuvent être fatales et de passer la période néonatale. -Contrôle des risques d’hypoglycémie en limitant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes dans la cage et tétines de biberon longue). En cas d’hypoglycémie, une solution de sucre (glucose) sera administrée à la souris et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle. Les animaux seront entraînés à recevoir du glucose à la pipette par voie orale avant l’induction de la maladie. -Afin de limiter la douleur, une crème anesthésiante sera appliquée sur les zones qui peuvent être douloureuses. -Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Elle sera réalisée dans des conditions d’asepsie afin d’éviter tout risque d’infection. Afin de limiter au maximum le risque d’hypothermie pendant la chirurgie, un module permettant de chauffer la boîte à induction et un tapis chauffant seront utilisés. La glycémie sera aussi contrôlée régulièrement afin d’intervenir au plus tôt pour administrer une solution de sucre. Enfin, tout le suivi post-opératoire se fera dans une pièce permettant de garder les souris à thermoneutralité. [Modif.11/05/26] Un suivi de poids mensuel, puis quotidien pendant la période post-opératoire ou bihebdomadaire lors du changement de régime permettra d’identifier une perte de poids anormale de l’animal. La durée du régime induisant une fibrose du foie sera limitée dans le temps afin de prévenir la survenue de dommages hépatiques et d’un mal-être important. La mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés a permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet.

Choix des espèces

En ce qui concerne la régulation de la glycémie, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux, comme la souris, dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle de souris transgéniques reproduit toute la pathologie humaine de la glycogénose, y compris le développement de tumeurs. Le protocole sera débuté chez des souris adultes âgées d’au minimum 6 à 8 semaines. L’induction de la glycogénose sera réalisée à l’âge adulte ce qui permet d’éviter l’apparition de retard de croissance dû à la maladie et de passer la période périnatale sans phénotype dommageable. Les perfusions [Modif.11/05/26] ou les traitements à l’hormone de croissance seront réalisés 4 mois après le développement de la glycogénose. Seule la biopsie de la pina de l’oreille [Modif.11/05/26] pour génotypage sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7 jours.

Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, donc plus exposée aux infections et maintenue sous couvercle filtrant. 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une injection de cellules tumorales dans les deux flancs, puis des molécules fluorescentes et des anesthésies répétées pour l'imagerie, avec deux tumeurs pouvant atteindre 250 mm3, des nécroses traitées au spray cicatrisant et une mise à mort déclenchée au-delà de deux millimètres de nécrose ou de 15 % de perte de poids. Toutes seront tuées pour observer la fluorescence de leurs tumeurs et de leurs organes, dans un projet où cinq souris sont prévues par molécule testée et dont le porteur annonce que ces agents pourraient "réduire le nombre d'animaux utilisés dans les expériences précliniques".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester des molécules couplées à des sondes fluorescentes permettant de détecter par imagerie de fluorescence les tumeurs. Ces agents pourront ensuite permettre le suivi de la prise tumorale chez la souris et pourront également servir pour réaliser de la chirurgie assistée par fluorescence ou délivrer des agents thérapeutiques. Dans ce projet, nous testerons la capacité de ces molécules à cibler et permettre la détection des tumeurs sous-cutanées. Il s’agit ici de faire la preuve de concept de l’utilisation de ces molécules.

Bénéfices attendus

Ce projet est la partie preuve de concept (POC) de projets de plus grandes ampleurs. Il permet de tester aussi bien la possibilité des molécules imageantes à reconnaitre leur cible que leur capacité à être imagées. L’étape suivante sera de tester les meilleurs agents dans des modèles plus proches de l’Homme avant de pouvoir envisager leur utilisation chez l’Homme. Ces agents pourront également faciliter le suivi de la progression tumorale chez les souris et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans les expériences précliniques.

