Rongeurs

Les souris utilisées portent la mutation du syndrome de Wolfram et développent, dès 21 jours de vie, une surdité et un syndrome vestibulaire, auxquels s'ajoute un diabète. 1 440 souris sont engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever plusieurs structures cérébrales. Elles subissent des injections quotidiennes pendant deux mois et demi, six contrôles alimentaires de quinze heures, six piqûres caudales sur neuf mois, et le porteur signale une irritation possible aux sites d'injection sur l'abdomen. Des tests comportementaux servent à évaluer les capacités motrices du premier mois à l'âge adulte, sans que le document précise lesquels.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie génétique rare mais qui ne dispose aujourd'hui d'aucune thérapie. L'identification de la protéine responsable de la pathologie et la compréhension récente de son rôle dans la cellule et son implication dans les processus neurodégénératifs, fondamentaux dans des pathologies comme Alzheimer, Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique ou la maladie de Huntington, permet aujourd'hui d'envisager des approches thérapeutiques. Il est important de caractériser les effets thérapeutiques de composés neuroprotecteurs chez les souris pour définir les paramètres d'efficacité des candidats médicaments testés par la suite chez l'Homme. Le modèle d'étude est la souris qui possède la même mutation que l'Homme. Cette souris développe plusieurs déficits d'équilibre et d'audition. Les objectifs de ce projet sont de déterminer l'ampleur des déficits observables et d'évaluer les effets bénéfiques des composés médicaments testés.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'apporter une preuve d'efficacité des composés testés. Le bénéfice à terme est d'amener en clinique des composés à visée thérapeutique pour des pathologies rares/orphelines (Sclérose latérale amyotrophique, Hungtington...) pour lesquelles il n'existe actuellement aucun traitement.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : Les animaux seront soumis à 1 contrôle alimentaire (durée 15h), des injections journalières pendant 2 mois et demi et des prélèvements de quelques gouttes de sang mensuellement pour suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murin. Au total, en plus des injections journalières, les animaux seront soumis à 6 contrôles alimentaires, 6 injections et 6 piqures caudales sur une période de 9 mois.

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". Le contrôle alimentaire sur un durée de 15h peut également engendrer un stress. Une irritation peut survenir aux sites d'injections sur l'abdomen de l'animal. L'incision pour les prélèvements de goutte de sang est superficielle mais peut engendrer un léger stress . Pour limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation au préalable. Le modèle murin du syndrome de Wolfram-like développe progressivement des troubles neurosensoriels ( surdité et syndrome vestibulaire) à partir de 21 jours après la naissance.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort et les organes collectés pour procéder aux analyses de biologie moléculaire et d'immunohistochimie permettant la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle mammifère est le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques du syndrome de Wolfram, type déficit vestibulaire, dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. Aucune alternative à ce jour ne peut se substituer totalement à ce modèle. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant. Toutes les molécules testées ont été préalablement testées sur des modèles in vitro de culture cellulaire et sur des tests comportementaux sur la larve de poisson zèbre dont l'âge est inférieur à 5 jours.

Réduction

Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe. Ce nombre de 12 souris par groupe fait également références aux études antérieures réalisées au laboratoire. Une veille bibliographique sera également prise en compte durant la durée du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de collecter un maximum d’échantillons.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en carton pour éviter que les animaux ne se blessent et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Si les animaux présentent un augmentation de leur production d'urine (dû à l'installation d'un diabète) les fonds de cages seront changés plus régulièrement. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Une crème analgésique sera appliquée sur la queue avant les prélèvements de sang. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu .

Choix des espèces

Ces expérimentations seront réalisées sur un modèle murin de type syndrome de Wolfram qui mime tous les symptômes que l'on retrouve chez l'Homme atteint par cette pathologie, à savoir un diabète, et une dégénérescence des cellules ciliées de l'oreille menant à des troubles vestibulaires. Les capacités motrices des animaux seront testées dès le 1er mois jusqu'à l'âge adulte.

