Rongeurs
Réponse de l’épithélium broncho-alvéolaire lors d’une irradiation du thorax entier chez la souris avec déplétion des cellules club par le naphtalène (NA)
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
820 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 500 d'entre elles. Elles reçoivent une irradiation du thorax entier à 20 Gy sous anesthésie et des injections répétées de naphtalène destinées à détruire un type de cellules pulmonaires, et sont gardées jusqu'à six mois, pour étudier la réponse de l'épithélium bronchiolique à la radiothérapie. Le porteur indique que cette irradiation entraîne à elle seule la mort de 35 % des animaux sur six mois et des difficultés respiratoires, l'absence des cellules ciblées pouvant aggraver les lésions. Il conclut que la réponse du tissu pulmonaire ne peut être appréhendée qu'in vivo, dans un système biologique intégré.
Objectifs
La qualité de la prise en charge thérapeutique du cancer inclut la qualité du contrôle tumoral mais également la qualité de vie des patients. La radiothérapie est très efficace mais génère néanmoins des séquelles. La réponse pulmonaire à la radiothérapie fait l’objet de publications, mettant en avant le rôle de plusieurs types cellulaires dans le développement des dommages de type inflammatoire ou fibreux post-irradiation. En revanche, très peu de données existent sur la réponse de l’épithélium bronchiolique. Lors d’un projet précédent, nous avons pu identifier un type cellulaire, les cellules club, comme candidat intéressant dans le développement de la fibrose au niveau du poumon. Les cellules club sont situées sur l’épithélium bronchiolique et sont impliquées dans la protection de l’épithélium bronchiolique et dans la détoxification pulmonaire. Elles sont également des cellules capables de se diviser et se différencier pour reconstruire l’épithélium endommagé. Cette protection passe entre autres par la synthèse et la sécrétion d’une substance particulière, l’utéroglobine. Une diminution de cette sécrétion ou une modification génétique impactant les gènes codant pour celle-ci ont été associés au développement de certaines pathologies comme la broncho-pneumopathie obstructive chronique. L’objectif du présent projet est donc d’utiliser un modèle dans lequel les cellules club sont éliminées afin de déterminer l’impact de ces cellules sur le développement des lésions pulmonaires après irradiation du thorax entier chez la souris. Cela est possible, de façon transitoire, par injection de naphtalène qui toxique pour les cellules club. Ce modèle, très utilisé, ne provoque pas de conséquence clinique notable chez les animaux. L’élimination des cellules club maintenue dans le temps peut être obtenue en répétant les injections tous les 3 à 4 jours. Une expérimentation préalable sera effectuée afin d’évaluer la toxicité éventuelle de ces injections répétées. Deux lignées de souris seront utilisées car elles ont des spécificités en lien avec le développement de lésions pulmonaires. Comparer ces deux lignées de souris pourrait nous permettre de comprendre quels sont les facteurs impliqués dans l’évolution des dommages pulmonaire depuis l’inflammation vers la fibrose, une notion importante dans la gestion clinique des séquelles des radiothérapies thoraciques.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension du rôle des cellules club dans la réponse aux rayonnements ionisants, et globalement de la réponse de l’épithélium bronchiolique, peut permettre d’améliorer l’index thérapeutique de la radiothérapie thoracique, en offrant des perspectives préventives ou thérapeutiques sur les lésions radiques pulmonaires.
Procédures
Selon les procédures et lots : • Irradiation 20 Gy, sous anesthésie (durée 10 min) • Injection intra-péritonéale sur animal vigile (unique ou répétée) jusqu’à 1 injection tous les 3 ou 4 jours pendant 4 semaines (soit 16 injections maximum) • Injections répétées de naphtalène/véhicule, 1 injection/semaine/4 semaines, sur animal vigile • Scanner sous anesthésie (8 min, max 3 fois) • Les animaux sont gardés au maximum 6 mois.
Impact sur les animaux
D’après le recul acquis au laboratoire, l’irradiation du thorax entier sur un irradiateur de type médical à une dose unique de 20 Gy entraine une mortalité de 35% des animaux sur une période de 6 mois. On peut s’attendre à une mortalité comparable suite à une irradiation sur un irradiateur guidé par l’image. L’absence de cellules club au moment de l’irradiation pourrait aggraver la sévérité des lésions. Les effets cliniques de l’irradiation thoracique sont essentiellement des difficultés respiratoires. Une injection unique de naphtalène n’a pas d’effet clinique notable. Les injections répétées de naphtalène peuvent générer de la fibrose péribronchique en 14 semaines, nous prévoyons d’injecter pendant 4 semaines seulement. Une expérimentation dédiée sera réalisée. La procédure complète ne sera mise en place que si cette expérimentation préalable ne démontre pas d’effet toxique notable.
Devenir
La collecte d’organes pour les analyses ultérieures (histologie, analyse génétique) nécessite l’euthanasie des animaux. Tous les prélèvements aux points d’étude 1 et 6 mois seront faits post-mortem. Les prélèvements concernent tous les animaux du projet.
Remplacement
La réponse globale du tissu pulmonaire aux rayonnements ionisants ne peut être appréhendée qu’in vivo, au sein d’un système biologique intégré.
Réduction
Les modèles d’expérimentation présentés pour l’étude des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Pour effectuer des tests statistiques, il est donc nécessaire d’avoir un minimum de 10 animaux pour chaque groupe irradié pour obtenir des résultats exploitables en fonction des analyses effectuées.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum la souffrance animale (suivi des animaux, anesthésie pour les irradiations, hébergement en groupe avec enrichissement). Les souris sont suivies régulièrement et tout signe d’atteinte importante du bien-être animal (amaigrissement, immobilité, déshydratation importante, signes de détresse ou douleur, incapacité à se redresser lors du test de redressement) entrainera l’euthanasie anticipée.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. C’est également l’espèce de référence utilisée au sein de notre laboratoire. Les précédents projets d’irradiation pulmonaire du laboratoire ont été menés sur souris. Les animaux seront utilisés entre 8 et 34 semaines, correspondant au stade adulte. Le stade adulte est choisi car la thématique de recherche concerne les séquelles des radiothérapies chez les adultes, les effets secondaires des tumeurs pédiatriques étant un domaine de recherche particulier.
Rôle de la modulation d’un sphingolipide hépatique dans le développement du diabète de type 2 chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
736 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une amputation de l'extrémité de la queue sert au génotypage, puis un virus est injecté sous anesthésie, un régime gras est imposé douze semaines, avec gavages de glucose, injections d'insuline, sept prélèvements de sang à la queue et trois jours d'isolement en cage calorimétrique, pour étudier le rôle d'un dérivé lipidique du foie dans le diabète de type 2. Le porteur situe les retombées au conditionnel, l'identification de possibles cibles thérapeutiques. Il justifie la souris par le fait que l'homme partagerait 95 % de son génome avec elle et que le diabète de type 2 y serait bien reproductible.
