Rongeurs
Etudes des mécanismes cellulaires et moléculaires régulés par les cellules dendritiques plasmacytoïdes et promouvant l’immunopathologie pulmonaire associée à l’infection grippale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Des souris de fond génétique pur, choisies pour leur faible variabilité, et des lignées génétiquement modifiées pour supprimer une population de cellules immunitaires portent ce projet sur la grippe. 2 370 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Le virus leur est administré goutte à goutte dans le nez sous anesthésie, et selon les groupes s'ajoutent une irradiation de neuf minutes, des injections de cellules par voie intraveineuse et des injections de toxine dans l'abdomen sur animal vigile, avec pelage ébouriffé, respiration saccadée et perte de poids annoncés. Les souris qui survivent aux procédures sévères sont tuées elles aussi, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent pas être réutilisées.
Objectifs
Les cellules du système immunitaire sont nécessaires pour combattre les virus. Lorsqu’elles réconnaissent les cellules infectées par le virus, elles produisent des molécules, dites cytokines, qui orchestrent la défense contre le virus et son élimination. Ces cytokines sont indispensables pour la résistance aux infections virales, mais, lorsque leur production est trop prolongée ou excessive, elle devient délétère pour l’hôte. En effet, elles provoquent une inflammation et des lésions pulmonaires parfois fatales pour l’hôte, comme observé dans les poumons des individus infectés par le virus responsable de la pandémie du COVID-19 ou le virus de la grippe. Nous étudions une population de cellules immunitaires qui, lorsqu’elles détectent un virus, produisent en grande quantité ces cytokines à effet double tranchant. Ces cellules sont ainsi réputées essentielles pour l’immunité anti-virale. Cependant, lorsqu’elles sont absentes ou incapables de produire ces cytokines, cela n’affecte pas la résistance à la majorité des infections virales qui est assurée par d’autres cellules immunitaires. En absence de nos cellules d’étude, les souris tolèrent même mieux l’infection par le virus de la grippe et développent une forme moins sévère, en montrant que nos cellules et leurs cytokines sont en réalité délétères. Eliminer spécifiquement les cellules que nous étudions ou inhiber leurs fonctions permettrait donc de reduire la sévérité de la pathologie pulmonaire induite par l’infection par le virus de la grippe. Nous déterminerons quel est le temps le plus tardif auquel on observe un effet délétère des cellules en étude chez les souris infectées par le virus de la grippe. Nous définirons le temps optimal pour administrer des médicaments qui inhibent les fonctions délétères des cellules étudiées. Nous identifierons aussi les cellules ciblées par les cytokines produites par les cellules étudiées et étudierons leurs fonctions délétères. Nous utiliserons deux souches de virus de la grippe choisies comme les plus fréquentes dans les épidemies grippales. Nos résultats permettront d’envisager le développement de nouveaux médicaments pour soigner les patients développant de formes sévères de pathologie pulmonaire induite par des virus respiratoires, comme celui de la grippe.
Bénéfices attendus
Lors d’infection par des virus respiratoires, tels que celui de la grippe ou le Covid-19, les cellules immunitaires, intervenues pour contrôler l’infection, peuvent provoquer une inflammation pulmonaire sévère, si activées de manière excessive et prolongée. Cela dépend en particulier de molécules produites par ces cellules, dites cytokines. Ces cytokines sont nécessaires pour éliminer le virus, mais, lorsque produites en quantité excessive ou sur un temps trop long, elles provoquent des lésions pulmonaires et affectent la capacité respiratoire. Actuellement, la majorité des médicaments administrés pour limiter cette pathologie des poumons rend l’hôte plus vulnerable à l’infection par de nombreux autres pathogènes. Nous avons identifié une population de cellules immunitaires qui est une source délétère de ces cytokines, mais qui n’est pas requise pour éliminer le virus. Nos travaux visent à comprendre quand et comment les cellules que nous étudions et les cytokines qu’elles produisent favorisent les lésions des poumons chez les souris infectées par le virus de la grippe. Pouvoir éliminer au temps le plus opportun uniquement ces cellules ou inhiber leur production de cytokines permettrait de limiter les lesions des poumons sans altérer la capacité de l’hôte à se defendre contre d’autres pathogènes. Cela representerait une avancée majeure pour développer de nouveaux médicaments pour soigner les patients qui développent des pathologies pulmonaires sévères sans compromettre leurs défénses immunitaires.
Procédures
Dans toutes les Procédures Infection une fois sous anesthésie en administrant goutte à goutte dans le nez la solution contenant le virus (durée 30 secondes). Si desydratation, injection une fois dans l’abdomen d’une solution saline. Les gestes suivants seront réalisés uniquement dans les Procédures indiquées Procédure 1 Injection une fois dans l’abdomen d’une toxine sur 80 souris vigiles ou par voie gastrique d’un produit(durée 1 minute). Injection une fois dans l’abdomen sur 60 souris vigiles de médicaments (durée 1 minute). Procédure 3 Irradiation pendant 9 minutes, puis injection de cellules par voie intraveineuse, une fois sous anesthésie ; Procédure 5 Injection intraveineuse d’anticorps et prelévément de sang une fois sous anesthésie, 260 souris (durée 1 minute). Administration d’une solution une fois sous anesthésie goutte à goutte dans la gorge, 40 souris (durée 1 minute). Procédure 6 Infection en administrant goutte à goutte dans le nez, deux fois à 35 jours d’interval sous anesthésie, 20 souris, (durée 30 secondes). Injection intraveineuse d’anticorps et prelévément de sang, une fois sous anesthésie, 240 souris (durée 1 minute). Administration d’une solution une fois sous anesthésie goutte à goutte dans la gorge, 40 souris (durée 1 minute). Procédure 7 Irradiation une fois sous anesthésie pendant 9 minutes, puis injection de cellules par voie intraveinuese. Injection intraveineuse d’anticorps et prelévément de sang une fois sous anesthésie générale, 240 souris, durée 1 minute. Administration d’une solution goutte à goutte dans la gorge une fois sur souris anesthésiées durée 1 minute. Procédure 8 Injection intraveineuse de cellules une fois sous anesthésie, durée 1 minute.
Impact sur les animaux
L’infection par le virus de la grippe s’effectue par instillation dans les narines et sous anesthesie, ce qui peut provoquer un stress et une douleur légèrs et transitoires. L’infection peut induire des changements de l’aspect (pelage ébouriffé, réduction du toilettage), du comportement (réduction de la mobilité et de l’activité) et du rythme de la respiration (respiration lente ou saccadée), une perte d’appetit et de poids que nous monitorerons de façon très précise pour détecter le plus précocément une aggravation de l’état des souris si elle a lieu. L’administration par injection dans l’abdomen de la toxine par voie intraperitoneale sur souris vigiles induit un stress et une douleur legère et transitoire. L’administration de reactif par voie gastrique sur souris vigiles induit un stress et une douleur de courte durée. L’administration des inhibiteurs sera effectuée par injection dans l’abdomen sur souris vigiles, ce qui comporte un stress et une douleur legère et transitoire. Avant irradiation, les souris subiront un stress et une douleur légère lors de l'administration de l’anesthésique par injection dans l’abdomen L’administration d’anticorps et les prélèvements de sang seront effectués sur souris anesthesiées ce qui peut provoquer un stress et une douleur légèrs et transitoires. L’injection de cellules sera effectuée par voie intraveineuse sous anesthésie générale, les souris subiront un stress et une douleur légère lors de l'administration de l’anesthésique par injection dans l’abdomen.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure moderée pour effectuer les prelevements et les expérimentations prévus. Mise à mort de tous les animaux survivants à la fin de chaque procédure sévère car les animaux ne peuvent pas être reutilisés dans d'autres procédures.
Remplacement
Ce projet nécessite d’étudier la réponse immunitaire et la réparation des tissus pulmonaires au cours d’une immunopathologie suite à l’infection par le virus de la grippe. La complexité des interactions établies entre les cellules ne peut pas être reproduite in vitro dans son intégralité et nécessite donc l’utilisation de modèles d’étude vivants. L’intégration d’un système vivant et complet est donc indispensable pour reproduire l’ensemble de ces processus dans leur complexité. La souris répresente le modèle d’étude optimale car elle permet de générer et utiliser de modèles génétiquement modifiés ciblant les cellules et/ou les molécules en étude. De plus, les similitudes entre système immunitaires murin et humain ont déjà permis le développement de nombreux traitements de maladies chez l’homme. Dans le cas spécifique de ce projet, nous nous attendons à obtenir des indications médicales pour limiter et inhiber les effets néfastes de l’immunopathologie pulmonaire chez les patients souffrant de formes sévères d’infection grippale.
Réduction
Les effectifs d'animaux nécessaires seront réduits au minimum. Nous utiliserons des souris de fond génétique pur, ce qui nous permet de limiter la taille des groupes expérimentaux à 10 souris (5 x2 réplicats) par souche et par condition, en raison d’une variabilité inter-individuelle moindre par rapport aux animaux de fond génétique mixte. Ces nombres ont déjà été validés dans des expériences effectuées précedemment par notre équipe, comme suffisantes pour produire des analyses statistiques fiables dans les procédures utilisées.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, conçues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques). Les conditions d’hébergement sont contrôlées et régulées. Pour limiter le stress des animaux, ils seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Le poids, le comportement, la mobilité et la respiration seront suivis quotidiennement dès le début de chaque traitement. En cas d’affaiblissement des souris, de la nourriture sous forme de paté et de l’eau sous forme de gélée seront mises à l’intérieur de la cage afin d’en faciliter l’accès. Si nécessaire, les souris seront réhydratées par injection dans l’abdomen d’une solution saline. Les points limites et des grilles de score ont été définis dans chaque procédure. Sur la base de ces points limites la douleur sera scrupuleusement mésurée pour évaluer les signes de souffrance relatifs à l’expérimentation en cours, de manière à mettre en place le plus précocement possible des mesures pour réduire au maximum la souffrance des animaux. Les animaux atteignant les critères d’arrêt seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Des souris âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées car elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires. Un écart type de maximum 2 semaines au sein d’un même groupe expérimental est défini afin de limiter les variabilités qui pourraient exister entre des souris d’un écart d’âge plus important.