Des cellules cancéreuses mammaires sont greffées dans le coussin graisseux de 500 souris, la tumeur primaire est mesurée au pied à coulisse jusqu'à 500 mm3, puis retirée chirurgicalement pour laisser les métastases se développer. Les souris, immunocompétentes, immunodéficientes ou porteuses d'un système immunitaire humanisé, sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes et de sang. Le porteur attend des pertes de poids, des prostrations, des vocalisations, des tremblements ou des convulsions liées aux métastases cérébrales, et prévoit jusqu'à dix prélèvements de sang par jour par une incision de la veine de la queue. L'étendue réelle de ces gestes n'est pas arrêtée par le protocole, le document indiquant qu'elle dépendra des demandes des clients.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer chez la souris de nouveaux traitements pour les métastases des cancers du sein dont les besoins thérapeutiques sont non satisfaits. La dissémination métastatique constitue la principale cause de mortalité liée au cancer du sein, impliquant un enchaînement complexe d’événements biologiques incluant l’invasion locale, l’intravasation (entrée dans la circulation sanguine), la survie circulante, l’extravasation (sortie de la circulation sanguine) et la colonisation d’organes distants. Dans ce contexte, le développement de modèles précliniques pertinents est essentiel pour comprendre les mécanismes de la progression métastatique et pour évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Parmi ces modèles, les modèles murins orthotopiques avec exérèse de la tumeur primaire représentent aujourd’hui une approche particulièrement pertinente pour se rapprocher de la situation clinique observée chez les patientes. Pour ces modèles, des lignées cellulaires cancéreuses du sein, soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées directement dans le coussin graisseux mammaire des souris. En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Une fois la tumeur primaire bien développée, elle sera retirée chirurgicalement pour permettre le développement de métastase. Les études consistent à administrer des traitements à potentiel thérapeutique à ces souris porteuses de métastases de cancer du sein, puis à mesurer les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines ou tissulaires du composé d’intérêt et/ou la croissance métastatique. Les mesures de concentrations permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et la pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité préclinique, de toxicologie réglementaire et enfin pour prédire les doses en développement clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Historiquement, de nombreuses études précliniques ont utilisé des modèles expérimentaux basés sur l’injection intraveineuse ou intracardiaque de cellules tumorales, permettant de générer rapidement des métastases. Toutefois, ces modèles court-circuitent des étapes clés de la cascade métastatique, notamment l’échappement à partir du site primaire et les interactions précoces avec le microenvironnement tumoral. De plus, dans les modèles spontanés sans intervention chirurgicale, la croissance de la tumeur primaire conduit souvent à l’euthanasie précoce des animaux, empêchant l’étude des phases tardives de la maladie métastatique. Ainsi, ces limitations compromettent la capacité de modéliser fidèlement la progression clinique du cancer du sein, en particulier dans le contexte du traitement adjuvant, qui intervient après exérèse de la tumeur primaire chez les patientes. Les modèles murins combinant implantation orthotopique de cellules tumorales mammaires et exérèse chirurgicale de la tumeur primaire permettent de surmonter ces limites. Dans ces systèmes, les cellules tumorales se développent initialement dans un environnement anatomique et stromal approprié, puis disséminent spontanément vers des sites distants, tels que les poumons, le foie, les ganglions lymphatiques ou les os, reproduisant fidèlement les schémas métastatiques humains. En conclusion, les modèles murins de cancer du sein intégrant une exérèse de la tumeur primaire constituent une avancée majeure pour la recherche translationnelle. En reproduisant de manière plus fidèle la progression clinique de la maladie et les conditions thérapeutiques auxquelles sont exposées les patientes, ils permettent une meilleure compréhension des mécanismes métastatiques et une évaluation plus pertinente des stratégies thérapeutiques. Ces modèles apparaissent ainsi comme des outils essentiels pour combler le fossé entre recherche préclinique et application clinique dans le traitement du cancer du sein métastatique.

Procédures

1) Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Greffe des cellules tumorales à l’aide d’une aiguille réalisées dans le coussin graisseux mammaire sous anesthésie gazeuse : durée 30 secondes 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs primaires avec un pied à coulisse, max 2 fois par semaine pendant 6 semaines max (jusqu’à ce que la taille de la tumeur permettent sa résection entre 150 et 500 mm3) • Résection chirurgicale des tumeurs primaires, max 1 fois, durée 10 min sous anesthésie gazeuse. • Mesure des tumeurs avec l’appareil de bioluminescence : durée 15 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 2 fois par semaine pendant max 8 semaines. • Administration de luciférine pour imagerie de bioluminescence par voie intrapéritonéale : durée 30 secondes sur animaux vigiles (maximum 2 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines, max 8 semaines). • Administrations des composés à potentiel thérapeutique o par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max2xjour), , sous-cutanée (max1xjour), intramusculaire (max1xjour) ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à 4 semaines de traitement. OU o par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 1 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). 2) Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile o via la veine saphène : durée 30 secondes (max 1xjour) o via la veine faciale : durée 30 secondes (max 1xjour) o via une incision de la veine latérale de la queue (1 seule incision d’environ 2 mm réalisée pour la totalité des prélèvements) durée 1 min (max 10xjour).

