Rongeurs
Evaluation in vivo du rôle de molécules impliquées dans l’inflammation au cours d’une maladie thrombotique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris peuvent développer des microthromboses qui altèrent leur mobilité, et leur respiration ralentit après l'induction de la maladie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes et en réaliser des coupes colorées. Le porteur écrit pourtant que les souris "ne subiront que très peu de contraintes" et résume les perturbations attendues à une douleur d'injection et à la gêne de la contention. L'objet du projet est de départager le rôle de deux molécules inflammatoires, désignées A et B, dans les lésions cardiaques d'une maladie rare, et le bénéfice annoncé se limite à envisager un traitement plus personnalisé lors des crises.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre le rôle exact de deux molécules, appelées pour simplification A et B, dans la gravité des problèmes sanguins et des lésions au cœur dans une maladie rare. Cette maladie, causée par un manque d’une protéine spécifique, provoque la formation de petits caillots dans les vaisseaux sanguins, ce qui peut bloquer la circulation et endommager des organes comme le cœur. Des recherches précédentes ont montré qu’un médicament qui bloque l’action à la fois de A et de B pouvait réduire les dommages au cœur et au cerveau dans un modèle de souris atteintes de cette maladie. Cela suggère que l’inflammation causée par A et B joue un rôle important dans les lésions observées. On sait aussi que A et B favorisent la libération de substances impliquées dans la formation des caillots et peuvent aggraver les baisses de cellules sanguines. Cependant, on ne sait pas encore précisément quel rôle joue chacune de ces deux molécules A et B. L’objectif du projet est donc de tester, chez la souris, l’efficacité de traitements qui ciblent spécifiquement A ou B ou une molécule liée l’apparition de A et B, pour prévenir les dommages dans le cœur au cours de cette maladie. À ce jour, aucune étude n’a encore permis de déterminer clairement le rôle respectif de A et de B dans cette maladie et les données de ce projet pourront permettre à termes, une thérapie plus précise pour les patients atteints de cette maladie qui souffrent souvent de complications cardio-vasculaires.
Bénéfices attendus
Si nous constatons que A ou B est impliqué préférentiellement dans cette pathologie, nous pourrons envisager un traitement plus personnalisé aux patients lorsqu’ils développent des crises de cette pathologie.
Procédures
Les animaux sont mis en cage d'inhalation pour induire une anesthésie. Ils seront soumis à de la contention et à des injections pouvant leur occasionner un stress et une douleur minime. La douleur est contrôlée par l’utilisation de gouttes analgésiques et d’injection d’analgésique si besoin, en fonction d’une grille de douleur établie préalablement et sur laquelle nous nous appuyons. Les imageries seront d'une durée maximale de 30minutes. A la fin du protocole, les animaux recoivent une anesthésie profonde et constatée et un prélèvement est réalisé afin de récupérer le sang des souris. Ces gestes durent 10 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Les perturbations anticipées pour les animaux se résument à la possibilité de ressentir de la douleur, associée à une injection et de la gêne par la contention. Les animaux peuvent également développer des microthromboses qui altèrent leur mobilité. Lors de l'induction de la pathologie, la respiration des animaux est un peu plus lente et revient en moins de 5 minute à la normale. L’imagerie et l'injection de traceurs nécessiteront une anesthésie et pourront engendrer un stress, ainsi qu'une hypothermie. Les
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, quelle qu'elle soit, afin de récupérer les organes des animaux et réaliser de l'immuno-histochimie sur ces organes, c'est à dire une coupe des organes et des colorations de ces coupes d'organes
Remplacement
La réalisation de ce projet est justifiée par l’impossibilité de les remplacer par un modèle in vitro. A ce jour, il est impossible de reproduire in vitro un vaisseau avec ce qui recouvre les vaisseaux, la totalité des cellules qui circulent dans le sang et les molécules solubles du plasma participant à l’activation des vaisseaux. L’utilisation de l’animal a pour but de reproduire des conditions physiopathologiques intégratives impossible à reproduire in vitro
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum après calcul du nombre de sujet nécessaire pour démontrer un effet des traitements. Le calcul du nombre d'animaux est défini grâce à un logiciel de statistique.
Raffinement
Les animaux ne subiront que très peu de contraintes et la douleur sera minimisée par l'utilisation d'analgésiques. Tous les gestes pratiqués sur les animaux sont réalisés sous anesthésie. Les cages seront enrichies avec du coton, un dôme et/ou un tunnel. De plus, la douleur et la souffrance seront évaluées lors des protocoles tous les jours et la souffrance évaluée par une grille permettant d'établir un score. Cette grille est précise et permet de définir la douleur de l'animal grâce à des critères établis au préalable et reconnus par les vétérinaires. Les animaux ne sont pas seuls dans les cages. Ils seront hébergés dans des cages comprenant au maximum 5 animaux du même sexe, afin d'éviter tout conflit entre eux. Ils sont hébergés avec de la nourriture et de l'eau à volonté. Les salles sont spécialement conçues dans une animalerie agréée avec une température vérifiée quotidiennement et stable, une ventilation continue, et une visite des animaux est organisée quotidiennement avant que l'expérience ne soit réalisée. Une personne est responsable du bien-être de ces animaux
Choix des espèces
Les souris constituent un modèle simple à étudier compte tenu de la taille et de sa disponibilité. Des études ont montré que ce modèle d'étude, la souris, est adapté pour étudier notre pathologie. En effet, la souris présente des similitudes génétiques avec l'homme puisque la souris partage une grande partie de ses gènes avec celui de l'homme. Cette similitude génétique permet d'étudier des processus biologiques fondamentaux et des maladies humaines chez la souris. En outre, les souris sont des animaux de laboratoire relativement petits, faciles à manipuler et à élever en grand nombre. Elle ont un cycle de vie court et l'âge de 12 semaines correspond à une souris jeune adulte. Nous choisissons cet âge étant donné que chez l'homme notre pathologie se développe plutôt chez les jeunes adultes. Nous devons donc choisir chez la souris un jeune âge également. Enfin, les précédentes études de la bibliographie justifient pleinement l'utilisation de souris pour notre pathologie, puisque c'est le modèle qui est le plus similaire à la pathologie développée chez l'homme.
Etudes des circuits neuronaux impliqués dans l’abstinence de la cocaïne.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
340 rats vont être utilisés, tous tués pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie de quarante-cinq minutes en moyenne pour l'implantation d'un dispositif d'auto-administration de cocaïne, puis entre vingt-cinq et quatre-vingt-une séances de trois heures, cent vingt d'entre eux étant en plus opérés du cerveau pendant environ une heure. Certaines séances sont associées à de brèves expériences aversives destinées à provoquer l'arrêt de la consommation, le porteur décrivant chez le rat un sevrage "extrêmement faible". Il présente le choix du rat comme "une sorte de compromis", cette espèce étant selon lui assez proche de l'humain pour constituer un "modèle animal valide" et assez éloignée "par rapport à d'autres espèces plus sensibles" sur le plan éthique.
Objectifs
Parmis les personnes développant une addiction à la cocaine, une partie significative parvient à atteindre l’abstinence. Notamment, des événements négatifs intenses (accidents, maladies) peuvent constituer des signaux clés qui font prendre conscience aux individus qu’ils sont « allés trop loin ». Cependant, l’abstinence met du temps à s’établire et la survenue d’événements négatifs est risquée. Aussi, trouver des thérapies efficaces est nécessaire. Les objectifs de ce projet sont de modéliser l’abstinence induite par des événements négatifs et d’en étudier les bases cérébrales. Nos travaux antérieurs montrent que des rats ayant une prise soutenue de cocaine arrêtent quasi-instantanément de prendre la drogue lorsqu’elle est associée à un événement négatif. Cependant, cette abstinence est de courte durée et beaucoup de rats rechutent lorsque les conséquences négatives disparaissent. Selon des témoignages et données issus de la littérature, l’apparition cyclique de conséquences négatives aurait un effet cumulatif qui pourrait conduire à l’abstinence. Aussi, notre protocole testera l’effet de l’exposition cyclique à des conséquences négatives (1 fois tous les 10 jours) sur l’abstinence volontaire. Nous prévoyons que la majorité des rats arrivera à une abstinence durable après un maximum de 5 cycles. Une certaine variabilité est cependant attendue avec des individus atteignant l’abstinence après 1, 2, 3, 4 ou 5 cycles. Aussi, nous prélèverons les cerveaux des rats dès qu’ils présenteront une abstinence durable. L’évaluation post mortem du cerveau permettra d’identifier les zones cérébrales associées à l’abstinence volontaire dans les différents sous-groupes de rats. Après avoir isolé les régions cérébrales associées à l’abstinence volontaire, nous les activerons ou désactiverons temporairement pour confirmer leur rôle causal dans ce comportement. Afin de mieux comprendre l’engagement/désengagement progressif de ces régions avec l’abstinence, les signaux cérébraux, dans ces régions, seront également mesurée en direct durant le comportement. Enfin, pour évaluer les spécificités biologiques associées à l’abstinence, les régions cérébrales clés seront prélevées chez les différentes populations de rats pour des études biologiques approfondies.
Bénéfices attendus
Ces expériences fourniront des informations uniques sur les bases neuronales de l’abstinence de la cocaine. De plus, elles mettront en lumière les spécificités neuronales et moléculaires au moment précis où les individus développent une abstinence. A moyen terme, les résultats issus de ces expériences seront très important pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques de l'addiction. En effet, ces résultats permettront d'orienter de futures études d'imagerie cérébrale chez l'humain et permettront d'affiner la compréhension des mécanismes nécessaires à la mise en place de l'abstinence.
Procédures
Etant basé sur la prise de cocaine, la totalité des animaux (n=340) sera soumise à une chirurgie permettant l'auto-administration de cocaine (45 minutes en moyenne). Les animaux seront sous anesthésie chimique et sous analgésie. De même, l'ensemble des rats sera soumis à des tests comportementaux comprenant des séances d'auto-administration de cocaine de 3 heures. Suivant les groupes et les phénotypes (rechute ou abstinence), les rats suivront entre 25 et 81 séances d'auto-administration. Certains animaux (n=120) seront égelement soumis à une chirurgie du cerveau (1 heure en moyenne). Les animaux sont sous anesthésie gazeuse et sous analgésie.
Impact sur les animaux
Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances pouvant éventuellement être attendues sont principalement celles associées aux différentes chirurgies, c'est à dire : possible risque d'inflammation ou d'infection, apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée, perte des points de suture avant cicatrisation complète. Le cas échéant, les douleurs post opératoire seront minorés par des antalgiques durant quelques jours. Afin de mener à l'abstinence, certaines séances d'auto-administration seront associées à de brèves (0,5 sec) expériences aversives légèrement stressantes, mais non douloureuse, dont l'intensité ne dépassera pas le degré modéré. Avec l'abstinence, les animaux cesseront rapidement et durablement de consommer de la cocaine induisant un sevrage. Cependant, il est à noter que comme pour la majorité des psychostimulants, la cocaine entraine un sevrage extrêmement faible chez le rat.