Procédures

Les animaux recevront l’injection de cellules tumorales dans les deux flancs (100 µl en 30 secondes) après avoir été anesthésiés. Ils recevront également une injection de molécules imageantes (maximum 200 µl en 1 minute)

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées lors de l’injection des cellules tumorales - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs pourrait provoquer un léger stress. - La présence de deux tumeurs sur les flancs pouvant atteindre jusqu’à 250 mm3 pourrait générer une légère gêne au mouvement et donc impacter légèrement leur état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - L’injection des agents imageants (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure et les tumeurs et les organes seront alors récupérés pour visualisation de la fluorescence ex-vivo.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces molécules imageantes pour visualiser les tumeurs nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’animal et l’Homme et donc d’avoir des tumeurs. Le but est de montrer que ces agents sont capables d’aller jusqu’à la tumeur, de reconnaitre leur cible et d’être visualisable. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux porteurs de tumeurs exprimant les cibles des molécules testées. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits.

Réduction

Pour chaque molécule imageante à tester, 1 groupe de 5 souris sera constitué afin de générer un groupe avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer leurs capacités à reconnaitre la tumeur et à être imagé. L’implantation de tumeurs porteuses de la cible ou non sur le même animal permet de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant de devoir faire des expériences supplémentaires.

Raffinement

L’hébergement des souris se fera en groupe pour éviter le stress et ces souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Les différentes lignées de cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée dans le flanc de souris anesthésiées. Les animaux seront suivis tous les 2-3 jours pour vérifier leur bien-être et déterminer la progression tumorale par mesure du volume de la tumeur. En cas d’apparition de nécrose les tumeurs seront traitées avec un spray cicatrisant, si la nécrose dépasse 2 mm de diamètre ou si d’autres signes de souffrance apparaissent (ex : perte de 15% du poids de la souris), les animaux seront mis à mort. Les animaux immunodéficients étant plus sensibles aux infections, ils seront maintenus sous couvercle filtrant.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouvelles molécules imageantes utilisées en cancérologie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes ou immunodéficientes selon la cible de la molécule et donc les cellules tumorales à implanter. Les souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée de ces cellules cancéreuses. Des souris adultes d’au moins 6 semaines seront utilisées pour permettre une bonne prise tumorale et l’obtention d’un système immunitaire fonctionnel dans le cas des souris immunocompétentes

Des souriceaux nouveau-nés reçoivent une injection sous-cutanée d'antibiotique de quinze secondes, leurs mères allaitantes recevant le même produit dans l'eau de boisson. 336 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour des analyses histologiques. L'objet est fondamental, comprendre le rôle d'une molécule de guidage et de son récepteur dans la formation du réseau lymphatique de l'utérus, une demande d'autorisation ultérieure étant annoncée pour le cancer de l'endomètre. Le porteur affirme avoir déterminé par des outils statistiques le nombre d'individus qu'il juge "nécessaires", et avoir divisé cet effectif par deux en scindant les cornes utérines, sans dire ce qui conduit à 336 souris.

Objectifs

Le système lymphatique est constitué d'un réseau ouvert, unidirectionnel et à faible pression de vaisseaux lymphatiques. Il maintient le volume et la composition du liquide situé entre les cellules de l’organisme, participe à l'absorption intestinale des graisses et des vitamines alimentaires et contribue au bon fonctionnement du système immunitaire. Ces vaisseaux sont tapissés par des cellules qui délimitent l’intérieur du vaisseau et le tissu. La formation du réseau lymphatique à partir de la vascularisation préexistante est un processus hautement contrôlé appelé lymphangiogenèse. Ce mécanisme fait intervenir de nombreuses molécules, dont des molécules connues pour contrôler le développement du système nerveux. Ce projet vise à comprendre le rôle d'une de ces molécules et de son récepteur au cours de la mise en place de ce réseau lymphatique dans l’utérus. Ce projet sera réalisé à l’aide de plusieurs modèles génétiques murins permettant de moduler l’expression de gènes d’intérêt dans un tissu spécifique et à un moment donné. Ce contrôle spatio-temporel permet d’éviter les événements délétères sur les animaux. Ce projet pourrait donc permettre de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation et l’organisation des vaisseaux lymphatiques au cours du développement mais également d’ouvrir de nouvelles perspectives d’études dans des conditions pathologiques comme le cancer. En effet, le système lymphatique est impliqué dans la progression métastatique où il est une voie de dissémination pour les cellules cancéreuses, notamment dans les cas de cancer de l’endomètre.