Impact sur les animaux

Ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux étant opérés et ayant des métastases, il est possible que les animaux présentent des signes d’origine neurologique comme des tremblements et/ou des convulsions (métastases cérébrales) ou pulmonaires (métastases pulmonaires). Ces effets seront très limités dans le temps par la mise en place de critères d'arrêt anticipés et de suivi très rigoureux des animaux. Tous ces effets seront dans la majorité des cas liés au modèle. La perte de poids peut, quant à elle, être due au produit testé ou au modèle. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement). Des animaux à phénotype potentiellement dommageable (immunodéprimés) sont utilisés ; pour la bonne santé des animaux, l'absence d'expression de ce phénotype est contrôlée grâce à des conditions d'hébergement adaptées garantissant l'absence de contact avec des germes pathogènes ou opportunistes pouvant altérer leur santé.

Devenir

Les animaux sont mis en mort en fin de procédure pour prélèvements d’organes/de sang.

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, selon la littérature, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral et encore moins dans un contexte métastatique. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre 1) d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes 2) d’obtenir un modèle pertinent de processus métastatique comparable à ce qui se passe chez l’humain.

Réduction

La prise et la croissance métastatiques seront suivies au cours du temps par imagerie de bioluminescence. L’utilisation de cette technique non-invasive permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme) et de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et de détermination de la taille des groupes expérimentaux. Nous évaluons à 500 le nombre de souris maximal utilisé pour ce projet.

Raffinement

Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinelles. Les animaux seront groupés dans des cages de 5 animaux contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire. Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie. Pour les anesthésies longues (instillation des cellules tumorales ou traitement des animaux) les animaux seront placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température corporelle pour éviter toute hypothermie. A noter qu’afin de protéger la sécheresse oculaire durant la phase d’anesthésie, du gel ophtalmique est déposé sur les yeux de l’animal à l’aide d’un coton-tige. Pour éviter l’apparition de potentielle douleur lors de la résection de la tumeur primaire, une injection en sous-cutanée d’analgésique sera réalisée 30 minutes avant l’instillation des cellules. Cette injection sera répétée en cas d’apparition de signe de douleur. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées. En fonction de l’état des animaux la surveillance sera renforcée et si les points limites anticipés sont atteints, l’animal sera immédiatement euthanasié. Pour les souches à phénotype potentiellement dommageable (immunodéprimés), les animaux sont hébergés en conditions adaptées pour garantir leur bonne santé par absence de contact avec des germes pathogènes ou opportunistes.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles de cancer du sein/métastases du cancer du sein chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.. La souris est un modèle d’étude de choix car : 1) sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2) la disponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer, c’est pour cela que nous utiliserons des souris adultes

Un médicament oral à usage double, pour la population générale et pour les militaires en opération en cas de dissémination radioactive, est testé sur 710 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour mesurer les radionucléides fixés dans leurs organes. Chaque souris reçoit deux administrations orales sous contention, puis passe 48 heures seule en cage métabolique pour la collecte des urines et des fèces. Le porteur écrit qu'aucun prélèvement invasif n'est prévu et juge peu probable d'atteindre le point limite de 20 % de perte de poids sur des études de huit jours au maximum, tout en annonçant une vigilance sur le risque de fausse route lors des gavages. L'effectif de 710 est présenté comme le résultat d'une étude statistique dont le document ne donne ni les hypothèses ni la puissance visée.

Objectifs

Lors d’un accident nucléaire ou d’une attaque terroriste avec un dispositif de dispersion radiologique, des matières radioactives peuvent être libérées sous forme de poussière ou de fragments. Outre les traumatismes corporels et l’irradiation externe, la contamination interne par inhalation ou par blessure représente un risque majeur. De nombreuses victimes pourraient aussi être touchées en cas de contamination intentionnelle de la nourriture ou de l’eau potable. Bien que le mode d’action des attaques terroristes ne soit pas prévisible, les radionucléides (RN) les plus couramment utilisés dans l’industrie, en médecine ou bien en recherche doivent être particulièrement considérés en raison de leur relative disponibilité. En l’occurrence, les radionucléides pouvant potentiellement faire l’objet d’un détournement pour la conception d’une bombe sale ont été identifiés parmi les isotopes de l’américium (Am), du cobalt (Co), du césium (Cs), du plutonium (Pu), du strontium (Sr), du thorium (Th), du neptunium (Np) ou encore de l’uranium (U-235). En cas de contamination interne par ces RN, des toxicités chimique et radiologique potentielles peuvent être rencontrées au niveau des organes de rétention majeurs (le foie pour le cobalt, le rein pour l’uranium ou le squelette pour le strontium) entrainant divers troubles. Les stratégies de décorporation, principalement élaborées durant la guerre froide, ont peu évolué malgré l’augmentation des risques liés aux tensions géopolitiques et au développement de l’énergie nucléaire. Malheureusement, les solutions actuelles sont limitées par leur mode d’administration, par leur action spécifique sur une gamme de RN restreinte et parfois par leur manque d’efficacité. Ce projet vise à développer un médicament oral pour le traitement de patients en cas de dissémination radioactive par un large panel de RN en se focalisant principalement sur la contamination par ingestion. L’ambition de ce projet est d’envisager une application duale de ce médicament à la fois pour la population générale et pour le militaire en opération.