Objectifs
Chez les personnes en bonne santé, l'équilibre entre la production du glucose et son utilisation est finement contrôlé. Lorsque la glycémie atteint un seuil critique, les cellules beta pancréatiques sécrètent de l'insuline qui a pour action de diminuer les concentrations circulantes de glucose en facilitant son stockage, principalement dans le muscle squelettique et le foie, tout en inhibant sa production par le foie. En cas d'obésité, lorsque l'action tampon du tissu adipeux pour stocker les acides gras est altérée, les tissus non adipeux comme les cellules musculaires, hépatiques et beta pancréatiques, accumulent des acides gras et cette accumulation conduit à un phénomène appelé lipotoxicité et finalement au diabète de type 2. Au cours de l'obésité, les acides gras ectopiques accumulés dans les tissus non adipeux sont métabolisés sous forme de dérivés de de dérivés lipidiques spécifiques. Alors que le rôle de certains de ces lipides dans le développement du diabète de type 2 est bien établi, l'effet d'autres sphingolipides dérivés des céramides sur la résistance à l'insuline et le diabète de type 2 n’est pas bien caractérisée. Les objectifs du projet sont donc au nombre de deux. la relation d'autres lipides avec la résistance à l'insuline et le diabète de type 2 n’est pas bien caractérisée. Des études ont montré que ces derniers auraient un effet positif ou négatif sur la lipotoxicité selon les tissus. Les objectifs du projet sont donc au nombre de deux. D'une part, il s'agit d'étudier l'impact de la modulation des concentrations de ces lipides sur les tissus périphériques tels que les tissus adipeux, muscles squelettiques, cœur et cellules bêta pancréatiques au niveau métabolique durant l'obésité. D'autre part, nous essaierons de déterminer l'effet de la modulation des concentrations de ces lipides sur les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de l'insulino-résistance dans le diabète de type 2.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’ouvrir de nouvelles perspectives pour lutter contre le développement d’une résistance à l’insuline des tissus périphériques en comprenant mieux les mécanismes intracellulaires mis en jeu en réponse à la modulation de certains dérivés lipidiques hépatiques. Ces informations seront précieuses pour contrôler le développement de l’insulinorésistance dans le foie, et donc le diabète de type 2. Elles pourraient permettre notamment l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, préalable au développement de molécules susceptibles de combattre le diabète de type 2.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Les animaux sont pucés dès l’âge d'une semaine et un bout d'extrémité de la queue de moins de 0,5 cm est prélevé entre 7 et 10 jours après la naissance pour génotypage. Une injection intraveineuse d'un virus adénoassocié sous anesthésie durant quelques secondes. La mise en place d’un régime hyperlipidique durant 12 semaines. Un gavage au glucose pour le test de tolérance au glucose sur animal vigil durant quelques secondes. Une injection intrapéritonéale d’insuline pour le test de sensibilité à l'insuline sur animal vigil durant quelques secondes. 7 prélèvements sanguins à la queue de 1 à 10 µL sur animal vigil lors des tests de tolréance au glucose et sensibilité à l'insuline durant quelques secondes. Une injection intrapéritonéale d'un mélange d'anesthésique et analgésique pour anesthésie durant quelques secondes. Un isolement de la souris pour mesures calorimétriques individuelles pendant 3 jours. Un placement en tube de contention pour mesure de la masse corporelle qui dure moins de 2 minutes. Les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires en fonction des besoins expérimentaux.
Impact sur les animaux
Le prelèvement d'un bout d'extrémité de la queue pour génotypage peut entrainer une douleur de courte durée. L'anesthésie gazeuse peut entrainer une perte de chaleur et un stress thermique. La mise à jeun des animaux pendant 4 heures lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent être stressant et entrainer une légère faim. Le gavage de glucose et l’injection intrapéritonéale d’insuline peuvent aussi être stressant à cause de la contention de l'animal. L'injection d'insuline lors du test de tolérance à l'insuline peut induire une douleur de courte durée au niveau de la piqûre de l'aiguille et une hypoglycémie. Le prélèvement du sang à la queue pour mesurer la glycémie des animaux est un geste peu stressant pour l’animal. Une microcoupure de 1mm de l’extrémité de la queue peut entrainer un léger inconfort et une douleur de courte durée. Les mesures de masse grasse et maigre par l'analyseur peuvent entrainer un stress lors de la contention de la souris dans le tube de l'appareil. La mise en cages calorimétriques pour 3 jours afin d’évaluer l’apport alimentaire et hydrique ainsi que la consommation métabolique de O2 et production de CO2 peuvent entrainer un stress à cause de l'isolement d'une souris par cage.
Devenir
A l’issue des différents actes, les animaux seront euthanasiés par deux méthodes réglementaires différentes en fonction des analyses à réaliser sur les organes/prélèvements.
Remplacement
Ce projet vise à étudier les conséquences métaboliques d’une modulation de la concentration hépatique d'un dérivé lipidique chez la souris. Il s’agit d’un projet de physiologie intégré dans lequel tous les organes de régulation de l’homéostasie glucidique sont impliqués. C’est la raison pour laquelle le modèle de souris a été privilégié. Il serait difficile de mener à bien ce projet en utilisant qu’un seul modèle cellulaire car nous pensons que la modulation de la concentration hépatique du dérivé lipidique aura des conséquences intrahépatiques, mais sûrement aussi sur le métabolisme lipidique et glucidique d’autres tissus périphériques tels que les muscles squelettiques, les cellules beta pancréatiques et les tissus adipeux.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour atteindre une significativité statistique, nous avons utilisé un programme informatique pour calculer le nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Nous nous sommes basés sur des résultats obtenus précédemment sur la mesure des variables. De plus, nous utiliserons un test statistique adapté à notre étude pour déterminer si des différences existent entre les groupes des animaux après traitement ou régime. Nous utiliserons 736 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Pour atténuer le stress de la manipulation des souris dans le temps, le même expérimentateur effectue toutes leurs pesées régulières afin que les souris soient familiarisées au même expérimentateur. Quand vient l’heure des injections, nous gardons les animaux dans un environnement calme avec le minimum de personne dans la pièce pour éviter tout stress additionnel et inutile aux souris. Si un animal reste prostré dans sa cage pendant 48h maximum, ou montre une anomalie importante de la qualité du poil on ne le laisse pas souffrir et il est euthanasié. Les animaux sont observés tous les jours, y compris le week-end. Une grille de suivi sera mise en place avec comme contrôle une pesée hebdomadaire des animaux. Pour une souris sous régime normal, une perte de poids de 20 pour cent entre 2 suivis hebdomadaires consécutifs sera considérée comme point limite et entrainera l’euthanasie de la souris. Idem, pour une souris sous régime gras, une perte de poids de 20 pour cent entre 2 suivis hebdomadaires consécutifs sera considérée comme point limite et entrainera l’euthanasie de la souris. L'injection de virus adénoassocié est réalisée sous anesthésie et analgésie. Durant toute anesthésie, les animaux seront gardés sous une lampe chauffante pour éviter toute perte de chaleur. Des protocoles d’enrichissement de l’environnement de l’animal sont mis en place avec notamment la présence de nids végétaux et de tunnels.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris C57B6J génétiquement modifiées de 6 semaines, âge où les animaux sont sevrés et pubères et sont dans les conditions métaboliques stables. Le fait que l’homme partage 95 pour cent de son génome avec celui de la souris valide l’utilisation de cet animal. De plus, le diabète de type 2 est une pathologie humaine bien reproductible chez la souris.
Validation de matrices d’encapsulation d’îlots pancréatiques de rats et humains implantées en intrapéritonéale ches le Rat diabétique.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
948 rats vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour une partie et sans réveil pour une autre. Un diabète leur est provoqué par injection, avant deux chirurgies pour prélever puis implanter des îlots pancréatiques encapsulés dans l'abdomen, avec jusqu'à 70 mesures de glycémie, 90 injections d'insuline et des sections répétées de la queue pouvant entraîner nécrose et hémorragie. Le porteur teste des hydrogels censés protéger la greffe d'îlots contre le rejet, bénéfice pour les patients diabétiques renvoyé au conditionnel. Il affirme que la régulation glycémique met en jeu de nombreux organes et conclut que le recours à l'animal vivant est indispensable.
Objectifs
Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune induisant une destruction des cellules sécrétant l’insuline et une hyperglycémie. L'une des thérapeutiques proposées pour les patients ayant un DT1 est l'injection dans le foie d'îlots pancréatiques. En effet, la greffe d'îlots est une approche prometteuse permettant une quasi normalisation du contrôle glycémique, qui prévient des évènements hypoglycémiques sévères et qui améliore significativement la qualité de vie du patient DT1. Cependant, cette approche thérapeutique comporte encore de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Il s’agit d’une réaction inflammatoire médié par le sang mettant en jeux les mécanismes de la coagulation appelée « Instand Blood Mediated Inflamatory Reaction » (IBMIR). Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Depuis les années 80, de nombreuses équipes ont tentées de mettre en place un pancréas bioartificiel basé sur l’encapsulation des îlots pancréatiques. Néanmoins, à ce jour, aucun système n’a réellement montré d’efficacité à long terme sur la survie et la fonction des îlots. Ainsi, cette approche de protection des îlots doit être encore améliorée et c’est dans ce contexte que nous situons notre projet de recherche. Ainsi, dans le but de promouvoir cette thérapie en levant ces verrous, nous souhaitons tester différentes méthodes d’encapsulation des îlots à l’aide d’hydrogels. Nous souhaitons donc tester in vivo l’impact de l’encapsulation d’îlots de rats dans le cadre d’une allogreffe (Donneurs et receveurs sont des individus distincts mais d’une même espèce) et humains dans le cadre d’une xénogreffe (le donneur est d'une espèce biologique différente de celle du receveur) dans la cavité abdominale de rats rendu diabétique. Cette étude permettra d’évaluer l’effet protecteur de notre encapsulation sur les réactions de rejet et les réactions.