Bénéfices attendus

Ce projet a un but exclusivement fondamental. Son objectif est de clarifier le rôle d’une molécule de guidage axonal et son récepteur dans la mise en place du réseau lymphatique de l’utérus. Si ce projet aboutit à l’identification d’une fonction pour ce couple ligand/récepteur. Nous déposerons une nouvelle demande de projet pour tester ce rôle dans un contexte tumoral (cancer de l’endomètre). En effet, le système lymphatique est connu pour être une voie de dissémination métastatique dans les cancers de l’endomètre.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, nous réaliserons uniquement des interventions sur des nouveau-nés. Nous réaliserons une injection sous-cutanée (15 secondes). Enfin, nous prélèverons les tissus post-mortem pour des analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Les nouveau-nés recevront une injection sous-cutanée d’un antibiotique afin de déclencher l’évènement génétique permettant d’étudier la fonction de nos gènes d’intérêt. Nous n’attendons pas d’effet délétère fort, mais plutôt un retard de croissance du système lymphatique. Les mère allaitantes auront également l'antibiotique dans leur eau de boisson.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure, car nous réaliserons des analyses sur tous les Animaux (histologiques).

Remplacement

La compréhension du développement du système vasculaire lymphatique ne peut être réalisée uniquement chez l’animal. En effet, l’organisation du réseau vasculaire lymphatique est hautement complexe et les mécanismes impliqués dans son développement font intervenir des interactions tissulaires. Il est impossible de récapituler in vitro l’ensemble de ces différentes caractéristiques.

Réduction

Une attention particulière sera accordée à la réduction du nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. L’analyse développementale est principalement basée sur des caractères histologiques qui seront quantifiés. Nous avons pu ainsi déterminer à l’aide d’outils statistiques le nombre d’individus nécessaires permettant d’obtenir des résultats robustes. Par ailleurs, les cornes utérines seront scindées en deux ce qui permet de diviser par 2 le nombre d’individus.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Les injections sous-cutanées seront réalisées par un expérimentateur habitué à réaliser ces gestes. Le contrôle spatial et temporel de l’évènement génétique permet de restreindre les défauts au système vasculaire lymphatique par rapport aux animaux constitutivement invalidés pour les gènes étudiés.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle qui partage 98% de son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Dans ce projet, le système lymphatique sera analysé grâce à des souris génétiquement modifiées dont l’expression des molécules candidates est perturbée. Les analyses seront réalisées à différents âges qui ont été choisis suite à une étude préliminaire qui a montré que le système lymphatique de la corne utérine se développe entre 2 jours post-natals et 21 jours post-natal (le réseau a atteint sa maturité).

192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs muscles et de leurs organes. Chacune reçoit une injection intraveineuse sous anesthésie brève, puis des molécules par voie intra-péritonéale ou orale deux à cinq fois par semaine, avec jusqu'à deux prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie. Une première série porte sur des souris adultes non malades, chez lesquelles un gène rapporteur est délivré pour repérer les molécules qui augmentent son expression, la seconde sur des lignées dystrophiques. Le porteur limite le projet aux expériences qu'il juge "absolument indispensables", et affirme que les cultures cellulaires et les organoïdes ne permettent pas d'étudier l'effet de l'âge sur un transfert de gène à l'échelle d'un "organisme entier".