Bénéfices attendus

Actuellement, il manque des médicaments capables de protéger efficacement contre la contamination interne d’éléments radioactifs. Le composé testé a pour objectif de combler ce manque. Il est conçu pour avoir une double utilisation : d’une part pour la population générale en cas d’accident ou de crise nucléaire, et d’autre part, pour les militaires en opération, exposés à des risques radiologiques. Facile à prendre sous forme de comprimé, il pourra être distribué rapidement et à grande échelle en cas d’urgence. Il viendra compléter les autres mesures de protection déjà existantes, comme le confinement, l’évacuation ou les restrictions alimentaires. Grâce à son action préventive, ce composé renforcera aussi les moyens de protection des militaires sur le terrain. Il offrira une protection large contre différents types de substances radioactives, tout en limitant les effets nocifs des radiations sur le corps.

Procédures

Aucun prélèvement invasif ou procédure chirurgicale sur les animaux n'est prévu(e) au cours des études. En revanche, les animaux auront une administration orale avec contention à deux reprises ce qui peut être source de stress. Par ailleurs, la collecte des excreta (urine et fèces), sans intervention sur l’animal, mais nécessitant un hébergement individuel en cage métabolique, est planifiée afin de pouvoir évaluer l’efficacité du nouveau traitement pharmacologique.

Impact sur les animaux

La période d’acclimatation et les études d’efficacité du traitement étant de courte durée (maximum 8 jours), il paraît peu probable d’atteindre des points limites tels que la perte de poids de 20%. Toutefois, en cas de signes cliniques ou comportementaux anormaux, l’euthanasie anticipée sera réalisée par une personne compétente. L’ensemble du personnel sera très vigilant au risque de fausse route lors des gavages et au bien-être des animaux au cours du passage durant 48h en cage à métabolisme.

Devenir

La fin des procédures consistera à collecter les différents organes de rétention d’intérêt pour mesurer la quantité de radionucléides et ainsi, pouvoir apprécier l’efficacité du nouveau traitement pharmacologique par rapport au traitement de référence. Il sera donc nécessaire d’euthanasier tous les animaux.

Remplacement

Le principal objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité d’un nouveau traitement pharmacologique en cas de contamination interne par différents radionucléides. Pour y parvenir, il est indispensable de pouvoir mesurer la rétention des éléments radioactifs dans les organes d’intérêt majeurs (tels que les os et le foie) et leur excrétion dans les urines et les fèces. S’appuyer sur le modèle animal apparait donc essentiel.

Réduction

Des études d’affinité chimique du composé avec les radionucléides seront préalablement réalisées dans des tubes à essais. Seuls les radionucléides pour lesquels le composé présente une efficacité d’extraction supérieure à 20% seront sélectionnés pour les études chez l’animal. Ces études in vitro permettront in fine de définir les conditions expérimentales dans lesquelles les études in vivo seront réalisées (notamment les RN retenus) et ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de la procédure. Par ailleurs, l’exposition des animaux se fera sous forme de mélange de RN selon notamment les techniques analytiques employées pour les mesurer, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Enfin, une étude statistique a été menée. Le nombre total d’animaux pour obtenir une puissance statistique suffisante est de 710. Cet effectif nous permettra d’obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Afin de garantir leur bien-être, les animaux auront à leur disposition le nécessaire en enrichissement pour satisfaire leurs besoins physiologiques et comportementaux. Une observation quotidienne des signes comportementaux (prise alimentaire, etc.) et cliniques (absence de blessure, peur, souffrance) sera également faite.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris comme modèle animal, couramment employé pour des études de pharmacologie en raison de sa pertinence physiologique et expérimentale. De plus, des études de toxicité du traitement ont déjà été menées chez cette espèce permettant ainsi de s’appuyer sur des données existantes. Dans le cadre d’une première étude d’efficacité d’un traitement pharmacologique, le stade adulte (animaux âgés de 8 à 10 semaines au moment de l’étude) sera utilisé.

2 672 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs dépôts de tissu adipeux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un même groupe de 360 souris subit 35 gavages, 3 injections, 3 périodes de jeûne de quatre à six heures et 27 prélèvements d'une goutte de sang, la moitié étant hébergée seize semaines à une température dérogatoire. D'autres reçoivent un régime riche en graisses pendant vingt semaines, et le porteur signale une prise de poids, un stress lié à l'hébergement individuel et au froid, et des hypoglycémies possibles lors des tests de tolérance à l'insuline. Sur le remplacement, il indique passer par des lignées cellulaires d'adipocytes bruns et beiges plutôt que par des cellules primaires pour la partie in vitro, tout en affirmant qu'il est "indispensable" de recourir au vivant pour saisir les interactions entre types cellulaires.

