Rongeurs
Electrorétinographie, potentiel évoqué visuel et thérapie génique chez des souris modèles de myopathie de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour vérifier si l'électrorétinogramme peut servir de marqueur des atteintes cérébrales de la myopathie de Duchenne, 1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau et de la rétine, dans des procédures menées sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent la pose d'électrodes sur la cornée, une incision du scalp et une ou deux perforations du crâne, une injection intraoculaire et une injection intracérébrale, sous anesthésie prolongée de deux heures chez les adultes et sous hypothermie sur glace chez les nouveau-nés. Le porteur indique que les injections dans l'œil peuvent provoquer une déshydratation, un ulcère de la cornée ou une cataracte, et qualifie de légère la douleur des interventions chirurgicales. Il précise que le projet sera interrompu si aucune anomalie corticale n'est mesurable, auquel cas l'effectif déclaré serait "largement surestimé".
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est causée par des mutations d’un gène qui produit des protéines nommées dystrophines, qui conduisent à une dégradation des muscles pouvant être associée à des troubles cognitifs et divers autres troubles sensoriels et cérébraux. Les patients atteints de DMD peuvent notamment développer des rétinopathies. Nos récents travaux montrent que chez différents modèles murins de DMD, l’expression de différentes dystrophines rétiniennes, et la fonction de la rétine, sont affectées de manière variable en fonction de la position de leur mutation. Les anomalies mesurées in vivo à l’aide d’électrorétinogrammes (ERGs) pourraient refléter la sévérité des troubles cérébraux, aider à classer les patients en fonction de la sévérité de leurs atteintes centrales, voire servir de marqueur non invasif de l’évolution de la pathologie et des effets de traitements thérapeutiques. Le projet a pour but de vérifier cette hypothèse en enregistrant en parallèle les ERGs et les potentiels évoqués dans le cortex visuel (Potentiel évoqué visuel, ou PEV), chez des souris porteuses de différentes mutations. Le PEV est un outil important pour évaluer la fonction visuelle et le traitement cortical des informations visuelles, offrant une nouvelle perspective d’étude de l'impact neurologique de la maladie. La mesure synchronisée des ERGs et des PEVs permettra de vérifier l’existence d’une corrélation entre la sévérité des altérations rétiniennes et celle des altérations cérébrales. Le cas échéant, nous testerons ensuite la sensibilité de ces mesures électrophysiologiques à des traitements de thérapie génique pour déterminer si les ERGs, et/ou les PEVs, peuvent effectivement servir de marqueur d’efficacité des traitements ciblant le cerveau. Ce projet est donc important pour le diagnostic, le développement et le suivi de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des troubles affectant le système nerveux dans la DMD.
Bénéfices attendus
L’évaluation des capacités visuelles à l’aide d’électrorétinogrammes et l’enregistrement de potentiels évoqués corticaux sont très rarement effectuées chez les patients, voire pas du tout en ce qui concerne l’activité électrique corticale. Notre étude permettra d’évaluer si ces mesures devraient être appliquées chez les patients, soit dans un but pronostique (évaluer la sévérité de futures déficits cérébraux), diagnostique (classer les patients en fonction de la sévérité des atteintes centrales présumées), ou encore pour suivre l’évolution de la pathologie ou des effets d’un traitement avec des méthodes qui seront non invasives chez l’Homme. Les approches de thérapie génique prévues dans ce projet incluent différents mode d’injections qui permettront de déterminer la réversibilité des déficits centraux en fonction de l’âge auquel le traitement est administré. Elles permettront aussi d’identifier les dystrophines qu’il faut ré-exprimer en priorité pour atteindre un objectif thérapeutique, et la fenêtre thérapeutique optimale pour ces traitements. Les découvertes issues de ces études ont un intérêt critique pour l’orientation du traitement d’un nombre important de patients atteints de DMD, et les méthodes employées pourront également être applicables à d’autres pathologies du système nerveux.
Procédures
Une anesthésie avec hypothermie transitoire (5 min) chez les nouveau-nés, ou une anesthésie profonde prolongée chez les souris adultes (2h), éventuellement répétée après un intervalle de 2 mois. Sous anesthésie générale et avec analgésie : Pose d’électrodes de contact sur la cornée de l’œil, d’électrodes sous-cutanées, incision du scalp et 1 ou 2 perforations du crâne pour électrodes corticales de surface (sans réveil), injection intraoculaire (1 œil, 1 fois, sans réveil), 1 injection intracérébrale (une seule fois) sous anesthésie générale (durée environ 5 min).
Impact sur les animaux
Les injections intraoculaires sont susceptibles d’induire une déshydratation oculaire, un ulcère de la cornée ou une cataracte. Certaines interventions chirurgicales peuvent occasionner une douleur légère pendant et après la chirurgie. L’anesthésie sur glace provoque une hypothermie.
Devenir
À la suite des enregistrements, les souris tests seront euthanasiées pour prélèvements post-mortem du cerveau et de la rétine.
Remplacement
Nos molécules thérapeutiques font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques, non toxiques sur cellules, et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Ensuite, les études précliniques pour ces pathologies n’ont pas de modèle in silico ou in vitro et sont généralement menées sur des souris modèles déficientes en dystrophine chez lesquelles les déficits sont préalablement caractérisés, afin de servir de marqueur pour évaluer l’efficacité des traitements. Notre projet implique des injections suivies de périodes de récupération, et des enregistrements électrophysiologiques qui nécessitent l’utilisation d’animaux vivants, mais sous anesthésie et antalgie.
Réduction
Sur la base d’études précédentes, la caractérisation des anomalies rétiniennes et cérébrales nécessite 12-15 souris par groupe, minimum nécessaire pour une démonstration statistique convaincante des objectifs. Certains groupes comprennent des souris recevant un traitement et des groupes contrôles indispensables aux analyses statistiques. Nous utiliserons préférentiellement des tests statistiques adaptés aux petits échantillons, sauf dans le cas d’analyses plus complexes d’interactions entre facteurs ne pouvant être effectuées avec ces tests. Pour les traitements, la sélection préalable in vitro, des molécules à fort potentiel thérapeutique et non toxiques, permet de limiter le nombre d’études in vivo. Le projet comprend une caractérisation préalable des dysfonctions, qui débutera avec les souris modèles connues pour exprimer les déficits les plus sévères. Si cette étude ne révèle pas de dysfonction mesurable au niveau cortical, la suite du projet sera interrompue, auquel cas le nombre d’animaux déclaré dans ce projet sera largement surestimé.
Raffinement
Dans le cas où les animaux seraient importés et non issus de nos élevages, ils auront 5-7 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement lors de leur arrivée. Tous les tests seront effectués avant l’âge de 6 mois, donc avant apparition de la faiblesse musculaire due à la myopathie. Les injections et anesthésies, la récupération post-opératoire et les études fonctionnelles ont été optimisées en concertation avec notre vétérinaire. Elles comprennent une anesthésie/analgésie générale et locale (au niveau de l’œil et de la peau du crâne), une prévention de la déshydratation oculaire, et l’utilisation d’un tapis chauffant pendant la chirurgie (sauf pour les injection néonatales sous anesthésie par hypothermie) et pendant le réveil. Toutes les manipulations sont effectuées par des personnels qualifiés parfaitement formés aux procédures mises en place dans ce projet ; le taux d’échec sera donc faible. Les thérapies géniques ont été choisies sur la base des études antérieures pour leur efficacité, l’absence de toxicité et la possibilité de transposer les résultats à des doses applicables à des patients. Leur administration nécessitera des interventions chirurgicales qui ont déjà été éprouvées, qui sont maitrisées et associées à des anesthésies générales avec analgésie, et un suivi régulier des animaux. Le bien-être des souris au cours du traitement sera évalué par observation quotidienne par l’expérimentateur et par l’équipe zootechnique le week-end. En cas de signe de détresse ou souffrance, l’animal sera soigné, ou bien retiré de l’expérimentation et euthanasié, selon un protocole mis en place avec notre vétérinaire référent. Les conditions d’hébergement sont enrichies jusqu’à la fin du projet et les souris expérimentales sont maintenues en groupe sociaux par fratrie.
Choix des espèces
D’autres modèles animaux de la DMD existent (rat, chien, porc), mais seule l’espèce souris permet actuellement de disposer de différents modèles mutants ou transgéniques porteurs de mutations variées et représentatives des sous-groupes de patients montrant des variations dans la sévérité des symptômes. Les troubles visuels ont uniquement été étudiés chez les souris modèles. Les recherches précliniques pour ces pathologies sont donc généralement menées sur ces souris modèles, chez lesquelles les problèmes identifiés servent de marqueur pour évaluer l’efficacité des traitements. Les électrorétinogrammes ne sont pas stables avant 8 semaines, et il est important de ne pas inclure des variations liées à l’âge qui pourraient compliquer nos conclusions sur les effets des traitements. Les enregistrements seront donc effectuées chez des souris adultes (12-14 semaines), ce qui sera comparable à nos études précédentes. Les injections intraoculaires et intracérébrales seront effectuées au moins 2 mois avant, temps nécessaire pour atteindre un plateau d’efficacité des molécules thérapeutiques. Pour être en accord avec de précédentes études, les souris seront injectées à l’âge 8 semaines, excepté pour le groupe qui recevra un traitement en post-natal (nouveau-nés). L’administration du traitement dans un groupe de nouveau-nés est susceptible d’être plus efficace d’après des résultats obtenus par des collaborateurs, et pourrait avoir des effets préventifs plutôt que curatifs.
Approche thérapeutique par injection de morpholinos pour un modèle de souris MTM1.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'échantillons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Atteintes d'une myopathie qui les affaiblit dès l'âge de quatre semaines, elles reçoivent quatre injections de composés puis trois injections d'anesthésiques, sous contention manuelle et mécanique, pour une mesure de la force musculaire que le porteur annonce par "différents tests" sans les nommer. Les retombées annoncées pour les malades restent au conditionnel, le projet devant fournir la seule preuve qu'une protéine ciblée peut améliorer le phénotype musculaire des souris. Le porteur affirme avoir déjà démontré l'efficacité de ce type de traitement dans un autre modèle murin, et conclut néanmoins qu'un modèle in vivo est "essentiel" et la souris "indispensable".