Devenir
A l'issu de chacune des procédure, les animaux seront mis à mort et leur cerveau sera prélevé pour des études post mortem.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (jeunes adultes, mâles et femelles). Ce recours à l’animal se justifie pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologique invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe de certains processus cérébraux dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou informatiques valides et réalistes permettant d’étudier les processus cérébraux avec un niveau de complexité suffisant ; 3) contrairement à la dépendance physique, l’addiction est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ; 4) Les espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider des mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la cocaïne mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions.
Réduction
Ce projet s'intéresse à la présence de deux sous groupe d'animaux : ceux qui s'abstiennent et ceux qui rechutent. Etant donné que tous les animaux ne montreront pas une prise stable de drogue, il faut démarrer l’expérience avec un groupe de 10 rats. En effet, pour que nos expériences soient concluantes sur le plan statistique, il faut obtenir un effectif final minimum de 6 individus dans chacun des sous groupes (abstinence et rechute). Par ailleurs, et si nécessaire, certains animaux qui ne montreront pas une prise stable de drogue mais qui montrent tous les signes de bonne santé, pourront être utilisés pour des tests chirurgicaux (optiminsation de certains paramètres). Dans ce cas, la procédure de chirurgie sera similaire en tous points à celle décrite dans ce projet. Ceci permettra, de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ce projet.
Raffinement
Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie et anesthésie chimique ou gazeuse, sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection de solution saline pour favoriser la réhydratation. Pendant une période de récupération de 7 jours les animaux sont surveillés quotidiennement pour détecter rapidement d'éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et d'y remédier rapidement. Suivant un arbre décisionnel établi, la décision de soins conservatoires sera appliquée en fonction du type et de l'intesité de l'inconfort et/ou de la douleur. Si la prise en charge ne fonctionne pas après 5 jours de traitement ou si une aggravation rapide est observée, la décision de mise à mort sera prise rapidement par le porteur du projet. Avant le début des expériences, les rats sont manipulés tous les jours et habitués aux cages expérimentales afin de limiter le stress et l’anxiété. Plusieurs critères sont pris en compte pour quantifier le niveau de souffrance de l’animal et décider de l’arrêt de la procédure/du test. Ces critères sont listés dans une grille d'observation ayant plusieurs niveau d'intervention selon le niveau de douleur (de léger à sévère). Ces manifestations éventuelles sont suivies quotidiennement par des méthodes non invasives.
Choix des espèces
Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis dans la musure où cette espèce est suffisamment proche de l’homme du point de vue de son évolution (mammifère, divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 millions d'années) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles. Les espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la cocaïne mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés sont tous de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.
Étude préclinique de tolérance d’analogues d’une bithérapie ciblant le métabolisme de la méthionine chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
Sélectionner entre quatre et huit molécules candidates parmi des analogues d'une bithérapie ciblant le métabolisme de la méthionine : 686 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque souris reçoit soit une injection unique, soit des injections quotidiennes pendant six semaines, soit un dispositif implanté sous la peau lors d'une chirurgie de quinze minutes sous anesthésie, et suit un régime alimentaire particulier qui peut lui faire perdre du poids. Les prélèvements sanguins ont lieu deux à trois fois sous anesthésie, complétés par des tests d'activité de dix à quinze minutes une à deux fois par semaine, sans que le porteur précise lesquels. Il indique qu'aucune méthode ne permet d'évaluer la sécurité et la toxicité à long terme de ces molécules sans animal, "car seule l'étude sur un organisme entier permet d'observer leurs effets sur différents tissus et fonctions".
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans la suite de travaux ayant permis de découvrir une molécule, associée à un régime alimentaire spécifique, capable de ralentir la croissance de certaines tumeurs. L’objectif est de tester des versions améliorées de cette molécule, toujours associées à ce régime, afin d’identifier entre 4 et 8 candidats finaux présentant le meilleur compromis entre efficacité et tolérance. Pour cela, la dose optimale, la manière dont ces traitements agissent dans le temps, ainsi que leurs éventuels effets indésirables seront étudiés, afin de mieux comprendre leurs effets bénéfiques et secondaires. Les résultats aideront à sélectionner le candidat le plus prometteur pour le développement de futurs traitements chez l’Homme.
Bénéfices attendus
L’objectif est de déterminer une dose adaptée et sûre d’utilisation. Si les résultats sont satisfaisants, ils permettront de poursuivre le développement de ce traitement dans des études plus avancées. À terme, ce projet pourrait contribuer à la mise au point d’une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement du cancer du pancréas chez l’Homme.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique ou des injections quotidiennes (hors week-end) pendant 6 semaines, réalisées sur animaux vigiles. Dans certains cas, un petit dispositif sera placé sous la peau lors d’une intervention chirurgicale mineure (environ 15 minutes) sous anesthésie, afin d’administrer le traitement de façon continue. Des tests simples d’activité (quelques minutes à 10–15 minutes, 1 à 2 fois par semaine) seront réalisés sur animaux vigiles. Les prélèvements sanguins (2 à 3 fois) seront effectués sous anesthésie, en plus des prélèvements réalisés en fin de procédure. Les animaux seront suivis quotidiennement et hébergés dans des conditions adaptées pour limiter le stress et l’inconfort.
Impact sur les animaux
Le régime alimentaire spécifique peut entraîner une légère perte de poids. Les animaux recevront soit des injections, soit un petit dispositif sous la peau, pouvant provoquer une gêne locale temporaire, prise en charge par des traitements contre la douleur. Les interventions sous anesthésie peuvent entraîner une sécheresse des yeux ou une baisse de température, prévenues par des mesures adaptées. Un isolement temporaire peut être nécessaire après chirurgie pour la surveillance et la protection du site opératoire. Les animaux sont suivis quotidiennement et hébergés dans des conditions adaptées afin de limiter le stress et assurer leur bien-être.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude ou plus tôt en cas d’atteinte des points limites définis dans le protocole. Certains animaux satellites pourront également être utilisés à des temps définis pour des analyses biologiques, biochimiques et anatomopathologiques. Ces derniers permettent d’évaluer l’exposition au traitement, la pharmacocinétique et la toxicité précoce, sans affecter le suivi des autres animaux de l’étude. La mise à mort sera réalisée selon des méthodes réglementaires sous anesthésie générale, afin de limiter toute douleur et stress, et permettra la réalisation de prélèvements nécessaires aux analyses scientifiques. Cette organisation permet de concilier le bien-être animal et les objectifs scientifiques de l’étude.
Remplacement
Cette étude fait suite à des travaux ayant identifié une molécule prometteuse associée à un régime alimentaire spécifique. L’objectif est maintenant de tester des molécules proches afin d’identifier celle qui est la mieux tolérée par l’organisme. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer complètement la sécurité, la toxicité et les effets secondaires à long terme de ces molécules sans utiliser l’animal, car seule l’étude sur un organisme entier permet d’observer leurs effets sur différents tissus et fonctions. Ces études sont donc nécessaires pour vérifier la sécurité globale avant un éventuel passage chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables. L’étude est réalisée de manière progressive, en commençant avec un nombre restreint d’animaux, puis en élargissant uniquement si nécessaire. Les animaux sont surveillés en continu afin de détecter rapidement tout effet indésirable et d’adapter ou arrêter l’étude si besoin. Cette organisation permet de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant des résultats fiables.
Raffinement
Toutes les mesures nécessaires seront mises en place pour limiter au maximum les effets indésirables liés aux manipulations et aux procédures expérimentales. Le bien‑être des animaux sera évalué quotidiennement afin de détecter rapidement tout signe d’inconfort. Avant toute intervention, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 jours, avec des séances de familiarisation pour les habituer progressivement au contact humain et réduire le stress. Toutes les interventions seront réalisées dans un environnement calme, par du personnel qualifié et formé, afin de limiter la durée des manipulations et les réactions de stress. La douleur ou l’inconfort sera surveillé chaque jour. En fonction du niveau de douleur observé, un traitement adapté sera administré. Si la douleur ne peut pas être soulagée ou si la situation l’exige, l’animal sera immédiatement mis à mort afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6J constituent un modèle de référence pour les études précliniques de tolérance et sont largement documentées dans la littérature. Cette souche présente un fond génétique stable et homogène, ce qui réduit la variabilité interindividuelle dans les paramètres essentiels évalués en toxicologie (poids, marqueurs biochimiques, analyses histologiques, comportement). Par ailleurs, leur utilisation étendue en pharmacologie, en toxicologie et en neurosciences offre un important historique de données comparables et reproductibles, renforçant la pertinence scientifique de leur choix pour cette étude. Les souris seront accueillies dans l’établissement utilisateur entre 6 et 8 semaines de vie et début des procédures entre 7 et 9 semaines de vie, comme décrit majoritairement dans la bibliographie.
Développement de nouveaux modèles combinant génétique et facteur environnemental pour l’étude d’une maladie métabolique du foie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Deux gavages chez la femelle gestante, cinq injections chez les nouveau-nés, un bout de queue de un à deux millimètres prélevé au septième jour pour le génotypage : 884 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes les interventions étant réalisées sur animal vigile. Les souriceaux qui développent la maladie visée présentent une jaunisse et un retard de croissance, la biopsie de queue entraînant selon le porteur une douleur modérée et passagère. L'objet déclaré est de combiner la délétion d'un gène du foie avec des molécules toxiques pour les canaux biliaires, afin d'obtenir une malformation des voies biliaires à un âge plus précoce que dans les travaux publiés. Tous les souriceaux seront tués à vingt et un jours et les adultes des croisements à la fin de la procédure, sans autre raison donnée que le fait qu'ils sont "nécessaires pour notre étude".
Objectifs
L’objectif de ce projet est l'étude de souris dans des modèles environnementaux de la malformation des voies biliaires lors du développement embryonnaire en utilisant des molécules potentiellement toxiques pour les canaux bilaires couplé à la délétion d'un gène impliqué dans le fonctionnement hépatique. Cela permettra d’étudier le développement de la maladie à des âges plus précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra le développement d’un modèle combinant la délétion génétique avec un facteur environnemental pouvant expliquer la cause de la maladie, c'est à dire des molécules pharmacologiques dans ce contexte. Il permettra également d’étudier les mécanismes métaboliques et inflammatoires menant aux symptômes précoces de la maladie et pourront être utilisés à l'avenir pour la découverte de nouveaux traitements.
Procédures
Toutes les interventions sont réalisées sur animal vigile. 5 injections de 10sec chez les nouveaux nés. 2 gavage de 30sec chez la femelle gestante. Prélèvement d'un bout de queue 1 à 2 mm le 7ème jour post natal.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances seront les injections sur les nouveaux nés et les gavages chez les femelles gestantes. Elles entrainent une douleur légère et passagère. Dans le cas où les animaux développent la maladie, les symptômes seront une jaunisse et un retard de croissance (poids moins élevés). Pour le génotypage un prélèvement d'un à deux millimètres de queue sera prélevé entre 7 jours après la naissance ce qui entraîne une douleur modérée et passagère.