Développement d’un modèle murin de cancer colorectal métastatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Deux chirurgies sous anesthésie gazeuse, l'une pour greffer des cellules cancéreuses dans l'intestin, l'autre pour retirer le caecum, ouvrent un protocole qui se poursuit par des prélèvements sanguins hebdomadaires. 640 souris vont être utilisées, toutes tuées pour le prélèvement des organes, dans des procédures que le porteur classe en niveau de souffrance modéré. Le projet compare quatre techniques d'implantation de cellules tumorales afin de retenir la plus reproductible, avant tout usage thérapeutique. Entre huit et douze semaines après la greffe, le porteur annonce des douleurs au ventre, une perte de poids, des diarrhées ou des traces de sang, une grande fatigue et des difficultés respiratoires liées aux métastases, tout en maintenant le classement en souffrance modérée.
Objectifs
Le cancer colorectal est la deuxième cause de décès par cancer en France, avec environ 17 000 morts chaque année. Il débute dans le côlon et peut se propager à d’autres organes, comme le foie ou les poumons, lorsque la maladie n’est pas détectée ou traitée suffisamment tôt. À ce stade métastatique, le pronostic reste défavorable malgré les progrès des traitements. Pour mieux comprendre l’évolution de ce cancer et tester de nouvelles thérapies, des modèles expérimentaux chez la souris sont indispensables. Toutefois, les modèles actuels manquent parfois de fiabilité et de reproductibilité, notamment pour la formation des métastases. L’objectif de ce projet est de développer un modèle murin robuste et reproductible de cancer colorectal métastatique capable de reproduire les principales étapes observées chez l’Homme, de la tumeur intestinale initiale jusqu’à la dissémination de cellules tumorales vers des organes distants. Quatre méthodes d’implantation de cellules tumorales dans l’intestin de la souris seront comparées afin d’identifier la plus efficace et la plus reproductible. Différents types de cellules tumorales seront utilisés, chez des souris avec ou sans système immunitaire fonctionnel. Une fois validé, ce modèle servira d’outil de référence pour de futurs projets, permettra de limiter l’utilisation d’animaux et facilitera le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer colorectal métastatique.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mettre au point un modèle de cancer du côlon métastatique chez la souris, qui se rapproche le plus possible de la maladie observée chez l’homme. Il permettra de mieux comprendre comment l’environnement qui entoure la tumeur influence son apparition, sa croissance et sa propagation vers d’autres organes. Ces recherches pourraient aussi aider à identifier des indicateurs biologiques permettant de mieux suivre l’évolution de la maladie. Ce projet est important car on ne comprend pas encore bien comment le cancer colorectal se propage dans le corps. Les possibilités de traitement sont limitées lorsque la maladie atteint un stade avancé. Ces recherches sont donc essentielles pour améliorer les soins proposés aux patients.
Procédures
Les animaux subiront une première intervention chirurgicale pour la transplantation de cellules cancéreuses et une deuxième intervention chirurgicale pour retirer le caecum. Les actes s’effectueront sous anesthésie générale gazeuse (moins de 25 minutes). Ils recevront une dose d’analgésique 30 minutes avant l’anesthésie, 8h après l’intervention et deux doses le lendemain (à 8h d’intervalle). Des prélèvements sanguins seront réalisés une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure. Les différents gestes seront compris entre 20 et 90 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir un stress temporaire lors de leur manipulation et de l’anesthésie. Après l’intervention chirurgicale, une douleur passagère peut apparaître, comme après toute opération, avec un faible risque de complications locales (irritation ou infection de la zone opérée). Les effets sur les animaux peuvent évoluer avec le temps : • 4 à 8 semaines après l’intervention : Les animaux peuvent être légèrement gênés. Ils peuvent être un peu moins actifs, avoir un pelage moins bien entretenu et montrer une discrète difficulté à se déplacer, liée au début du développement de la tumeur dans l’intestin. • 8 à 12 semaines après l’intervention : La gêne peut devenir plus importante. Les animaux peuvent ressentir des douleurs au ventre, perdre du poids, présenter des troubles digestifs (comme des diarrhées ou des traces de sang), être très fatigués, moins réactifs et se déplacer plus difficilement. La maladie peut se propager à d’autres organes, comme le foie ou les poumons, des difficultés respiratoires ou des signes de mal-être général peuvent apparaître dans les phases les plus avancées.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et les organes d’intérêts seront récupérés pour une analyse post mortem.
Remplacement
Ce projet vise à développer un modèle murin du cancer colorectal métastatique, afin de mieux comprendre la progression d’une tumeur vers un stade métastatique. Pour étudier ces mécanismes, il est nécessaire d’utiliser des organismes vivants complets, car ils possèdent l’ensemble des interactions naturelles présentes dans un corps (circulation sanguine, système immunitaire, environnement cellulaire complexe…). Les modèles murins utilisés dans ce projet reproduisent de manière fidèle la formation de métastase. À ce jour, aucun modèle en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permet de reconstituer toutes les composantes d’un tissu vivant dans son intégralité. C’est pourquoi l’utilisation de ces modèles animaux reste indispensable pour répondre aux questions scientifiques posées dans ce projet.
Réduction
Nous avons choisi le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir des résultats fiables, en nous appuyant sur des données scientifiques et des méthodes statistiques. Nous commencerons par la méthode qui est moins invasive. Si elle fonctionne, les méthodes plus lourdes ne seront pas utilisées, ce qui réduira encore le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Nous avons mis en place toutes les mesures nécessaires pour assurer le bien-être des animaux. Leur état sera vérifié chaque jour, et les procédures seront réalisées sous anesthésie pour éviter la douleur et réduire le stress. Après la chirurgie, les animaux seront maintenus au chaud jusqu’à leur réveil. Nous surveillerons attentivement tout signe de malaise. En cas de problème, des actions rapides seront mises en place pour soulager l’animal, comme une alimentation plus facile à consommer, des améliorations de l’environnement ou l’administration d’antidouleurs en complément si besoin.
Choix des espèces
Ce projet nécessite un modèle animal proche de l’humain sur le plan physiologique. Pour mener ces recherches, deux types de souris sont utilisés de façon complémentaire. Des souris au système immunitaire intact sont nécessaires pour comprendre comment les défenses naturelles de l’organisme influencent le développement des tumeurs. En parallèle, des souris dont le système immunitaire est affaibli sont indispensables pour pouvoir étudier des tumeurs humaines implantées chez l’animal. L’association de ces deux approches permet de mieux comparer les situations et d’obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe chez l’être humain. Les animaux seront utilisés à partir de 2-3 mois d'âge selon le protocole établi dans la littérature ou lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g.
Evaluation de radiotraceurs pour l’imagerie des cancers exprimant une cible spécifique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 141
Des cellules tumorales sont injectées dans le cerveau de souris sous anesthésie, puis quatre examens d'imagerie hebdomadaires suivent la croissance de la tumeur pendant trois à quatre semaines. 1 550 animaux non-humains sont utilisés, 1 409 souris et 141 rats, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur ne retient pourtant, parmi les effets néfastes, qu'une gêne ou une douleur possibles et deux nuisances qu'il qualifie de légères, le stress de la contention et celui de l'anesthésie. La mise à mort sert à prélever organes et fluides et à mesurer la radioactivité fixée, le porteur écrivant que chaque animal sera "exploité au maximum" afin de réduire le nombre total.
Objectifs
Les mutations de certains gènes favorisent la progression tumorale. Ce projet a pour objectif d’évaluer de nouvelles méthodes d’imagerie médicale permettant d’identifier ces mutations.
Bénéfices attendus
L’objectif ultime étant d’offrir un nouvel outil d’identification des tumeurs pour une médecine de précision.
Procédures
- 1 injection de cellules sous-cutanée (
Impact sur les animaux
La croissance tumorale sous cutanée pourrait entrainer une gêne ou une douleur. De même, la croissance tumorale intracérébrale pourrait entrainer l’apparition de signes cliniques neurologiques. Le stress modéré lors de l’injection de la molécule radioactive dans un appareil de contention, réduite à une dizaine de secondes car réalisée par un expérimentateur expert (nuisance légère). Le stress léger dû à l’induction de l’anesthésie (nuisance légère).
Devenir
À l'issue de chaque procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort par une personne compétente et habilitée, conformément à la réglementation en vigueur. Cette étape est indispensable pour permettre le prélèvement des tissus et des organes d'intérêt. Les échantillons seront ensuite utilisés pour réaliser des analyses ex vivo, notamment des mesures de radioactivité (comptage radioactif) afin de quantifier précisément la biodistribution du radiotraceur, ainsi que des analyses histologiques et immunohistochimiques destinées à caractériser l'expression des biomarqueurs et à corréler ces résultats avec les données obtenues par imagerie in vivo. Ces analyses nécessitent l'intégrité des tissus et ne peuvent pas être réalisées chez l'animal vivant.