Objectifs
Les myopathies centronucléaires (CNM) sont des maladies rares touchant le muscle squelettique, et les personnes affectées souffrent d’une faiblesse musculaire générale et souvent fatale. L' objectif sera de cibler et diminuer spécifiquement l’expression du géne resposable dela maladie. En effet, notre équipe a préalablement démontré l’efficacité de ce type de traitement dans un autre modèle murin. Cependant, chez les patients, des effets toxiques ont été observés ,avec certaines molécules de composition chimique différente. C est pourquoi, nous voulons développer dans ce projet une nouvelle génération de molécules pour obtenir un traitement efficace sans effet toxique. Il s'agit d' une approche thérapeutique génique en injectant des petites molécules avant l’apparition des premiers signes afin de pouvoir évaluer l’efficacité du traitement ( en mesurant la force musculaire des souris par différents tests) et ainsi guérir (ou du moins atténuer) la myopathie.
Bénéfices attendus
Le projet vise à mieux comprendre le développement des CNMs et de fournir la preuve de concept que la réduction d'une protéine ciblée peut améliorer le phénotype musculaire des sourisCNM. Ce travail pourra conduire au développement d'approches thérapeutiques pour les patients CNM qui restent à ce jour incurrables.
Procédures
Nous prévoyons les interventions suivantes : 1) 4 injections de composés chimiques - durée : moins d 'une minute. 2) 3 injections pour les mesures de la force musculaire - durée: 20 minutes.
Impact sur les animaux
Ces souris présentent un phénotype sévère de faiblesse musculaire qui nécessite une surveillance dès l âge de 4 semaines où les premiers signes apparaissent. Cette faiblesse musculaire devient observable et quantifiable lors de tests de force générale et spécifique. L injection de morpholinos peut induire une nuisance chez les animaux ainsi que l injection d 'anesthesiques (lors de la mesure de force musculaire) peut causer des nuisances. Il y aura aussi une contention manuelle lors de l injection d anesthésiques ) et une contention mécanique ( lors de l injection des morpholinos) Nous proposons donc une procédure de suivi en tenant compte de tous ces critères .
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d 'échantillons.
Remplacement
Ce projet vise à étudier et à évaluer l’effet d’approches thérapeutiques sur la fonction et la structure musculaire. Pour ces raisons, un modèle in vivo est essentiel et nous ne pouvons avoir recours à des modèles in vitro. Les connaissances du système musculaire sont très développées chez la souris, qui représente de ce fait un modèle approprié et indispensable pour étudier la physiopathologie des CNM et établir des approches thérapeutiques qui pourraient être transférées aux patients dans l’avenir.
Réduction
Un nombre maximal de 10 souris par groupe sera utilisé (pour les 4 groupes étudiés) Ces nombres ont été calculés pour s’assurer que l’étude soit statistiquement et scientifiquement valable. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées chez les mêmes souris réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et les difficultés ambulatoires. Nous avaluerons la douleur à 'l aide d 'un tableau de détection de la douleur chez la souris: dans chacune des catégories de la table, un système d’évaluation avec indices de 0 (signe absent) à 2 (signe évident de douleur) sera utilisé. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré ) et l’étude sera prématurément arrêtée. Lors de la procédure de mesure de la force in situ, les souris seront anesthésiées par trois injections afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l' expérience. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur chaleur corporelle. Nous surveillerons également la sècheresse oculaire et rajouterons de l ocrygel si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent et courant en myologie. son systéme musculaire est bien étudié et de nombreuses techniques d’analyse sont établies afin de mener à bien les analyses. Par ailleurs, notre équipe dispose de plusieurs modèles murins de myopathies centronucléaires sur lesquels nous avons publié de nombreux articles. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Enfin, ces souris présentent des phénotypes comparables aux patients humains, qui en font des modèles appropriés pour comprendre la maladie et développer des traitements. Les souris seront injectées à partir de 4 semaines d 'âge ce qui correspond au début de l apparition des symptômes.
Evaluation de l’impact d’une protéine sur la formation, la stabilité et la dissolution d’un caillot sanguin au cours d’un accident vasculaire cérébral chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une moitié des souris est maintenue sous anesthésie jusqu'à sa mise à mort, sans jamais reprendre conscience. 360 souris vont être utilisées, 180 dans ce régime sans réveil et 180 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur sang, le caillot et les tissus. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par une intervention chirurgicale d'environ une heure trente avec injection dans le cerveau, suivie selon les groupes d'une observation au microscope pouvant durer deux heures. Le porteur affirme que seules des souris peuvent reproduire la complexité vasculaire du cerveau et la réaction des cellules immunitaires lors d'un AVC, après des essais préalables menés sur du sang de souris.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux dits ischémiques sont dus à un caillot, qui bloque la circulation sanguine dans une artère cérébrale. La résistance de ces caillots aux traitements varie selon les individus. Ce projet étudie une protéine présente dans les vaisseaux sanguins qui, lorsqu’elle circule dans le sang, peut limiter la formation des caillots ou destabiliser les caillots. L’objectif de ce projet est d’évaluer le potentiel de cette protéine, pour empêcher la formation du caillot, ou le déstabiliser une fois formé. Cette protéine permettra de proposer de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter les accidents vasculaires cérébraux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre le rôle de la protéine étudiée dans la formation et la dégradation des caillots lors d’un accident vasculaire cérébral. L’ischémie cérébrale, due à l’occlusion d’une artère, endommage les tissus cérébraux et altère les fonctions cérébrales. Plus cette occlusion persiste dans le temps, plus les dommages causés au cerveau deviennent irréversibles pour les patients. Cette étude pourrait ouvrir la voie à une nouvelle stratégie thérapeutique visant à rétablir ou améliorer la circulation sanguine dans les artères cérébrales et ainsi limiter les séquelles liées à l’ischémie. À terme, cette approche pourrait contribuer à réduire la survenue des complications et la mortalité associées aux accidents vasculaires cérébraux. Les résultats obtenus dans ce projet permettront d’améliorer les connaissances sur les mécanismes impliqués dans la formation et la dégradation des caillots, et pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients.
Procédures
Les animaux seront répartis en différents groupes selon les expériences réalisées. Ils recevront jusqu’à trois administrations de traitement contre la douleur, chaque administration durant environ 30 secondes. Selon les groupes, une anesthésie générale sera réalisée soit pour une intervention chirurgicale d’une durée totale d’environ 1 heure 30 minutes, soit pour une observation au microscope d’une durée maximale de 2 heures. Une injection d’un marqueur permettant la visualisation du caillot, sera effectuée avant cette observation (environ 30 secondes). Plusieurs administrations de molécules seront réalisées à différents moments de l’étude (30 minutes avant ou après l’intervention, ou 2 heures après), chaque administration durant moins d’une 1 minute. En fin d’étude, une anesthésie générale profonde sera réalisée afin de permettre le prélèvement des tissus. Enfin, une ou deux administrations de solution physiologique seront réalisées après la chirurgie pour assurer la réhydratation, chaque administration durant environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
L’induction d’un accident vasculaire cérébral dû à un caillot nécessite une intervention chirurgicale et une injection dans le cerveau, réalisées sous anesthésie générale. Les effets indésirables attendus comprennent une douleur liée à la chirurgie, d’intensité modérée, prise en charge par un traitement contre la douleur. Selon les situations expérimentales, les animaux peuvent soit être maintenus sous anesthésie pendant toute la durée de l’expérimentation, soit être réveillés après l’intervention. Dans ce dernier cas, ils font l’objet d’un suivi attentif afin de limiter toute douleur ou souffrance.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer du sang, le caillot et les tissus.
Remplacement
Des expériences in vitro ont été réalisées permettant de réduire l’utilisation d’animaux vivants. Ces expériences, faites sur du sang de souris, ont permis d’étudier comment la protéine d’intérêt influence la formation et la stabilité des caillots. Elles nous ont aussi aidés à réduire le nombre d’animaux nécessaires, en déterminant à l’avance la dose la plus adaptée pour les études suivantes. Cependant, pour comprendre l’effet de cette protéine dans un accident vasculaire cérébral, il est indispensable d’utiliser un modèle vivant. Seules des souris peuvent reproduire la complexité vasculaire du cerveau, et des cellules immunitaires lors d’un accident vasculaire cérébral, ce qui n’est pas possible avec des tests entièrement in vitro. Ces informations nous permettent de mener les expériences dans les meilleures conditions, en appliquant la règle des 3R pour limiter au maximum l’inconfort animal.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. L’estimation du nombre d’animaux nécessaires se fonde sur des travaux précédents réalisés avec le même modèle d’AVC, sur des données de la littérature scientifique et sur l’utilisation d’un logiciel statistique spécialisé.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les interventions nécessitant une chirurgie seront faites sous anesthésie générale, avec des mesures destinées à assurer le confort des animaux avant, pendant et après l’intervention. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout le long de la procédure, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant. Une grille de score et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteinte d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi car il permet d’étudier les maladies cérébro-vasculaires, comme l’AVC, en reproduisant plusieurs caractéristiques observées chez l’humain, telles que les déficits comportementaux et l’évolution des lésions cérébrales dans le temps. Les mécanismes complexes impliqués dans l’AVC ischémique, incluant différents types cellulaires et des réponses immunitaires différentes, nous impose l’utilisation de modèle in vivo pour intégrer l’ensemble de ces phénomènes impliqués dans l’étude de l’évaluation d’un traitement préventif ou curatif. En sachant que les accidents vasculaires cérébraux touche principalement les adultes, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 2 à 3 mois. Ce choix garantit que les animaux sont à un stade de développement comparable à celui des patients adultes, tout en permettant une observation fiable des effets du modèle et des traitements testés.
Etude et vectorisation de nouvelles molécules à visée anti-fibrotique MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Prostration, chute de la température, perte de poids : ces seuils, une fois atteints, déclenchent la mise à mort des souris. 300 souris vont être utilisées, 90 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 170 modéré et 40 sévère, toutes tuées à la fin pour prélever et imager leurs organes. Une fibrose pulmonaire leur est provoquée par instillation de bléomycine dans la trachée ou par voie nasale, puis elles enchaînent jusqu'à cinq séances d'imagerie, sept injections intrapéritonéales et cinq prélèvements de sang, sous anesthésie gazeuse à chaque fois. Le porteur retient des mâles de huit semaines pour leur sensibilité aux atteintes pulmonaires provoquées par la bléomycine, autrement dit parce qu'ils développent la maladie plus facilement.