Devenir
Tous les nouveaux nés seront mis à mort à 21 jours d'âge car ils sont nécessaires pour notre étude et tous les animaux adultes des croisements seront également mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Cette étude permettra de valider les mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Les cultures cellulaires ne peuvent pas complétement remplacer les études in vivo pour l'étude de la mise en place de la fibrose et l'étude du développement de l'arbre biliaire lors de l'embryogénèse.
Réduction
Dans un souci de réduction des animaux les deux sexes seront utilisés car les études précédentes n’ont pas montré de différence en fonction des sexes pour le développement de cette maladie. De multiples paramètres seront analysés pour chaque souris. Afin de vérifier que les résultats sont statistiquements significatifs des tests adaptés seront utilisés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Afin de limiter le stress des animaux seul l’expérimentateur du projet sera amené à manipuler les animaux durant la période de croissance des nouveaux nés. Les manipulations seront effectuées le plus rapidement et calmement possible. Pour les nouveaux nés l’utilisation d’une table chauffante durant les pesées permettra de limiter la perte de chaleur des animaux. Des aiguilles adaptées à la taille et au poids (volumes adaptés) de l’animal seront utilisés pour les injections. Pendant toutes les procédures une grille de score avec des points limites spécifiques ont été établis. Notamment l’expérimentateur fait un suivi journalier pour les nouveaux nés.
Choix des espèces
Le choix de la souris est lié à la conservation des mécanismes de l'homéostasie métabolique physiologiques et physiopathologiques dans le foie entre l'humain et la souris. Elle a été confirmée par de nombreuses études. En particulier, le développement de l’arbre biliaire est similaire entre espèces. Les souris néonatales (P1 à P21) pour étudier le développement du foie et de l’arbre biliaire ainsi que des souris adultes gestantes (de 6 semaines minimum).
Exploration de la toxicité retardée sur les cellules de Purkinje de produits de référence administrés par voie intra-cérébroventriculaire chez la souris pour le traitement de maladies neurologiques
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Un abord chirurgical de trente minutes sous anesthésie gazeuse pour injecter un produit directement dans les ventricules du cerveau, puis six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures sur souris vigiles, chacune maintenue en contention deux minutes. 324 souris mâles jeunes adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le produit dit positif est choisi parce qu'il détruit les cellules de Purkinje du cervelet, et le porteur écrit pourtant que les produits de référence "ne devraient pas induire de signes cliniques modérés ni marqués", les signes neuro-locomoteurs n'apparaissant selon lui que lors d'évaluations dédiées. Toutes les souris ayant reçu une injection sont tuées pour prélever leurs organes et chercher des marqueurs précoces de cette toxicité, seules celles écartées avant la chirurgie pouvant être transférées vers d'autres projets.
Objectifs
Les troubles neurologiques constituent la première cause de handicap et de morbidité mondiale, touchant plus de 3,4 milliards de personnes. Face à l'absence de traitements curatifs pour ces pathologies graves affectant le cerveau et la moelle épinière, la Recherche et Développement accélère le déploiement de thérapies innovantes, notamment les oligonucléotides antisens (ASO). Cette stratégie thérapeutique bloque la production de protéines toxiques avant l’apparition de lésions cérébrales. Le principal obstacle réside dans la difficulté pour ces thérapies de franchir la barrière hémato-encéphalique (BHE), filtre protecteur qui isole le cerveau de la circulation sanguine. Pour contourner ce problème, les médicaments sont injectés directement au niveau des lombaires entre les méninges chez l'Humain. Chez la souris, cette méthode n'est pas possible en raison de sa petite taille, et les médicaments sont administrés directement dans le cerveau par la voie intra-cérébroventriculaire dite ICV. Cependant, l’administration de certains ASOs par voie ICV chez la souris peut provoquer des effets indésirables structurels, notamment la perte de cellules de Purkinje (type de neurones du cervelet, crucial pour le contrôle moteur fin). Ces modifications anatomiques, souvent asymptomatiques au début, peuvent altérer gravement les fonctions neurologiques à terme. L’enjeu de ce projet est d’identifier des biomarqueurs précoces de cette toxicité retardée à la suite de l’injection par voie ICV de produits de référence (provoquant une perte des cellules de Purkinje) chez la souris. C’est un modèle présentant une forte homologie physiologique avec l’Humain et pour lequel cet effet indésirable a déjà été observé. Un suivi de deux semaines maximum post-injection, incluant des prélèvements biologiques à différents temps sont programmés pour effectuer des analyses approfondies. L'objectif scientifique de ce projet est donc de caractériser ces anomalies en intégrant une recherche de biomarqueurs précoces prédictifs d’une potentielle toxicité cérébrale avant même l'apparition de lésions irréversibles telles que la perte de cellules de Purkinje et l’apparition de signes cliniques. L’exploitation des résultats de ce projet pourra être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments (ASOs), dans le cadre d’un autre projet. En identifiant ces signaux d'alerte dès les phases non cliniques, cela permettra de garantir la sécurité des patients lors des futurs essais cliniques.
Bénéfices attendus
Ces études s’inscrivent dans l’optique d’accélérer la mise à disposition de thérapies innovantes pour le traitement de pathologies neurologiques et d’offrir de meilleures perspectives aux patients touchés par ces maladies. Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. A court terme il permettra la détection de biomarqueurs précoces susceptibles de prédire les effets potentiellement toxiques (anomalies cérébrales) des produits de référence. L’exploitation des résultats de ce projet pourra ensuite être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments en développement (à moyen terme) pour renforcer leur profil de sécurité dans le cadre d’un autre projet. A plus long terme, le bénéfice sera de sécuriser l’utilisation de ces thérapies chez les patients
Procédures
• injection unique du produit de référence/véhicule dans le cerveau nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie générale gazeuse et une couverture analgésique (durée de la chirurgie 30 min environ) • injection d’analgésique en pré, péri et post opératoire (maximum 2 fois par jour pendant 2 jours) et avant l’euthanasie (moins de 10 sec) • prélèvements de sang de très faibles volumes sur animal vigile : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 1 fois maximum durant l’étude, contention de 2 minutes maximum, durée du prélèvement de moins de 30 sec.
Impact sur les animaux
• injection unique du produit de référence ou du véhicule dans le cerveau nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie générale gazeuse et une couverture analgésique (durée de la chirurgie 30 min environ), la phase d’induction de l’anesthésie gazeuse peut générer un stress léger et de courte durée. La phase de réveil post-opératoire peut générer une douleur modérée • Injection de l’analgésique pré et post opératoire (maximum 2 fois par jour pendant 2 jours) et lors de l’euthanasie (moins de 10 sec) douleur légère et de courte durée à l’injection • A des prélèvements de sang de très faibles volumes sur animal vigile : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 1 fois maximum durant l’étude, contention de 2 minutes maximum, générant une douleur légère au moment de la ponction de moins de 30sec et stress lié à la contention nécessaire. - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : • Les produits de référence administrés pourraient induire une perte de cellules de Purkinje débutante (produit positif) mais ne devraient pas induire de signes cliniques modérés ni marqués. Toutefois des signes neuro-locomoteurs légers peuvent déjà être observées précocement et uniquement lors d’évaluations comportementales et neuro-locomotrices dédiées pouvant provoquer un inconfort léger pour l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un produit de référence ou d’un véhicule seront euthanasiés à l’issue de ce projet pour l’analyse de biomarqueurs et d’organes pour examen de leur structure (analyse histologique) ou analyse de l’activité des gènes (transcriptomique) et des protéines produites dans ces tissus (protéomique)selon les groupes. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les souris pour lesquelles au moins une première administration d’analgésique en préparation de la chirurgie a été réalisée et qui n’ont pas été opérées et n’ont donc pas reçu de produit de référence ou véhicule. Ce cas peut se produire dans de rares cas suite à une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre animal traité du même groupe par exemple. Ces animaux ayant déjà reçu au préalable une injection d’analgésique avant la chirurgie pourront dans ce cas être réutilisés dans d’autres projets.
Remplacement
Ce projet a pour but d’identifier des biomarqueurs précoces prédictifs d’une toxicité retardée post administration de produits de référence induisant ou non une perte de cellules de Purkinje. Cette approche permet d’identifier de potentiels marqueurs précoces de cette toxicité pouvant être observée avec les ASOs administrés dans le système nerveux. Actuellement, il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux tout comme il n’existe pas de modèle vitro suffisamment complet, pour permettre l’identification de biomarqueurs prédictifs de l’apparition d’une toxicité retardée suite à l’injection de ces produits de référence (ASOs). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et la souris est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (toxicité observée dans cette espèce, processus physiologiques très proches de l’Humain).
Réduction
Les produits de référence sont sélectionnés à l’aide de screening vitro et/ou silico et des études vivo de sécurité avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre d’animaux prévu par étude est de 9 par temps de prélèvement (3 temps envisagés au total par produit de référence/véhicule). Ce choix est dicté par la nécessité de garantir la robustesse des données face à plusieurs sources de variabilité. Par groupe, 5 animaux seront nécessaires pour les analyses biochimiques, analyse de l’activité des gènes et de la synthèse des protéines et 4 pour l'examen des tissus. Ce nombre est nécessaire pour obtenir des résultats robustes pour les analyses complexes ex vivo envisagées et permet de compenser l’hétérogénéité liée à l’injection intra-cérébroventriculaire (diffusion du produit variant d’un sujet à l’autre) et les variabilités interindividuelles. Ainsi le nombre d’échantillons produit permettra d’assurer des données exploitables lors des analyses en laboratoire. Cette approche permettra de détecter avec certitude des signaux d'alerte (biomarqueurs) qui prédisent une toxicité retardée, garantissant ainsi la robustesse de nos conclusions. C’est une approche efficace afin d’atteindre les objectifs de la procédure, générer des données consolidées pour les études ultérieures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint possible. Le choix de ce nombre est basé sur la littérature et sur l’expérience interne (chaque équipe effectuant les analyses ex vivo ayant une bonne connaissance de la variabilité observée chez la souris et spécifique à son type d’analyse). Les études de ce projet permettent la mesure de nombreux paramètres sur un même animal, grâce à différents examens cliniques et paracliniques peu invasifs (observations cliniques, poids) ou terminaux (prélèvement d’organes…) et des cinétiques complètes sur un même animal. Le design expérimental de ce projet est optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus, la sélection préalable des produits de référence qui seront utilisés dans ces études (produit positif induisant des anomalies cérébrales, produite négatif ne présentant pas de toxicité retardée) permet d’explorer dans les meilleures conditions les biomarqueurs prédictifs de toxicité.