Remplacement
Malgré la pré-sélection des radiotraceurs lors d’études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouveaux radiotraceurs requièrent la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. La pharmacocinétique d’un radiotraceur est dépendant de la physiologie globale de l’individu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant (fixation aspécifique du traceur dans un autre tissu, métabolisation hépatique…)
Réduction
Les études préliminaires d’évaluation des radiotraceurs in vitro permettent de présélectionner les molécules prometteuses et de réduire ainsi le nombre d’animaux engagé dans les études précliniques. Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les lots de biodistribution, les animaux des lots imagerie seront utilisés pour réaliser le dernier point d’évaluation ex vivo. Le nombre d’animaux a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. Pour les études d’évaluation d’un radiotraceur in vivo, n=4/ groupe est un nombre suffisant généralement utilisé. Chaque animal sera exploité au maximum (prélèvements organes et fluides) afin d’optimiser l’information obtenue et réduire le nombre total nécessaire.
Raffinement
Une habituation sera réalisée pour faciliter l’entrée des animaux dans l’appareil de contention pour les intra-veineuses. Le personnel pratiquant les iv est un personnel expérimenté ce qui permet de limiter la contention vigile à moins de 2 minutes (associé à l’habituation cela limite le stress de l’animal). Des méthodes de préhension douces seront utilisées pour les animaux. Les animaux des lots imagerie seront leurs propres contrôles et serviront de point terminal pour les études de biodistribution. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d’antalgiques avant l'atteinte des points limites définis (perte de poids supérieure à 20%, du poids maximal observé, prostration, hérissement du poil, volume tumoral, aspect du point d’injection, aspect de la tumeur…). Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptés pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Des animaux de 5 à 7 semaines sont classiquement utilisés pour ce type de modèle. Le modèle rat est classiquement utilisé pour les études sur les gliomes mais la croissance tumorale peut être moindre chez ces animaux. Aussi nous envisageons (en alternative) la possibilité de réaliser l’étude sur le modèle de gliome implanté chez la souris selon les études in vitro et les molécules candidates sélectionnées.
Etude de l’effet de différentes molécules sur la modulation de la neuropathie induite par l’oxaliplatine chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à 23 tests de sensibilité à la douleur par animal, sur sept semaines : 1 040 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. La douleur est provoquée par l'oxaliplatine, un anticancéreux courant, et le porteur annonce un abaissement du seuil douloureux persistant quelques jours, des œdèmes, des troubles de la locomotion et de l'alimentation. Aucune souris ne peut être réutilisée, les substances administrées et l'état douloureux installé fausseraient une nouvelle procédure. Le porteur affirme qu'il lui est "indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe" et décrit la souris comme "incontournable" en neurosciences, après avoir déjà obtenu des résultats avec ces mêmes molécules chez elle dans d'autres protocoles de douleur.
Objectifs
Les chimiothérapies provoquent souvent des effets secondaires importants. Parmi eux, beaucoup de patients développent des douleurs chroniques. L’oxaliplatine, un médicament utilisé pour traiter plusieurs types de cancers, est très efficace. Cependant, il peut aussi provoquer des douleurs neuropathiques. Même si ces atteintes peuvent parfois disparaître après l’arrêt du traitement, certaines personnes continuent à souffrir de douleurs nerveuses chroniques qui réduisent leur qualité de vie. Ces douleurs se traduisent par une hypersensibilité : des sensations comme le froid, la chaleur ou le toucher, qui ne sont normalement pas douloureuses, peuvent alors devenir très pénibles. Les traitements actuels contre ces douleurs sont souvent partiellement efficaces et peuvent provoquer des effets secondaires importants. Par exemple, l’utilisation prolongée d’opioïdes peut paradoxalement augmenter la sensibilité à la douleur. L’objectif de ce projet de recherche est donc de trouver de nouvelles approches pour prévenir ou traiter ces douleurs nerveuses liées aux chimiothérapies. Nos travaux suggèrent que certains récepteurs présents dans l’organisme, appelés récepteurs RFamide, pourraient jouer un rôle dans ces douleurs. Nous avons récemment identifié des molécules capables de bloquer spécifiquement ces récepteurs. En étudiant leurs effets dans un modèle expérimental de douleur causée par l’oxaliplatine chez la souris, nous espérons mieux comprendre les mécanismes de ces douleurs et ouvrir la voie à de nouveaux traitements plus efficaces et mieux tolérés pour les patients.
Bénéfices attendus
L’étude de l’effet de nos composés dans ce modèle de douleur neuropathique provoquée par l’oxaliplatine, un anticancéreux communément utilisé chez l’homme, nous permettra de mieux comprendre le rôle de récepteurs spécifiques dans la mise en place de la douleur et ainsi d’envisager de nouveaux traitements thérapeutiques mieux tolérés.
Procédures
Dans le protocole 1 les animaux subiront : 18 tests nociceptifs (chaque test dure entre 5 et 15 minutes), 4 administrations de molécules (30 secondes). Cette procédure dure 5 semaines. Dans le protocole 2 les animaux subiront : 23 tests nociceptifs (chaque test dure entre 5 et 15 minutes), 12 administrations de molécules (30 secondes). Cette procédure dure 7 semaines. Dans le protocole 3 les animaux subiront : 20 tests nociceptifs (chaque test dure entre 5 et 15 minutes), 15 administrations de molécules (30 secondes). Cette procédure dure 7 semaines.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux à un niveau modéré pouvant persister quelques jours, l’apparition d’inflammation / œdème, des comportements anormaux, des problèmes de locomotion, d’alimentation. Nous pouvons aussi nous attendre à une amélioration du niveau de douleur pour les molécules qui s’avéreront efficaces
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait de l'administration de substances pharmacologique et des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.
Remplacement
Les molécules testées in vivo, sont au préalable sélectionnées sur la base d’évaluations in vitro afin de déterminer leur affinité et leur activité sur le récepteur d'intérêt ainsi que leurs caractéristiques physicochimiques. Ces expériences permettent de limiter fortement le nombre de molécules à tester sur l'animal. Cependant l'évaluation de leurs effets sur la nociception n’est réalisable que sur l’animal entier ou l’on peut conserver les interactions inter organes avec leur physiologie ; il n’existe, à ce jour, pas de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail.
Réduction
En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, le nombre d’animaux est limité à 10 par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables (un outil informatique est utilisé afin de calculer ce nombre). L’évaluation préalable in vitro de nos molécules permet de réduire grandement le nombre de molécules à évaluer in vivo et par conséquent réduit également fortement le nombre d’animaux nécessaires pour leur évaluation. Les expériences seront menées sur les mâles et les femelles afin de s’affranchir d’un biais de réponse lié au sexe et de représenter la répartition homme/femme dans la population générale.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi composé d’un carré de coton, de frisure, d’un bâton en bois à ronger et de tunnel. Le change sera fait à l’aide d’un tunnel, les souris seront manipulées à l’aide de ce tunnel ou prises en cup quand cela sera possible. Quotidiennement, une observation de l’état clinique des souris sera assurée par une personne compétente et les animaux seront pesés toutes les semaines. Les souris seront habituées à l’expérimentateur et au matériel utilisé afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et après concertation auprès de la structure chargée du bien-être animal. Chaque geste rattaché à une procédure sera raffiné au maximum afin de maximiser le bien-être des animaux. Ainsi, chaque arrivée d’animaux sera suivie d’une semaine d’acclimatation à nos locaux. Puis d’une ou deux semaines d’habituation, durant lesquelles les animaux seront manipulés par l’expérimentateur et habitués à la contention afin de faciliter les expériences futures. Toutes les injections seront réalisées avec une taille d’aiguille la plus fine possible. Les animaux étant très bien habitués à être mis en contention légère dans un torchon, les injections seront grandement facilitées et ne provoqueront que très peu de stress et de douleur car les sites d’injections deviennent multiples. Chaque test de sensibilité sera arrêté après un certain temps garantissant la non lésion des tissus. Après chaque manipulation de cage, une pincée de flocon d’avoine stérile sera donnée dans la cage afin de récompenser les animaux.
Choix des espèces
Les objectifs du projet consistent à étudier les effets de molécules sur les douleurs persistantes provoquées par un traitement anti-cancéreux, l’oxaliplatine. Il nous est donc indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. De plus, nous avons déjà obtenus de bons résultats avec ces molécules antagonistes chez la souris, dans d’autres modèles de douleur neuropathique. Nous utiliserons des animaux âgés de 2 à 6 mois afin de travailler sur un animal adulte.
Implication d’un récepteur de la sérotonine dans le développement des troubles du spectre de l’autisme
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées pour des analyses histologiques ou biochimiques, 56 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un premier groupe reçoit une injection quotidienne pendant sept jours puis passe un test par jour pendant six jours, un second subit une chirurgie de 45 à 60 minutes suivie d'un prélèvement terminal de tissus. Ces souris portent une invalidation génétique d'un récepteur à la sérotonine dont le porteur affirme qu'elle reproduit des déficits de sociabilité et des comportements stéréotypés, et le projet mesure si un traitement déjà employé chez des personnes autistes corrige ce tableau. Les tests comportementaux ne sont nommés nulle part, alors que l'évaluation du traitement repose entièrement sur eux.
Objectifs
Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) touchent environ 1 % de la population, selon de récentes études épidémiologiques à grande échelle. Les TSA constituent un ensemble de troubles neurodéveloppementaux dont les symptômes touchent principalement le comportement et la communication sociale. Parmi les gènes récemment identifiés comme potentiellement impliqués dans les TSA, notre équipe a mis en évidence le rôle d’un type de récepteur à la sérotonine. Des souris génétiquement invalidées pour ce récepteur présentent des déficits de sociabilité ainsi que des comportements restreints et stéréotypés, caractéristiques des TSA. L’objectif de notre projet est double : 1/ Évaluer si un traitement pharmacologique actuellement utilisé pour atténuer les symptômes des TSA, permet de corriger le phénotype autistique observé chez les souris. 2/ Étudier l’impact de la délétion du gène du récepteur à la sérotonine sur la morphologie des cellules gliales et neuronales dans des régions cérébrales clés dans la régulation des comportements sociaux et des comportements répétitifs
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension du rôle du récepteur à la sérotonine dans le développement de la pathologie autistique, ainsi que l’exploration de nouvelles pistes thérapeutiques pour atténuer les symptômes de l’autisme. À court terme, il nous permettra de comprendre les mécanismes impliqués dans la mise en place de la pathologie et les voies de signalisation du récepteur qui constituent une cible thérapeutique potentielle. À plus long terme, il nous permettra de mettre au point de nouveaux médicaments ciblant notre récepteur et agissant spécifiquement sur les voies de signalisation dérégulées dans la pathologie.