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique fibrosante associée à un déclin progressif de la fonction pulmonaire et a une durée médiane de survie inférieure à 5 ans après le diagnostic. Il n'existe pas de traitement curatif et les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la fibrose pulmonaire sont encore peu connus. Dans ce projet, nous proposons d’optimiser l'administration de nouveaux composés anti-fibrose et de tester leur efficacité dans des modèles murins de fibrose pulmonaire. Le développement de la fibrose sera suivi de manière non invasive par imagerie. Seuls les composés validés sur cellules seront évaluées chez l'animal. Les composés porteront un marqueur fluorescent afin de suivre leur comportement dans l’organisme en temps réel et de façon non-invasive par imagerie de fluorescence. L’efficacité des composés sera evaluée pour le traitement de la fibrose. De plus, l'efficacité, la spécificité et le mécanisme d'action des composés dans les différentes populations cellulaires du poumon atteint de fibrose seront évalués sur les poumons. Les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le processus de fibrose, et le recours à l’animal reste une étape indispensable pour démontrer le potentiel traitement anti-fibrose d’un candidat médicament. Ces composés seront également évalués dans des cellules pulmonaires primaires provenant de patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique pour valider ce médicament dans un contexte humain.
Bénéfices attendus
La fibrose est un processus complexe mettant en jeu de nombreux types cellulaires. Les options de traitement pour la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) sont limitées avec seulement deux médicaments approuvés, le nintedanib et la pirfénidone, qui ralentissent la progression de la fibrose pulmonaire mais sont incapables d'inverser ou même d'arrêter la maladie. Ce projet permettra d'optimiser l'administration de composés anti-fibrose pour augmenter l'efficacité de traitement. Il pourra également ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour d'autres types de fibrose, comme la fibrose rénale, hépatique ou musculaire.
Procédures
Dans le cadre de l'administration des composés, les animaux subiront soit une injection intraveineuse (1 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse), soit une administration par voie intratrachéale (1 fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse). Dans le cadre de la cinétique sanguine, les animaux auront des prélèvements sanguins répétés dans la veine caudale (5 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse). Dans le cadre de la détermination de la biodistribution des composés, les animaux subiront une injection intrapéritonéale (1 à 2 fois, 1 minute) et une anesthésie gazeuse le temps de l'imagerie de bioluminescence (1 à 2 fois, 5 minutes). Dans le cadre des procédures d’imagerie de fluorescence, les animaux seront simplement anesthésiés au gaz pendant l'imagerie (6 fois, 5 minutes). Dans le cadre du développement de la fibrose, les animaux subiront une administration par voie intratrachéale (1 fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse) MOFIFICATION: ou par voie intranasale (2 fois, 5 min, sous anesthésie gazeuse), puis les animaux seront simplement anesthésiés au gaz pendant l'imagerie µCT (5 fois, 10 minutes). Dans le cadre des procédures d'efficacité thérapeutiques, les animaux avec fibrose subiront des injections intrapéritonéales (7 fois, 1 minute), et soit des injections intraveineuses (1 ou 3 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse), soit des administrations par voie intratrachéale (1 ou fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse).
Impact sur les animaux
Dans cette étude, les nuisances ou effets indésirables attendus sont : douleurs et conséquences de l'administration intratrachéale pour déclencher la fibrose, des injections intrapéritonéales et intraveineuses, stress de la contention et des anesthésies répétées (pour l'imagerie et les traitements), gène respiratoire et/ou douleurs induites par la présence de fibrose.
Devenir
Les animaux issus des procédures seront mis à mort, afin de prélever leurs organes, les imager et les conserver pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Les paramètres de biodistribution sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques. De plus, les processus biologiques à l’origine du développement de la fibrose sont mal connus. La fibrose étant un processus dynamique mettant en jeu de nombreux types cellulaires, son étude ne peut se concevoir que sur organisme entier. Les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le processus de fibrose, et le recours à l’animal reste une étape indispensable pour démontrer le potentiel anti-fibrose d’un candidat médicament. Les rongeurs constituent un modèle de choix pour l’étude de la fibrose, on retrouve de nombreuses similitudes avec la pathologie humaine et nous disposons d’une grande variété d’outils moléculaires pour mener à bien nos expérimentations. Le consensus actuel est que l'utilisation du modèle murin de fibrose par instillation de bléomycine par voie oropharyngée représente le modèle animal le mieux caractérisé disponible pour les tests précliniques.
Réduction
Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de composés à tester in vivo. Les modèles utilisés dans ce projet utilisent des procédures couramment décrites, et qui ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et valides. Les nombres de souris indiqués par condition sont nécessaires pour une analyse statistique fiable, évitant de refaire l’expérience. Le nombre des groupes sera ajusté en fonction des premiers résultats de biodistribution. La mise en place du modèle murin de référence pour la fibrose sera effectuée dans une étude pilote qui permettra de déterminer les doses optimales de bléomycine (dépendante de chaque lot de bléomycine) à administrer pour l’induction de la fibrose pulmonaire et la durée du suivi par imagerie non invasive afin d’observer une résolution totale. Cette étude nous permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux dans les procédures suivantes. De plus, seuls le meilleur composé et la meilleure voie d’administration seront testés dans des modèles de fibrose, ce qui permettra aussi de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques en expérimentation animale. Les animaux seront maintenus dans des cages ventilées. Les animaux seront hébergés par fratries afin de limiter les bagarres. Les conditions standards de luminosité, hygrométrie et température seront appliquées. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, enrichi avec des tunnels en carton et morceaux de papier pour y faire un nid. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La gravité des procédures est légère pour les biodistributions, cinétiques sanguines et traitements. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. Des points limites pertinents seront déterminés et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. La mise à mort sera faite sous anesthésie générale. Nous réaliserons une étude pilote afin d’optimiser et calibrer finement le modèle de fibrose et permettre un suivi non-invasif par imagerie. Les animaux seront anesthésiés afin de réduire le stress et la douleur. Un suivi quotidien accru des animaux sera effectué au cours de l’établissement de la fibrose. Les paramètres observés seront la prostration, la diminution de la mobilité, la forte baisse de température et la perte de poids. Tout animal présentant une perte de poids de 20% par rapport aux pesées précédentes sera sorti de l’étude et euthanasié par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Les modèles animaux permettent d’avancer dans la mise au point de nouvelles thérapies et procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Les rongeurs constituent un modèle de choix pour l’étude de la fibrose tissulaire, on retrouve en effet de nombreuses similitudes avec la pathologie humaine. Plus particulièrement, nous utiliserons des souris de 8 semaines mâles en raison de leur sensibilité notamment aux atteintes pulmonaires induites par la bléomycine. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes, de taille et de poids suffisants pour être facilement manipulables.
Evaluation du 9-HODE et 13-HODE sur le vieillissement vasculaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour mesurer l'effet de deux médiateurs lipidiques sur le vieillissement des vaisseaux, 320 souris âgées de deux à vingt-quatre mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à trois injections intrapéritonéales par semaine pendant un à trois mois, avec un prélèvement de sang hebdomadaire sur animal vigile, la dernière prise de sang étant terminale. Le porteur écrit que "le bien-être animal est au cœur de cette étude" et que les contraintes subies restent faibles, tout en reconnaissant le stress lié à la fréquence des manipulations et la douleur au point d'injection. Aucun analgésique ne peut leur être administré, les antidouleurs modulant l'expression des lipides étudiés, et les souris atteignant un point limite sont tuées.
Objectifs
Dans ce projet, nous souhaitons explorer le rôle de 2 médiateurs lipidiques sur le vieillissement vasculaire. Le vieillissement de la population est un enjeu majeur du XXIe siècle. Il s’accompagne d’une augmentation de la fréquence de maladies telles que le cancer et les maladies cardiovasculaires. Ces dernières sont la principale cause de mortalité dans le monde, majoritairement causé par un dysfonctionnement du système vasculaire (vaisseau sanguin et lymphatique) et du système de coagulation. Cette étude sera menée selon plusieurs axes : Axe 1. Evaluation de l’implication du lipide 1 dans le vieillissement vasculaire Axe 2. Evaluation de l’implication du lipide 2 dans le vieillissement vasculaire
Bénéfices attendus
Le choix des lipides à tester (2) ainsi que leur concentration ont été déterminées grâce à nos études in vitro et ex vivo chez l’humain. Brièvement, les lipides circulants dans le sang des humains ont été mesurés et quantifiés en spectrométrie de masse, puis étudiés sur cellules tapissant les vaisseaux sanguins (les cellules endothéliales) in vitro. Cependant, l’effet in vitro est certes significatif, mais ne représente pas la complexité d’un modèle vivant entier. C’est pourquoi l’axe 1 et 2 de cette demande éthique permettra d’évaluer dans un modèle murin, l’impact de ces lipides sur le vieillissement en général, mais aussi vasculaire et à l’échelle multi-cellulaire.
Procédures
Les prélèvements sur animaux vigiles auront lieu 1 fois par semaine sur 1 à 3 mois selon les groupes
Impact sur les animaux
Nous sommes conscients que la répétition de contentions restreignantes, d'injections IP, et de prises de sang peuvent entrainer des effets indésirables. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent. Les animaux risquent d'être stressé par le nombre fréquent de manipulation pour les injections en IP (1 à 3 fois par semaine, de 1 à 3 mois). Ils risquent de ressentir une douleur au niveau de l'injection en IP. La prise de sang est terminale sous anesthésie
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L’usage de médiateurs lipidiques nécessite l’évaluation de l’efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant mise en place chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisant. Nous avons au préalable évaluer in vitro le vieillissement sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs. Afin de réduire le protocole, deux études pilotes dans l’Axe 1 et 2 utiliseront chacune 80 souris afin d’optimiser la durée du traitement avec les lipides et le nombre d’injection. Dans l’étude principale #2 et 4, un groupe contrôle ainsi que 3 groupes de souris permettront par la suite de répondre à l’hypothèse de travail, le détail des groupes est abordé. Considérant une variance hypothétique maximale de 16%, le nombre minimal d’animaux nécessaire a l’observation d’une difference significative pour une mesure unique, si elle existe, est de 10 par groupe experimentale (a
Raffinement
Le bien-être animal est au cœur de cette étude. Nous veillerions à ce que l’hébergement des animaux leur permettent d’avoir un enrichissement (avec paille, bois, coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les contraintes subites par les animaux sont faibles. Il s’agit d’une étude de vieillissement avec une manipulation réduite des animaux (prise de sang en veine saphène ou caudale et/ ou injection de médiateurs lipidiques en intrapéritonéale). Les souris seront observées quotidiennement et lorsqu’une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Dans notre étude nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique puisque nous étudions les médiateurs lipidiques dont l’expression est modulée par ces produits.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique du vieillissement. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Qui plus est, plusieurs de nos analyses reposent techniquement sur la cytométrie en flux, méthodologie qui requière un nombre conséquent de cellules issues d’organes immunitaires. Ce type d’expériences rend impossible l’utilisation d’organismes comme le poisson zèbre ou la drosophile. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations de la coagulation par exemple. Les souris utilisées seront de 2 à 24 mois. Pour notre étude, nous avons besoin de souris jeunes (2 mois) et souris vieillissante de 6 à 24mois. Elles ont toutes un stade de développement complet.