Raffinement
Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Le jour de la chirurgie, l’ensemble des animaux sera suivi grâce à une grille de scoring comportemental effectué 1h/3h et 24h (si applicable) post-opératoire. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, une prescription de soins ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base sur le score d’une grille éthique de points limites spécifique à l’espèce étudiée et au projet, mise en place dès l’apparition de signes cliniques marqués. L’utilisation des produits de référence dans ce projet ne devrait pas induire de signes cliniques modérés ni marqués sur la durée de l’étude. Cependant, des signes légers ont déjà pu être observés précocement avec ces produits de référence lors des évaluations hebdomadaires comportementales et neuro-locomotrices dédiées. Par mesure de précaution, la grille éthique dédiée à ce projet pourra être utilisée si jugée nécessaire. L’administration par voie ICV est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire. Les administrations ICV se font de manière séquentielle afin de s’assurer du bon déroulement de la chirurgie et de ne pas inclure l’ensemble des animaux dans la procédure si des signes cliniques venaient à survenir, bien que les produits de référence soient injectés à une dose précédemment évaluée et ne devant pas induire de signes cliniques. Les animaux sont régulièrement manipulés par l’ensemble du personnel technique formé pour permettre un renforcement positif afin de générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Tous les animaux sont hébergés dans des conditions strictes de confinement avec à disposition un enrichissement spécifique (tunnel, éléments de nidification) et manipulés par du personnel formé au bien-être animal. Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Ce projet est réalisé chez la souris car : - La souris présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Humain et ainsi une forte valeur translationnelle. - La perte des cellules de Purkinje, qui constitue une toxicité potentielle liée à l’administration d’ASOs dans le système nerveux, a été observée dans cette espèce (et dans l’espèce Primate également) et doit être investiguée afin d’éviter que cet effet indésirable ne survienne chez l’humain en clinique. Les souris utilisées sont des jeunes adultes mâles et correspondent au sexe et à l’âge des animaux utilisés chez lesquels cette toxicité retardée a été observée avec les produits de référence.
Evaluation de la fibrose hépatique par IRM in vivo sur un modèle de souris développant une surcharge ferrique EU1/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
À partir de huit semaines, 30 souris, dont douze nourries d'une alimentation enrichie en fer, sont suivies pendant environ douze mois et pesées toutes les deux semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit cinq examens d'IRM sous anesthésie gazeuse, de deux heures au maximum, précédés d'un jeûne d'une heure, avec un risque d'hypothermie, de sécheresse oculaire et, exceptionnellement, de décès sous anesthésie. Le porteur écrit qu'un passage en clinique exige des preuves obtenues in vivo "sur un modèle animal pertinent tel que la souris". Huit souris seront tuées en cours d'étude pour prélever leur foie, leur cœur, leurs reins et leur rate, les deux couples reproducteurs après quinze mois, et le sort des vingt-deux dernières, âgées de quatorze mois, reste suspendu à un avis vétérinaire, entre maintien en vie et mise à mort.
Objectifs
La surcharge en fer correspond à une accumulation excessive de fer dans l’organisme pouvant avoir différentes origines. Son importance dépend de la cause sous-jacente et de la durée d’évolution sans traitement. Souvent peu symptomatique au début, elle est généralement diagnostiquée tardivement. Le foie est l’un des premiers organes touchés. L’excès de fer peut entraîner des lésions hépatiques progressives, notamment une fibrose hépatique, caractérisée par une accumulation anormale de tissu cicatriciel. L’évaluation de cette fibrose est essentielle pour suivre l’évolution de la maladie et adapter la prise en charge des patients. La biopsie hépatique constitue actuellement l’examen de référence pour évaluer la fibrose. Cependant, elle est invasive, douloureuse et peut souffrir d’un biais d’échantillonnage, le prélèvement n’étant pas toujours représentatif de l’ensemble du foie. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet d’obtenir des informations anatomiques, structurelles, fonctionnelles et biomécaniques sur les tissus. Parmi les techniques disponibles, l’élastographie par résonance magnétique (ERM) fournit une cartographie non invasive de la rigidité hépatique, paramètre étroitement lié au degré de fibrose. Toutefois, la présence d’une forte concentration de fer dans le foie constitue une limite importante de cette technique. Le taux d’échec de l’ERM augmente avec la quantité de fer présente, rendant difficile, voire impossible, l’évaluation de la fibrose chez les patients souffrant de surcharge ferrique. L’objectif de ce projet est de valider une méthode d’imagerie alternative (ERM-alt), développée au sein du laboratoire, permettant d’évaluer la fibrose hépatique même en présence de fer. La faisabilité de cette approche a déjà été démontrée sur des objets tests puis in vivo chez des souris saines. Il est désormais nécessaire de la valider chez des souris présentant différents niveaux de surcharge ferrique afin de confirmer sa robustesse et d’envisager son transfert vers la clinique. Ce projet porte ainsi sur la validation expérimentale d’une méthode innovante destinée à améliorer le diagnostic non invasif de la fibrose hépatique chez les patients atteints de surcharge en fer.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche translationnelle permettra : 1. De comparer les teneurs en fera quantité de fer dans le foie hépatique mesurées par IRM avec les valeurs histologiques (technique de référence) sur des cohortes de souris malades. 2. De comparer laes rigidité du foies hépatiques mesurées par IRM avec les stadifications stade de fibrose hépatiqueréalisées par obtenue par analyse histologiquee sur des cohortes de souris malades. 3. De déterminer les seuils de fer hépatique compatibles avec les techniques IRM et dDe montrer que la technique IRM (ERM-alt) développée au laboratoire permet de surmonter les problèmes limitations de la méthode classiquesoulevés par la présence importante de fer. Les résultats positifs sur souris serviront alors de base pour une étude clinique chez l’humain sur sujets sains dans un premier temps puis sur patients souffrant de surcharge ferrique. La méthode proposée sera et ainsi offrir clé pour pouvoir faire une solution non-invasive pour stadifier la stadification non-invasive de la fibrose hépatique chez ces patients, ce qui n’est pas possible aujourd’hui évitant ainsi une biopsie du foie.
Procédures
Un groupe recevra une alimentation enrichie en fer pendant environ 12 mois, tandis que l’autre groupe suivra une alimentation standard. À partir de l’âge de 8 semaines, les souris seront suivies pendant environ 12 mois. Elles seront pesées toutes les deux semaines afin de vérifier leur état de santé et le bon suivi du régime alimentaire. Les animaux seront soumis à 5 examens. Chaque examen durera au maximum 2 heures et sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. Avant chaque examen d’IRM, les animaux seront soumis à un jeûne d’environ 1 heure afin de standardiser les conditions d’imagerie.
Impact sur les animaux
Certaines souris auront une modification génétique entraînant une accumulation progressive de fer dans l’organisme. Un groupe de 12 souris recevra une alimentation enrichie en fer afin d’augmenter cette accumulation au niveau du foie, ce qui devrait entraîner des modifications modérées de la rigidité du foie correspondant à un stade précoce de fibrose. Le retour à une alimentation standard devrait permettre une réduction du niveau de fer hépatique et une régression de la fibrose. Les animaux seront âgés de 14 mois à la fin du projet, ce qui pourrait induire des problèmes de santé liés simplement à la vieillesse. Pendant le transport entre l’établissement hébergeur et le laboratoire les animaux peuvent subir un stress temporaire. Pendant l’anesthésie et l’examen d’IRM, les animaux peuvent présenter une baisse de la température corporelle et une sécheresse oculaire. Les examens seront répétés plusieurs fois au cours de l’étude, ce qui peut entraîner un stress modéré supplémentaire lié aux manipulations répétées. Comme pour toute procédure réalisée sous anesthésie, un risque très faible de décès pendant l’examen existe, bien que cela reste exceptionnel au regard de notre précédente expérience d’imagerie chez des souris saines.
Devenir
Huit animaux seront euthanasiés au cours de l’étude afin de prélever certains organes (foie, cœur, reins et rate) nécessaires à la réalisation d’analyses histologiques permettant d’évaluer l’accumulation de fer et les lésions hépatiques. Les deux couples reproducteurs utilisés pour la constitution de la colonie seront également euthanasiés à l’issue de la période de reproduction, soit environ 15 mois après le début du projet. Les 22 autres animaux (8 du groupe 1, 8 du groupe 2 et 6 du groupe 3) auront environ 14 mois à la fin de l’étude. Leur devenir sera évalué en concertation avec la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire référent de l’établissement. En fonction de leur état de santé et de leur âge, ils pourront soit être maintenus en vie pour d’éventuels projets compatibles, soit être euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur.
Remplacement
De plus, pour pouvoir passer à une étude clinique, il est demandé des preuves de l’applicabilité de la méthode IRM développée (ERM-alt) in vivo sur un modèle animal pertinent tel que la souris.La fibrose hépatique est une maladie complexe qui se développe sur plusieurs années. Elle implique des interactions entre différentes cellules et une organisation très précise du tissu hépatique. Aujourd’hui, avec les technologies disponibles (comme les cultures de cellules ou les organoïdes en laboratoire), il est impossible de reproduire fidèlement tous ces mécanismes. Comme cette étude vise à valider une nouvelle méthode d’imagerie médicale par IRM pour évaluer la fibrose du foie, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, comme la souris, car ils permettent de reproduire les processus biologiques réels de la maladie. Enfin, avant de tester cette méthode sur l’humain, il faut d’abord prouver son efficacité et sa faisabilité in vivo, ce qui n’est possible qu’avec des modèles animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum au maximum pour chaque groupe sans compromettre l'interprétation des résultats suite à une analyse robuste des résultats par des tests statistiques non paramétriquespour garantir des résultats fiables en termes de significativité statistique. Cette estimation tient compte des prélèvements d’organes réalisés à des fins depour les biopsies et d’une éventuelle mortalité au cours du protocole. Cela permet de garantir que les objectifs scientifiques pourront être atteints sans avoir recours à des animaux supplémentaires ni d’interrompre l’étude en cours faute d’animaux en nombre suffisant. Le groupe contrôle (G3) est également constitué du stricte minimum (3 mâles et 3 femelles) permettant de comparer les résultats entre les groupes tout en respectant les différences liées au sexe.d’avoir des résultats comparatifs avec les groupes 1 et 2 en fonction du sexe. Enfin, pour éviter d’utiliser davantage d’animaux, les mêmes animaux seront suivis au cours du temps. Cela permet de suivre l’évolution de la maladie, sans avoir besoin d’une quantité élevée d’animaux.
Raffinement
Les souris du groupe 1 auront une alimentation riche en fer pour qu’elles développent une surcharge de fer dans le foie. Cette solution permet d’obtenir le modèle expérimental sans nécessité d’acte invasif. Les examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse par isoflurane) et pourront durer jusqu’à 2 heures. Une goutte d’Ocrygel sera instillée dans chaque œil juste après l’installation de l’animal sur le lit IRM afin de limiter le dessèchement oculaire. Une couverture chauffante sera utilisée pour maintenir la température de l’animal tout le long de l’examen. Cette température ainsi que la respiration de la souris seront suivies pendant toute la durée de l’examen. L'apport en isoflurane sera couplé à un concentrateur d'oxygène pour favoriser la respiration de l'animal et sa récupération au réveil. En fin de procédure, si l'animal a été anesthésié plus de 2 heures, il recevra une injection sous cutanée de 0,5mL de sérum glucosé chauffé à température corporelle pour recevoir une réhydratation rapide et éviter une possible hypoglycémie. La phase de réveil se fera en isolement dans une cage à part, l’animal sera déposé sur un tapis chauffant évitant une hypothermie. Des points limites prédictifs et spécifiques de ce projet ont été établis afin d'anticiper tout effet dommageable sur les animaux, avec une surveillance adaptée à chaque étape de la procédure jusqu’à la mise à mort des animaux en fin de procédure.