Bénéfices attendus
La transplantation d’îlots pancréatiques comporte de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Ainsi, l’encapsulation d’îlots pancréatiques permettrait de protéger leur destruction par les réactions inflammatoires et de rejet. De plus, au vu de la pénurie d’organe inhérent à toute greffe d’organe, l’encapsulation permettrait d’utiliser des îlots pancréatiques d’espèces différentes. Par ailleurs, l’implantation de d’îlots encapsulés dans la cavité abdominale permet de se soustraire de ces réactions inflammatoires médiées par le sang à l’origine d’une destruction massive des îlots post transplantation. Ainsi, notre stratégie permettrait de maintenir à long terme la survie et la fonction des îlots et d’appliquer la stratégie de transplantation d’îlots pancréatiques à un plus grand nombre de patients diabétiques.
Procédures
Le diabète sera induit par injection pharmacologique réalisée sur animal vigile (1 injection/animal, durée quelques secondes). Sur 3 à 4 semaines après induction pharmacologique du diabète, une sélection des animaux sera faite selon des critères de glycémie (1 mesure après 4h de jeûne et 1 mesure non à jeun, 1 fois par semaine), de consommation alimentaire et hydrique (mesure sur 24h une fois par semaine sur animal isolé précédée de 24h d’habituation) et de sensibilité à l’insuline (un test de 120 min précédée de 4h de jeûne réalisée à 3 semaine de suivi où la glycémie sera mesurée 8 fois par animal et un prélèvement sanguin sera effectué). Les cellules pancréatiques seront prélevées par approche chirurgicale sous anesthésie/analgésie profonde sans réveil (durée 5 minutes). Ceux-ci seront ensuite encapsulés et implantés 24h plus tard dans le péritoine des rats diabétiques par approche chirurgicale sous anesthésie et analgésie profonde (durée 10 minutes par animal). Tout au long du suivi métabolique, la glycémie sera mesurée sur animal vigile à l’aide d’un glucomètre (durée de quelques secondes) afin d’évaluer l’efficacité des dispositifs (au maximum 70 fois/animal). Une partie de l’évaluation de l’efficacité de la greffe nécessitera de réaliser une injection de glucose aux animaux (au maximum 8 injections/animal sur 3 mois, durée 1 minute). De plus, les animaux recevront au maximum 90 injections d’insulines (Correspondant à la durée maximale de suivi de 3 mois) si la glycémie reste élevée après implantation des dispositifs contenant les îlots pancréatiques (durée quelques secondes par injection). Par ailleurs, afin d’évaluer l’efficacité de notre encapsulation d’îlots, au maximum 22 prélèvements sanguins seront réalisées par animal sur l’ensemble du suivi métabolique si celui-ci dure 3 mois (sous anesthésie locale, 2 minutes par prélèvement). Enfin, l’évaluation de la consommation alimentaire et hydrique des animaux post implantation engendrera au maximum 1 isolement de 48h (24h habituation + 24h de mesure) par semaine soit 12 (si suivi sur 3 mois).
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sont : - perte de poids en lien avec l’induction du diabète - douleurs post-opératoires à la suite des chirurgies réalisées pour la mise en place des hydrogels et l’injection des îlots dans le foie - risque hémorragique lors de l’injection des îlots dans le foie pour les rats contrôles - risque d’infection suite aux implantations (hydrogels, îlots nus) - stress en lien avec la répétition des injections d’insuline (si nécessaires) ou les mesures de glycémies et prises de sang au cours du suivi - stress lié à l’isolement lors des tests de consommation alimentaire et hydrique - hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude et durant les tests de tolérance au glucose - hypoglycémie lié au test de sensibilité à l’insuline - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques répétées. -Hémorragie post section de la queue.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.
Remplacement
Nous souhaitons valider de nouveaux hydrogels sur la fonction du greffon chez un sujet diabétique. Or la régulation glycémique est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, afin d’étudier si un pancréas bio artificiel est efficace, il ne suffit pas de s’intéresser uniquement à la cellule à insuline isolé mais il est impératif de l’évaluer dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présent. Le recours à une étude in vivo est alors indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. Le nombre d’animaux nécessaire pour la réalisation des groupes que nous avons indiqué correspond au nombre nécessaire d’animaux à utiliser afin d’obtenir des résultats statistiques. De plus, ce nombre est basé sur les différences interindividuelles des animaux et des préparations d’îlots humains que nous isolerons mais aussi sur notre longue expérience obtenue au cours des nombreuses études métaboliques réalisées sur des rats rendus diabétiques dans le cadre de transplantation d’îlots pancréatiques.Cette étude nécessitera 948 rats.
Raffinement
Le raffinement a principalement lieu au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés. En accord avec cette grille, des points limites prédictifs ont été déterminé afin de soustraire les animaux aux procédures expérimentales en cours d’étude. Les animaux en hyperglycémie recevront une insulinothérapie. Le cas échant la cétonémie sera mesurée afin d’ajuster les doses d’insuline à injecter. Enfin, les actes chirurgicaux et les prélèvements terminaux seront réalisés sous anesthésie analgésie profonde. De plus, la chirurgie et les tests d’évaluation d’efficacité de notre traitement, ne seront effectués que 2h après avoir placé les animaux dans la salle où aura lieu l’expérimentation, afin de diminuer le stress. Enfin, tout acte sur l’animal sera réalisé par du personnel expérimenté afin de réduire au maximum la durée des interventions et le stress des animaux.
Choix des espèces
Le Rat est la principale espèce utilisée dans de nombreuses études sur le diabète et la transplantation d’îlots pancréatiques. En effet, les rats diabétiques partagent des caractéristiques similaires à la physiopathologie du diabète chez l’Homme. De plus, les rats ont été préférés aux souris à cause de leur taille permettant une aisance de manipulations et facilite les interventions chirurgicales. Les rats pour cette étude seront âgés de 8 semaines, coïncidant avec un poids d'environ 200g. Poids idéal pour le prélèvement des pancréas, la réalisation des chirurgies et de nos tests d’évaluation d’efficacité de notre traitement.
Evaluation du profil pharmacocinétique d’un candidat médicament chez le rat
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Sept voies d'administration possibles, de la bouche à la trachée en passant par la veine, le muscle, la peau ou le péritoine, et des prises de sang sous la langue, à la queue, au cou, aux pattes ou par un cathéter posé dans la carotide ou l'artère fémorale : 3 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre eux subit une chirurgie de 20 à 45 minutes pour poser ce cathéter ou une minipompe, et certains sont mis à jeun la veille, isolés en cage de jeûne. Ni le produit ni la maladie visée ne sont nommés : il s'agit de mesurer le devenir d'un candidat médicament dans l'organisme avant les premières administrations chez l'humain. La déclaration prévoit que 875 rats pourront être réutilisés dans d'autres projets, par exemple de formation, et les autres tués, notamment après un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien, des effets marqués du produit ou la pose d'un dispositif. Pour les rats eux-mêmes, le porteur annonce comme bénéfice "une amélioration des connaissances scientifiques de l'espèce utilisée (le rat)".
Objectifs
Le projet consiste à étudier le devenir dans l'organisme d'un candidat médicament chez le rat (éveillé ou anesthésié), grâce à des prélèvements répétés dans le temps d'échantillons de sang après administration du produit à tester ainsi qu'un prélèvement terminal de liquide cephalo-rachidien.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la maladie humaine qui est visée par le/les produit(s) testé(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouveaux médicaments. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques de l’espèce utilisée (le rat) et le développement de méthodes pour améliorer le bien-être des animaux. Ces méthodes sont de plus en plus adaptées à l’espèce animale la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.