Objectifs

Chez les mammifères, il existe deux grands types de cellules graisseuses. Les cellules graisseuses blanches servent principalement de réserve d’énergie : elles stockent l’excès de calories sous forme de graisses et les libèrent lorsque l’organisme en a besoin. À l’inverse, les cellules graisseuses brunes et beiges ont une fonction différente : elles brûlent de l’énergie pour produire de la chaleur. Ce mécanisme, appelé thermogenèse, est particulièrement activé en cas d’exposition au froid, mais peut aussi se déclencher lorsque l’apport alimentaire est élevé. Ces cellules jouent donc un rôle important dans la régulation de la température du corps et dans l’équilibre énergétique. En situation d’obésité, le nombre et le fonctionnement de ces cellules capables de brûler des calories sont diminués. Cependant, les mécanismes responsables de cette altération restent mal compris. Il a été montré qu’une molécule issue du métabolisme des lipides peut freiner la formation de ces cellules « brûleuses » de graisses. Des données suggèrent également qu’un type particulier de cellules immunitaires présentes dans le tissu adipeux constitue une source importante de cette molécule. L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre le rôle de cette molécule produite par ces cellules immunitaires dans le développement de l’obésité et de ses complications (comme le diabète), ainsi que dans la capacité de l’organisme à produire de la chaleur en réponse au froid. Nous étudierons également si bloquer la production de cette molécule pourrait représenter une nouvelle piste thérapeutique pour lutter contre l’obésité et ses conséquences métaboliques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques qui favorisent l’obésité et ses complications, en particulier le rôle des cellules immunitaires dans le tissu adipeux. À terme, ces travaux pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à stimuler la dépense énergétique et à prévenir ou traiter l’obésité et les maladies métaboliques associées.

Procédures

Les interventions réalisées sur animaux vigiles seront les suivantes : 1) 360 animaux : 35 gavages (30 secondes) + 3 injections (30 secondes) + 3 périodes de jeûne (4 ou 6 heures) + 27 prélèvements d’une goutte de sang (30 secondes) + prélèvement sanguin terminal (1 minute), dont la moitié sera hébergée à une température dérogatoire pendant 16 semaines ; 2) 360 animaux : régime riche en graisses pendant 16 semaines + 35 gavages (30 secondes) + 3 injections (30 secondes) + 3 périodes de jeûne (4 ou 6 heures) + 27 prélèvements d’une goutte de sang (30 secondes) + prélèvement sanguin terminal (1 minute), dont la moitié sera hébergée à une température dérogatoire pendant 16 semaines ; 3) 512 animaux : régime riche en graisses pendant 20 semaines + 13 gavages (30 secondes) + 2 injections (30 secondes) + 3 périodes de jeûne (4 ou 6 heures) + 18 prélèvements d’une goutte de sang (30 secondes) + prélèvement sanguin terminal (1 minute), dont la moitié sera hébergée à une température dérogatoire pendant 20 semaines ; 4) 360 animaux : 3 gavages (30 secondes) + prélèvement sanguin terminal (1 minute), dont la moitié sera hébergée individuellement à une température dérogatoire pendant 6 heures ; 5) 360 animaux : 6 gavages (30 secondes) + prélèvement sanguin terminal (1 minute), dont la moitié sera hébergée à une température dérogatoire pendant 10 jours ; 6) 720 animaux : régime riche en graisses et hébergement à une température dérogatoire pendant 20 semaines + 19 injections (30 secondes) + 1 période de jeûne (6 heures) + prélèvement sanguin terminal (1 minute).

Impact sur les animaux

Le régime riche en graisses entraîne une prise de poids. La contention pour les gavages induit un stress transitoire. Les injections et prélèvements sanguins provoquent une douleur légère. Lors du test de tolérance à l’insuline, l’injection d’insuline peut provoquer une hypoglycémie. L’hébergement individuel et l'exposition au froid induisent un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les différents dépôts de tissus adipeux dans le but de les analyser pour répondre aux objectifs scientifiques définis.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, les études in vitro seront réalisées sur des lignées cellulaires d’adipocytes bruns/beiges au lieu de cellules primaires isolées à partir des animaux. Cependant, pour comprendre les fonctions d'une molécule produite par les macrophages du tissu adipeux, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans le tissu adipeux et entre les différents organes.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, nous organiserons les croisements de manière à éviter de faire naître des animaux dont nous n’avons pas besoin. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.