Choix des espèces
Les modèles de souris restent accessiblessont et compatibles bien adaptées à une analyse surpour la recherche dans le domaine de l l’imagerie’IRM préclinique, notamment en IRM, à haut champ magnétique de 7T (plusieurs papiers références) . Les techniques IRM mise en œuvre dans cette demande de projet sont couramment pratiquées au sein du laboratoire sur des souris saines. La proximité génétique entre les souris et l’homme permet d’étudier des mécanismes biologiques comparables. L’utilisation de souris génétiquement modifiées déficientes en hepcidine1 permettra de se rapprocher au mieux des modifications physiopathologiques observées chez l’homme dans le cadre de pathologies caractérisées par une accumulation excessive de fer dans le foie (hémochromatose) pouvant mener à la formation de tissus cicatriciel au niveau du foie (fibrose hépatique). car elles présentent des similitudes biologiques avec l’homme, ce qui permet d’étudier des maladies du foie proches de celles observées chez les patients, notamment l’accumulation excessive de fer (hémochromatose) et le développement d’une fibrose hépatique Les souris des trois groupes suivront le protocole d’imagerie IRM à partir de 8 semaines afin de s’assurer que le système immunitaire soit mature et que le foie ait également atteint une rigidité stabiliséeLes examens d’IRM commenceront lorsque les souris auront 8 semaines. À cet âge, leur organisme est suffisamment développé et le foie a atteint un état stable (démontrée lors d’une étude antérieure sur une petite cohorte). Pour le groupe recevant une alimentation riche en fer, ce régime débutera également à partir de la 8ᵉ semaine afin de coïncider avec le début du suivi par IRM. Le suivi par imagerie durera 12 mois afin d’observer progressivement différents niveaux d’accumulation de fer dans le foie selon les groupes étudiés, ainsi que les premiers stades de fibrose hépatique, sans provoquer d’atteintes sévères chez les animaux.
Étude chez la souris de l’influence conjointe des variants du gène de l’apolipoprotéine E, du sexe et d’une alimentation riche en graisses sur des changements biologiques liés à la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois tests comportementaux répétés deux fois, un prélèvement sanguin précédé d'un jeûne de trois heures et huit pesées hebdomadaires : 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs structures cérébrales. Une partie d'entre elles reçoit un régime riche en graisses, avec une prise de poids attendue sous les 30 %, pour observer comment l'alimentation et les variants du gène de l'apolipoprotéine E modifient les membranes des cellules du cerveau. Le porteur affirme que l'étude de l'impact des régimes alimentaires sur le cerveau ne peut s'effectuer que sur un "organisme entier" et écrit que cette étude in vivo est "indispensable et irremplaçable". Il annonce trois tests comportementaux qu'il décrit comme indolores, sans préciser lesquels, tout en signalant un stress de manipulation lors de deux d'entre eux.
Objectifs
Les cellules de notre cerveau sont entourées d’une membrane composée de graisses nécessaires pour leur permettre de fonctionner correctement. Mais avec l'âge, sous l’influence d’une mauvaise alimentation ou de certains gènes, la composition en graisses des membranes devient déséquilibrée, occasionnant des dommages pouvant déclencher (bien avant l'apparition des premiers symptômes) une cascade de problèmes et d’anomalies menant à la mort des neurones et à la maladie d’Alzheimer (MA). Notre projet veut élucider, chez les individus de sexe masculin ou féminin, comment l’alimentation riche en graisses et certains gènes (dont un qui est un facteur de risque majeur) perturbent le fonctionnement des cellules nerveuses et favorisent la production de produits hautement neurotoxiques capables d’initier les lésions cérébrales liées à la MA. Notre objectif est de comprendre comment un régime alimentaire trop gras peut perturber les membranes des cellules du cerveau et favoriser les troubles liés à la MA, dans le but ultime de proposer de nouvelles stratégies de prévention.
Bénéfices attendus
Ce projet doit créer des modèles fiables pour étudier l’influence de la génétique, de régimes gras et du sexe sur l’apparition de la maladie d’Alzheimer, dans le but de découvrir des marqueurs biologiques pour identifier les personnes à risque et leur proposer une prévention appropriée.
Procédures
1. Tests comportementaux indolores (3, réalisés 2 fois), d’une durée de 10 à 15 minutes par test 2. Prélèvement unique d’un très faible volume sanguin, d’une durée inférieure à 30 sec 3. Mesure du poids corporel (hebdomadaire sur 8 semaines), d’une durée maximale de 1 min par pesée
Impact sur les animaux
- Stress légers de manipulation et de situation induits lors de deux des trois tests comportementaux - Un jeûne de 3 h préalable au prélèvement sanguin - Stress léger de manipulation lors de la pesée hebdomadaire - Une prise de poids (attendue à moins de 30 %) des animaux sous régime gras
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie à l’issue de l'étude afin de prélever le sang et les structures cérébrales requises pour l’analyse des marqueurs biologiques d’intérêt.
Remplacement
L'étude de l’impact de régimes alimentaires sur le cerveau ne peut s'effectuer que sur un organisme entier. Cette étude in vivo est indispensable et irremplaçable, mais elle s'appuie sur une étude préalable menée sur des cellules en culture et dont les résultats permettent de limiter au strict minimum le nombre d’expérimentations animales.
Réduction
Nous avons minimisé les effectifs de souris en nous appuyant sur l’expérience cumulée par l’équipe lors de diverses études conduites lors des 15 dernières années. Les simulations opérées pour réduire les effectifs au strict nécessaire recommandent un minimum de 9 souris par groupe expérimental, sachant qu’il est indispensable d’évaluer l’impact du sexe. À ceux-ci s’ajoutent 5 animaux par groupe pour les études des tissus cérébraux et 4 animaux par groupe pour l’étude des lipides cérébraux à la moitié du régime.
Raffinement
Toutes les étapes du protocole seront assurées par des expérimentateurs qualifiés et en parfaite maîtrise des gestes techniques et dans le respect scrupuleux des réglementations en vigueur. Les animaux seront hébergés dans des espaces conçus pour minimiser le stress. Ils seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur état de santé et détecter d’éventuels signes de détresse (par exemple la posture, l’activité et le poids). Tous les prélèvements seront menés sous anesthésie et les tests sont courts et sans douleur.
Choix des espèces
Ce projet utilise des souris adultes mâles et femelles, couramment utilisées pour la sensibilité aux régimes gras qui en fait de bons modèles afin d’étudier comment la génétique et l’alimentation peuvent augmenter le risque de maladie d'Alzheimer.
Immunotherapie intranasale pour le traitement de l’allergie alimentaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Deux injections à une semaine d'intervalle sur souris vigiles pour installer une allergie à l'ovalbumine, puis jusqu'à cinq administrations orales, jusqu'à six administrations intranasales sous anesthésie générale et jusqu'à trois prises de sang. 930 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les réactions allergiques provoquées comprennent des diarrhées, une baisse de la température corporelle et une perte de poids, plus rarement des difficultés respiratoires et des signes de choc anaphylactique, et que la température et les diarrhées servent de points limites déclenchant la mise à mort. Toutes sont tuées pour récupérer la rate, les ganglions, le tissu nasal et l'intestin.
Objectifs
Les allergies alimentaires touchent 6 à 8 % des enfants et 2 à 4 % des adultes. Elles se caractérisent par des symptômes gastro-intestinaux, cutanés, respiratoires et cardiovasculaires, pouvant conduire à un choc anaphylactique. Si l’absence stricte et contraignante de l'aliment incriminé est la première approche utilisée, l'immunothérapie spécifique de l'allergène gagne en intérêt, mais se heurte toujours à un manque de protection durable et à des effets secondaires sévères. Utilisant le modèle de l’allergie alimentaire à l’ovalbumine, la principale protéine du blanc d'œuf, le projet vise à évaluer l’effet thérapeutique d’un traitement intranasal par une ovalbumine modifiée pour désensibiliser l'organisme et réduire les réactions allergiques. Pour ce projet, une allergie alimentaire à l’ovalbumine sera induite chez la souris selon un protocole défini mimant ce qui se passe chez l’homme. Puis, l’effet d’un traitement avec de l’ovalbumine modifiée administrée par voie intranasale sera analysé.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de démontrer l'efficacité thérapeutique de l'administration intranasale de notre protéine de fusion dans le traitement de l'allergie alimentaire à l'ovalbumine, composante du blanc d’oeuf. Si cette approche s'avère efficace, elle pourrait représenter une avancée majeure dans la prise en charge des allergies alimentaires en général, qui, à l'heure actuelle, offrent peu d'options thérapeutiques durables et souvent insatisfaisantes pour les patients. L’administration intranasale se distingue par son caractère non invasif, ce qui en ferait une alternative potentiellement plus sûre et plus confortable que les traitements actuels. Les résultats attendus pourraient poser les bases d'essais cliniques pour valider cette approche chez l’homme, ouvrant la voie à de nouvelles thérapies pour les patients allergiques.
Procédures
- Injections pendant 10 secondes, effectuées 2 fois à 1 semaines d’intervalle sur souris vigile. - Administration intranasale sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 6 fois maximum (1/jour). - Administration orale sur souris vigile pendant 2 minutes, effectuée 5 fois maximum (1/jour tous les 2 jours). - Prélèvement de sang effectué 3 fois maximum sur souris vigile pendant 30 secondes, ou effectué 1 seule fois sous anesthésie générale pendant 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les interventions prévues dans le cadre de ce projet peuvent entraîner un stress et quelques effets indésirables. Les injections et administrations orales et intranasales peuvent causer des douleurs légères ou des inconforts localisés et de courte durée (quelques secondes à quelques minutes). Les réactions allergiques incluent des diarrhées, la diminution de température corporelle, la perte de poids, et plus rarement des difficultés respiratoires et des signes de choc anaphylactique dans les cas les plus graves.
Devenir
Les souris sont mises à mort pour récupération de différents organes nécessaires pour répondre à la question scientifique
Remplacement
Des tests cellulaires appropriés seront utilisés pour analyser le mécanisme d'action et l'impact de notre protéine sur les réponses immunitaires. Cependant, ces approches ne peuvent remplacer les expérimentations sur animal vigile, car elles ne reproduisent pas fidèlement la dynamique et la complexité des réactions allergiques. L'expérimentation animale est indispensable pour évaluer sur le vivant l'efficacité thérapeutique des stratégies proposées sur le traitement de l'allergie alimentaire et comprendre les mécanismes immunitaires de la maladie et de l’effet thérapeutique observé dans leur globalité.