Évaluation de thérapies anti cancer dans des modèles de greffe orthotopique de cellules tumorales par voie rectale
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Des cellules tumorales sont injectées dans la muqueuse intestinale par voie rectale sous endoscopie, geste répété chaque semaine pour suivre la croissance de la tumeur. 2 752 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever rate, ganglions, intestins et tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des traitements anticancéreux par voie orale, rectale, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse ou par gavage, avec des prélèvements de sang à la veine faciale jusqu'à une fois par semaine. Le porteur affirme que l'effectif est calculé "au plus juste" à partir d'expériences antérieures en greffe sous-cutanée, sans donner un seul chiffre à l'appui de ces 2 752 animaux.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans la continuité de projets déjà existants et ayant donné des résultats très prometteurs. Il consiste à mettre au point des modèles de greffe de cellules tumorales dans la muqueuse intestinale afin de se rapprocher au plus près de ce qui se passe chez l’homme dans le cas de personnes atteintes de cancer digestif. En effet des expériences préliminaires ont été réalisées en greffant des cellules tumorales sous-cutanées afin de développer et de tester de nouvelles approches de thérapies de vaccination anti-cancer. Afin de continuer et d’optimiser ces thérapies, il est intéressant et judicieux d’améliorer les modèles d’études. La localisation des cellules tumorales est un paramètre important à prendre en compte dans nos études. En effet, celle-ci peut modifier la réponse aux thérapies due à un différentiel de biodistribution du médicament selon les organes, le microenvironnement, une réponse immunitaire différente selon les organes. C’est pour cela qu’il est important de développer des modèles murins de greffe de cellules tumorales au niveau de l'instestin. De plus dans le cancer colo-rectal les immunothérapies sont peu efficaces, cette étude a pour objectif de tester un traitement local in-situ afin d’augmenter les efficacités de traitements. La stratégie de vaccination des lésions in-situ permettrait d’empêcher les lésions pré-cancéreuses de se développer.
Bénéfices attendus
Malgré les progrès importants dans la prise en charge des patients atteints de cancer digestifs, un certain nombre ne répondent pas aux différente de traitement ou récidivent. Il est donc essentiel de développer de nouvelles thérapies ou d’optimiser les traitements existants. Pour cela, nous avons besoin de modèles se rapprochant au plus près de la pathologie humaine. L’utilisation du modèle murin de greffe de cellules tumorales issues de cancer digestifs au niveau de l'intestin permettra de créer un environnement au plus proche de celui des cancers digestifs chez l’Homme et pourra ainsi répondre à des interrogations auxquelles nous ne pouvons pas répondre dans les modèles traditionnels de greffe tumorale en sous-cutané.
Procédures
Les animaux subiront une endoscopie sous anesthésie afin d'injecter des cellules tumorales dans la muqueuse intestinale. Ces animaux subiront ensuite d'autres endoscopies sous anesthésie afin de suivre l'évolution de la tumeur (une par semaine). Pour les animaux ayant reçu une lignée cellulaire dont le suivi peut être réalisé par imagerie une fois par semaine, une injection intra-péritonéale de produit de traçage sera réalisée suivi par une anesthésie gazeuse pour le placement dans l’appareil d’imagerie. Les animaux recevront ensuite différents traitements anti-cancer (un traitement par animal). Ceux-ci seront administrés soit par voie orale, rectale sous endoscopie, intra-musculaire, intra-péritonéale, inra-veineuse ou par gavage. Les animaux, au cours de la procédure pourront subir des prélèvement de sang veineux périphérique au niveau de la veine faciale après anesthésie gazeuse à l’isoflurane au maximum une fois par semaine.
Impact sur les animaux
La greffe des cellules tumorales sera réalisée sous anesthésie gazeuse par endoscopie dans la muqueuse intestinale ce qui peut induire un stress de l’animal. Le développement des tumeurs peut être à l’origine de souffrance et de gênes qui seront évaluées par observations fréquentes des animaux (poids, état général) 3 fois par semaine et estimation de la prise tumorale par imagerie de bioluminescence après injection IP de luciférine lors de l’utilisation de lignées cellulaire possédant la luciférase ou par endoscopie.
Devenir
A l'issu de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever certains organes (rate, ganglions, intestins, tumeurs...) et ainsi réaliser des analyses immunologiques complémentaires. Ces analyses sur les organes permettront de mieux comprendre les mécanismes de développement tumoral ainsi que les mécanismes d'actions et les conséquences des traitements.
Remplacement
Un modèle animal, et plus précisément mammifère doté d’un système immunitaire complexe, est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes dans le cancer. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées préalablement à l’aide de modèles de culture cellulaire in vitro, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Les études de délivrance et de biodistribution nécessitent forcément d’avoir recours à l’expérimentation animale. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu. Préalablement à ces expériences in vivo des études in vitro ont été réalisées afin de définir des conditions optimales de croissance tumorale et de conditions d’administration des traitements.
Réduction
Ces expériences in vivo sont réalisées pour soutenir et compléter des résultats qui ont été obtenus in vitro. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste afin de pouvoir montrer des différences significatives ainsi que la reproductibilité et la répétabilité des résultats obtenus. Ces effectifs sont calculés à partir des résultats que l’on a pu obtenir par le passé sur des expériences utilisant des modèles de greffe sous cutanée ainsi que les données de la littérature sur le sujet.
Raffinement
Après une semaine d’acclimatation, les souris seront habituées au geste de la contention et à la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi (abris, matériaux de nidification, contrôle du cycle lumineux, de l’hygrométrie et de la température). Ils bénéficient d’un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et sont manipulés exclusivement par du personnel formé et habilité. Les animaux seront suivis de façon adaptée à l’intensité de la pathologie afin d’évaluer les nuisances causées ainsi que la sévérité de la pathologie. Les procédures expérimentales potentiellement douloureuses seront encadrées par une anesthésie. L’apparition d’une potentielle douleur en lien avec les procédures expérimentales sera appréciée par une échelle d’évaluation de la douleur. Lorsque cela sera possible, des techniques d’imagerie par bioluminescence seront privilégiées pour le suivi de la maladie à la place des endoscopies. Enfin, des points limites seront mis en place, prenant en compte plusieurs paramètres tels que la perte de poids, l’état du pelage, la capacité de locomotion et la présence d’une douleur qui sera évaluée grâce à une grille de score précise. Ces points limites permettront, lorsqu’ils sont atteints, de mettre à mort immédiatement les animaux.
Choix des espèces
La souris présente un système immuno-physiologique très proche de celui de l’humain, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques. Les modèles utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. La souris présente également l’avantage d’être disponible avec différentes mutations génétiques permettant d’étudier plus profondément certains mécanismes cellulaires. Des souris âgées de 4 à 12 semaines seront utilisées. Ce stade de développement a été retenu car le système immunitaire est pleinement mature permettant d'obtenir une réponse inflammatoire reproductible après implantation de la tumeur. L'utilisation d'animaux adultes limite également les variations physiologiques observées au cours de la croissance ou liées au vieillissement, susceptibles d'influencer les paramètres étudiés. Par ailleurs, la majorité des données publiées concernant le modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales au niveau de l’intestin a été obtenue chez des souris jeunes adultes, ce qui permet de comparer les résultats générés dans ce projet avec ceux de la littérature scientifique et d'assurer la reproductibilité des expériences.
Collatérales: leur rôle dans la réorganisation vasculaire post-AVC ischémique.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Le crâne ouvert au-dessus de l'artère cérébrale moyenne, la tête maintenue immobile et sans anesthésie générale, 168 souris vont subir l'induction d'un accident vasculaire cérébral en étant éveillées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles enchaînent trois chirurgies, quatre jours d'habituation à la contention par sessions montant jusqu'à une heure trente, sept acquisitions d'imagerie ultrasonore vigiles et une IRM. Le porteur justifie l'AVC sur animal éveillé par la volonté d'écarter le biais de l'anesthésie, et prévoit un stress lié à la survenue de l'AVC ainsi que des déficits fonctionnels. Aucune souris n'est gardée en vie, le porteur jugeant impossible de réhabiliter des animaux ayant subi une ischémie et trop élevé le risque d'infection de la prothèse crânienne.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, posant un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Actuellement, la circulation sanguine cérébrale collatérale est reconnue comme un acteur majeur de la physiopathologie de l'AVC ischémique : une bonne collatéralité étant identifiée comme protectrice dans les différentes phases de la pathologie et un facteur d'amélioration de l'efficacité d'un traitement thrombolytique (le traitement visant à rétablir une circulation sanguine normale). Toutefois, la collatéralité est très variable chez l'Homme. C’est pourquoi il est recommandé d'intégrer ce facteur pour l’intégration des patients dans les phases de recherche chez l'Homme, et les collatérales sont considérées comme des cibles prometteuses pour de nouvelles thérapies. L'investissement de la recherche dans ce domaine semble indispensable, dans ce cadre où l’AVC représente un enjeu de santé publique avec de forts impacts au niveau des populations et où trop peu de patients ont accès à un traitement. Il existe actuellement un problème de translation évident des résultats obtenus en laboratoire vers l'Homme, où malgré les recommandations, la collatéralité est rarement prise en compte en clinique. Parmi les facteurs pouvant expliquer ce décalage (difficultés de translation des résultats obtenus en laboratoire à la clinique, difficultés d’imagerie des collatérales en clinique, diversité des méthodes et critères d’évaluation de la collatéralité, etc.), le manque de connaissances fondamentales sur le rôle des collatérales dans l'AVC ischémique est notable. Les techniques classiques d’imagerie des collatérales sous anesthésie pouvant modifier le fonctionnement cérébral, elles peuvent interférer avec le fonctionnement des collatérales. L’objectif de ce projet est d’augmenter nos connaissances sur la collatéralité dans l’AVC grace à un modèle d'ischémie cérébrale chez la souris vigile. Cela grace à l'imagerie ultrasonore. L'imagerie ultrasonore utilise des ultrasons pour fournir une image d'une manière similaire à l'échographie. Mais ici avec l'imagerie dites Microscopie de Localisation Ultrasonore (ULM) en vigil, l'image révèle l'anatomie des vaisseaux sanguins cérébraux. Et avec l'imagerie Fonctionnelle UltraSonore (fUS) en vigil, l'image révèle des informations fonctionnelles (un signal en fonction du temps) qui indique le fonctionnement du cerveau.