Raffinement

Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Nous surveillerons l’aspect des sites d’injection et de prélèvement. Dans le cas d’injections répétées, nous utiliserons des aiguilles très fines et nous effectuerons une rotation des sites d’injection. En cas d’hypoglycémie lors des tests de tolérance à l’insuline, une injection de glucose sera réalisée. Dans les différentes procédures, le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (au moins une fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, nous étudions les macrophages du tissu adipeux et nous disposons déjà du modèle génétique murin permettant de les cibler. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. L’ensemble des procédures se fera sur des souris jeunes adultes (à partir de 7 semaines d’âge), de façon à étudier des organismes physiologiquement stables, qui ne sont ni en phase de croissance ni en processus de vieillissement.

Injectées, opérées du cœur pour provoquer un infarctus, puis passées à l'échocardiographie sous anesthésie, 2 540 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs tissus et organes. L'objectif immédiat est de comprendre comment une hormone thyroïdienne et ses transporteurs agissent sur la réparation cardiaque, les traitements évoqués pour les personnes malades restant au conditionnel et au long terme. Le porteur signale une douleur modérée de courte durée après l'infarctus expérimental, une baisse d'activité ou d'appétit, et une "mortalité liée au modèle chirurgical". Deux âges sont utilisés, des nouveau-nés de 1 à 3 jours dont le cœur se régénère naturellement, et des adultes de plus de 8 semaines dont le cœur ne se régénère pas, ce que le porteur juge plus proche de la situation humaine.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre comment certaines hormones et les éléments qui les transportent dans le corps peuvent aider le cœur à se réparer après une crise cardiaque. L’objectif est de découvrir comment ces hormones soutiennent la guérison du cœur et, à terme, de trouver de nouvelles façons d’améliorer la réparation cardiaque chez l’être humain.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices importants pour la santé du cœur : - Nouveaux traitements possibles : En testant de nouvelles façons d’aider le cœur à se réparer après une crise cardiaque, ce projet pourrait ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces que celles que nous avons aujourd’hui. - Idées utiles pour d’autres maladies : Les méthodes développées ici pourraient aussi servir pour d’autres organes ou maladies où les tissus se réparent mal, ce qui pourrait aider à faire avancer la médecine régénérative dans son ensemble. - Moins de séquelles et de coûts pour la société : La crise cardiaque est l’une des principales causes de décès et de handicap. Si le cœur pouvait mieux se réparer, cela réduirait les complications pour les patients, les hospitalisations répétées et certains traitements lourds, ce qui bénéficierait à la fois aux personnes malades et au système de santé.

Procédures

Injection, durée approximative 5 à 10 minutes par animal. Chirurgie cardiaque, durée approximative 15 à 20 minutes par animal. Échocardiographie : durée approximative 5 à 10 minutes par animal. Chaque intervention est réalisée une seule fois par animal sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Ce projet implique des interventions cardiaques qui peuvent provoquer : • Une gêne légère et passagère au point d’injection. • Un stress temporaire lié à la manipulation. • Une douleur modérée de courte durée après l’infarctus expérimental, pouvant s’accompagner d’une baisse d’activité ou d’appétit. • Une gêne très brève lors des échographies. Une mortalité liée au modèle chirurgical.

Devenir

L’ensemble des souris sera mis à mort à la fin du projet afin de permettre le prélèvement de tissus et d’organes nécessaires aux analyses biologiques (histologiques, moléculaires et/ou biochimiques). Ces analyses ne pouvant pas être réalisées in vivo, la mise à mort constitue une étape indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Aujourd’hui, aucun modèle en laboratoire (comme les organoïdes ou les cultures de cellules cardiaques) ne peut reproduire exactement ce qui se passe dans un cœur après une crise cardiaque. On utilise ces modèles pour étudier certains mécanismes précis, mais ils ne peuvent pas remplacer les expériences réalisées sur des animaux vivants, nécessaires pour comprendre la réparation du cœur dans son ensemble.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour chaque manipulation est basé sur notre expérience au laboratoire et a été déterminé afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum l’utilisation d’animaux. Lorsque cela est possible, nous favorisons des approches permettant de suivre les mêmes animaux dans le temps (imagerie non invasive, mesures répétées), ce qui réduit le nombre nécessaire par groupe. Les analyses sont ensuite réalisées avec des méthodes adaptées garantissant la qualité scientifique des résultats, tout en respectant le principe de réduction.

Raffinement

Deux protocoles d’anesthésie et d’analgésie sont proposés, afin de s’adapter aux besoins expérimentaux tout en assurant le confort des animaux. La chirurgie est réalisée par un personnel formé et expérimenté, suivant un protocole standardisé et rigoureux. Le contrôle de la douleur est garanti pendant l’intervention et après, avec une surveillance post-opératoire étroite. Les conditions d’hébergement sont optimisées : cages chauffées, enrichies, avec récupération en groupe. Des points limites sont définis, et des critères de mise à mort sont appliqués en cas de souffrance non contrôlable.