Réduction
Le nombre de souris utilisées sera minimisé tout en assurant une analyse statistique fiable des résultats. Pour chaque souris, plusieurs organes seront collectés, notamment la rate, les ganglions, le tissu nasal et l'intestin, afin de maximiser les données recueillies. Aussi, afin de diminuer le nombre de souris utilisé, le protocole donnant le meilleur effet thérapeutique sera déterminé avant de lancer de nouvelles expériences pour comprendre les mécanismes responsables de l’effet thérapeutique.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus (groupes sociaux) dans un environnement enrichi. Pour minimiser le stress, la douleur et l'inconfort des animaux, toutes les manipulations seront effectuées rapidement (quelques minutes) et par des opérateurs expérimentés. Des points limites adaptés ont été établis (notamment la mesure de température, l'observation de diarrhées) permettant de mettre à mort l'animal en cas de signes de souffrance ou de développement d'une réaction allergique trop sévère. Une anesthésie générale de courte durée (quelques minutes) est réalisée pour réduire la douleur de certains gestes.
Choix des espèces
La souris est un modèle largement utilisé pour l’étude des allergies alimentaires en raison de sa pertinence biologique, de la disponibilité d’outils expérimentaux adaptés et de l’abondante littérature existante. Les mécanismes immunitaires impliqués dans les réponses allergiques sont largement conservés entre la souris et l’homme, ce qui rend ce modèle particulièrement approprié pour étudier l’allergie alimentaire et évaluer l’efficacité nouvelles thérapies. Les expériences seront réalisées chez des souris adultes, à partir de 10 semaines d’âge afin que les souris aient un système immunitaire mature.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique d’un agoniste ocytocinergique dans des modèles de douleur neuropathique et de dépression induite par le stress chronique MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux cent quatre-vingts souris subissent une chirurgie de la cuisse sous anesthésie pour léser un nerf, cent quarante reçoivent dix injections de vincristine, un anticancéreux qui provoque des douleurs nerveuses, et deux cent dix sont soumises à des stresseurs quotidiens d'une heure pendant vingt et un jours. 780 souris sont utilisées au total, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère, toutes tuées pour analyser leurs tissus nerveux. Le porteur écrit que ces douleurs "peuvent durer plusieurs semaines", et écrit aussi : "Les animaux pourraient donc être soulagés de leurs symptômes douloureux et/ou anxio-dépressifs." Le traitement est bu au bout d'une micropipette par 490 souris et administré par gavage à 240 autres, et l'évaluation passe par quatre tests comportementaux sur quatre jours consécutifs, que le résumé ne nomme pas.
Objectifs
Ce projet de recherche préclinique vise à caractériser les effets thérapeutiques d’un nouveau composé ciblant les récepteurs de l’ocytocine dans des contextes pathologiques pertinents. Plus précisément, il s’agit d’évaluer son potentiel analgésique dans deux modèles murins de douleur neuropathique (chimio-induite et lésionnelle), ainsi que son potentiel antidépresseur dans un modèle de dépression induite par un stress chronique variable. Les effets de ce composé seront comparés à ceux de traitements de référence déjà utilisés en clinique (duloxétine, prégabaline, fluoxétine). L’effet de la molécule améliorée présentée sous forme de suspension pour faciliter la translation en clinique sera ensuite évalué dans le modèle de douleur neuropathique lésionnelle et dans une évaluation des comportementaux sociaux afin de déceler tout effets indésirables potentiels.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité d’un nouveau candidat thérapeutique dans des pathologies à fort impact clinique et sociétal : les douleurs neuropathiques chroniques et la dépression. Il pourrait ouvrir la voie à l’utilisation de nouvelles approches pharmacologiques ciblant le système de l’ocytocine comme alternative ou complément aux traitements actuels.
Procédures
Les animaux de ce projet participeront à différentes interventions : • Douleur neuropathique pour 280 d'entre eux: une petite chirurgie est réalisée sur la cuisse de l’animal sous anesthésie (environ 30 minutes) pour provoquer une légère douleur similaire à celle observée après certaines atteintes nerveuses. Après une semaine de récupération, les animaux sont suivis régulièrement avec des tests simples et non invasifs • Douleur liée à la chimiothérapie pour 140 animaux : les animaux reçoivent un traitement par vincristine, un médicament anticancéreux connu pour causer des douleurs nerveuses. Dix injections sont administrées sur deux semaines (deux séries de 5 jours, séparées par une pause de 2 jours). Les réactions nociceptives sont mesurées chaque jour avec des tests courts (5 à 20 minutes). • Stress chronique pour les 210 autres: pendant 21 jours, les souris sont soumises à différents petits stresseurs, chacun durant environ une heure. À la fin, leur comportement est évalué avec 4 tests, réalisés sur 4 jours consécutifs. Les traitements sont donnés chaque jour sous forme liquide, que les animaux apprennent à boire spontanément au bout d’une micropipette pour 490 d’entre eux MODIFICATION : ou par gavage (1 fois/j pendant 21 jours) pour 240 d’entre eux. Enfin, à la fin de l’étude, certains animaux sont profondément anesthésiés pour un prélèvement de tissus (système nerveux) afin de réaliser des analyses scientifiques.
Impact sur les animaux
Les souris pourront ressentir des douleurs nerveuses, provoquées soit par une petite chirurgie sous anesthésie, soit par l’administration répétée d’un médicament anticancéreux (vincristine). Ces douleurs peuvent durer plusieurs semaines. Dans un autre modèle, les animaux seront exposés à des situations de stress pendant 21 jours afin de reproduire des symptômes de type anxieux ou dépressif. Pour évaluer ces symptômes, les souris seront soumises à des tests comportementaux courts (3 à 20 minutes), réalisés une ou deux fois par jour au maximum, sur plusieurs semaines selon le modèle. Des limites précises sont établies pour arrêter immédiatement la procédure si un animal présente des signes persistants de souffrance. MODIFICATION : L’administration du produit par gavage oral nécessite de manipuler les animaux chaque jour, ce qui peut entraîner un léger stress temporaire. Cette technique est couramment utilisée et maîtrisée. Dans de rares cas, une irritation de la gorge peut apparaître, et très exceptionnellement une complication respiratoire. Ces risques restent très faibles lorsque la procédure est réalisée par du personnel formé et avec des précautions adaptées.L’objectif de ce projet est de tester un nouveau traitement qui pourrait soulager à la fois la douleur chronique et les troubles anxio-dépressifs. Les animaux pourraient donc être soulagés de leurs symptômes douloureux et/ou anxio-dépressifs. Enfin, la molécule testée cible un des systèmes impliqués dans la régulation des comportements sociaux, ainsi des modifications comportementales non souhaitées (altération des interactions sociales, augmentation ou diminution de la sociabilité, comportements d’évitement ou d’agitation) pourraient apparaître au cours du traitement.
Devenir
Toutes les procédures : Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des analyses post-mortem des tissus nerveux.
Remplacement
Le remplacement par des méthodes in vitro ou in silico n’est pas envisageable dans ce projet. Les comportements de douleur, anxiété ou dépression nécessitent l’observation de l’animal vivant et vigile dans un contexte environnemental contrôlé.
Réduction
Toutes les expériences seront menées en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaire pour garantir la fiabilité scientifique des résultats. Pour cela, des calculs ont été réalisés à partir de données déjà obtenues afin de déterminer combien d’animaux sont indispensables, sans excès. Chaque souris sera testée sur plusieurs comportements, ce qui permet de recueillir un maximum d’informations avec un même individu. Dans les modèles de douleur et pour l’évaluation des comportementaux sociaux, 10 animaux par groupe et par sexe suffisent pour obtenir des résultats fiables. Dans le modèle de stress chronique, où tous les animaux ne développent pas les mêmes symptômes, il est nécessaire d’avoir jusqu’à 15 animaux par groupe et par sexe afin d’assurer une analyse statistique robuste. MODIFICATION : Pour l’évaluation des comportements sociaux, des animaux “interacteurs” seront inclus afin de permettre la réalisation des tests, selon un ratio de 1 interacteur pour 2 animaux testés.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux afin de respecter leurs besoins éthologiques. Leur environnement sera enrichi par l’ajout de carrés de coton pour la nidation et de bâtonnets de bois à ronger, afin de limiter le stress et les comportements agressifs. Avant les expérimentations, les animaux seront habitués aux manipulations, aux dispositifs expérimentaux ainsi qu’à la prise volontaire de solutions par micropipette, afin de réduire les réactions de peur et d’évitement. Les tests comportementaux seront limités à deux par jour maximum, espacés d’au moins 4 heures pour éviter fatigue et stress. Une observation quotidienne attentive permettra de détecter tout signe de stress, de douleur ou de comportement anormal. Un suivi renforcé sera assuré après toute intervention chirurgicale. Lors des chirurgies, les animaux seront anesthésiés et placés sur un tapis chauffant pour maintenir leur température corporelle. Un gel ophtalmique sera appliqué pour prévenir le dessèchement oculaire. Les procédures seront réalisées en conditions stériles. Après l’intervention, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine pour récupérer dans un environnement familier, avec un accès facilité à la nourriture et à l’eau (y compris sous forme gélifiée si nécessaire). MODIFICATION : Lorsque cela est possible, l’administration par micropipette, reposant sur une prise volontaire d’une solution appétente, constitue une mesure de raffinement en évitant la contention. Des points limites précoces sont définis : tout animal présentant des signes persistants de souffrance ou une altération importante de son état sera retiré de l’étude et, si nécessaire, euthanasié. Des améliorations méthodologiques pourront être intégrées en cours de projet en concertation avec la SBEA. MODIFICATION : En cas de gavage, celui-ci sera réalisé par du personnel formé, avec du matériel adapté au poids des animaux. Une manipulation douce et une habituation à la contention seront mises en place. Une surveillance quotidienne (poids, comportement, respiration) permettra de détecter rapidement toute complication. Des critères d’arrêt anticipé seront appliqués en cas de signes de détresse.
Choix des espèces
La souris est un modèle largement utilisé en neurosciences et dans l’étude de la douleur. Ses systèmes biologiques sont proches de ceux de l’humain, ce qui permet de tirer des conclusions transposables aux maladies étudiées. Elle présente aussi l’avantage de disposer de nombreuses données de référence et de lignées bien caractérisées, ce qui facilite la comparaison avec d’autres travaux scientifiques. Les animaux utilisés seront des adultes (8 semaines, > 20 g), stade nécessaire à la maturité comportementale.
Effets de différents traitements dans des modèles murins de mort subite et inattendue en épilepsie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une stimulation sonore de soixante secondes au maximum, appliquée une fois à chaque souris pour déclencher une crise convulsive qui peut la tuer : 3 168 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les survivantes étant tuées à la fin pour prélever leurs organes. Certaines reçoivent une substance une seule fois, d'autres deux fois, et 576 jusqu'à vingt-huit fois, à raison de deux administrations par jour pendant quatorze jours. L'objet déclaré est de tester des traitements contre la mort subite inattendue en épilepsie, faute de traitement spécifique existant, en cherchant une dose efficace puis une éventuelle synergie entre deux molécules. Ces souris appartiennent à des souches sensibles aux crises audiogènes et sont testées vers le vingt-et-unième jour après la naissance, âge auquel le porteur indique que les crises létales sont les plus fréquentes, et jusque-là hébergées avec leur mère et leur portée.