Bénéfices attendus
L'objectif du projet étant d'augmenter les connaissances fondamentales sur la collatéralité dans l'AVC à court, moyen et long terme, tout en évitant le biais de l'anesthésie, les bénéfices seraient de mieux comprendre le rôle des collatérales dans l'AVC et ainsi de promouvoir la recherche de solutions thérapeutiques en lien avec celles-ci.
Procédures
Les animaux seront soumis : A 3 chirurgies : - Une chirurgie de pose de prothèse crânienne sous anesthésie analgésie d'une durée de 20 minutes; - Une chirurgie permettant une pose d'un cathéter dans la veine de la queue de la souris pour injecter les traitement ainsi que l'accès à l'artère cérébrale moyenne en retirant le crane situé juste au dessus de l'artère dans laquelle sera faite l'injection pour modéliser l'AVC ischémique, sous anesthésie et analgésie, d'une durée de 30 à 45 minutes; - Une chirurgie d'induction de l'ischémie sans anesthésie générale, sous analgésie et anesthésie locale. A 1 protocole comportemental : Un protocole d'habituation à la contention (le maintient immobile de la tête) pendant 4 jours consécutifs, avec des cessions augmentant progressivement de 15 min jusqu'à 1h30 au total. A 2 protocoles d'imagerie vigile : 7 acquisitions à l'imagerie ultrasonore soit fUS soit ULM, où chaque acquisition dure 10 minutes avec une injection de produit de contraste lors de chaque acquisition. Et 1 acquisition à l'IRM où chaque acquisition dure 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'appraître chez les animaux seraient : Des douleurs post opératoires après la pose de prothèse, un stress lors des premières sessions d'habituation à la contention, une perte de poids après les anesthésies et l'induction de l'AVC,des douleurs post opératoires après la chirurgie d'accès à l'artère cérébrale oyenne, un stress dû à la survenue de l'AVC chez la souris éveillée, des déficits fonctionnels à la suite de l'AVC.
Devenir
Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (168) seront mis à mort. Il a été décidé de ne garder aucun animal en vie car il n'est pas concevable pour leur bien-être de réhabiliter ou réutiliser des souris ayant subit une procédure sévère telle qu'une ischémie. De plus, le risque d'infection au niveau de la prothèse crânienne et de la craniotomie sont trop importants pour garder les souris en vie.
Remplacement
Dans ce projet, il n’est pas possible de remplacer le modèle animal, il s’agit d’étudier un modèle in vivo avec tous les mécanismes vasculaires physiopathologiques associés, survenant lors d'un l'AVC. Les effets de molécules pharmacologiques sur le développement des lésions cérébrales ainsi que la récupération fonctionnelle ne peuvent être investigués autrement que via un modèle in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux a été determiné en reprenant les données d'études antérieures comparant la taille des lésions ischémiques obtenues chez les souris Swiss versus souris C57 avec le modèle thromboembolique. Au cours de ce projet, chaque animal faisant l'objet d'un suivi longitudinal est son propre contrôle, grâce à l'utilisation de l'imagerie. Cela permet de ne pas faire de groupes supplémentaires pour chaque étape du projet où il est nécessaire de caractériser l'ischémie cérébrale, en plus de renforcer la validité des résultats. Conformément à la règle des 3R, le nombre d'animaux nécessaires au projet à été réduit au maximum, en se basant sur les études déjà réalisées au sein du laboratoire et dans la littérature, ainsi que sur un calcul de puissance statistique, permettant d'avoir des résultats significatifs avec un minimum d'animaux. Nous avons principalement utilisé pour ce calcul les données obtenues sur l'ischémie vigile chez la souris Swiss (ayant peu de collatérales) et la C57 (ayant beaucoup de collatérales), pouvant mimer les résultats attendus dans notre étude avec les souris Rabep2-/- (peu de collatérales) et leur contrôles (ayant beaucoup de collatérales), on observe une moyenne du volume de lésion lié à l'ischémie de 10,18 mm3 (SD: 5,356) dans le groupe des souris Swiss, et de 10 mm3 (SD: 6,501) dans le groupe des souris C57. Pour un seuil de significativité à 95 % et une puissance de 80 % (beta = 20%), 15 animaux seraient nécessaires dans chaque groupe. Cependant, nous avons observé un taux d'exclusion d'environ 40%. Car il peut arriver d'avoir des exclusions durant les nombreuses étapes de l'étude (arrachements de prothèse, perte de poids, stress trop intense lors des premières habituations, ...). Le nombre d'animaux a donc été augmenté à 21 par groupe, sachant qu'il sera réduit à 15 si aucun incident ne survient au cours du protocole.
Raffinement
Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux auront le temps de s'acclimater à la nouvelle animalerie après leur réception auprès du fournisseur pendant une semaine, puis seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole, afin de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et apprendre aux souris à coopérer. Les cages seront pourvue de coton en quantité pour la fabrication d'un nid, paillettes, kraft et bout de bois pour ronger. Une période de récupération de 3 jours et prévue après la pose de la prothèse crânienne, durant laquelle les souris bénéficieront de croquettes humides dans une coupelle au sol afin de favoriser la prise de nourriture et l'hydratation. Le protocole d'habituation progressif à la contention permet de réduire le stress des souris lors de l'induction de l'AVC et de l'imagerie vigiles. Durant l'induction de l'AVC, les souris sont sous analgésie, et sous anesthésie locale au niveau de l'ACM. Les yeux de la souris sont couverts afin de ne pas l'éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire. Après la chirurgie d'induction de l'AVC, les souris disposent de croquettes humides dans une coupelle au sol pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Concernant l'application des point limites, les animaux seront mis à mort (anesthésie profonde suivie d'une dislocation cervicale) dans les 24 heures dans l'une des situations suivantes : - signes de douleur extérieure ; - absence de réaction ; - animal inactif dans sa cage ; - complications chirurgicales inattendues (hémorragie impossible à stopper, détresse cadiorespiratoire, échec) ; - perte de poids >15%. - décollement de la prothèse crânienne.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences, et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’influence de l’anesthésie sur le devenir des lésions induites par un AVC ischémique. L'étude se déroulera sur une souches de souris C57BL/6-Rabep2em2Jef/J (Rabp2-/- et son contrôle) présentant des profils de collatérales différentes. Ces deux souches ont un fond génétique de C57BL6, régulièrement utilisée pour la recherche, et C57BL/6-Rabep2em2Jef/J est décrite comme une souche utile à l'étude de la circulation collatérale dans le contexte de l'AVC. Les souris utilisées seront de jeunes adultes, entre 6 et 10 semaines (6 semaines lors du début du protocole, et 10 semaines arrivées à la fin du protocole). Le projet est réalisé avec des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.
Etude du système immunitaire dans un contexte tumoral chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Chaque souris est irradiée sous anesthésie générale, greffée par voie intraveineuse avec des cellules immunitaires modifiées, puis injectée avec des cellules tumorales sous la peau ou dans la veine de la queue, cette dernière injection sans anesthésie. 1 440 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever rate, moelle osseuse et foie. Le porteur reconnaît que les tumeurs diffuses peuvent provoquer une douleur ou un inconfort modéré dans plusieurs organes, et que les tumeurs solides gêneraient les déplacements si les animaux n'étaient pas tués avant. Il présente pourtant cet enchaînement comme "plusieurs manipulations simples, réalisées dans des conditions assurant le confort et la sécurité des animaux".
Objectifs
Les cellules immunitaires sont capables de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses. Elles ont besoin d’énergie pour remplir efficacement leur rôle, et plusieurs mécanismes à l’intérieur de la cellule régulent cette utilisation d’énergie. Ce projet cherche à comprendre comment ces mécanismes influencent l’activité des cellules immunitaires, leur activation, leur déplacement et leur capacité à combattre les tumeurs, qu’elles soient localisées (tumeur solide) ou diffuses dans l’organisme (métastases).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’énergie disponible dans les cellules immunitaires influe sur leur capacité à agir contre les cellules cancéreuses. Le rôle des cellules immunitaires étant primordial, les résultats pourraient aboutir à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques visant à renforcer la réponse immunitaire anti-tumorale. Le projet permettra également d’évaluer l’intérêt potentiel d’un médicament déjà utilisé pour traiter le diabète dans la prise en charge du cancer. Si son efficacité est démontrée, son utilisation en thérapeutique pourrait être facilitée et plus rapide, car ce médicament est déjà autorisé et utilisé chez l’humain.