Procédures
Les rats de ce projet pourront subir une chirurgie pour introduire un tube très fin dans les veines et/ou les artères ou bien introduire une minipompe qui libère progressivement le produit (20 à 45 minutes). Les rats seront administrés (moins de 2 minutes) avec les produits à tester par différentes voies: orale, intrapéritonéale (au niveau de l'abdomen), sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, dans la trachée, ou intraveineuse (avec une dose unique ou par injection lente). Les animaux pourront être mis à jeun la veille de l'administration pour une durée qui est dépendante du produit à tester. Des prélèvements de sang (moins de 2 minutes) pourront être réalisés: - Au niveau de la veine sous la langue de l’animal transitoirement anesthésié - Au niveau de la veine de la queue, du cou ou des pattes sur l’animal actif au moyen d'un maintien adapté de l'animal - Au niveau de l'artère qui distribue le sang du coeur vers la tête (carotide) ou de l'artère de la cuisse (fémorale) sur animal préalablement implanté d'un tube très fin.
Impact sur les animaux
Les rats de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture et à l'isolement en cage de mise à jeun. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille ou une contrainte légère liée à l'administration orale lors de l'administration du produit ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements de sang.
Devenir
Les animaux seront mis à mort si réalisation de prélèvements terminaux, suite à des effets marqués des produits testés, si non utilisés pour d’autres projets ou si implantés avec les dispositifs médicaux (procédures 1 et 2). Certains animaux (ex: témoins, animaux ne présentant pas d'effets marqués après traitement) pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (en milieu artificiel ou par informatique) pour évaluer la pharmacocinétique d’un nouveau produit. Ou si ces méthodes existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses pharmacocinétiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse pharmacocinétique : 5 par groupe.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir (absorption, distribution, métabolisation, élimination), d’un produit testé, dans le sang. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Impact du stress néonatal de séparation maternelle dans les neuropathies induites par constriction chronique du nerf sciatique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 rats vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est séparée de sa mère trois heures par jour du deuxième au douzième jour après la naissance, puis une partie subit la pose d'un manchon autour du nerf sciatique sous anesthésie, avant huit semaines de tests comportementaux quotidiens non précisés, pour étudier si un stress précoce aggrave une douleur chronique. Le porteur indique que la chirurgie provoque une douleur chronique et de possibles comportements anxieux et dépressifs, et tue les animaux en fin d'étude parce que leur état anxieux les rend inutilisables ailleurs. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reconstitue les réseaux neuronaux impliqués et que la séparation maternelle ne peut être reproduite que sur un modèle vivant.
Objectifs
Les données cliniques suggèrent que la prématurité impacte le développement du système nerveux, modifiant plusieurs paramètres neurologiques à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN) chez le rongeur est un modèle de stress reflétant la prématurité humaine et induisant des altérations nociceptives, une anxiété accrue, ainsi que des troubles des comportements sociaux. Cependant, l’impact de la SMN sur le développement de douleurs chroniques reste méconnu. Nous faisons en effet l’hypothèse que la SMN constitue un facteur aggravant dans le cas de douleurs chroniques, aussi bien au niveau des symptômes sensoriels qu’émotionnels et cognitifs. Dans ce contexte, nous caractériserons à l’âge adulte les réponses sensorielles, les comportements anxieux et dépressifs et les capacités cognitives des animaux SMN suite à l’établissement d’une neuropathie. Ce modèle n’a encore jamais été étudié chez des animaux ayant subi au préalable une SMN. La mise en place d’une douleur chronique suite à un stress précoce pourrait en effet favoriser l’apparition de comorbidités anxio-dépressives aggravées et d’ordinaire non détectables chez des rats contrôles soumis à ce modèle de neuropathie.
Bénéfices attendus
Le modèle de séparation maternelle néonatale a permis de décrypter nombre de mécanismes et d’altérations du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, cette étude permettra de mieux comprendre l’impact d’un stress néonatal (i.e. une séparation précoce avec la mère) associé à une neuropathie au niveau des réponses sensorielles, comportements anxieux et dépressifs et des capacités cognitives. Ce modèle n’a encore jamais été étudié chez des animaux ayant subi au préalable une SMN. La mise en place d’une douleur chronique suite à un stress précoce pourrait en effet favoriser l’apparition de comorbidités anxio-dépressives aggravées et d’ordinaire non détectables chez des rats contrôles soumis à ce modèle de neuropathie.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis au protocole de SMN et seront séparés de leur mère 3 heures par jour du deuxième au douzième jour postnatal. Une partie des animaux subiront une chirurgie de 5 à 10 minutes sous anesthésie générale et analgésie. Afin d’évaluer l'évolution des animaux, ils passeront des tests de comportements dont la durée varie entre 5 et 30 minutes, une fois par jour pendant 8 semaines.
Impact sur les animaux
Le modèle de SMN chez le rat est un modèle classique de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux. La SMN induit également au niveau comportemental une anxiété accrue chez la mère. La chirurgie du cuff provoque le développement d'une douleur chronique chez l'animal, ainsi que de potentiels comportements anxieux et dépressifs. Les tests de comportements prévus sont courts (de 5 à 30min) et n’induisent qu’un stress mineur chez l’animal.
Devenir
A la fin de l’étude les animaux utilisés seront mis à mort car leur état anxieux n’est compatible ni avec une autre étude ni avec un replacement. Les animaux surnuméraires des portées seront utilisés pour d’autres projets de l’équipe.
Remplacement
Les comportements sociaux, cognitif et la douleur étant des processus intégrés impliquant différentes composantes sensorielles, cognitives et émotionnelles, ce projet nécessite l’étude d’un système intégré et mature, il est donc actuellement impossible de se passer de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans le comportement observé. La séparation maternelle ne peut être mimer qu’en utilisant un modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux prend en compte les risques liés à la chirurgie et les variabilités entre les animaux nécessitant un certain nombre pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous chercherons également à mettre en évidence des différences entre les mâles et les femelles, qui ont été démontrées pour les réponses à la douleur et dans différents modèles de stress précoce.
Raffinement
A leur arrivée, les femelles gestantes sont laissées 1 semaine dans l'animalerie pour acclimatation. Durant la SMN, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Les animaux sont hébergés encages collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à disposition de la frisure pour un nid, un bâton à ronger et un tunnel. Les animaux sont suivis quotidiennement afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien-être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental. Dans ce cas, des aliments humides seront mis à disposition dans les cages pour faciliter la prise alimentaire. Les chirurgies se feront sous anesthésie avec une analgésie pré- et post-opératoire, et les animaux seront observés quotidiennement en respectant les points limites fixés avant de la chirurgie et en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental des animaux. Les tests nociceptifs sont effectués après une semaine d’habituation afin de réduire le stress.
Choix des espèces
Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle qui est bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. La séparation maternelle aura lieu du deuxième au douzième jour postnatal. La procédure commencera quand les animaux seront adultes donc à partir du quarantième jour postnatal.
Rôle de l’irradiation de la zone intestinale à faible dose dans la réponse tumorale au blocage de PD-L1
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes tuées à l'issue pour des analyses de leurs tissus et organes, 1 620 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une prise de sang par ponction sous anesthésie générale, une injection de cellules tumorales et jusqu'à cinq injections de traitement sous anesthésie locale, certaines deux gavages, et une partie d'entre elles une irradiation localisée à faible dose sous anesthésie générale, que le porteur dit sans "nuisance". L'hypothèse vient d'un essai clinique de l'équipe associant radiothérapie et immunothérapie, où les patients dont l'intestin avait reçu une irradiation non voulue comptaient davantage de survivants à long terme, et le projet cherche chez la souris si cette irradiation renforce l'immunothérapie en modifiant le microbiote intestinal. Pour le choix de l'espèce, le porteur décrit les souris comme "génétiquement proches de l'Homme" et de "parfaits organismes-modèles", du fait de "leur petite taille, leur reproduction rapide et leur espérance de vie" plus courte.