Objectifs
La mort subite inattendue en épilepsie (SUDEP) est une cause de décès importante, dont l’incidence est évaluée autour de 1 cas pour 1000 patients épileptiques. Plusieurs hypothèses ont été émises sur les causes de cette mortalité : une anomalie du rythme cardiaque, secondaire à une crise généralisée, un arrêt respiratoire, ou encore une dépression générale des activités électriques cérébrales. Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de traitements contre les crises épileptiques provoquant une SUDEP. Pour cela, nous allons utiliser un modèle animal de crises audiogènes où une crise tonique pouvant provoquer la mort est induite par un stimulus audio. Ce modèle est reconnu comme un modèle de SUDEP. Nous proposons ici de tester plusieurs types de traitements : traitement aigu d’une substance (afin de définir la dose efficace pour prévenir des crises et de la mortalité, ainsi que pour définir le temps d’activité de la molécule), traitement répété d’une substance (afin d’évaluer si une exposition prolongée à une substance permet une meilleure protection contre les crises létales), et enfin un traitement associant 2 molécules (afin de définir une possible synergie entre ces molécules).
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’évaluer l’efficacité de différents traitements contre le SUDEP à l’aide d’un modèle murin validé par la littérature. Il n’existe pas de traitement spécifique au SUDEP, ces travaux permettront d’évaluer le potentiel des substances évaluées et de leur association contre cette mortalité.
Procédures
Les animaux seront administrés vigiles: une fois pour 1728 animaux, deux fois pour 864 animaux, et au maximum 28 fois (si 2 fois/jour pendant 14 jours) pour 576 animaux. Tous les animaux seront exposés une fois à une stimulation audio (max 60s) induisant des crises audiogènes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont la survenue de crises létales et non létales à la suite de la stimulation audio et un stress du aux administrations de substance.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.
Remplacement
Les méthodes expérimentales in vitro ne reproduisent pas l’ensemble des propriétés des crises d'épilepsie survenant dans un cerveau entier. De plus, la modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore insuffisantes pour produire des données applicables chez l’humain.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences, en réalisant d’abord des études sur chaque molécule administrée seule pour mieux les caractériser avant d’évaluer l’intérêt d’une administration répété ou de l’association de 2 molécules. De plus, selon les résultats des substances testés lors de la première partie du projet, nous ne retesterons que celles aux résultats positifs pour la 2ème partie. L’utilisation d’un modèle murin déjà validé comme modèle de SUDEP nous permet de ne pas passer par une procédure de validation du modèle. Le calcul du nombre d'animaux est fait selon une approche statistique, sur la base de la variabilité du comportement des souris modèles de SUDEP qui est décrite dans la littérature, nous estimons qu’il nous faut au minimum 12 animaux par groupe pour pouvoir évaluer leur phénotype épileptique. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous n’utiliserons pour chaque procédure que la moitié des animaux administrés par un contrôle véhicule.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec leur mère et leurs congénères de même portée jusqu’à l’expérimentation à P21 ou jusqu’à leur sevrage à P21. Ils seront ainsi hébergés dans des conditions environnementales répondant à leurs besoins, avec un enrichissement adapté (papier tork ou frisure de carton). Les animaux seront manipulés par du personnel expérimenté afin de réduire le stress global. La stimulation audio induisant les crises est limitée à une par animal et pendant 60s maximum.
Choix des espèces
L’espèce que nous avons choisie (souches de souris sensibles aux crises audiogènes) est le modèle animal décrit dans la littérature comme reproduisant au mieux le SUDEP. Les animaux seront principalement testés vers le jour postnatal 21, où les crises audiogènes létales sont les plus fréquentes selon la littérature et selon nos précédents travaux internes.
Etude de l’impact des dermatites sur la réactivité gliale et les conséquences sur la démangeaison et les troubles de l’humeur
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Tuées à la fin de chaque procédure pour des prélèvements de tissus, 3 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sur la peau des applications répétées de substances qui provoquent une inflammation ou abîment la barrière cutanée, jusqu'à dix applications en cinq jours pour la peau sèche, et jusqu'à neuf applications sur trois semaines pour un autre protocole d'induction. Le porteur indique que ces souris peuvent présenter des lésions cutanées, des rougeurs, un épaississement de la peau et des grattages répétés, avec un inconfort transitoire ou persistant, et qu'elles passent jusqu'à six séances de tests de grattage, de stimulation cutanée légère et d'exploration, de dix à quarante-cinq minutes. Sur le remplacement, il affirme que les cultures et les tissus isolés ne reproduisent pas ensemble l'inflammation, l'activation des nerfs et le grattage, et qu'il est donc "nécessaire d'utiliser des modèles animaux permettant d'étudier la démangeaison dans un organisme entier".
Objectifs
La démangeaison est une sensation très fréquente dans les maladies de peau. Elle pousse à se gratter et peut devenir difficile à supporter lorsqu’elle dure longtemps. Dans ce cas, elle peut gêner le sommeil, augmenter le stress et modifier le comportement. Ce projet cherche à mieux comprendre pourquoi la peau démange et pourquoi cette sensation peut devenir chronique. Nous allons étudier le rôle des nerfs qui transmettent le signal de démangeaison depuis la peau, ainsi que celui de cellules de soutien présentes dans le système nerveux. Ces cellules peuvent influencer la façon dont le signal de démangeaison est traité. L’objectif est de comprendre comment ces différents acteurs participent à l’apparition, au maintien et aux conséquences de la démangeaison.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes neurobiologiques du prurit et sur la manière dont les signaux provenant de la peau sont traités par le système nerveux. Il apportera également des informations nouvelles sur l’impact du prurit chronique sur le comportement et l’état émotionnel. À moyen et long terme, ces connaissances pourront contribuer à orienter la recherche dans le domaine du prurit chronique et des maladies cutanées associées, sans constituer une évaluation directe de traitements chez l’animal.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1. Injections Les animaux recevront des injections répétées selon les procédures La durée de chaque injection est d’environ 5 à 10 secondes. Selon la nature de l’injection, les gestes sont réalisés sur animal vigile ou sous anesthésie gazeuse brève. Le nombre maximal d’injections pour un même animal est de 6 injections au total, réparties sur une période pouvant aller jusqu’à environ 4 semaines, dans le cas d’une injection initiale suivie, après un délai nécessaire à son action, d’injections répétées d’un produit permettant de moduler l’activité de cellules ciblées. Dans les autres procédures, le nombre d’injections est inférieur ou égal à 4, réparties sur 3 jours à 2 semaines selon le protocole. 2. Applications cutanées répétées Dans les modèles de dermatite chronique, les animaux sont soumis à des applications cutanées répétées de substances induisant une inflammation ou une altération de la barrière cutanée. Chaque application a une durée d’environ 10 à 30 secondes et est réalisée sous anesthésie gazeuse brève afin de limiter le stress lié à la contention. Le nombre maximal d’applications cutanées est de 10 applications sur 5 jours pour le modèle de peau sèche, réalisé deux fois par jour. Pour les modèles de dermatite induits par des agents inflammatoires ou allergènes, le schéma le plus long correspond au modèle HDM, avec 9 applications réparties sur 3 cycles, soit environ 3 semaines. 3. Manipulations comportementales et observations Les animaux sont soumis à des tests comportementaux non invasifs, incluant l’observation du comportement de grattage, des stimulations cutanées légères et des tests d’exploration. Ces tests sont réalisés sur animaux vigiles et ont une durée comprise entre 10 et 45 minutes par session, selon le test. Le nombre maximal de sessions comportementales pour un même animal est de 6 sessions. Ces sessions sont réparties sur la durée de la procédure, jusqu’à environ 3 semaines pour les modèles les plus longs, avec habituation préalable lorsque nécessaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues dans le cadre de ce projet sont principalement liées à l’induction des modèles de prurit, aux administrations de produits par différentes voies d’administration, aux manipulations expérimentales associées et aux évaluations comportementales répétées. Dans les modèles de prurit chronique associés à une inflammation cutanée, les animaux peuvent présenter des lésions cutanées locales, des rougeurs, un épaississement de la peau et des comportements de grattage répétés, associés à un inconfort transitoire ou persistant dont l’intensité dépend du modèle utilisé et de la durée d’exposition. Les modèles de prurit aigu peuvent entraîner une réponse transitoire de grattage et un inconfort de courte durée, sans inflammation chronique. Les administrations de produits peuvent entraîner un inconfort transitoire lié à la contention, au geste d’administration ou à l’effet attendu du produit administré. Des réactions locales au point d’administration peuvent également survenir, incluant une rougeur, un gonflement, une irritation, une inflammation locale ou, plus rarement, une infection ou une ulcération. Certaines interventions expérimentales visant à moduler l’activité neuronale et/ou gliale peuvent entraîner une modification transitoire de l’activité des cellules ciblées, pouvant s’accompagner d’un inconfort ou d’une douleur de courte durée selon la population cellulaire concernée et la modalité utilisée. Les évaluations comportementales peuvent générer un stress modéré lié à la manipulation, à l’exposition à un nouvel environnement ou à la répétition des tests. Elles sont réalisées sur des durées limitées, avec des méthodes non invasives et non nociceptives.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasié à la fin de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements tissulaires post-mortem.
Remplacement
Ce projet vise à mieux comprendre pourquoi certaines démangeaisons apparaissent, pourquoi elles peuvent devenir chroniques, et comment elles peuvent modifier le comportement des animaux, par exemple en augmentant le stress ou en altérant l’humeur. La démangeaison ne dépend pas seulement de la peau : elle implique aussi les nerfs qui transmettent le signal depuis la peau, la moelle épinière, des cellules de soutien du système nerveux et des cellules immunitaires. Ces différents éléments interagissent entre eux, ce qui rend le phénomène difficile à reproduire avec des méthodes uniquement réalisées en boîte de culture ou sur des tissus isolés. Ces approches alternatives peuvent apporter des informations utiles, mais elles ne permettent pas de reproduire en même temps une inflammation de la peau, l’activation des nerfs responsables de la démangeaison, l’intervention des cellules de soutien du système nerveux, et l’apparition de comportements comme le grattage ou les changements liés à l’état émotionnel. Pour répondre aux objectifs du projet, il est donc nécessaire d’utiliser des modèles animaux permettant d’étudier la démangeaison dans un organisme entier, depuis la peau jusqu’aux comportements observables.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été défini de manière à obtenir des résultats scientifiquement interprétables tout en limitant le recours aux animaux au strict nécessaire. Une veille bibliographique sera réalisée tout au long du projet afin d’éviter la duplication d’expériences déjà publiées et d’adapter les choix expérimentaux aux connaissances disponibles. La stratégie de réduction repose d’abord sur l’utilisation d’un modèle de référence. Ce modèle permettra de valider les approches expérimentales nécessitant des groupes contrôles complets et de vérifier que les effets observés sont interprétables. Une fois ces validations réalisées, les autres modèles seront étudiés avec des plans expérimentaux allégés, limités aux comparaisons nécessaires, afin d’éviter la répétition de groupes contrôles redondants. Lorsque cela est scientifiquement justifié, les groupes contrôles seront mutualisés au sein d’une même procédure, en particulier lorsque les conditions expérimentales sont comparables. Cette organisation permet de réduire le nombre total de groupes tout en conservant des comparaisons valides. Pour les lignées génétiques, les croisements seront planifiés afin de maximiser l’utilisation des animaux produits. Les animaux présentant un génotype compatible avec les groupes expérimentaux ou contrôles prévus seront utilisés autant que possible, ce qui limite la production d’animaux excédentaires et le nombre de reproducteurs nécessaires. Lorsque plusieurs approches indépendantes répondent à une même question scientifique, elles seront d’abord limitées au modèle de référence. Leur extension à d’autres modèles ne sera réalisée que si les premiers résultats le justifient. Les effectifs reposent sur un minimum de 12 animaux par condition expérimentale, répartis en 3 répétitions indépendantes de 4 animaux par groupe. Les données seront analysées en regroupant ces répétitions, tout en vérifiant la cohérence des effets observés. Ce dimensionnement tient compte de l’expérience de l’équipe, de la variabilité attendue et de la nécessité de détecter des différences biologiquement pertinentes. Enfin, chaque animal sera inclus dans une seule procédure expérimentale et suivra une trajectoire complète au sein d’un modèle donné, afin d’éviter toute exposition cumulative inutile.