Choix des espèces

Ce projet utilise la souris comme modèle, car elle est aujourd’hui l’animal de référence pour l’étude de l’infarctus du myocarde. La souris a été choisie car : • Elle permet d’observer et de suivre précisément les cellules du cœur. • Sa petite taille facilite l’étude du cœur avec des méthodes d’imagerie et d’analyse détaillées. • Les réactions de son système cardiovasculaire sont bien caractérisées. Deux stades de développement sont étudiés : • Les nouveau-nés (1 à 3 jours) : ils présentent une capacité naturelle de régénération cardiaque. Leur étude permet d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette régénération. • Les adultes (plus de 8 semaines) : leur cœur ne se régénère pas après un infarctus, ce qui correspond davantage à la situation humaine. Ils servent de référence pour comparer les mécanismes de réparation avec ceux observés chez les nouveau-nés.

Pour déterminer à quelle vitesse une tumeur cérébrale greffée se développe et quand commencer à tester un traitement, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever cerveau et tumeur. Des cellules cancéreuses leur sont greffées dans le cerveau au cours d'une chirurgie de quarante-cinq minutes, puis la tumeur est suivie jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie sur soixante jours au plus. Le porteur indique que la croissance de la tumeur peut entraîner des effets neurologiques selon la structure cérébrale visée, et classe l'ensemble en souffrance modérée. Il retient six souris par groupe et emploie des souris dépourvues de système immunitaire pour greffer des cellules humaines, ou des souris immunocompétentes lorsque la réaction immunitaire doit être observée.

Objectifs

Les cancers du cerveau (et plus particulièrement les glioblastomes qui représentent 30% de ces cancers) sont des maladies graves qui touchent de nombreuses personnes, et les traitements actuels ne permettent pas d’apporter une solution thérapeutique efficace aux patients. Pour développer de nouveaux médicaments, il faut d'abord les tester sur des modèles qui reproduisent la maladie le plus fidèlement possible avant tout essai chez l’humain. Ce projet vise à améliorer la recherche de traitements contre certains cancers du cerveau, encore difficiles à soigner aujourd'hui. Il a pour objectif d’étudier les meilleures conditions pour reproduire et suivre des tumeurs cérébrales chez la souris. L'objectif est de savoir si les cellules cancéreuses s'installent correctement, à quelle vitesse la tumeur se développe, et quel est le bon moment pour commencer à tester un traitement. Concrètement, des cellules cancéreuses sont greffées dans le cerveau de la souris sous anesthésie générale et anti-douleurs, puis la croissance des tumeurs est observée régulièrement grâce à des techniques d’imageries qui permettent de visualiser la tumeur de façon non invasive. Les souris utilisées seront dépourvues de système immunitaire pour éviter le rejet de la greffe lorsque les cellules tumorales utilisés seront d’origines humaines. Dans le cas où l’impact du système immunitaire serait important dans nos hypothèses, des souris immunocompétentes seront utilisés et des tumeurs de souris seront greffées pour modéliser une tumeur dans son microenvironnement sans risque de rejet de greffe. Ce travail permettra de choisir les meilleurs modèles pour tester de futurs médicaments et comprendre leurs mécanismes d’actions.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de disposer de modèles de recherche fiables qui reproduisent fidèlement la maladie. Habituellement, les cellules tumorales sont implantées sous la peau des animaux, mais cette méthode a des limites importantes : l'environnement autour de la tumeur n'est pas le même que dans le cerveau, et la barrière naturelle (barrière hématoencéphalique) qui protège le cerveau n'est pas présente. En étudiant la tumeur directement dans le cerveau, là où elle se développe réellement, ce projet vise à mieux comprendre comment le cancer se développe dans un organisme vivant. Cela permettra d'adapter les conditions de test pour évaluer plus efficacement les futurs médicaments. À court terme, ces connaissances sont essentielles pour développer des modèles d’études pertinents et identifier à moyen terme des traitements plus efficaces, dans le but d'améliorer la survie et la qualité de vie des personnes atteintes de cancer du cerveau.

Procédures

Intervention chirurgicale pour la greffe des cellules tumorales sous anesthésie générale gazeuse et locale avec injection d’analgésie (45 min) – 1 fois Imagerie sous anesthésie gazeuse (20min) – 1 fois par semaine jusqu’à 8 fois au cours de l’étude après injection d’un substrat dont la transformation émet des photons détectables par imagerie durant 60 jours maximum.