Objectifs
Les principales méthodes de traitement du cancer sont la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie et l'immunothérapie. La radiothérapie tue les cellules cancéreuses en provoquant directement des dommages définitifs à l'ADN. Elle peut également déclencher une réponse immunitaire anti-tumorale. La combinaison de la radiothérapie et de d'une immunothérapie pourrait donc avoir un effet antitumoral synergique. Cette nouvelle combinaison thérapeutique a d'abord été testée dans des modèles précliniques, puis validée dans quelques essais pionniers chez l'Homme avec des résultats prometteurs. Depuis, des centaines d'essais ont été lancés pour examiner cette combinaison thérapeutique dans divers cancers. Toutefois, il convient de noter que seuls 10 à 30 % des patients participant à ces essais ont présenté une réponse objective à ce traitement. Les mécanismes qui sous-tendent la résistance des patients au traitement restent insaisissables. De nouvelles stratégies sont nécessaires pour améliorer les résultats pour les patients. Nous avons mené un essai clinique de phase II pour évaluer l'efficacité thérapeutique d'un type de radiothérapie en combinaison avec l'immunothérapie dans le cancer métastatique. Le suivi à long terme suggère qu'environ 20 % des patients bénéficient du traitement avec une survie globale supérieure à 24 mois. L'objectif du projet est de tenter de déterminer les mécanismes de résistance mis en cause et d'améliorer la proportion de patients répondant bien au traitement.
Bénéfices attendus
L'étude de l'ADN des échantillons fécaux des patients traités indique que les répondeurs sont associés à un enrichissement de l'abondance des espèces bactériennes immunogènes. En outre, la moitié des patients recrutés dans cet essai ont subi une exposition hors cible de la zone intestinale à l'irradiation lorsque l'irradiation a été administrée à des métastases hépatiques. Il est frappant de constater que le nombre de patients ayant une survie à long terme est plus élevé dans le sous-groupe des patients ayant subi une irradiation non voulue que dans le sous-groupe des patients n'en ayant pas subi (38 % contre 5). Notre hypothèse est que cette irradiation pourrait stimuler la réponse des patients à l'immunothérapie en modulant la composition du microbiote intestinal. L'étude de cette irradiation pourrait fournir des indications importantes sur le traitement personnalisé du cancer et ouvrir la voie à de nouvelles thérapies. Nous nous attendons à trouver que la combinaison de cette irradiation et une immunothérapie conduisent à un effet synergique sur le contrôle de la tumeur. Cette étude fournira donc des informations importantes sur le traitement individualisé du cancer pour les patients et aidera à développer de nouvelles thérapies pour améliorer leurs résultats.
Procédures
Nous prélèverons le sang des souris par ponction (1 fois) sous anesthésie générale, durée une minute. Les souris recevront également une injection de cellules tumorales (1 fois, durée une minute), les souris recevront jusqu'à 5 injections pour traitement (durée 1 minute), sous anesthésie locale. Certains animaux auront des administrations par gavage (n=2), durée 1 minute. Les souris recevront une irradiation localisée sous anesthésie générale (durée 5 minutes).
Impact sur les animaux
Dans certaines procédures les souris seront irradiées localement à faible dose. L'irradation limitée et localisée n'induit pas de nuisance. L'implantation tumorale (1 fois) par injection sous anesthésie locale entraîne une douleur légère et transitoire. Les traitements peuvent entraîner des pertes de poids (assez rare, car selon nos études précédentes, il n'y a pas eu de perte de poids notable). Les administrations orales entraînent une contrainte transitoire de courte durée due à la préhension et au geste lui même.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour analyses post-mortem sur tissus et organes.
Remplacement
Il n'y a pas de modèle de remplacement, car il est impossible de récapituler et reproduire toutes les interactions immunologiques dans l'organisme in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est donc indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un cadre de cancer du colon, avec toutes les interactions nécessaires notamment les effets de l'irradiation sur la partie intestinale, impossible à reproduire in vitro. Dans ce projet, nous voulons observer l'effet de l'administration orale d'un composé sur différents organes, sur l'expression de gènes et protéines mais surtout sur la migration de cellules immunitaires entre ces différents organes.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D Après un calcul de puissance, nous avons pu déterminer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe. Les tests statistiques utilisés pour suivre la croissance tumorale et la survie des animaux ont été préalablement définis. Au vu du nombre d'animaux utilisé par groupe, des tests statistiques non paramétriques seront utilisés.Les concentrations de traitements ont déjà été établies par notre laboratoire et sont donc optimisés pour réduire au maximum les animaux en procédure.
Raffinement
Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis quotidiennement pour effectuer un examen clinique et observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement adéquat. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire leur est proposé avec facilité d'accès.
Choix des espèces
Les souris comme les humains font partie des Mammifères, ce qui les rend génétiquement proches de l’Homme. De plus, leur petite taille, leur reproduction rapide et leur espérance de vie étant plus petite, font d'elles de parfaits organismes-modèles. Les modèles tumoraux existants sont issus de lignées cellulaires murines et plus particulièrement avec un fond génétique utilisé. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, c'est à partir de cet âge, qu'elles sont catégorisées comme adulte et donc ayant un métabolisme fonctionnel et une immunité normale.
Travaux Pratiques de pharmacologie : étude des effets de molécules anti-hypertensives chez le rat mâle et femelle
- Enseignement supérieur
392 rats vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée à l'issue et 180 réutilisés dans d'autres protocoles. Les rats reçoivent des molécules antihypertensives par voie orale, subissent des mesures répétées de pression artérielle par contention en tube et des piqûres à la queue pour la glycémie, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des étudiants se destinant aux métiers de l'expérimentation animale. Les rats témoins sont tués en cours de séance pour une étude sur organe isolé, les autres à la fin. Le porteur affirme qu'il n'existe aucune méthode de remplacement permettant une formation technique équivalente sur l'animal vigile.
Objectifs
Cette séance de travaux pratiques (TP) chez le rat est destinée à des étudiants dont la formation peut conduire à des métiers en lien avec le domaine de l’expérimentation animale. Dans ce contexte, les étudiants doivent acquérir un savoir-faire pour participer aux essais chez l’animal vigile et être en mesure de réaliser entre autres les traitements et les observations cliniques des animaux afin de pouvoir candidater sur les postes proposés par les organismes publics ou privés de recherche et par les industriels. Cet enseignement pratique participe à une meilleure orientation de nos étudiants par la découverte concrète des exigences et responsabilités liées à l’utilisation de l’animal. Les objectifs pédagogiques de ces travaux pratiques sont de plusieurs ordres : - D’un point de vue pharmacologique : mettre en évidence les effets de différents médicaments sur le système cardiovasculaire (Pression artérielle et fréquence cardiaque chez le rat vigile - D’un point de vue éthique (raffinement) : montrer l’intérêt du renforcement positif aux étudiants en mettant en place un système de récompence chez les animaux ; mettre en pratique un système de mesure de la pression artérielle / fréquence cardiaque non invasif chez le rat - D’un point de vue expérimental chez l’animal : former à la réalisation d’une administration par voie orale chez le rat ; apprendre à utiliser le système de mesure de la pression artérielle / fréquence cardiaque au niveau de l’artère caudale chez le rat ; savoir recueillir des données expérimentales de façon exhaustive afin de répondre à l’objectif de l’étude (sensibilisation à la nécessité de préparer une étude afin d’en tirer les résultats attendus sans avoir besoin de les reproduire).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’apprendre à nos étudiants à réaliser des expérimentations in vivo de pharmacologie. En effet, les enseignements de ce diplôme sont définis selon un programme pédagogique national. Les étudiants doivent acquérir 5 compétences durant leur formation, et notamment la compétence « mener des études à l’échelle du vivant ». En troisième année, la validation de cette compétence implique de savoir « Participer à l’évaluation de l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques ». Il est également précisé que la mise en pratique de l’étude des médicaments des grandes fonctions, dont les médicaments du système cardiovasculaire, se fait in vivo et/ou in vitro. Ainsi ce TP s’inscrit parfaitement dans ce cadre et les bénéfices attendus pour les étudiants seront les suivants : - consolidation de l’apprentissage de la manipulation des rats vigiles : contention, administration par voie orale, mesure de la pression artérielle / fréquence cardiaque - mise en oeuvre d’une étude en pharmacologie in vivo : constitution des lots d’animaux après randomisation, identification des animaux, utilisation d’un logiciel dédié, recueil de données et traçabilité, analyse et interprétation des résultats - mise en pratique des éléments vus en cours théoriques sur l’éthique en expérimentation animale, notamment mise en évidence du respect du bien-être des animaux au cours du TP. L’enseignant s’assure tout au long du TP du respect de l’éthique et interroge régulièrement les étudiants sur les éléments indispensables au respect des regles de bien-être animal dans ce TP.