Procédures
Chaque souris sera soumise à plusieurs manipulations simples, réalisées dans des conditions assurant le confort et la sécurité des animaux. Chaque animal recevra : • Une anesthésie générale suivi d’une irradiation (30 minutes) • Une greffe de cellules immunitaires par injection intraveineuse (durée : 1 min) sous anesthésie volatile (durée : 5 min) • Un prélèvement sanguin sous anesthésie afin d’évaluer la prise de greffe (durée : 5 min) • Une injection de cellules tumorales sous la peau (durée : 30 s), sera effectuée sous anesthésie volatile (durée : 5 min) pour la moitié des animaux ou une injection dans la veine de la queue sans anesthésie (inaccessible avec anesthésie), (durée : 1 min) pour l’autre moitié. • Une injection dans l’abdomen ne nécessitant pas d’anesthésie (30 s) ou en sous-cutanée (30 s) après une anesthésie volatile (durée : 5 min)
Impact sur les animaux
Les procédures peuvent provoquer une douleur légère et temporaire lors des injections. L’irradiation aux rayons X n’induit qu’un faible stress et une faible douleur car les animaux seront anesthésiés profondémment. L'injection des cellules de la moelle osseuse et les prélèvements sanguins ne provoquent pas de douleur ou d'inconfort autre que le stress et la douleur liés à l'injection. Nous n’attendons pas de souffrance suite à la greffe. En effet, la prise de greffe se déroule bien dans >90% des cas, d'autre part, les cellules immunitaires modifiées au cours de ce protocole ne sont pas strictement nécessaires à la survie de l’animal et ne sont pas connues pour induire de pathologie. Le développement des tumeurs, notamment dans le modèle de tumeur diffuse, peut entraîner une douleur ou un inconfort modéré en raison de la présence des tumeurs dans différents organes (rate, moelle osseuse, foie). En revanche, la croissance des tumeurs solides n’affecte pas les mouvements ni ne provoque de gêne locomotrice au cours du protocole, les animaux étant euthanasiés avant l’apparition de ces gênes. Tout animal présentant une réaction anormale ou une souffrance non contrôlable sera immédiatement euthanasié conformément aux critères de fin d’expérience établis.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes post mortem pour des analyses sur les cellules immunitaires modifiées et mises en compétition.
Remplacement
Les cellules du système immunitaire modifiées ont été testées in vitro notamment face à des cellules tumorales. Cependant, il est impossible de reconstituer in vitro la complexité de la réponse anti-tumorale. De ce fait, la mise en place d’expériences in vivo sur un modèle animal est pertinente. Pour des raisons éthiques et de praticité cela ne peut être effectué directement chez l'homme avant preuve chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été calculé au strict minimum nécessaire pour permettre une analyse fiable des résultats. Des calculs statistiques simples montrent qu’il faut au moins cinq animaux par groupe pour pouvoir détecter des différences réelles et solides entre les conditions testées, sans augmenter inutilement le nombre d’animaux. De plus, des expériences préliminaires déjà réalisées nous confortent dans ce choix et confirment que cet effectif est suffisant pour obtenir des données solides. La procédure a été conçue pour obtenir le plus de données possibles à partir d’un seul individu, en réalisant plusieurs analyses sur les mêmes animaux. Enfin, la co- injection dans un même animal permet une comparaison directe de nos conditions expérimentales et limite la variabilité, réduisant ainsi le nombre total d’animaux nécessaires à la réalisation du projet. Cette organisation permet de réduire la répétition d’expériences indépendantes et donc de limiter l’utilisation d’animaux tout en garantissant la qualité scientifique du projet.
Raffinement
L’équipe possède une expertise solide se traduisant par la mise en place de plusieurs mesures visant à garantir au maximum le bien-être des animaux : • Utilisation d’une armoire chauffante pour assurer une bonne récupération de l’animal suite à l’irradiation • Contrôler précisément le nombre de cellules injectées, afin d’éviter une croissance tumorale trop rapide ou imprévisible. Données déterminées suite à l’expertise de l’équipe (8 ans d’utilisation du modèle tumorale) • Assurer une surveillance régulière, tous les deux jours, en observant notamment la motricité, le comportement, la posture et la réponse aux stimulations • Définir des points limites stricts (perte de motricité, perte de réponse aux stimulations) et précoces : si l’un de ces seuils est approché, la fréquence de surveillance est augmentée pour intervenir au bon moment et éviter toute souffrance inutile. • En cas d’apparition de signes d’irritation ou d’inflammation des lavages au sérum physiologique sera effectué deux fois par jour pendant 48h. Si cela ne s’améliore pas un vétérinaire sera alors contacté.
Choix des espèces
Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront âgées de 8-9 semaines le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.
Etude de l’implication de récepteurs dans le cerveau dans la physiopathologie de la migraine et son traitement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une crise de migraine leur est provoquée par injection intrapéritonéale quotidienne, répétée cinq jours de suite, puis leur douleur est mesurée par des tests comportementaux durant de trente-cinq minutes à deux heures. Le porteur cherche à savoir si un récepteur déjà breveté par son équipe pour la douleur neuropathique joue aussi dans la migraine, et si une molécule capable de l'inhiber en efface les symptômes. Aucun analgésique ne peut être administré puisque la douleur est le paramètre mesuré, et les animaux qui développent des troubles du comportement sont tués sans délai.
Objectifs
La migraine est une pathologie très invalidante, touchant 12 à 15 % de la population. Les formes chroniques sont particulièrement difficiles à traiter et les traitements actuels ne soulagent pas toujours correctement les patients. Parmi les symptômes les plus handicapants on retrouve la sensibilité accrue au toucher, la sensibilité à la lumière et la douleur spontanée. Ces signes peuvent aussi être observés chez l’animal et servent alors de repères pour mieux comprendre la physiopathologie de la migraine. Nos travaux précédents ont montré que l’activation d’un récepteur neuronale est nécessaire et suffisante pour générer expérimentalement une douleur neuropathique (douleurs liées aux nerfs) chez les rongeurs. Plus important encore, nous avons montré que, lorsque l’état de douleur neuropathique était installé, l'inhibition de ce récepteur suffisait à annuler les symptômes douloureux. Ces résultats ont été publiés et fait l’objet de plusieurs brevets. Puisque les douleurs neuropathiques et les douleurs migraineuses partagent plusieurs mécanismes communs — comme une amplification anormale des signaux de douleur — nous pensons que ce même récepteur pourrait également être impliqué dans la migraine. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de ce récepteur dans le développement et l’entretien des crises migraineuses, notamment au niveau du réseau de nerfs qui gère la sensibilité du visage, une zone clé dans la migraine. Nous testerons également si une molécule capable de bloquer ce récepteur pourrait diminuer la douleur, la sensibilité à la lumière et les autres symptômes associés. Ce travail pourrait ouvrir la voie à un nouveau traitement pour les personnes souffrant de migraine.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but, dans un premier temps, de compléter nos connaissances sur l’intégration de l’information douloureuse et son maintien, ainsi que d’amener de nouvelles clés à la compréhension des mécanismes dans un contexte de douleur migraineuse. D’autre part, le manque d’efficacité des traitements de crises et prophylactique dans la migraine agit comme motivateur principal à ces travaux de recherche. Ce travail, mené depuis maintenant plusieurs années, nous a déjà permis de mettre en avant un acteur essentiel dans les douleurs provoquées par un dysfonctionnement nerveux, mais surtout une cible potentielle pour de nouveaux composés thérapeutique. Afin d’évaluer l’étendue potentielle du champ d’action de notre cible pharmacologique, nous nous intéressons maintenant au rôle de ce récepteur neuronal dans le développement de la migraine. Nous cherchons notamment à comprendre comment son activité participe à l’initiation et au maintien de la douleur. Grâce à ces avancées, nous espérons pouvoir identifier de nouveaux composés prometteurs, les tester en préclinique, puis ouvrir la voie à de futurs essais chez l’être humain afin de développer des traitements mieux adaptés aux personnes souffrant de douleurs chroniques, notamment des patients migraineux.
Procédures
Les animaux seront soumis au maximum à une injection péritonéale par jour (durée d’intervention < 1 minute). Cette injection i.p. peut être répétée pendant 5 jours consécutifs. De plus, les animaux pourront recevoir, par voie orale et sous légère sédation, une solution de la substance d’étude ou une solution témoin le jour de la première injection i.p. ou le jour de la dernière injection i.p. Après une phase d'habituation, des tests comportementaux de mesure de la douleur seront réalisés (habituation+test: entre 35min et 2h).
Impact sur les animaux
La douleur étant le paramètre étudié aucun anti-douleur ne peut être utilisé dans ce projet. D’autre part, des tests de toxicologie in vitro sont systématiquement réalisés sur nos composés avant tout test sur l’animal pour garantir la sûreté de nos produits. Aucun des composés déjà testés n’ont montré de problème de toxicologie, ni l’apparition d’effets secondaires sur l’animal. De ce fait, la douleur induite par nos différents modèles sera la seule nuisance pour les animaux. En cas de troubles comportementaux, les animaux seront euthanasiés sans délai afin de prévenir toute souffrance inutile. En cas de lésions dues à des attaques entre les animaux, ceux-ci seront séparés et/ou le milieu enrichi par ajout d’igloo. Si les attaques continuent et/ou les lésions sont trop importantes ou douloureuses pour l’animal, celui-ci sera euthanasié sans délai.
Devenir
La migraine aigue et chronique étant étudiée, et donc induite, chez ces animaux, le devenir de ceux-ci en fin de procédure expérimentale sera systématiquement la mise à mort afin de ne pas prolonger inutilement la douleur. Aucun placement ou mise en liberté n’est donc prévu pour ce projet.
Remplacement
A ce jour, il n'y a pas de modèles non animaux permettant d'étudier les mécanismes du système nerveux impliqués dans la transition entre douleur aiguë (court terme) et douleur chronique (long terme), mécanismes impliqué dans la chronicisation des crises de migraine. Les effets pharmacologiques des molécules utilisées sur la chronicisation douloureuse, l'analgésie et l'état émotionnel, doivent être évalués au travers de systèmes intégrés par différents tests comportementaux, qui viennent appuyer et confirmer les données obtenues par des approches cellulaires. Il est donc indispensable d'avoir recours à des investigations sur l'animal afin de proposer des alternatives thérapeutiques pour une amélioration de la prise en charge de la douleur. La souris étant un mammifère dont la physiopathologie est proche de l'Homme, cette espèce sera utilisée dans le cadre du projet.
Réduction
Le nombre de souris par lot a été déterminé sur la base d’expérimentations précédentes réalisées. Ce nombre a été confirmé par le calcul de puissance via une analyse a priori à l’aide d’un logiciel.