Procédures
Un premier lot d’animaux sera injecté une fois par jour durant 7 jours avec une solution de traitement ou contrôle, puis passera des tests comportementaux (5 à 10 minutes par test, un test par jour durant 6 jours) puis une fixation terminale de tissus pour prélèvements. Le deuxième lot sera soumis à une chirurgie unique avec anesthésie et analgésie (45-60 minutes) puis un prélèvement terminal de tissus.
Impact sur les animaux
Des animaux recevront des injections d’agents pharmacologiques. Une inflammation au site d’injection peut être observée. Un léger stress dû à la manipulation par l’expérimentateur et à la séparation courte d’avec les congénères peut survenir durant les tests comportementaux. Un inconfort au niveau du site d’intervention et de légères douleurs locales peuvent survenir après la chirurgie, normalement résolues sous 24 heures.
Devenir
Tous les animaux utilisés seront mis à mort pour analyses histologiques ou biochimiques
Remplacement
Pour pouvoir développer de nouvelles approches thérapeutiques dans le cadre des TSA, il faut comprendre les mécanismes moléculaires provoquant ces pathologies afin d’agir spécifiquement sur ces mécanismes. Pour ce faire, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux d’autisme, sur lesquels nous pourrons d’une part effectuer des tests biochimiques, permettant de caractériser les déficits moléculaires associés à la pathologie et d’autre part des tests comportementaux qui permettront d’évaluer l’efficacité d’une approche thérapeutique. En effet, il n’existe pas de marqueur biologique pour l’autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental
Réduction
Nous testerons chaque animal dans différentes tâches comportementales. Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique suffisante pour exploiter les résultats.
Raffinement
Nous raffinerons nos expériences en soulageant l’inconfort ou le stress potentiels subis par les animaux tout au long du protocole expérimental, en logeant les souris par groupe de 4, en mettant à disposition le nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant quotidiennement les animaux par le même expérimentateur. Comme l’autisme est une pathologie qui touche autant les hommes que les femmes, nous utiliserons les animaux des deux sexes. L'injection stéréotaxique de petits volumes est largement documentée, et maitrisée dans notre équipe. Cette opération est conduite sous anesthésie générale de l'animal, et est suivie d'une observation accrue pendant la phase de réveil. En fonction des signes cliniques observés en post-opératoire, la souris aura accès à une nourriture hydratée et/ou un anti-inflammatoire non-stéroïdien sera utilisé pendant 24 à 72 heures. Nous ne nous attendons pas à un degré de souffrance justifiant la mise à mort des animaux, mais si une souris montre une perte de poids significative, alors elle sera euthanasiée.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux chez lesquels il est possible d’étudier de nombreux comportements, en particulier ceux qui sont altérés chez les patients souffrants de TSA. Des animaux jeunes adultes (8-12 semaines) seront utilisés car à cet âge les déficits comportementaux sont facilement mesurables, et les structures cérébrales sont bien en place. Nos tests seront donc suffisamment robustes pour permettre de détecter des différences dans l’organisation des régions du cerveau des animaux modèles de TSA et également pour tester les effets bénéfiques potentiels de composés médicamenteux.
Evaluation préclinique de produits de santé pour la chirurgie des tissus mous – MODIFICATION
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Lapins : 800
Chiens : 96
Cochons : 800
Chèvres : 160
Moutons : 640
Tester des mesh abdominaux, des colles hémostatiques et d'autres dispositifs de chirurgie des tissus mous conduit à utiliser 2 816 animaux non-humains, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 410 d'entre eux étant opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Parmi eux, 800 lapins, 800 cochons, 640 moutons, 320 rats, 160 chèvres et 96 chiens subissent une implantation chirurgicale de 1 h 30 à 2 h 30, jusqu'à trois séances d'imagerie sous anesthésie et des prélèvements sanguins. Les tissus au contact de l'implant sont prélevés après la mise à mort pour analyse microscopique, ce qui exclut de garder un seul animal en vie. Le porteur décrit une activité de prestation, le donneur d'ordre commandant les essais et s'engageant à ne pas les faire refaire à l'identique, et indique que des formations du personnel peuvent être menées dans ce cadre.
Objectifs
Il s’agit d’un projet de recherche et développement qui vise à étudier la performance (efficacité) de produits de santé utilisés en chirurgie des tissus mous et/ou d’en évaluer la tolérance (sécurité). Il peut s'agir de produits de renforcement abdominaux (mesh), de produits hémostatiques (colle, poudre, compresses...), de produits pour protection lors d’une cryothérapie, …. Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir la sécurité des patients et l’efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables pour l'Homme durant l'utilisation clinique. Dans le cadre de ce projet, des formations adaptées pourront être menées afin d'assurer et de maintenir les compétences du personnel de l'EU sur les études couvertes par ce projet. En ce sens, différents types d’essais peuvent être menés : - Essais de performance : - Essais de screening d’efficacité : Les essais de screening d’efficacité vérifient si la performance d’un produit mérite d’être approfondie ou s’il est nécessaire de mener d’autres études avant de passer aux essais de confirmation de performance. Ces essais sont essentiels dans la stratégie de réduction du nombre total d’animaux utilisés. - Essais de confirmation de performance : Les essais de confirmation de performance sont effectués après validation des essais de screening d’efficacité. Comme leur nom l’indique, ils visent à confirmer les résultats obtenus lors des essais préalablement menés sur un produit. - Essais de tolérance locale : Les essais de tolérance locale évaluent la réaction d’un organisme en contact avec un produit étranger. Dans ce projet, ces essais peuvent être réalisés en complément des essais de performance, sur les mêmes animaux. Les critères d’évaluation à prendre en considération sont définis lors de la rédaction du protocole d’essai. Ce projet pourra se conduire dans plusieurs EU partenaires, afin d'obtenir des résultats d'imagerie spécifique non disponible dans notre EU.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir des données de performance et de tolérance de produits de santé utilisés en chirurgie des tissus mous. En mimant au plus près l'implantation du dispositif chez les patients, ces études permettront de mieux appréhender la réaction de l’organisme au produit à tester, et ainsi améliorer la sécurité et/ou les performances du produit, avant sa mise sur le marché.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 1h30 et 2h30). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), et analgésie. L’antibiothérapie est ajoutée au cas par cas en fonction de l’invasivité de la chirurgie et des risques infectieux associés. Des prélèvements sanguins peuvent etre réalisés en cours d'étude (en général un prélèvement à la chirurgie et un prélèvement en fin d'étude, d'une durée de quelques minutes). Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres types d'interventions non douloureuses, de type scanner ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude, 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - mise à jeun - stress liés à la chirurgie - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours - Atteinte de la structure ou du fonctionnement des organes en contact avec le dispositif implanté. (par exemple difficulté à uriner après implantation d’un dispositif au niveau de la prostate.) Les douleurs post-opératoires peuvent apparaitre et seront prises en charge par des mesures de raffinement. Les animaux recevront une anesthésie fixe afin de réaliser l'imagerie, pouvant induire un stress. Du produit de contraste pourra être injecté grâce à un cathéter en intraveineux. Une légère perte de poids (non systématique) pourrait être observée dans les quelques jours suivant l'anesthésie.
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques sur des prothèses abdominales pour évaluer la résistance du dispositif). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de chirurgie des tissus mous en raison des interactions complexes s'établissant entre le tissus ciblé et le dispositif lui-même. De plus, l’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation que doivent suivre les tests précliniques sur les dispositifs médicaux, avant de pouvoir lancer les tests cliniques.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’EU. Ensuite, et avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations (exemples : habituation aux pesées, habituation alimentaire). Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (exemple : jouets), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements : pommes dans la litière des porcs, ou friandises dans les jouets, et augmentation de la litière des ovins). Les transports des animaux vers les EU partenaires seront organisés dans le respect du bien-être animal et de la réglementation en vigueur (durée du transport jusqu'à 1h30 en fonction des EU avec ajout de litière et transport en groupe). Un contrôle clinique de chaque animal est réalisé par du personnel qualifié (vétérinaire, technicien ou zootechnicien) au départ et à l'arrivée. Lors des séances d'imagerie externalisées, afin de limiter le stress des animaux, une période de repos adéquate sera instaurée entre la réception des animaux et l'anesthésie et entre le réveil des animaux et le transport retour vers notre EU. La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire, les suivis quotidiens sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (désinfection des sites chirurgicaux à une fréquence adaptée). Les signes cliniques servant de points limites ont été définis, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances. Selon l'espèce, les prises de sang peuvent être réalisées sous anesthésie générale (injectable et/ou volatile, lors d'une phase de chirurgie par exemple), ou sous sédation légère (voir paragraphe sur la liste des médications) avec au besoin une analgésie, afin de maitriser le stress et la douleur potentielle. Les conséquences de l’anesthésie/chirurgie : du gel oculaire est appliqué au niveau de la cornée lors des anesthésies des animaux pour prévenir l'assèchement oculaire. Une attention particulière est portée à la lutte contre l'hypothermie : température de la salle, isolation du sol, couvertures, lampes chauffantes si besoin. En cas de doute, une mesure de la température rectale est réalisée.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans les textes de référence. MODIFICATION V13: l’espèce est également choisie en fonction de sa similarité avec l’humain (exemple pour la prostate du chien qui est plus proche de l’humain que celle des autres espèces. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez les rongeurs ou le lapin (norme ISO10993 Partie 6). Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le porc ou les ovins/caprins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (le long terme: espèces à longue durée de vie). Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. Le stade de développement est pertinemment sélectionné en fonction de l'utilisation clinique du produit ou de sa taille par exemple. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. Cas particulier des porcs domestiques : étant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines) est la plus appropriée dans ce projet.