Procédures
Les animaux pour l'entrainement à la voie orale suivront cette administration par voie orale 2 fois au maximum par animal (2 fois, car 2 séances d'entrainement par session). Les animaux du protocole expérimental seront soumis à trois interventions: 1. Injection par voie orale du véhicule ou molécules antihypertensives. L'administration par voie orale sera réalisée 2 fois maximum par animal (2 traitements car 2 séances d'étude par session). Chaque administration dure quelques secondes. 2. Mesure non invasive de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque au niveau de la veine caudale. Cette mesure sera réalisée 4 à 8 fois par animal (réparties sur 2 jours consécutifs puis 2 jours après sur 2 jours consécutifs, 1 à 2 mesures par jours). En effet il arrive que les résultast obtenus ne soient pas exploitables, si l'animal bouge par exemple lors de la prise de mesure, dans ce cas une nouvelle prise de pression artéreille est réalisée à distance de la précédente dans la même demi-journée. Chaque mesure de pression artérielle/fréquence cardiaque dure environ 2 minutes et nécessite 7 minutes d'habituation pour sytabiliser la température de mesure. 3. Mesure de la glycémie après piqure au niveau de la veine caudale. Cette intervention sera réalisée 4 fois en 4 jours par animal et durera quelques secondes à chaque fois.
Impact sur les animaux
Les manipulations (contention, administration par voie orale, mesure de la pression artérielle et fréquence cardiaque) génèrent du stress chez les animaux. Le prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la veine caudale entraîne une légère douleur.
Devenir
Tous les animaux ayant servi pour l'entraînement à la voie orale seront gardés en vie jusqu'à leur utilisation dans des protocoles hors champ, car cette procédure est légère. Pour la procédure expérimentale, les animaux du lot témoin seront mis à mort au cours des sessions de TP afin de réaliser une étude sur organe isolé. Les autres animaux seront mis à morts à la fin de chaque session. En effet, nous considérons que, bien que les gestes techniques effectués soient faiblement invasifs, le fait qu'ils soient effectués par des étudiants peut augmenter le stress des animaux. C'est pourquoi nous proposons que cette procédure soit considérée de gravité modérée. Dans ces conditions la mise à mort des animaux à la fin des séances est adaptée à la procédure. Les animaux surnumraires n'ayant pas été inclus dans l'étude pourront être utilisés pour des procédures hors champ.
Remplacement
Dans la formation de nos étudiants le programme pédagogique national prévoit, en pharmacologie, l’évaluation in vivo des effets de molécules de référence par la mise en œuvre de protocoles expérimentaux. Ce TP doit permettre d’illustrer les effets de traitements des pathologies cardiovasculaires et notamment la classe des médicaments ciblant le système adrénergique . Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de remplacement permettant une formation appropriée de nos étudiants sur le plan technique (manipulation de l’animal vigile, administration des substances chez l’animal vigile, mesure de l'activité cardiovasculaire…). Toutefois, afin de favoriser l'apprentissage des étudiants et de limiter le nombre d'animaux d'entraînement ainsi que la durée de manipulation de ceux-ci, des vidéos présentant la réalisation des gestes techniques (préhension, contention, administration VO) leur seront présentées. De plus, les étudiants pourront au cours du TP s'entraîner à réaliser les injections en manipulant des seringues/sondes dédiées sur un support inerte.
Réduction
Ce TP aura lieu sur 2 sessions comportant chacune deux séances d'étude sur 3 jours de protocole, pour 12-15 étudiants par séance (annexes 2 et 3). Deux groupes de 15 étudiants maximum participeront à chaque session d'étude, pour un total de 52 étudiants par an. Pour chaque séance, chaque étudiant sera en charge du traitement et du suivi d’un animal. Pour chaque session, les 4 animaux témoins seront utilisés pour une séance d'étude d'organe isolé et ne seront donc pas réutilisés à la seconde séance d'étude. Les 8 à 11 animaux restant seront utilisés pour la séance d'étude suivante, avec 4 nouveaux animaux témoins (annexe 3). Le même nombre d'animaux sera utilisé pour la session suivante. Soit un total de 34 animaux + 3 animaux surnuméraires par session soit 34+3+3=40 animaux par an pour 52 étudiants et 200 animaux pour 5 ans pour 260 étudiants. A ces animaux s’ajoutent la première année les 12 animaux nécessaires à l’étude préliminaire soit 212 animaux au total. Une semaine avant la séance d'étude, les étudiants s'entraineront à la réalisation de la VO sur des rats issus du surplus d'élevage, à raison d’1 rat par étudiant. Ces rats serviront aussi pour l'apprentissage des étudiants de la seconde séance d'étude d'une même session. Ainsi pour une session de 26 étudiants en moyenne, il sera prévu 13 animaux+ 5 animaux surnuméraires, c'est-à-dire pour un an et deux sessions, un total de 26+10=36 rats par an et pour 52 étudiants. Ainsi au total sur 5 ans, 212 + (36 x 5)= 392 rats pour 260 étudiants.Ce chiffre sera bien évidemment indexé chaque année sur le nombre réel d’étudiants inscrits à notre formation. Afin de garantir une formation de qualité aux étudiants, il n’est pas possible de diminuer le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes socialement harmonieux et en présence d’un enrichissement comprenant au moins 2 éléments (tunnel en plastique noir, bâtonnet en bois et noix à ronger). Afin de limiter le stress des animaux lors de la manipulation, mais également lors de la mesure de la pression artérielle et fréquence cardiaque, qui s’effectue à l’aide de tubes à contention, les animaux seront habitués à la préhension/contention et à ces mesures quotidiennement pendant la semaine précédant le début des travaux pratiques. Cette habituation se fera via un système de récompense (pop corn, gâteau sec, vers séchés, mélange de fruits légumes et graines, mini-gouttes de yaourt séché, billes de céréales…). Tout animal présentant des signes de stress ou de maladie tels que: poil hérissé, stéréotypie, comportement agressif ou absence de prise de poids tel qu'attendu à l'âge de ces animaux ne sera pas inclus dans le TP. Enfin, le site de piqure pour le prélèvement de la goutte de sang (nécessaire à l'analyse de la glycémie) sera noté pour chaque rat et modifié à chaque mesure pour limiter la sensibililté.
Choix des espèces
Le rat est une espèce très souvent utilisée pour les études de pharmacologie. C'est notamment une espèce de choix pour l’étude de la fonction cardiaque, notamment en pharmacologie de sécurité. C'est donc un modèle de choix pour l'étude des effets de médicaments agissant sur la fonction cardiovasculaire. Pour voir l'effet des médicaments utilisés des animaux jeunes adultes sont couramment utilisés dans les essais de pharmacologie. Les animaux seront utilisés à deux stades différents en fonction du sexe: - 8 à 12 semaines pour les mâles - 14 à 18 semaines pour les femelles Ces stades sont choisis d'une part pour que les animaux aient un poids permettant l'utilisation des tubes de contention fournis dans le système de mesure de la pression artérielle et fréquence cardiaque et d'autre part afin que les mâles et femelles utilisés puissent provenir des mêmes portées de notre élevage. Quant aux animaux utilisés pour l'apprentissage de la voie orale, ils seront de tout âge (> 7 semaines) selon les disponibilités du surplus d'élevage.