Objectifs

Les myopathies des ceintures sont des maladies génétiques rares qui touchent principalement les muscles des épaules et des hanches. Elles entraînent une faiblesse musculaire progressive et une perte de mobilité. Certaines formes sont actuellement ciblées par des approches de thérapie génique, qui consistent à apporter une copie fonctionnelle d’un gène dans les cellules musculaires grâce à un vecteur viral rendu inoffensif. Notre laboratoire a observé que, chez la souris, cette approche est moins efficace à l’âge adulte qu’à un âge plus jeune. Le projet a donc pour objectif de déterminer si certains traitements pharmacologiques peuvent restaurer cette efficacité chez l’adulte, sans augmenter la dose de vecteur viral administrée. Le projet comporte deux étapes. La première vise à identifier, chez des souris adultes non malades, des molécules capables d’augmenter l’expression d’un gène rapporteur délivré par thérapie génique. La seconde étape vise à vérifier, dans des modèles murins de dystrophie musculaire, si les molécules améliorent également l’expression d’un gène thérapeutique ainsi que certains marqueurs biologiques de la maladie. L’objectif final est de mieux comprendre les limites de la thérapie génique chez l’adulte et d’identifier des pistes d’amélioration pour de futurs traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permet d’approfondir nos connaissances sur la relation entre l’efficacité des thérapies géniques et l’âge. Les approches thérapeutiques destinées aux patients atteints de LGMD-R5 et LGMD-R9 pourraient directement bénéficier des résultats générés par cette étude. Ces résultats pourraient contribuer aux perspectives d’amélioration des traitements de thérapie génique dans le cadre de ces maladies. Les résultats obtenus de ce projet permettraient de développer des stratégies pour d’autres pathologies où nous observons un phénomène similaire.

Procédures

Des injections sont réalisées par voie intraveineuse une seule fois sur la durée de l’étude, sous anesthésie de courte durée, c’est-à-dire moins de 5 minutes. D’autres injections seront faites par voie intra-péritonéale (durée d’injection : moins de 1 minute) ou per os (durée d’administration : moins de 2 minutes), sur animaux vigiles. Dans ce cas les molécules seront injectées entre 2 et 5 fois par semaine en fonction de leur demi-vie. Des prélèvements de sang seront faits pour le suivi biologique au maximum deux fois par semaine sur animaux sous anesthésie de courte durée, c’est-à-dire moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont classées légères à modérées. Certaines sont liées à la nature des différents actes réalisés : douleur de l’injection pour administration de vecteur de thérapie génique en intraveineux (classe légère) ou de molécules soit en intra-péritonéale soit par voie orale (classe modérée). Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des muscles et des organes.

Remplacement

Des approches in vitro, y compris des cultures cellulaires ou des organoïdes, peuvent être utilisées pour explorer certains mécanismes moléculaires. Toutefois, elles ne permettent pas d’étudier de façon satisfaisante l’effet de l’âge sur l’efficacité d’un transfert de gène à l’échelle d’un organisme entier, ni les interactions entre muscle, circulation sanguine et métabolisme. Le recours à l’animal reste donc nécessaire pour répondre à la question posée dans ce projet.

Réduction

Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Lorsque ce sera possible, nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes en tant que contrôles pour les différentes conditions évaluées. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Un test statistique a été utilisé pour déterminer le nombre de souris par groupe afin de garantir des résultats fiables tout en évitant l’usage excessif d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés avant le début des procédures et surveillés régulièrement pendant toute l’étude. Les procédures susceptibles d’être douloureuses ou stressantes, notamment les injections intraveineuses, sont réalisées sous anesthésie. Un gel ophtalmique est appliqué pendant les anesthésies pour éviter le dessèchement oculaire. Les prélèvements sanguins sont réalisés avec des méthodes courtes et adaptées. Des points limites cliniques sont définis pour permettre une prise en charge rapide ou une euthanasie anticipée si nécessaire. Les tissus prélevés en fin d’étude sont exploités au maximum afin d’éviter des procédures supplémentaires.

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce souris car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur cette espèce. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte (entre 1 et 2 mois) et adulte (entre 6 et 8 mois). A ces stades, nous avons observé des données robustes sur plusieurs expériences avec une bonne transduction au stade juvénile et une perte significative de l’efficacité dans les souris adultes. Sa petite taille permet de limiter les volumes biologiques requis tout en assurant une puissance statistique suffisante avec un nombre réduit d’animaux. L’utilisation de ce modèle s’inscrit pleinement dans le respect des principes des 3R, en particulier la réduction, grâce à l’optimisation des conditions expérimentales et à l’exploitation des résultats obtenu.