Étude de l’effet de l’insufflation intra-abdominale de dioxyde de carbone (CO₂) sur l’inflammation générale et cérébrale dans un modèle d’entérocolite (inflammation sévère de l’intestin) chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Nourris par une sonde introduite par la bouche jusqu'à l'estomac, matin et soir du 3e au 7e jour de vie, avec un lait contenant une substance qui provoque une inflammation intestinale, 432 souriceaux subissent aussi trois passages quotidiens de dix minutes dans une chambre où l'oxygène est abaissé de 21 à 5 %. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré à sévère, avec douleur abdominale, diarrhée, sang dans les selles, altération de l'état général et décès parmi les effets attendus. Certains reçoivent au 6e jour une insufflation de dioxyde de carbone dans l'abdomen, que le porteur décrit comme réalisée sous anesthésie générale afin qu'ils ne ressentent aucune douleur, tout en signalant une perforation d'organe suivie du décès et une perforation possible de l'œsophage lors du passage de la sonde. Des tests comportementaux sont annoncés au 30e et au 45e jour de vie, sans que le document précise lesquels. Tous sont tués, à 8 jours pour prélever intestins, cerveaux, sang, foie et rate, à 50 jours pour prélever les cerveaux.
Objectifs
L’entérocolite ulcéro-nécrosante (ECUN) est une maladie grave de l’intestin du nouveau-né prématuré, correspondant à une inflammation sévère pouvant abîmer voire détruire une partie de l’intestin. Elle est responsable d’un état inflammatoire général prolongé avec un risque élevé de complications et de décès (15–30 %). Elle peut également avoir des effets sur le développement cérébral. En effet, elle est associée à une augmentation de la survenue de troubles du neurodéveloppement (TND) sans que l’on ne comprenne encore pourquoi. Les troubles du neurodéveloppement regroupent plusieurs difficultés liées au développement du cerveau pendant l’enfance et peuvent inclure par exemple des difficultés pour apprendre, se concentrer, communiquer ou interagir avec les autres. L’hypothèse principale pour expliquer ces séquelles neurologiques est que l’inflammation due à l’entérocolite perturberait le développement du cerveau chez ces nouveau-nés très fragiles. Le traitement de l’ECUN repose initialement sur les antibiotiques et la mise au repos de l’intestin (mise à jeûn). Si l’intestin se perfore ou si l’état du nouveau-né s’aggrave malgré ce traitement, une opération devient nécessaire. La chirurgie se fait classiquement par laparotomie, c’est-à-dire par une large ouverture abdominale. Une technique plus récente et moins invasive peut être utilisée. Il s’agit de la coelioscopie néonatale. Il s’agit d’une technique chirurgicale peu invasive. Elle consiste à faire de petites incisions dans le ventre pour introduire une caméra et des instruments. Le ventre est légèrement gonflé avec un gaz (le dioxyde de carbone) afin de créer de l’espace et permettre de voir et d’explorer les organes. Seulement 8 % des chirurgiens pédiatres dans le monde utilisent la coelioscopie dans la prise en charge des ECUN. Les études ont montré une diminution significative de l’inflammation chez les nouveau-nés ayant bénéficié d’une coelioscopie. L’hypothèse est l’effet anti-inflammatoire du CO2 insufflé lors de la cœlioscopie et son interaction directe avec l'intestin. Notre projet de recherche a pour objectif d’étudier l’effet anti inflammatoire et notamment neuroprotecteur de l’insufflation intra-abdominale de CO2 sur un modèle d’entérocolite chez la souris. L’intégralité de ce travail aura une application directe sur le protocole de prise en charge chirurgicale des entérocolites des nouveau-nés prématurés, et sur leur pronostic.
Bénéfices attendus
Un enfant né prématuré sur trois aura des TND. La survenue de ces troubles est plus fréquente en cas d’ECUN associée. En effet, plus de 50% des nouveau-nés prématurés avec ECUN auront un trouble du neurodéveloppement. Les effets de l’entérocolite sur le cerveau des nouveau-nés n’ont pas encore été élucidés. Avec ce projet, nous cherchons à comprendre d’une part l’association entre TND et entérocolite en étudiant l’impact de l’inflammation sur le développement du cerveau des nouveau-nés. Nous cherchons à comprendre d’autre part la baisse de l’inflammation et la meilleure évolution des nouveau-nés ayant bénéficié d’une coelioscopie, qui ont été constaté chez les patients. Seulement 8 % des chirurgiens pédiatres dans le monde utilisent la coelioscopie dans la prise en charge des ECUN. Les résultats de nos expériences précliniques, s’ils s’avèrent positifs, constitueraient un pré requis indispensable à la généralisation de l’exploration coelioscopique chez les nouveau-nés atteints d’ECUN. L’intégralité de ce travail aura une application directe sur le protocole de prise en charge chirurgicale des ECUN, et sur leur pronostic à court et long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis à quatre types d’intervention : - Une alimentation par une fine sonde orogastrique (fin tube introduit par la bouche, jusqu'à l'estomac) avec une solution lactée matin et soir du 3ème au 7ème jour de vie. La composition de la solution lactée diffère entre les groupes. Certains souriceaux recevront du lait à usage vétérinaire. D’autres souriceaux recevront du lait à usage vétérinaire contenant une substance qui provoque de l’inflammation intestinale (Dextran Sodium Sulfate). Cela permet de reproduire, chez la souris, une entérocolite similaire à celle observée chez les nouveau-nés prématurés. - Un maintien pendant 10 minutes trois fois par jour du 3ème au 7ème jour de vie dans une chambre avec une concentration en oxygène abaissée de 21 à 5%. - Au 6ème jour de vie, certains souriceaux auront une insufflation de CO2 dans l’abdomen, c’est à dire qu’ils recevront une faible quantité de gaz dans la cavité abdominale à l’aide d’un très fin tube. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale afin que les animaux ne ressentent aucune douleur. Le gaz sera administré pendant 10 minutes avec une pression très faible et contrôlée. Chaque souris concernée recevra cette intervention une seule fois. - Une IRM cérébrale sera réalisée sur chaque souris autour du 40ème jour de vie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie générale pour obtenir une immobilité parfaite.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent tout d’abord subir un stress temporaire lors : des manipulations, de la séparation ponctuelle avec la mère chez les souriceaux, des tests comportementaux, et du transport des animaux vers les salles d’expérimentation. Ils peuvent ensuite être sujets aux symptômes d’entérocolite : douleur abdominale, diarrhée, sang dans les selles, altération de l’état général, décès. L’administration du lait par voie orogastrique (sonde introduite par la bouche jusqu’à l’estomac) présente également des risques : l’introduction de cette sonde peut entrainer un stress et un inconfort liés au passage de la sonde et à la contention. Dans de rares cas des complications peuvent survenir, comme une fausse route ou une perforation de l’œsophage. De plus, bien que cela reste exceptionnel, une perforation d’organe suivi du décès peut survenir lors de l’introduction du petit tube d’insufflation de CO2. Pour finir, ils présentent un risque de décès provoqué par les produits anesthésiants lors des procédures réalisées sous anesthésie générale.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de réaliser les prélèvements tissulaires post-mortem : - A l’âge de 8 jours : prélèvement des intestins pour caractériser l’entérocolite, des cerveaux pour analyse de l’architecture cérébrale et des conséquences cérébrales de l’inflammation, du sang, du foie et de la rate pour caractériser l’inflammation. - A l'âge de 50 jours : prélèvement des cerveaux pour caractériser l’architecture cérébrale.
Remplacement
Les effets de cette maladie sur le cerveau et sur le système de défense du corps ne peuvent pas être étudiés correctement sans utiliser un animal entier. Il n’est pas possible de tester cette approche uniquement sur des cellules en laboratoire ou à l’aide d’un logiciel, car ces méthodes ne permettent pas de reproduire toute la complexité de la maladie. La souris est un animal souvent utilisé en recherche médicale pour les modèles d'entérocolite. Elle permet d’étudier cette maladie de manière fiable, car son organisme réagit d’une façon comparable et adaptée à ce type d’étude.
Réduction
Le modèle de maladie utilisé a été mis au point pour provoquer des lésions de l’intestin tout en limitant la gravité de l’état des jeunes souris, permettant de limiter la souffrance et de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. Une surveillance au minimum quotidienne est mise en place afin d’apprécier l’état des souriceaux. Plusieurs examens sont réalisés sur les mêmes animaux au cours de l’étude, ce qui permet de recueillir un maximum d’informations tout en limitant le nombre total de souris nécessaires. Le nombre de souris est réduit au strict nécessaire à l’obtention de résultats fiables.
Raffinement
Toutes les interventions sont réalisées par du personnel formé et autorisé. Cela concerne notamment l’alimentation des jeunes souris à l’aide de la sonde, l’anesthésie, les insufflations dans l’abdomen. Les animaux sont hébergées dans des conditions adaptées à leur bien-être : alternance jour/nuit régulière, température stable, eau et nourriture à volonté. Les cages contiennent du papier doux pour leur permettre de construire un nid. Les mères et leurs petits ne sont pas dérangés avant le troisième jour de vie. Lors des manipulations, la séparation est la plus courte possible et les petits sont maintenus au chaud avant d’être replacés auprès de leur mère. Pendant la période où la maladie est provoquée, les animaux sont observés deux fois par jour (poids, comportement, état général). Des règles précises sont suivies pour décider si un animal doit être euthanasié plus tôt afin d’éviter toute souffrance inutile. L’administration du gaz dans l'abdomen est réalisée sous anesthésie générale afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Le matériel utilisé permet de délivrer une pression très faible, adaptée à la taille des jeunes souris. Les animaux sont surveillés en permanence pendant et après l’anesthésie. Les tests de comportement sont réalisés dans une salle calme. Les animaux sont d’abord habitués à l’environnement et sont manipulés avec douceur.