Imagerie fonctionnelle de la partie intracrânienne du nerf optique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie crânienne d'une heure pour implanter une lentille au-dessus du nerf optique, une partie recevant en plus des injections dans l'œil ou dans le péritoine, puis elles sont observées éveillées ou anesthésiées jusqu'à dix fois sur un an sous stimulation visuelle, avant d'être tuées pour prélever le cerveau, afin d'étudier le couplage entre activité nerveuse et flux sanguin dans le nerf optique. Le porteur signale une douleur postopératoire de trois jours, une inflammation possible de l'œil après l'injection virale et un stress lié à l'imagerie chez l'animal éveillé. Il affirme que l'étude du flux sanguin exige un "animal entier" et que les données in vitro se sont révélées inutilisables faute de circulation.
Objectifs
L’hyperémie fonctionnelle est un réflexe déclenché par l’activation neuronale qui aboutit à une augmentation locale du flux sanguin. Ce réflexe, qui est à la source de l’imagerie fonctionnelle cérébrale de type fIRM chez l’Homme, met en cause un ensemble de mécanismes impliquant différentes cellules: les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, les astrocytes et les neurones. Le poids des différentes voies de signalisations mises en jeu reste controversé. S’il a été particulièrement étudié au niveau de la substance grise, très peu de données expérimentales concernent la substance blanche. Le nerf optique, dans sa partie intracrânienne, est un modèle de substance blanche complètement inexploré. Le but du projet est d’analyser les bases cellulaires de l'hyperémie fonctionnelle dans le nerf optique. Nous souhaitons plus précisément caractériser les différents types cellulaires participant à la régulation de ce phénomène. Pour cela, nous irons étudier dans le nerf optique de souris, les liens entre les réponses cellulaires et vasculaires, suite à des stimulations visuelles.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de caractériser le signal de sortie des cellules ganglionnaires au niveau de la partie intracrânienne et myélinisée du nerf optique in situ. Nous étudierons 3 paramètres quantitatifs du nerf, jusqu’alors inaccessibles : la propagation électrique du signal nerveux, le couplage neurovasculaire et la réponse métabolique du nerf au cours d’une stimulation visuelle physiologique. Cette approche, jamais tentée précédemment, sera établie chez l’animal normal, aboutissant à l’établissement d’un nouvel outil préclinique. Ceci pourra amener, dans un deuxième temps et dans le cadre d'une nouvelle demande, à utiliser cet outil pour comparer le fonctionnement du nerf optique intracrânien normal et pathologique.
Procédures
Une partie des animaux (44souris) recevront 3 injections intrapéritonéales rapides pour induire le modèle (1/jour pendant 3 jours). L'injection ne dure que quelques secondes. Tous les animaux subiront une seule procédure chirurgicale d’une heure sous anesthésie gazeuse et en conditions stériles. La procédure consistera en l’implantation d’une fine lentille au-dessus du nerf optique. Pour cela les animaux recevront des doses d’analgésiques avant et après la chirurgie. Une partie des animaux (48 animaux) recevra une unique injection virale intravitréenne de virus adéno associés (AAV) dans un seul œil, sous anesthésie gazeuse. La procédure d’injection dure environ 10 minutes. Les animaux seront observés en microscopie biphotonique éveillés, sédatés ou anesthésiés. Les animaux observés éveillés effectuent au préalable une habituation progressive de plusieurs jours au poste d’enregistrement. Les sessions d’enregistrements durent au maximum 2 heures. Les animaux reçoivent juste avant l’enregistrement une injection de colorants en intra veineux. Durant les sessions, les animaux peuvent être soumis à des stimulations visuelles de 1 à 30secondes : grille contrastée sur un écran placé devant l’œil de l’animal. Les animaux seront observés jusqu’à 10 fois selon les observations, durant l’année qui suit la procédure chirurgicale. Après les sessions d'imagerie, une partie des animaux (12 souris) est euthanasiée par une méthode réglementaire sous anesthésie pour pouvoir prélever leurs cerveaux. A la fin du projet tous les animaux sont euthanasiés.
Impact sur les animaux
L'injection intrapéritonéale pourra induire une perte de poids (rarement supérieur à 10% du poids initial, après le dernier jour d’injection) ainsi qu'un stress et une douleur au point d'injection. L'acte chirurgical pourra provoquer une inflammation locale au niveau du site opéré (crâne) ainsi qu'une douleur durant les trois jours suivants la chirurgie. L'injection de virus adéno associés dans le vitré de l'œil peut entrainer une inflammation de l’œil. L'imagerie peut provoquer un stress durant le temps de l'expérience particulièrement chez l'animal éveillé. Il existe un faible risque de mauvaise réaction à l’anesthésie.
Devenir
Les animaux sont tous euthanasiés à la fin du projet, selon différentes méthodes en fonction des besoins expérimentaux, pour vérifier l'exactitude des données obtenue en imagerie.
Remplacement
Jusqu’à présent, le nerf optique a été étudié in vitro. Toutes études métaboliques et celles s’attaquant à la régulation du flux sanguin nécessitent de travailler chez l’animal entier et normal. En effet, une grande partie des données obtenues in vitro se sont révélées non utilisables en recherche clinique puisqu’il qu’il n’y a plus de flux sanguin sur les modèles in vitro.
Réduction
Le nombre de 132 animaux a été estimé sur la base d’expérimentations similaires effectuées précédemment au sein de notre équipe ainsi que par des logiciels de statistique. Par ailleurs, nous nous engageons à réduire l'utilisation d'animaux autant que possible en observant plusieurs fois les mêmes animaux et en développant des analyses statistiques robustes pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Durant notre projet, nous prêterons attention à raffiner la méthodologie utilisée : - en améliorant les conditions expérimentales par l'administration d'anesthésiques et analgésiques chaque fois que nécessaire - en introduisant des points limites à chaque acte expérimental qui permettent d'éviter toute souffrance à l'animal et son euthanasie lorsque celle-ci ne peut être prise en charge - en garantissant des conditions d'hébergement appropriées aux animaux (ajouts d'enrichissements dans les cages et contrôle stricte des paramètres environnementaux) - en effectuant une surveillance quotidienne du bien-être des animaux, par un personnel formé et une surveillance régulière par un membre de la structure du bien être animal.
Choix des espèces
Il n'existe pas de méthode alternative possible à l'utilisation d'animaux vivants dans l’étude du couplage neurovasculaire. La souris est la seule espèce de mammifère chez laquelle il est aisé de générer des animaux transgéniques. Les souris seront utilisées entre P45 et 2 ans. Il est nécessaire d’utiliser des animaux chez lesquels les processus régulant le couplage neurovasculaire sont matures. Les souris sont identifiées par tatouage aux pattes et génotypées après une biopsie de l’extrémité distale de la queue.
Mise au point d’un dispositif expérimental externe et non-invasif pour la mesure de paramètres physiologiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes réutilisées à l'issue. Rasées et anesthésiées à plusieurs reprises, elles sont équipées d'un textile connecté porté jusqu'à vingt-quatre heures, parfois isolées, pour mettre au point un dispositif de mesure cardiorespiratoire présenté comme une alternative aux capteurs implantés par chirurgie. Le porteur reconnaît que les souris peuvent chercher à retirer le dispositif et se blesser en se grattant, que l'isolement les stresse et que le rasage provoque hypothermie et inflammation. Il affirme que des modèles 3D précèdent la phase animale mais que le recours à la souris reste un "passage obligé" pour évaluer le comportement et la tolérance.