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut survenir lors : − de la phase chirurgicale sous anesthésie nécessaire à l’administration des cellules (d’une durée d’environ 45 minutes) et du suivi post-opératoire (Stress et douleur modérée) -de la phase de pousse de la tumeur (60 jours maximum). L’évolution de la tumeur pourrait potentiellement avoir des effets neurologiques lié à la pousse de la tumeur et la structure cérébrale ciblée. Ce qui pourrait engendrer une douleur et un stress modéré. - de l’anesthésie gazeuse pour l’évaluation de la taille de la tumeur par de l’imagerie par bioluminescence d’une durée de 20 min hebdomadaire maximum sur une durée de deux mois maximum (Stress léger) - des injections d’anesthésiques et d’analgésiques lors des soins pré- péri- et post-opératoire, et également lors de la mise à mort en fin d’étude mais également l’injection hebdomadaire durant deux mois du substrat dont la transformation émet des photons détectable lors des mesures par imagerie. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress

Devenir

À la fin des procédures, tous les animaux sont mis à mort. Cette étape est nécessaire pour prélever et analyser les tissus (cerveau, tumeur) afin de valider les caractéristiques du modèle et de comprendre précisément le développement de la maladie à l'échelle cellulaire et de l’organe. Ces prélèvements permettent également de générer des échantillons pour des analyses complémentaires, optimisant ainsi l'utilisation de chaque animal.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer des conditions de greffe et de croissance de tumeurs implantées dans le cerveau chez la souris immunodéficiente ou immunocompétente. Dans un premier temps les lignées d’intérêts sont sélectionnées in vitro lors d’études dites de validation de cible (surexpression ou suppression du gène cible). Puis une fois validée, l’implantation des cellules permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du cerveau (Glioblastome) permettant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. De plus, cette localisation ajoute une complexité au développement du médicament qui se doit d’avoir des propriétés physico-chimiques spécifiques pour atteindre la tumeur et franchir la barrière hématoencéphalique tout en interagissant avec la cible. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le micro-environnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in-vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. Par la suite, l’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux.

Réduction

• Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie. En accord avec les données de la littérature et les données générées en interne ainsi que les recommandations du service biostatistique qui nous accompagne, 6 animaux par groupe est le minimum nécessaire • Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. • L’imagerie permet une détection des tumeurs non visibles à l’œil nu. Cette technique permet de suivre l’évolution des tumeurs au cours du temps et fait de l’animal son propre témoin (Suivi longitudinal), ce qui concourt directement à la réduction du nombre de souris nécessaires dans une même étude.

Raffinement

• La procédure de greffe tumorale dans le cerveau est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire, avec un maintien de la température corporelle dès l’anesthésie jusqu’au réveil total de la souris. • Les souris seront replacées en hébergement groupé après la chirurgie. • Mise en place de gel nutritif en préventif systématiquement 3 à 5 jours avant la chirurgie, dans un but d’habituation des animaux à l’aliment pour favoriser la prise en postopératoire ainsi que la récupération post chirurgie, puis tout au long de l’étude. • L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs comportements naturels comme ronger, se réfugier ou nidifier et favoriser le comportement de fouissage. • Les animaux font l’objet d’une observation clinique en post chirurgie et tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la Structure chargée du bien-être des animaux et les points limites seront appliqués. • Les animaux peuvent être hébergés dans des cages connectées. Ce mode d’hébergement permet de suivre, au cours de l'étude, d’éventuelles altérations de l’activité cumulée des souris dans une cage. Avec ce système l’analyse des résultats fournira une meilleure documentation des modèles. • Le suivi de la croissance tumorale par l’imagerie sous anesthésie gazeuse est une méthode non invasive et sans douleur pour l’animal qui permet de suivre un même animal tout au long de l’étude sans procéder à l’examen macroscopique de la tumeur en systématique. Les tumeurs sont mesurées par l’intensité du signal émis par les cellules tumorales 1 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter le stress ressenti par les animaux .

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe de cellules tumorales dans le cerveau chez la souris est décrite comme hautement pertinente La souris est le modèle de référence grâce à sa structure cérébrale et sa barrière hémato-encéphalique proches de celles de l'humain. La diversité des souches de souris disponibles permet aussi bien l'étude du système immunitaire sur des tumeurs murines (souris immunocompétentes) que la xénogreffe de cellules humaines sans risque de rejet (souris immunodéprimées). Le phénotype dommageable des souris immunodéprimées est maitrisé par les conditions strictes d’hébergement de notre animalerie protégée dans les études précliniques d’oncologie. La souris est le modèle de référence grâce à la structure de son cerveau et sa barrière physico chimique « hémato-encéphalique » proches de celles de l'humain. La diversité des souches de souris disponibles permet aussi bien l'étude du système immunitaire sur des tumeurs murines (souris immunocompétentes) que la xénogreffe de cellules humaines sans risque de rejet (souris immunodéprimées). Le phénotype dommageable des souris immunodéprimées est maitrisé par les conditions strictes d’hébergement de notre animalerie protégée Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie, il permet d’atteindre un poids corporel suffisant de l’animal pour assurer une bonne récupération post- chirurgicale. De plus à cet âge les souris présentent un cerveau développé et accessible pour l’implantation de tumeurs.