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux d’ECUN, le rongeur est largement utilisé dans la littérature. Plusieurs études sur les conséquences de l’insufflation du CO2 chez la souris ont été publiées précédemment. L’insufflation de CO2 intra-abdominale chez la souris est facilement réalisable, reproductible et ne nécessite qu’un seul point de ponction. Notre modèle d’entérocolite est induit chez des souriceaux du 3ème au 7ème jour de vie car ils ont à cet âge, un développement cérébral comparable à celui d’un nouveau-né prématuré. Les tests comportementaux sont réalisés pendant la période de l’acquisition motrice puis plus tard au 30ème et 45ème jours de vie correspondant aux périodes d’adolescence et de jeune adulte, à la recherche de troubles du neurodéveloppement.
Évaluation dose–réponse du composé X et ses effets intrinsèques en conditions pair-feeding
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Trente-cinq administrations et trente-deux pesées par animal, en cage individuelle: 60 souris rendues obèses par un régime dont 60 % des calories viennent des graisses sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Les témoins voient leur ration calorique quotidienne strictement alignée sur celle des souris traitées, afin de savoir si la perte de poids obtenue avec le composé X vient de la seule baisse de la prise alimentaire. Le porteur signale que l'obésité elle-même réduit la capacité de mouvement des souris, et que les prélèvements de sang causent des douleurs légères et du stress. L'étude est commandée par un client dont le porteur reprend l'objectif, faire aboutir la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.
Objectifs
Depuis 1975, la prévalence de l’obésité mondiale a presque triplé, atteignant plus de 650 millions d’adultes obèses en 2016 selon l’Organisation mondiale de la Santé (OMS). L’obésité constitue aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique, pour lequel de nombreuses approches thérapeutiques, interventions chirurgicales et dispositifs médicaux sont en cours de développement ou d’évaluation. Le présent projet s’inscrit dans la continuité d’une étude préliminaire menée par notre client, ayant démontré que le composé X induit, chez la souris rendue obèse par un régime enrichi en graisses, une diminution significative de la prise alimentaire associée à une réduction du poids corporel. Cet effet a été observé dans un contexte d’administration chronique. Afin de préciser la nature des effets observés, notre client souhaite déterminer si la perte de poids induite par le composé X résulte exclusivement de la diminution de la prise alimentaire ou si d’autres mécanismes métaboliques intrinsèques contribuent à cet effet. Pour répondre à cette question, nous avons conçu une étude de type pair-feeding. Le composé X sera administré à un groupe d’animaux afin de caractériser la réduction spontanée de la prise alimentaire induite par le traitement. En parallèle, des groupes témoins recevant le véhicule auront leur ration calorique quotidienne strictement ajustée à celle des animaux traités. Si la perte de poids observée s’avère comparable entre les deux groupes, il sera alors possible de conclure que l’effet du composé X sur le poids corporel est principalement imputable à la seule réduction de la prise alimentaire. En revanche, toute différence supplémentaire en faveur du groupe traité suggérerait l’existence d’un effet métabolique propre, indépendant de la restriction calorique.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (32 mesures au cours de l'étude ; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration des traitements (35 administrations ; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (3 mesures ; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Prélèvements sanguins (3 prélèvements ; durée du prélèvement : 5 minutes); 5) Anesthésie générale avant mise à mort et prélèvement d'organes (durée : 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. L'administration des traitements sera source de stress. Par ailleurs les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de stress. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après mise à mort pour analyses ultérieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 12 animaux par groupe pour les souris obèses a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de tunnels, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation sera prévue une semaine avant la phase de traitement afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Avant la mesure de la composition corporelle, les animaux seront habitués à être installés dans le tube de couleur rouge permettant de réduire le stress des animaux au cours de la mesure. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures. Les prélèvements sanguins seront limités au volume minimum nécessaire aux analyses pharmacocinétiques et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'anti-douleur en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (avec 60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 18 semaines à réception. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de 12 semaines de régime enrichi en graisses chez le fournisseur.
Apport de la thérapie génique pour soigner les troubles de l’oreille interne d’origine génétique
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Les souris utilisées sont déficientes pour des protéines de l'audition et deviennent sourdes et déséquilibrées dès la deuxième semaine de vie, un état qui dure jusqu'à leur mise à mort. 8 985 souris sont engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection unique dans l'oreille interne sous anesthésie, à un jour de vie ou entre 14 et 30 jours, puis des tests auditifs sous anesthésie répétés à 1, 2 et 3 mois, et des tests comportementaux d'équilibre et d'orientation, dont un test d'équilibre de 31 minutes et un test de flottaison de dix secondes. 4 635 souris sont tuées pour prélever les tissus de leur oreille interne, et 4 350 sont réutilisées pour de l'exploration fonctionnelle.
Objectifs
La surdité et les troubles de l'équilibre sont parmi les déficits sensoriels héréditaires les plus fréquents chez l'homme. Environ 1 nouveau-né sur 700 est atteint de surdité congénitale, et 80 % de ces cas ont une origine génétique, dont 30 % sont associés à des troubles de l’équilibre. Parmi les syndromes responsables, le syndrome d’Usher est l’une des principales causes de surdicécité et de troubles d’équilibre héréditaires chez l’homme. À ce jour, aucun traitement ne permet de prévenir ou de corriger ces atteintes sensorielles. Depuis peu, la thérapie génique est l’une des pistes explorées pour soigner ces déficits. Notre objectif est d’évaluer l’efficacité d’une telle approche dans différents modèles murins de surdités sensorielles parmi lesquelles le syndrome d’Usher. Nous testerons deux stratégies de thérapie génique dans des souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de développer des stratégies thérapeutiques capables de prévenir et/ou retarder les déficits sensoriels de l’oreille interne d’origine génétique. A court terme : Nous identifierons les méthodes les plus efficaces pour exprimer la protéine non mutée ou réparer la protéine mutée et déterminerons l’efficacité de ces stratégies pour corriger les troubles sensoriels chez nos souris déficientes. A long terme : Nous espérons avec ce travail développer des outils utilisables dans des essais pré-cliniques et cliniques afin de prévenir ou retarder les signes cliniques chez les patients atteints du syndrome d’Usher. Ceci inclut : - la mise en évidence d’approches nouvelles pour le transfert de gène, - la mise en évidence de l’efficacité in vivo de l’édition de gène pour la correction de mutations spécifiques.
Procédures
Chirurgie : Les animaux seront soumis à des injections dans l’oreille interne sous anesthésie gazeuse et analgésie, elles seront uniques et ne dureront pas plus de 10 minutes au stade néonatal et 20 minutes au stade post-natal. Tests auditifs : Les souris injectées au niveau de l’oreille interne seront soumises à des tests auditifs dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à 1, 2 et 3 mois. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes ou de sondes placées sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Tests d’équilibre : Les souris injectées au niveau de l’oreille interne seront également soumises à des tests comportementaux. Leurs déplacements seront analysés à l’aide d’un système vidéo (2 minutes). Leur capacité d’équilibre sera évaluée par deux tests : un premier de 31 minutes (composé de 3 sessions de 2 minutes et 3 sessions de 5 minutes, séparées par des pauses de 2 minutes) et un second de 2 minutes. Leur capacité d’orientation dans l’espace sera évaluée grâce à deux autre tests (10 à 60 secondes chacun). Un test de flottaison sera finalement réalisé (10 secondes) avant le retour en cage d’hébergement.
Impact sur les animaux
Les souris déficientes en protéine fonctionnelle de l’audition présentent des déficits qui se manifestent par des troubles de l’équilibre. Les injections dans l’oreille interne seront réalisées sous anesthésie et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en pré- et post-opératoire. Aucune dégradation de l’état des animaux n’est attendue. Bien au contraire, nous espérons que le remplacement ou la correction du gène muté contribuera à rétablir les fonctions sensorielles des souris injectées. En découle la liste ci-dessous des interventions après raffinement, et de leurs éventuels effets indésirables supérieurs ou égal à une piqûre d’aiguille : 1) Les lignées de souris transgéniques déficientes non traitées, élevées dans un milieu fortement enrichi, montrent une surdité et des troubles de l’équilibre, qui apparaissent à partir de la 2ème semaine de vie post-natale et perdurent jusqu’à la mise à mort. 2) Les injections dans l'oreille d’une durée maximum de 20 minutes, sont réalisées sous anesthésie avec analgésie et sous contrôle strict pré- et post-opératoire. Les souris sont placées sur un tapis chauffant (37°C) et surveillées tout au long de la procédure. 3) Un test entraîne de faibles nuisances, dont une chirurgie de courte durée (15min) et l’étude vidéo, qui nécessite de maintenir les animaux immobilisés pour une durée n'excédant jamais 30 minutes.
Devenir
4350 souris seront réutilisés pour exploration fonctionnelle. Les autres animaux (soit 4635 souris) seront mis à mort pour récupérer des tissus de l’oreille interne afin de réaliser des analyses biologiques et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules sensorielles ; 2) la transmission de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique à certains neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous aurons recours à la souris dans notre projet pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la surdité et les troubles de l’équilibre, et pour tester l’efficacité thérapeutique de traitements préventifs ou curatifs.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de publications. Un effectif de 5 individus par groupe permettra d’obtenir des résultats significatifs, au regarde des effets attendus. Nous limitons également le nombre d’individus de nos groupes contrôles en réexploitant, quand cela est pertinent, les données contrôles de nos expériences antérieures. Afin de contrôler d’éventuels effets techniques, les souris d’une même cage seront subdivisées pour recevoir au moins 2 traitements différents, et plusieurs répétitions seront réalisées. Ces facteurs seront pris en compte dans les analyses.