Raffinement
Précédent chaque expérimentation, une habituation de minimum une semaine est réalisée au cours de laquelle les animaux sont placés dans la pièce expérimentale pendant minimum 1h et exposés aux différents tests sans application du stimulus. Cela permet aux animaux de s’habituer à l’environnement et à l'expérimentateur limitant ainsi l’impact du stress (angoisse) lié à la procédure expérimentale. Ces périodes d’habituation sont fondamentales afin d’assurer une reproductibilité des tests et donc de limiter l’hétérogénéité des animaux, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, afin de limiter la douleur chez les animaux, toute expérience est limitée dans le temps (maximum 1 mois après la lésion). Un animal partage sa cage avec les autres animaux de la même portée ; ils bénéficient également d'un enrichissement du milieu de leur cage (copeaux, igloos en plastique, bâtonnets de cellulose). Un suivi hebdomadaire de l’animal sera mis en place où seront relevés : le poids de l’animal, l’aspect de son pelage, ses comportements ainsi que sa vitesse de respiration. Ces paramètres pourront nous indiquer les potentiels soins à apporter aux animaux.
Choix des espèces
La souris étant un mammifère dont la physiopathologie est proche de l'Homme, cette espèce sera utilisée dans le cadre du projet. Les souris utilisées seront adultes et auront entre 6 et 12 semaines afin que les animaux ne soient ni en croissance ni en phase de vieillissement.
Etude du rôle des astrocytes (cellule de soutien du neurone) dans le développement de lésions dans un modèle de traumatisme crânien pédiatrique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
À sept jours de vie, des souriceaux reçoivent une incision du cuir chevelu puis un poids lâché sur le crâne, avant que la plaie soit refermée à la colle biologique, le tout en moins de deux minutes sous anesthésie. 1 072 souris vont être utilisées ainsi, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, l'autre moitié sévère, toutes tuées ensuite pour prélever leur cerveau. Le porteur annonce une mortalité inférieure à 4 %, liée à l'anesthésie ou au traumatisme lui-même, et des troubles du comportement, anxiété et déficits sociaux, mesurés au quarante-cinquième jour de vie. Il indique ne disposer d'aucune donnée comportementale sur des animaux plus jeunes, et ne précise pas quels tests seront employés.
Objectifs
Le traumatisme crânien (TC) est un problème mondial majeur, affectant particulièrement les enfants et les jeunes, avec environ 69 millions de cas par an. Il ne s'agit pas seulement du choc initial (lésion primaire), mais surtout de l'inflammation qui s'ensuit (lésions secondaires et tertiaires). Si cette inflammation persiste, elle endommage le cerveau à long terme, entraînant des problèmes moteurs, cognitifs et émotionnels. Pour briser ce cercle vicieux, il faut comprendre précisément qui est aux commandes de cette inflammation chronique. Dans le cerveau, nous avons deux types de cellules impliqué dans l’inflammation. Les astrocytes sont des cellules en forme d'étoile qui, normalement, jouent un rôle vital de soutien et de réparation. Après un traumatisme chez l'enfant, ces astrocytes peuvent devenir hyper-actifs. Au lieu de réparer, ils forment parfois une cicatrice trop rigide qui empêche la guérison, ou alors ils libèrent des signaux qui alimentent l'inflammation pendant des mois, causant des lésions à long terme. Notre connaissance de ce que font les astrocytes chez l'enfant est très limitée. Notre étude a donc pour objectif de comprendre le rôle précis de l'astrocyte dans ces dégâts post-traumatiques chez les jeunes enfants.
Bénéfices attendus
Notre objectif est de comprendre quand et pourquoi ces cellules, qui sont normalement les "architectes" de la réparation, se mettent à former une cicatrice trop rigide ou à relâcher des signaux qui continuent d'abîmer le cerveau de l'enfant. En identifiant le moment exact où l'astrocyte bascule de protecteur à destructeur, nous pourrons intervenir pour le maintenir dans son rôle de guérisseur. Cela permettrait de limiter l'inflammation chronique qui est responsable des problèmes de mémoire, de concentration, et des troubles du comportement qui apparaissent des mois ou des années après l’accident. Jusqu’à présent, les traitements anti-inflammatoires sont souvent trop généraux. L’avantage de notre recherche est qu’elle isole une cible cellulaire très précise : l'astrocyte. En étudiant le comportement de cette cellule clé dans le cerveau en développement, notre projet vise à offrir une meilleure qualité de vie aux enfants victimes de traumatisme crânien.
Procédures
Des souriceaux subiront un traumatisme crânien à 7 jours de vie sous anesthésie générale : une incision cutanée suivie d’un lâcher de poids et d’une fermeture cutanée par de la colle biologique. Cette procédure est réalisée en moins de 2 minutes. Les groupes contrôles subiront la même procédure sans le traumatisme crânien.
Impact sur les animaux
La mortalité est de moins de 4% (principalement due à l’anesthésie générale ou au traumatisme crânien lui-même). Le fait de manipuler les souriceaux quotidiennement n’entraîne pas de rejet par la mère lors de la remise au nid car les souris utilisées ne sont pas perturbées par cela. Une irritation/inflammation au niveau de la cicatrice peut arriver de façon rarissime. Les animaux peuvent présenter des modifications du comportement (anxiété, déficits sociaux) qui seront analysées à P45 (45e jour de vie post natale). Nous n’avons pas de données comportementales sur des animaux plus jeunes. Une attention particulière sera apportée pour limiter le stress lors des différents tests comportementaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à différents temps avec prélèvement du cerveau et analyse.
Remplacement
L’impact du traumatisme crânien ne peut être envisagée que dans des conditions « in vivo », c’est-à-dire dans un organisme vivant. Aucune solution alternative n’est possible pour conduire ce projet de recherche. Il est impossible d’évaluer les conséquences sur le fonctionnement cérébral d’un traumatisme crânien sur un modèle de cellules en culture ou sur des modélisations informatiques.
Réduction
Le nombre d’animaux estimé et les tests statistiques pour ce type d’étude ont été réalisé. En effet, des études antérieures sur ce modèle permettent d’évaluer la mortalité et ainsi d’avoir le nombre d’animaux nécessaire pour avoir des résultats statistiquement corrects. Ce nombre minimum nous permettra d’être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet. Les animaux utilisés pour les tests comportementaux seront également utilisés pour des tests sur des coupes de cerveaux.
Raffinement
La procédure chirurgicale de traumatisme crânien sera réalisée sous anesthésie générale inhalatoire. Les animaux seront remis dans leur nid et on vérifiera que l’adoption par la mère se fait bien. Des arbres décisionnels seront proposés en fonction de l’âge des animaux, déterminant ainsi des points limites prédictifs : on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités et le tonus. En cas d’atteinte de ces points limites, les animaux seront euthanasiés. À distance du traumatisme crânien, on réalisera une surveillance hebdomadaire de la prise de poids, de l’absence de troubles du comportement (isolement, agressivité). Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi pour minimiser leur stress. Avant sevrage, les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. Le personnel technique de l’animalerie réalise aussi un suivi clinique quotidienne des animaux et de leurs conditions d’hébergement (nourriture, eau, température de la pièce, taux d’humidité) et nous alerte en cas de problème.
Choix des espèces
Les études chez l’animal permettent d’étudier les conséquences d’un traumatisme crânien modéré localisé sur l’ensemble du cerveau et de mimer au mieux la pathologie humaine. Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles de lésions du cerveau et notamment le traumatisme crânien. De plus, ce modèle de souris présente l’avantage de ne pas rejeter les petits après une séparation de courte durée. Les souris seront utilisées de 7 jours de vie à 45 jours de vie au maximum en fonction des groupes. Le traumatisme crânien sera fait à 7 jours de vie, pour mimer la survenue d’un traumatisme crânien chez le jeune enfant humain. Le rôle de l’astrocyte sera analysé à plusieurs temps (45 jours de vie pour voir les effets à la phase tardive), car l’inflammation pendant le développement cérébral est un processus complexe qui doit être étudié dans le temps.
Analyse des propriétés des plaquettes humaines produites in vitro après transfusion chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des souris immunodéficientes, dépourvues des cellules immunitaires qui élimineraient les cellules humaines injectées, portent l'essentiel de ce projet. 290 souris vont être utilisées, dont 50 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, les 240 autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un lot subit onze prélèvements de sang en 72 heures, dont cinq sur animal vigile, d'autres une chirurgie de thrombose ou une mesure du temps de saignement sous anesthésie. Le porteur écrit que la perte de sang et la thrombose induites ne sont pas compatibles avec le maintien en vie, ce qui vaut aux souris d'être tuées à l'issue, pour valider des plaquettes humaines produites en laboratoire.
Objectifs
Dans un contexte de besoins croissants en plaquettes pour la transfusion et de limites de leur disponibilité et durée de conservation, le développement de plaquettes humaines produites in vitro (hPLTs) sans nécessité de don représente une approche alternative prometteuse. Toutefois, avant toute utilisation chez l’Homme, il est indispensable de vérifier la bonne circulation de ces plaquettes ainsi que leurs fonctions après circulation dans un organisme vivant. L’objectif du projet est de caractériser les plaquettes humaines produites in vitro (hPLTs), tant leur capacité à circuler et à persister dans le sang, que leurs fonctions à différents temps après injection chez la souris. Il a également pour objectif de déterminer leur capacité à participer à l’arrêt du saignement et à la formation de caillot, appelée thrombose, à l’aide de modèles validés chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter des données essentielles sur la fonction et la capacité à circuler dans le sang des plaquettes humaines produites in vitro (hPLTs), constituant une étape clé de leur évaluation avant utilisation chez l’Homme. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de sources alternatives de plaquettes pour la transfusion, dans un contexte de besoins croissants et de contraintes liées à la disponibilité et à la durée de conservation des plaquettes issues de dons. Une telle approche pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients présentant un risque de saignement important, notamment chez les patients présentant un cancer.
Procédures
Un lot d’animaux sera soumis à un prélèvement sanguin sous anesthésie (20 minutes maximum). Un lot d’animaux sera soumis à 2 injections sous anesthésie et à 11 prélèvements sanguins sur 72 h (0 min, 3 min, 6 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 24 h, 48 h et 72 h injection des plaquettes) : 6 prélèvements sous anesthésie et 5 chez des souris vigiles de 5 minutes. Un lot d’animaux sera soumis à 2 injections et un prélèvement sanguin sous anesthésie (35 minutes maximum). Un lot d’animaux sera soumis à 2 injections et une chirurgie sous anesthésie (45 minutes maximum). Un lot d’animaux sera soumis à 2 injections et un temps de saignement sous anesthésie (40 minutes maximum).