Raffinement
Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, les souris bénéficieront d’une phase d’acclimatation d’au moins cinq jours dans une pièce dédiée, sur portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables, séparés par sexe, à un maximum de cinq par cage de 500 cm², dans un environnement contrôlé. Les groupes seront maintenus aussi stables que possible afin de limiter le stress lié aux remaniements. Une attention particulière sera portée aux interactions sociales, notamment chez les mâles, afin de détecter précocement toute agressivité ou blessure. Un enrichissement systématique sera mis en place, comprenant une maison et du matériel de nidification. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour par le personnel de zootechnie ou par le personnel impliqué dans le projet. Le poids sera suivi régulièrement au cours des manipulations, notamment lors des phases de traitement ou d’induction des modèles. Les grilles de suivi clinique et les points limites spécifiques sont définis dans chaque procédure afin d’encadrer la surveillance, les mesures de soutien éventuelles et le retrait anticipé des animaux si nécessaire. Les manipulations expérimentales sont réalisées de manière à limiter le stress, la durée de contention et l’inconfort. Les gestes susceptibles d’induire une gêne transitoire ou nécessitant une contention prolongée sont réalisés sous anesthésie gazeuse brève lorsque cela est compatible avec les objectifs expérimentaux. Les volumes administrés sont limités au strict nécessaire et adaptés à la voie utilisée. Le matériel est choisi de manière appropriée afin de réduire au maximum les lésions tissulaires. Les expérimentateurs impliqués dans le projet sont formés à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques et aux gestes techniques mis en œuvre. L’apprentissage et la maîtrise des gestes techniques sont encadrés et consignés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Enfin, une analyse rétrospective sera réalisée à l’issue des expériences afin d’identifier d’éventuelles possibilités d’amélioration des procédures et de réduction supplémentaire de la souffrance animale pour les études ultérieures.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie pour ce projet en raison de sa pertinence pour l’étude des mécanismes du prurit aigu et chronique et de ses conséquences comportementales. Des modèles murins validés permettent de reproduire différents contextes de prurit cutané, inflammatoire ou non inflammatoire, et d’étudier de manière intégrée les interactions entre la peau, les neurones sensoriels, les cellules gliales et la moelle épinière. La souris offre également l’accès à de nombreuses lignées transgéniques et conditionnelles permettant le ciblage spécifique de populations neuronales et gliales impliquées dans le prurit, ce qui est indispensable pour répondre aux objectifs du projet. Enfin, des protocoles comportementaux standardisés et largement utilisés permettent d’évaluer de façon fiable le prurit et ses conséquences comportementales. Les animaux utilisés dans ce projet sont exclusivement des souris adultes (Mus musculus). Les procédures expérimentales sont réalisées à des stades de développement compatibles avec la maturité des systèmes nerveux, immunitaire et comportemental. De manière générale, les souris sont utilisées à partir de 6 semaines d’âge. Certaines manipulations préalables (approches génétiques, virales ou inductibles) peuvent être réalisées chez des animaux âgés de 4 à 6 semaines, suivies d’un délai suffisant avant l’induction des modèles expérimentaux et les évaluations comportementales, afin de garantir une expression ou une recombinaison stable. Les modèles de prurit aigu et chronique ainsi que l’ensemble des évaluations comportementales sont réalisés chez des souris adultes, typiquement âgées de 6 à 12 semaines au moment des tests. Aucune procédure n’est réalisée chez des animaux en phase juvénile précoce ou néonatale.
Développement de nouveaux outils biométrologiques pour l’évaluation des expositions professionnelles aux PFAS
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Modéliser la distribution et l'élimination de mélanges de PFAS dans l'organisme, pour choisir quels prélèvements pratiquer chez des travailleurs exposés : 60 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes. Ils reçoivent une dose orale unique par gavage, sont tondus deux fois, subissent dix prélèvements sanguins sous anesthésie locale et passent 72 heures consécutives en cage à métabolisme, puis cinq séjours de 24 heures répartis sur les 60 jours du protocole. Le porteur désigne la cage à métabolisme comme la plus grande source d'inconfort après exposition, et écrit ne pas attendre que la quantité de PFAS administrée ait une "incidence majeure sur le bien-être des animaux". Le rat est retenu parce que la ligne directrice 417 de l'OCDE le préconise, le porteur indiquant qu'il est "utilisé de manière quasi exclusive dans les études toxicologiques".
Objectifs
Les composés perfluoroalkylés et polyfluoralkylés, connus sous le nom de PFAS (ou encore « polluants éternels »), représentent une famille de composés chimiques regroupant plusieurs milliers de molécules produits par l’activité humaine. En raison des multiples liaisons carbone-fluor qui les caractérisent, les PFAS sont très stables et dotés de propriétés physico-chimiques intéressantes pour de nombreuses applications. Ils sont largement utilisés dans l’industrie pour leurs propriétés imperméables, antiadhésives et de résistance à la chaleur. À ce jour, plus de 200 applications ont été recensées pour environ 1 700 composés (fartage, cosmétiques, textiles, ustensiles de cuisine, semi-conducteurs, plastiques, batteries, dispositifs médicaux, peintures, emballages, mousse anti-incendie, pesticides, encres…). Leur persistance dans l’environnement suscite des inquiétudes quant à leur impact potentiel sur la santé humaine et les écosystèmes, ce qui fait des PFAS une préoccupation majeure en termes de pollution chimique.
Bénéfices attendus
L'étude vise à modéliser la distribution et l'élimination dans l'organisme (toxicocinétique) de mélanges de PFAS pour optimiser les stratégies de prélèvement en milieu professionnel et identifier les matrices biologiques les plus pertinentes. Elle cherche également à repérer des métabolites (exogènes et endogènes) pouvant servir de marqueurs biologiques d'exposition ou d'effets précoces liés aux poly-expositions.
Procédures
Les animaux recevront une seule fois par voie orale les produits chimiques étudiés ou le véhicule (huile végétale). Ils seront tondus 2 fois (avant l’administration orale et à la fin de l’expérimentation) afin de récupérer leurs poils. Cette opération sera réalisée par 2 opérateurs et n’excèdera pas 2 min. L’administration orale par gavage des substances se fera chez l’animal vigile et demandera une contention inférieure à 1 min. Les animaux seront placés en cage à métabolisme permettant le recueil de l’urine pendant 72 h au début de l’expérimentation et pendant 5 périodes de 24 h réparties sur la durée du projet (60 jours). Dix prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie locale, chaque prélèvement nécessitant une contention de l’animal de quelques minutes. En fin d’expérimentation, les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et d’échantillons biologiques.
Impact sur les animaux
L’administration par voie orale ainsi que les prélèvements sanguins à la veine de la queue entrainent un stress physique mineur de courte durée. Le placement en cage à métabolisme (maximum 72 h consécutives) constituera la plus grande source d’inconfort post-exposition. Il n’est pas attendu que la quantité de produits administrée ait une incidence majeure sur le bien-être des animaux.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort en fin d’expérimentation afin de prélever différents organes et échantillons biologiques.
Remplacement
À ce jour, en l’absence de connaissances suffisantes, il est nécessaire d’utiliser des animaux de laboratoire pour étudier la biodistribution et l’excrétion de mélanges de PFAS. L'étude vise à modéliser la toxicocinétique de mélanges de PFAS pour optimiser les stratégies de prélèvement en milieu professionnel et identifier les matrices biologiques les plus pertinentes. Elle cherche également à repérer des métabolites (exogènes et endogènes) pouvant servir de biomarqueurs d'exposition ou d'effets précoces liés aux poly-expositions.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum nécessaire pour pouvoir interpréter les résultats obtenus. En l’absence de données de toxicocinétique pour la majorité des substances testées, des animaux des 2 sexes seront utilisés. En se basant sur la ligne directrice 417 de l’OCDE relative à la conduite des études de toxicocinétique, un minimum 4 animaux de même sexe doivent être utilisés.
Raffinement
Après une semaine d’acclimatation à l’animalerie, une technique de manipulation positive dite de « tickling » sera mise en place. Cette méthode consiste à reproduire, par des stimulations tactiles douces et répétées, les comportements de jeux sociaux entre jeunes rats. L’efficacité du tickling sera contrôlée par l’émission de vocalisation sonores mesurables associées à des états émotionnels positifs. Il sera ensuite pratiqué avant chaque manipulation des animaux pendant toute la durée du projet. Les animaux seront habitués progressivement à la préhension/contention avant le début des expérimentations afin de limiter le stress lié à ces manipulations. Tout au long de la procédure, les animaux seront placés en groupe et de manière hebdomadaire dans une aire de jeu comportant différents enrichissements (tunnels, abris, éléments d’exploration). Cet environnement favorisant les interactions sociales, stimule l’activité exploratoire naturelle et contribue à réduire le stress lié à l’hébergement et aux manipulations expérimentales, améliorant ainsi le bien-être général des animaux. La semaine précédant l’administration orale, les animaux seront habitués en introduisant la canule de gavage vide dans l’œsophage. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel formé, une attention toute particulière sera portée au moment du gavage et des prélèvements sanguins.
Choix des espèces
Actuellement, peu de données toxicocinétiques sont disponibles pour les PFAS. Dans ce cas, le rat est l’espèce préconisée par la ligne directrice 417 de l’OCDE car utilisé de manière quasi exclusive dans les études toxicologiques. Des rats femelles et mâles âgés de 12 à 14 semaines au moment de l’administration orale seront utilisés, ce qui correspond à un stade adulte de développement.