Gavées à trois reprises, puis anesthésiées au gaz pour recevoir une injection dans l'oreille, 124 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes mises à mort pour des coupes histologiques. Le gavage administre un analogue d'hormone qui déclenche la modification génétique visée, sur des lignées dont l'expression des molécules candidates est perturbée. Le projet est fondamental, comprendre comment une molécule et son récepteur maintiennent l'intégrité des vaisseaux lymphatiques, avec l'idée lointaine de bloquer la dissémination des métastases par cette voie. Le porteur retient la souris au motif qu'elle partage "98% de son patrimoine génétique" avec l'humain, et conduit les analyses chez l'adulte pour éprouver la fonctionnalité du réseau lymphatique.

Objectifs

Le système lymphatique est constitué d'un réseau ouvert, unidirectionnel et à faible pression de vaisseaux lymphatiques. Il maintient le volume et la composition du liquide situé entre les cellules de l’organisme, participe à l'absorption intestinale des graisses et des vitamines alimentaires et contribue au bon fonctionnement du système immunitaire. Ces vaisseaux sont tapissés par des cellules qui délimitent l’intérieur du vaisseau et le tissu. La formation du réseau lymphatique à partir de la vascularisation préexistante est un processus hautement contrôlé appelé lymphangiogenèse. Ce mécanisme fait intervenir de nombreuses molécules, dont des molécules connues pour contrôler le développement du système nerveux. Ce projet vise à comprendre le rôle d'une de ces molécules et de son récepteur dans le maintien de l’intégrité du réseau vasculaire lymphatique dans des conditions physiologiques et pathologiques (ici le cancer). Ce projet sera réalisé à l’aide de plusieurs modèles génétiques murins permettant de moduler l’expression de gènes d’intérêt. Ce projet pourrait donc permettre de mieux comprendre comment les cellules tumorales détournent la fonction du réseau vasculaire lymphatique afin de se disséminer dans tous l’organisme.

Bénéfices attendus

Ce projet a un but principalement fondamental, puisqu’il vise à mieux comprendre comment le réseau lymphatique maintient son intégrité et comment sa fonction peut être détournée dans des conditions pathologiques. À plus long terme, ce projet pourrait éventuellement permettre de développer des molécules permettant de bloquer la dissémination métastatique par la voie du réseau lymphatique.

Procédures

Les animaux seront gavés à trois reprises (15 secondes). Dans un second temps, ils recevront également une injection dans l’oreille sous anesthésie gazeuse (15 secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux seront gavé avec un analogue d’hormone afin de déclencher l’évènement génétique permettant d’étudier la fonction de nos gènes d’intérêt. Nous n’attendons pas d’effet délétère fort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure, car nous réaliserons des analyses sur tous les animaux (coupes histologiques et marquages).

Remplacement

La compréhension du développement du système vasculaire lymphatique ne peut être réalisée que chez l’animal. En effet, l’organisation du réseau vasculaire lymphatique est hautement complexe et les mécanismes impliqués dans son développement font intervenir des interactions tissulaires. Il est impossible de récapituler in vitro ces différentes caractéristiques.

Réduction

Une attention particulière sera accordée à la réduction du nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. L’analyse développementale est principalement basée sur des caractères histologiques qui seront quantifiés. Nous avons pu ainsi déterminer à l’aide d’outils statistiques le nombre d’individus nécessaires permettant d’obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Les injections sous-cutanées seront réalisées par un expérimentateur habitué à réaliser ces gestes. Le contrôle spatial et temporel de l’évènement génétique permet de restreindre les défauts au système vasculaire lymphatique par rapport aux animaux constitutivement invalidés pour les gènes étudiés.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle qui partage 98% de son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Dans ce projet, le système lymphatique sera analysé grâce à des souris génétiquement modifiées dont l’expression des molécules candidates est perturbée. Les analyses seront réalisées chez l’adulte afin de tester la fonctionnalité du réseau lymphatique.