Impact sur les animaux
Une des nuisances attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée transitoire). On pourra également observer une douleur localisée de courte durée au point d’injection, ainsi que d’éventuels saignements. La contention nécessaire aux injections pourra entraîner un stress chez les animaux. La déplétion des macrophages peut induire une altération transitoire de l’état général. Dans le cadre du prélèvement sanguin à la queue, l’entaille d’une veine peut provoquer une douleur aiguë et passagère, une perte sanguine transitoire. Les modèles de thrombose nécessitent des interventions chirurgicales réalisées sous anesthésie générale. Ces procédures peuvent entraîner un stress physiologique et un risque limité de saignement.
Devenir
A l’issue du prélèvement de sang en quantité importante ou répété, des thromboses et du temps de saignement, les animaux sont mis à mort car la perte de sang importante et le développement d’une thrombose ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux.
Remplacement
Le recours à l’animal ne peut pas être remplacé dans ce projet. Les objectifs nécessitent d’évaluer la circulation, la persistance et la fonction de plaquettes humaines produites in vitro (hPLTs) dans un organisme entier. Des approches in vitro et ex vivo sont utilisées en amont pour caractériser certains aspects fonctionnels. Toutefois, elles ne permettent pas de reproduire l’ensemble des paramètres impliqués après injection, notamment la circulation sanguine, les interactions cellulaires et les mécanismes d’élimination, ni d’étudier des processus dynamiques tels que l’arrêt du saignement et la thrombose. L’utilisation de souris immunodéficientes permettant la circulation de cellules humaines, est indispensable pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum et permet l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs sont calculés par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Une habituation à la manipulation et à la contention est prévue 5 jours avant le début de l’expérimentation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : Les animaux sont hébergés en groupes sociaux. Les souris NSG seront hébergées en conditions stériles. Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de la procédure. Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin de lutter contre l’hypothermie pendant la procédure Par l’injection d’analgésique et d’anesthésique local avant chaque procédure en sous-cutané. Des points limites ont été déterminés afin de soustraire les animaux à toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Des souris immunodéficientes seront utilisées pour les expériences principales, en raison de l’absence de cellules immunitaires, ce qui permet la circulation de cellules humaines sans élimination. Ce modèle est particulièrement adapté à l’étude du devenir et de la fonction de plaquettes humaines produites in vitro (hPLTs). Les expériences seront menées sur des souris adultes âgées de 8 à 24 semaines, une période idéale pour éviter les effets liés à la croissance ou au vieillissement. Seule une des procédures de thrombose nécessite l’utilisation de souris d’environ 3 semaines afin d’éviter la présence de lipides autour des vaisseaux sanguins et s’assurer de la reproductibilité du modèle.
Identification et études de cibles thérapeutiques potentielles dans l’allergie de la peau
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Un hypersensibilisant est appliqué sur le ventre rasé sous anesthésie, puis un second sur l'oreille droite pour déclencher une réaction proche d'une dermatite atopique : 1 236 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 432 d'entre elles reçoivent en plus une injection sous-cutanée de cellules immunitaires triées, et toutes subissent un prélèvement de sang à la veine mandibulaire en fin d'expérience. Le porteur ne décrit que des démangeaisons légères et passagères et un épaississement de la peau, tout en prévoyant des points limites au-delà desquels un animal est retiré de l'étude et tué. Toutes les souris sont mises à mort pour prélever leurs tissus, onze lignées étant mobilisées afin de trier des cellules dendritiques qui représentent moins de 1 % d'un ganglion.
Objectifs
Dans ce projet, l’objectif est de mieux comprendre le rôle des cellules dendritiques du système immunitaire, soupçonnées d’avoir une fonction apaisante dans une forme expérimentale d’inflammation de la peau. Pour cela, plusieurs approches complémentaires seront utilisées. D’abord, des animaux recevront une substance irritante sur la peau afin de déclencher une réaction ressemblant à une dermatite atopique. Les chercheurs analyseront ensuite les cellules immunitaires stimulées au cours de l’inflammation induite. Dans un second temps, La production d'autres cellules immunitaires seront induites à partir d’animaux traités avec un hypersensibilisant. Ces dernière cellules seront ensuite injectées dans la peau d’animaux afin d’observer si elles modifient l’intensité ou la nature de la réaction inflammatoire. Plusieurs quantités de cellules seront testées pour identifier la dose la plus efficace. Une fois cette étape validée, les chercheurs compareront l’effet de cellules activées ou non activées, afin de comprendre ce qui leur confère un potentiel anti inflammatoire. Les analyses utiliseront différentes techniques seront utilisées. L’ensemble de ces expériences permettra de déterminer si ces cellules immunitaires peuvent réellement atténuer l’inflammation cutanée, comment elles agissent et quelles conditions favorisent leur apparition. À terme, ces connaissances pourraient contribuer au développement de stratégies visant à mieux contrôler les réactions inflammatoires de la peau.
Bénéfices attendus
La mise en évidence de la fonction de cellules immunitaires spécialisées dans la modulation des réponses inflammatoires constituerait une nouvelle cible thérapeutique intéressante dans le traitement de pathologies en lien avec le système immunitaire, comme les maladies auto-immunes ou le cancer. En effet, la modulation de la réponse immunitaire de l'atténuer ou de la restreindre dans un contexte d'allergie ou de maladie auto-immune, ou de l'amplifier dans un contexte de cancer. De plus, l'utilisation de cellules immunitaires spécialisées générées ou modifiées ex vivo/in vitro est une stratégie thérapeutique innovante qui peut s'appliquer à l'homme et qui est déjà étudiée, notamment dans un contexte de lutte anticancéreuse.
Procédures
Les animaux vont être sensibilisés avec l'application unique topique d'un hypersensibilisant sur le ventre préalablement rasé sous anesthésie gazeuse (durée : 1min pour la survenue de la narcose et 1min pour l'application de l'haptène). 432 animaux vont être injectés en sous-cutanée au niveau du ventre avec les cellules immunitaires triées et présensibilisées (durée : 30s) et ces animaux vont etre soumis à une phase de déclenchement au niveau de l'oreille droite par un autre haptène hydrophile, sous anesthésie gazeuse . A la fin de l'expérience, un prélèvement sanguin à la veine mandibulaire sera effectué.
Impact sur les animaux
L’administration de l'haptène pour la sensibilisation se fait par application cutanée sur le ventre rasé sur 1cm2. Cette application peut être accompagnée de légères démangeaisons qui s'estompent quelques heures après le traitement. On constate un épaississement localisé de la peau du ventre. L’administration de l'haptène pour le challenge se fait sur l’oreille droite. On constatera une augmentation de l’épaisseur de l’oreille traitée ainsi qu’une légère démangeaison locale et passagère. L'application de l'haptène engendrera un léger stress d'une courte durée sur les animaux. L'injection de cellules engendrera un léger stress et douleur d'une courte durée sur les animaux injectés et sur les animaux ayant subi une application topique et unique de l’haptène sur l’oreille où une inflammation accompagnée de démangeaisons et d'une rougeur, pourraient survenir de manière passagère.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort pour permettre les prélèvements de tissus pour analyses (cytométrie en flux, histologique, ...).
Remplacement
Les phénomènes à l'oeuvre dans cette réaction immunitaire nécessitent deux phases distinctes, de sensibilisation et de déclenchement, et mettent en jeu différents organes et plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Le protocole de sensibilisation sera appliqué à un total de 11 lignées murines afin de mettre en place différentes stratégies d'identification et d'obtention des cellules dendritiques ou d'étudier l'implication de différentes molécules dans l'induction des réponses pro- et anti-inflammatoires. 12 souris par groupe seront suffisantes pour obtenir des résultats interprétables des modifications des sous-types de populations de cellules dendritiques entre les lignées mutantes et la lignée sauvage. Le protocole de traitement à l’haptène sera appliqué à un total de 6 lignées murines afin de mettre en place différentes stratégies d'identification et d'obtention des cellules dendritiques ou d'étudier l'implication de différentes molécules dans l'induction des réponses pro- et anti-inflammatoires. Cependant, les cellules dendritiques d'intérêts représentent moins de 1% de la population cellulaire totale d'un ganglion lymphatique après traitement et, d'après l'expérience sur de précédents projets, nous savons qu'il est nécessaire d'avoir 10 animaux dans chaque lignée murine pour avoir un nombre de cellules suffisant pour la suite du projet. Seul un groupe traité sera nécessaire dans l'obtention des cellules dendritiques ex vivo, donc nous n'inclurons pas de groupe non traité comme contrôle. Le protocole d'injection des cellules dendritiques sera réalisé sur un total de 5 lignées afin d'étudier la réponse immunitaire résultante de l’injection des différentes populations de cellules injectées issues des 7 lignées murines transgéniques. 8 animaux par groupe seront nécessaires pour arriver à des conclusions significatives. Les analyses statistiques seront réalisées à l'aide de plusieurs formules en fonction du nombre de paramètres et du nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et auront un accès constant à de l'eau et de la nourriture pendant toute la durée de l'expérience. L'application topique de l'haptène ou l'injection unique de cellules immunitaires spécialisées au niveau du ventre seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress et/ou la douleur des animaux pendant les procédures. Pendant l'expérience, il pourrait être possible d'observer une inflammation au niveau du ventre, accompagné de démangeaisons et d'une rougeur, mais n'impactera pas le comportement des animaux (soin du pelage, posture, activité normale, ...). Le dépôt de l’hypersensibilisant sur le ventre rasé provoquera une augmentation de l’épaisseur de la peau et une légère démangeaison localisée et limitée dans le temps. Cependant, si un animal vient à dépasser les points limites fixés par la grille de score de chaque procédure expérimentale, il sera retiré de l'étude et euthanasié.
Choix des espèces
Les phénomènes à l'oeuvre dans la réaction immunitaire étudiée nécessitent deux phases distinctes, de sensibilisation et de déclenchement, et mettent en jeu différents organes et plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et identifier et étudier les cibles thérapeutiques. Les souris C57BL6/J utilisées seront agés de 10 à 12 semaines afin que leur système immunitaire soit mature.