Raffinement
Enrichissement de l’environnement Chez la souris, les troubles sensoriels peuvent s’accompagner d’hyperactivité, de désorientation, de stress et de bagarres (chez les mâles). D’expérience, nous avons remarqué que pour limiter ces effets, il suffisait d’ajouter deux igloos par cage, des copeaux en carton (et non pas en coton propice aux garrots), des bâtonnets en bois à grignoter (1 par souris), et d’équilibrer le nombre d’animaux normaux et d’animaux déficients dans une même cage. Les cages doivent de plus être manipulées avec une très grande délicatesse et le moins souvent possible (une fois par jour maximum). Les personnes amenées à intervenir sur nos cages de souris déficientes sont alertées sur les consignes à appliquer. Surveillance des souris en amont et en aval d’une anesthésie avec ou sans chirurgie L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie des souriceaux. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans leur cage. Les animaux opérés seront régulièrement inspectés pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans la grille d’évaluation fournie par notre SBEA.
Choix des espèces
Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Ces modèles vont nous permettre d’explorer les preuves de concept thérapeutique que nous pourrons transposer, du moins conceptuellement, chez l’homme. Les injections se feront sur des souriceaux (P1, age 1 jour) ou des souris âgées de P14-P30 (age entre 14 et 30 jours). Le stade P1 est un stade immature où les cellules sensorielles ne sont pas encore trop affectées. Les stades P14/P30 correspondent à des stades où les tissus sensitifs de l’oreille interne sont matures. La mise à mort se fera entre 30 jours et 3 mois post-injection pour évaluer les effets à court, moyen et long terme d’une correction génique.
archivage et redérivation de lignées de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Pour transférer des lignées de souris génétiquement modifiées entre animaleries et les conserver congelées sous forme d'embryons, 5 025 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Les femelles donneuses reçoivent deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle pour produire davantage d'embryons, avant d'être tuées pour qu'on les récupère. Les mères porteuses subissent une chirurgie de transfert d'environ cinq minutes et trois injections, les mâles une vasectomie dans les mêmes conditions. Les mères porteuses sont tuées au plus tard au sevrage de leurs petits, le porteur écrivant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées comme reproductrices ni remises au transfert après une chirurgie, et les mâles vasectomisés le sont quand leurs performances d'accouplement diminuent, au bout de dix mois au plus tard.
Objectifs
Le projet présenté vise en premier lieu à permettre le transfert des lignées entre les animaleries en préservant l'état sanitaire des animaux. Pour cela, nous produisons des embryons par croisement des animaux (femelles et mâles fertiles), en induisant une stimulation hormonale des femelles pour augmenter le nombre d'ovules fécondables. Les embryons ainsi produits sont prélevés et transférés par voie chirurgicale sous anesthésie générale dans des femelles porteuses de statut sanitaire contrôlé dans l'animalerie de destination. Pour obtenir des femelles capables de recevoir ces embryons et de mener la gestation à bien jusqu'à la naissance des petits, il faut croiser ces femelles adultes avec des mâles vasectomisés. Cet accouplement permet de préparer physiologiquement la femelle à la gestation. Les petits obtenus sont débarrassés de tout germe potentiellement infectieux pouvant nuire à la santé des animaux et à la qualité de la recherche. Ce projet vise également à mettre en sécurité les lignées de souris sous forme d'embryons. En effet, cette technique de congélation robuste permet de préserver les lignées transgéniques pendant des décennies sans nécessité de garder des animaux vivants. On réduit de ce fait considérablement le nombre d'animaux utilisés pour le maintien d'une lignée, mais on la préserve aussi d'une perte occasionnée par une infection ou tout autre évènement imprévu ( incendie, catastrophe naturelle...). De plus, la forme congelée facilite les échanges de modèles avec d'autres laboratoires à travers le monde tout en évitant le stress lié au transport d'animaux vivants. La congélation d’embryons est complémentaire de la congélation de sperme, permettant la préservation de lignées présentant des mutations sur le chromosome X ou des mutations multiples.
Bénéfices attendus
La congélation des lignées de modèles de souris génétiquement modifiées générées dans le cadre des projets de recherche permet d’en assurer la préservation à long terme, tout en maintenant leurs caractéristiques génétiques et sanitaires. Cette approche contribue à réduire le nombre d’animaux maintenus en élevage. Elle facilite également les échanges avec des collaborateurs à l’échelle internationale et ainsi limite la création de modèles en double dans différents laboratoires, ce qui participe également à la réduction du nombre d’animaux utilisés. La décontamination par transfert d’embryons constitue la méthode la plus sûre pour restaurer et garantir un haut niveau de qualité sanitaire des lignées. Ce statut sanitaire élevé est essentiel pour assurer la fiabilité et la validité des résultats scientifiques. Par ailleurs, cette technique facilite également les échanges de modèles entre établissements, ce qui évite d'avoir à recrééer le même modèle, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Procédures
Les souris donneuses d'embryons vont subir 2 injections d'hormones à 48h d'intervalle pour stimuler la production d'embryons. Ces actes sont rapides et se font sous contention manuelle sur animaux vigiles. Les souris mères porteuses recevront lors de la chirurgie de transfert d'embryons : Une injection d'analgésique pré-opératoire (30 minutes avant), une injection d’un cocktail anesthésique avec action analgésique et décontractante musculaire (actes rapides, sur animaux vigiles sous contention). Une fois l'endormissement suffisamment profond, la chirurgie est réalisée. Elle dure environ 5 minutes par animal. 1 injection d'anti-inflammatoire couplée à celle de solution saline pour réhydrataion est réalisée en post opératoire et avant le réveil. Chaque femelle mère porteuse recevra au total 3 injections. Les mâles qui seront vasectomisés recevront lors de la chirurgie pour la vasectomie : Une injection d'analgésique pré-opératoire (30 minutes avant), une injection d’un cocktail anesthésique avec action analgésique et décontractante musculaire (actes rapides, sur animaux vigiles sous contention). Une fois l'endormissement suffisamment profond, la chirurgie est réalisée. Une fois l'endormissement suffisamment profond, la chirurgie est réalisée. Elle dure environ 5 minutes par animal. 1 injection d'anti-inflammatoire couplée à celle de solution saline pour réhydrataion est réalisée en post opératoire et avant le réveil. Chaque mâle vasectomisé recevra au total 3 injections. Les injections d'analgésique et celle pour induire l'anesthésie sont rapides et se font sous contention manuelle sur animaux vigiles. L'injection d'anti-inflammatoir et de réhydratation se fait pendant l'anesthésie.
Impact sur les animaux
Les procédures peuvent entraîner chez les animaux un stress léger et transitoire lié aux manipulations et aux contentions nécessaires à la réalisation des injections. Lors de l’administration des différents produits utilisés dans cette procédure en étant vigiles (hormones, analgésiques, anesthésiques), les animaux peuvent ressentir une douleur légère et de courte durée correspondant au moment de l’introduction de l’aiguille (sauf pour les injections réalisées sous ). Par ailleurs, lors des interventions chirurgicales, une plaie est créée et peut, dans de très rares cas, présenter une inflammation ou une infection. Enfin, il arrive exceptionnellement qu’en période post-opératoire certains animaux mordillent leurs fils de suture, ce qui peut fragiliser la cicatrisation.
Devenir
Les donneuses d'embryons seront mises à mort pour récupérer les embryons au stade souhaité. Pour les mèresporteuses, dès lors qu'il y a eu chirurgie de transfet d'embryons, elle seront mises à mort au plus tard au sevrage de leurs petits (soit 3-4 semaines post partum). Nous ne pouvons pas les réutiliser comme reproductrices ou de nouveau mère porteuses, ayant déjà subi une chirurgie. Les mâles vasectomisés sont mis à mort lorsque leurs performances d'accouplement diminuent (nombre de BVs par accouplement) au bout de 10 mois au plus tard. On évite d'utiliser des animaux agés ou ayant subi une procédure modérée pour une réutilisation en formation par exemple.
Remplacement
le recours à l’animal vivant pour la décontamination et l'archivage de lignées transgéniques est indispensable puisqu'il s'agit de produire des embryons.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisés ainsi que l’amélioration de leur bien-être constituent une préoccupation permanente dans la mise en œuvre de ces procédures. La superovulation de jeunes femelles permet d’augmenter significativement le nombre d’embryons produits par individu et, par conséquent, de réduire de manière importante le nombre d’animaux donneurs nécessaires. Le tri des femelles en œstrus, destinées à devenir mères porteuses, contribue également à diminuer le nombre de femelles et mâles maintenus en stock tout en améliorant l’efficacité des gestations. Par ailleurs, la souche sélectionnée pour les mères porteuses est reconnue pour ses bonnes capacités maternelles et la qualité des soins apportés aux portées. Ce choix permet d’augmenter le taux de succès des transferts embryonnaires et ainsi de limiter le nombre d’animaux requis. Enfin, le nombre d’animaux utilisés est ajusté en fonction de chaque procédure et des spécificités de chaque lignée génétique. Dans ce contexte, il n’est pas possible d’appliquer une approche statistique standardisée, les besoins étant déterminés au cas par cas selon les résultats obtenus.
Raffinement
Le personnel impliqué dans cette étude maîtrise ces gestes techniques, qui sont réalisés en routine depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Après les injections, les femelles sont maintenues sous surveillance afin de détecter toute manifestation externe de souffrance ou d’inflammation. Lors de la chirurgie de vasectomie ou de transfert d’embryons, les animaux sont anesthésiés et reçoivent un traitement antalgique adapté à la procédure. Un gel ophtalmique est systématiquement appliqué sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dessèchement et tout dommage cornéen. De plus, les animaux sont placés sur une plaque chauffante afin de limiter les pertes de chaleur liées à l’anesthésie. Après l’intervention, les animaux opérés restent sous observation jusqu’à leur réveil complet, dans leur cage placée sur une platine chauffante maintenue à 37 °C. Les souris sont hébergées en cages ventilées, en groupe dans la mesure du possible, et bénéficient d’un enrichissement de leur environnement (matériel de nidification, croquettes de nourriture déposées au fond de la cage). Le bien-être des animaux est suivi conformément au tableau de scoring en vigueur dans l’animalerie.
Choix des espèces
La souris est un très bon modèle d'expérimentation animale car elle est de petite taille, son génome est parfaitement connu et elle a un taux de reproduction très rapide. Elles sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Elle est couramment utilisé par les chercheurs pour des créations de lignées transgéniques. Les mâles vasectomisés sont de jeune adultes qui après vasectomie seront utilisés pour les croisements et production de femelles pseudo-gestantes. Ils seront utilisés jusqu’à environ 8 mois afin maintenir des performances élevées. Les mères porteuses sont de jeunes adultes qui sont utilisées durant 3-6 mois. Ce sont d’excellentes mères (choix de souches non consanguines ou hybrides) qui peuvent donner naissance et prendre soin de grandes portées, ce qui permet de réduire significativement le nombre de mères porteuses utilisées. Les femelles utilisées pour produire les embryons sont prépubères car elles répondent mieux aux traitements de stimulation hormonale pour la superovulation. (réduit le nombre de femelles donneuses utilisées)
Étude des bénéfices de l’électrostimulation neuromusculaire sur le système musculaire de souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Soumises à six séances d'électrostimulation musculaire sous anesthésie générale, à sept mesures de force, à une injection sous-cutanée et à un prélèvement de sang, 416 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue parce que l'analyse détaillée du tissu musculaire ne peut pas se faire sur l'animal vivant. Ce cumul d'actes est annoncé comme une source de stress, et le porteur qualifie pourtant son dispositif de "totalement non-invasif", ce dont il tire une réduction du nombre de souris utilisées. L'objet déclaré est d'identifier les molécules que la fibre musculaire sécrète en réponse à l'exercice, en vue de pathologies humaines de fonte musculaire. Les points limites appliqués portent sur le gonflement anormal de la patte, sa non-utilisation persistante, la prostration, les démangeaisons et une mobilité réduite.
Objectifs
Le projet vise à i) identifier les molécules sécrétées par la fibre musculaire en réponse à l’exercice, ii) évaluer leur impact sur les différents types cellulaires du muscle, iii) à analyser la persistance des noyaux dans la fibre musculaire, ainsi que sa durée ; et identifier leurs effets fonctionnels, tissulaires, biochimiques, cellulaires et moléculaires
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la réponse à la contraction musculaire induite par l’exercice est fondamentale pour la prise en charge de pathologies associées à une fonte du tissu musculaire et à une dysfonction des cellules souches musculaires (i.e., vieillissement, cancer, sepsis, insuffisance cardiaque).
Procédures
Les souris sont soumises à un protocole d’exercice par électrostimulation (sous anesthésie générale, durée 15 minutes maximum, 6 séances maximum), à une mesure de force (sous anesthésie générale, durée 5 minutes maximum, 7 mesures maximum), une injection sous cutanée et à un prélèvement de sang.
Impact sur les animaux
Un stress pour les animaux est attendu du fait d’un cumul d’actes (stimulations électriques musculaires, anesthésies, injection sous cutanée, prélèvement sanguin)
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.
Remplacement
Pour ce projet, les modèles animaux sont indispensables car la procédure implique un exercice par stimulations électriques musculaires qui est impossible à reproduire in vitro. Enfin, les études de physiologie nécessitent l'utilisation de modèles animaux car seule l'analyse du tissu, voire de l'organisme entier permet d'identifier le réel impact de ces interactions moléculaires et cellulaires sur la fonction de l'organe.
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’exercice par stimulations électriques musculaires et de mesurer la force musculaire de manière simultanée sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. L’enchaînement des procédures est construit sur une stratégie de type GO/NO GO qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’électrostimulation et de la mesure de la force musculaire. Notre expérience sur ce modèle d’exercice montre que l'ensemble (100%) des animaux est inclus pour réaliser des analyses fonctionnelles et biologiques. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont appliqués (gonflement anormal de la patte, non utilisation persistante de la patte, prostration de l'animal, démangeaison, mobilité réduite). Un traitement antalgique est utilisé pour le prélèvement sanguin.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Les processus physiologiques impliqués dans la fonction du muscle ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux seront utilisés entre 10 et 14 semaines d'âge.
Génération de chimères hématopoïétiques murines pour l’analyse du rôle de facteurs de transcription dans le développement et la fonction de lymphocytes
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Tuées pour qu'on prélève la moelle de leurs os, 150 souris donneuses fournissent les cellules souches injectées à 450 souris receveuses, elles-mêmes tuées à la fin de la reconstitution pour analyse de leurs organes. Les 600 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les receveuses sont irradiées une fois pendant une vingtaine de minutes, ce qui détruit leurs cellules souches et provoque une immunodéficience transitoire, couverte par deux semaines d'antibiotiques dans l'eau de boisson. Le porteur annonce que les connaissances produites permettront, à terme, de reconstituer le développement de ces cellules immunitaires in vitro et donc de s'affranchir du recours au vivant.
Objectifs
Les cellules lymphoïdes innées (CLI) ont été récemment découvertes et jouent des fonctions très importantes et uniques dans l’immunité et l’homéostasie. Les CLI pourraient également jouer un rôle bénéfique dans la lutte contre les tumeurs solides. La compréhension des mécanismes contrôlant le développement des CLI permettrait de moduler et optimiser ce processus à des fins immuno- thérapeutiques. Dans ce but, nous souhaitons examiner le rôle de facteurs de transcription dans le développement des CLI chez la souris. Pour cela, nous allons modifier génétiquement les facteurs d'intérêt dans les cellules souches hématopoïétiques de souris, et examiner l'effet de ces modifications sur le développement des CLI. Les cellules souches hématopoïétiques seront isolées à partir de « souris donneuses », modifiées génétiquement "in vitro", puis injectées dans des « souris receveuses » dans lesquelles elles se développeront ou non en CLI.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront de mieux comprendre les mécanismes contrôlant le développement des CLI chez la souris in vitro et in vivo, et d’identifier des moyens d’optimiser la génération de populations spécifiques de CLI chez l’Homme in vitro. Les connaissances générées par ce projet permettront, à terme, de récapituler le développement des CLI in vitro, et donc de s’affranchir du modèle in vivo.
Procédures
Les souris donneuses de cellules souches hématopoïétiques (150 souris) recevront une injection (une minute environ). Les souris receveuses de cellules souches hématopoïétiques (450 souris) seront irradiées une fois en début de procédure (20 minutes environ) ou recevront deux injections, en plus de l'injection de cellules souches hématopoïétiques (une minute environ par injection).
Impact sur les animaux
La destruction des cellules souches hématopoïétiques des souris receveuses induit une immunodéficience transitoire. Pour pallier à cet effet, les souris seront traitées avec des antibiotiques à large spectre dans l’eau de boisson. Le traitement commencera le jour précédant l’irradiation, pour accommoder les souris au gout des antibiotiques, et se poursuivra pendant 2 semaines après l’irradiation, le temps que les cellules immunitaires innées soient reconstituées.
Devenir
Les souris donneuses seront mises à mort afin d'isoler leurs cellules souches hématopoïétiques présentes dans la moëlle osseuse. Les souris receveuses seront mises à mort à la fin de la reconstitution hématopoïétique, afin d'analyser en détail le développement des CLI dans différents organes (ex. moëlle osseuse, thymus, poumon, intestin, foie,...).
Remplacement
Les facteurs de transcription dont nous souhaitons examiner le rôle dans le développement des CLI ont déjà été impliqués dans ce processus, ou sont prédits comme jouant des fonctions importantes par des modélisations bioinformatiques du développement des CLI. Leur rôle sera tout d’abord examiné in vitro, puis confirmé in vivo. Le passage in vivo est nécessaire pour récapituler tous les stades de développement des CLI et identifier précisément les stades nécessitant les facteurs de transcription d’intérêt.
Réduction
Le modèle de chimères hématopoïétiques pour étudier le développement des CLI donne des résultats très robustes. Le nombre de souris nécessaires pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs est donc faible (n=5 par groupe).
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages enrichies. Tous les actes douloureux seront effectués sous anesthésie générale. Après chaque acte, les souris seront réintégrées dans leurs cages et groupes d'origine pour éviter le stress. Les souris déficientes pour le développement de CLI ne développent pas de pathologies. Les chimères hématopoïétiques de cette étude ne devraient donc pas développer de pathologies. Les souris seront donc suivies quotidiennement, et en cas d’apparition du moindre signe clinique, les souris concernées seront sorties du protocole et mises à mort.
Choix des espèces
Les processus développementaux sont très conservés entre l’homme et la souris, donc la souris est un bon modèle d’étude pour comprendre le développement de cellules humaines. De plus de nombreux outils permettant l’analyse du développement des CLI ont été générés chez la souris et seront utilisés dans cette étude (anticorps, souches génétiquement modifiées). Les souris seront utilisées à l’âge jeune adulte (6-12 semaines) pour une meilleure récupération des souris après la procédure.