Objectifs
Lors d’études scientifiques, le bien-être des animaux peut être altéré par l’utilisation de dispositifs de mesure (électrocardiogramme, volume respiratoire), essentiel à la compréhension des fonctions physiologiques. Malgré leurs performances de mesure, ils nécessitent d’être implantés dans l’animal (par chirurgie) ou l’isolement des animaux. Outre les contraintes liées à leurs utilisations, (soins pré et post chirurgicaux,…) la chirurgie et l’isolement induisent des stress physiologiques pouvant altérer la qualité des résultats des études menées. Des dispositifs externes, développés chez les grands mammifères (singe, chien, porc…), permettent le recueil de données, sans chirurgie, sur des animaux éveillés et libres de leurs mouvements. Ces dispositifs ont permis l’amélioration du bien-être des animaux et contribuent à leur réutilisation et leur réduction dans les études. Grâce aux progrès de miniaturisation de la technologie, ces dispositifs ont été dernièrement adaptés aux petits mammifères de laboratoire (rat ou cochon d’inde), mais aucun dispositif de la sorte n’a été développé chez la souris notamment dû au challenge qu’elle représente (taille, comportement, manipulation…). Ce projet est initié pour aider les acteurs de la recherche à pallier cette situation dans les études nécessitant de mesurer des paramètres physiologiques chez la souris que ce soit pour évaluer les effets (bénéfiques ou néfastes) d’une molécule avant les premiers essais chez l’Homme ou comprendre les mécanismes de maladies et identifier de nouvelles pistes de traitements. L’objectif est de mettre au point un système chez la souris à partir d’un dispositif externe permettant la mesure de paramètres cardiorespiratoires dans le milieu d’hébergement habituel et avec ses congénères, sans chirurgie préalable. Un tel dispositif ayant pour seule contrainte le port d’un textile connecté, rend possible un suivi totalement indolore et plus respectueux des animaux. Ce dispositif participera à l’amélioration du bien-être des animaux et la qualité des résultats obtenus en permettant l’enregistrement de données plus pertinentes. Le projet se déroule comme suit : ● Des mesures morphométriques seront relevées afin de confectionner des prototypes du dispositif ● Des tests préliminaires des différentes formes de prototypes seront effectués sur des modèles 3D de souris Les prototypes seront évalués sur des animaux vivants, en conditions individuelles puis collectives et sur des durées progressives.
Bénéfices attendus
L’adaptation d’un dispositif de mesure externe à la souris, permettra de proposer aux acteurs de la recherche biomédicale (recherche fondamentale, appliquée, translationnelle…) un outil innovant d’investigation des paramètres physiologiques. Les bénéfices de ce projet sont donc : ● De remplacer les méthodes impliquant des actes de chirurgie (capteurs implantables) pour mesurer les paramètres physiologiques de l’espèce cible : la souris. Une alternative à ces méthodes permettra d’éviter le stress et la douleur ainsi qu’un suivi accru avant et après l’opération nécessitant des soins médicamenteux systématiques. Il permettra également le suivis de constantes physiologiques chez des animaux fragiles (génétiquement modifiés, modèle de maladie cardiaque et/ou respiratoire) ne supportant pas la chirurgie. ● D’améliorer les conditions d’hébergement lors du suivi, en rendant possible la mesure des paramètres physiologiques de l’animal directement dans sa cage d’hébergement, réduisant drastiquement le stress induit par l’isolement et permettant donc un suivi de ces paramètres sur une période longue. ● De collecter des données plus pertinentes ; le lien entre résultats et bien-être animal étant lié, l’amélioration des conditions de mesures physiologiques permettra des résultats plus précis et la diminution du nombre d’animaux utilisés dans les études.
Procédures
Les souris subiront une anesthésie de maximum 10 minutes pour effectuer différents gestes : ● Raccourcissement des griffes ● Tonte ou rasage ● Équipement ● Dé-équipement Spécifiquement pour la procédure d’évaluation des prototypes, les animaux seront maintenus jusqu’à 30 minutes sous anesthésie, afin de réaliser des mesures morphométriques pour alimenter la base de données, préalablement à l’équipement estimé, lui, à 10 minutes. Le temps total estimé est donc de 40 minutes. Les animaux pourront être amenés à être équipés plusieurs fois lors de chaque procédure selon leur comportement face aux différents prototypes. Par ailleurs l'anesthésie ne sera pratiquée que pour l’équipement et le dé-équipement des animaux soit 2 fois par jour et par individus. Lors de la procédure d’évaluation, les animaux seront équipés du dispositif pendant 90 minutes maximum. Avant la procédure de validation, les animaux seront équipés pendant 90 minutes le premier jour, et 150 minutes le deuxième jour, afin d’être habitués au dispositif. Lors de la procédure de validation, les animaux seront équipés pendant 3 heures maximum, en hébergement par 2 et par 4 individus. Puis ils seront équipés pendant 24 heures maximum (par 1, 2 ou 4 individus, en fonction des résultats de l’étape précédente) Au-delà de 2 jours sans équipement, les animaux seront ré-habitués au port du dispositif par un équipement de 150 minutes.
Impact sur les animaux
Une fois équipé du dispositif, il est possible que l’animal cherche à retirer son prototype. Ce phénomène qui a été décrit avec d’autres dispositifs externes et pour d'autres espèces, peut conduire à une irritation et des lésions dues à des grattages excessifs. Les animaux seront hébergés individuellement pour une durée limitée à 150 minutes. Si l’hébergement collectif est impossible lors de la phase de validation de 24h maximum, les individus subiront également un hébergement individuel. L’isolement d’individus peut provoquer un stress mais aucune donnée bibliographique ne présente la possibilité d’utiliser un dispositif externe chez la souris, en hébergement collectif. Afin de permettre la pose optimale de capteurs et d’assurer le maintien du dispositif sur l’animal, en amont de l’expérience, les souris seront soit rasées soit tondues. Le rasage de l’animal peut entraîner une légère hypothermie et une inflammation locale.
Devenir
À l’issue de ces procédures légères, à condition que leur santé et leur bien-être ne soient pas compromis, tous les animaux pourront être réutilisés dans d’autres projets, contribuant à réduire le nombre d’animaux requis à des fins scientifiques.
Remplacement
Afin de s’approcher au plus de la morphologie des souris, des modèles de souris 3D permettront, en amont de la phase sur animaux vivants, de tester les différents modèles de prototypes conçus, pour vérifier la bonne adaptation à la morphologie de la souris (forme du dos, périmètre du cou, diamètres des pattes etc…). Cette démarche permettra d’effectuer une première sélection des prototypes, et la mise en place des dispositions nécessaires pour équiper l’animal. Cependant, le recours au modèle animal reste, dans ce projet, un passage obligé étant donné que certains critères d’évaluations, tels que le comportement ou la tolérance de l’animal ne peuvent être déportés sur un modèle alternatif.
Réduction
Des calculs statistiques ont permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par lot pour la réalisation de cette étude, à partir des courbes de croissances des fournisseurs et du premier jeu de mesures morphométriques obtenu sur des souris mortes issus d'autres études. Ces calculs tiennent aussi compte de la marge d’erreur de fabrication, d’un éventuel retrait des animaux de l’étude, et du schéma expérimental (équipement par 2 ou par 4 etc…). Des groupes de taille similaire ont été utilisés dans différentes publications rapportant l’utilisation de dispositif externe chez la souris (entre 5 et 9 animaux par groupe). Ce nombre d’animaux suffisait pour observer les avantages et inconvénients des dispositifs lorsque les animaux étaient équipés. Lors de la procédure d’évaluation, si plusieurs itérations doivent être réalisées, le même lot d’animaux sera équipé plusieurs fois afin de limiter au maximum l’utilisation de nouveaux lots d’animaux. Lors de la procédure de validation, le lot d’animaux sera équipé des plusieurs formes de prototypes ayant atteint cette phase. Cette méthode permettra de limiter le nombre total d’animaux requis afin de limiter au maximum l’utilisation de nouveaux lots d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans la même salle où auront lieu les procédures. Ils effectueront une semaine d’acclimatation avant le début de l’étude. Seul un déplacement de cage sera opéré afin de réaliser l’anesthésie dans une autre salle, prévue à cet effet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards, avec de la nourriture (standard) et de la boisson en accès libre. De l’enrichissement compatible avec le port d’un dispositif sera utilisé (litière, matériel de nidification). Les souris seront manipulées avec toutes les précautions requises et des interactions fréquentes sont prévues avec l’expérimentateur, afin de réduire le niveau de stress lié à la manipulation au cours des procédures. 24 heures avant la pose du prototype sur l’animal, une familiarisation au textile composant le prototype, similaire au protocole existant chez d’autres espèces, sera réalisée, diminuant le stress et maximisant les chances de succès de l’hébergement collectif. Une anesthésie légère sera effectuée facilitant l’équipement et le dé-équipement des souris minimisant le stress et éviter une contention des animaux éveillés. Sous anesthésie, l’hypothermie sera limitée par un tapis chauffant. Les griffes seront raccourcies. Si malgré ces précautions, des lésions ou des irritations apparaissent, des soins adaptés seront réalisés et une observation accrue de l’animal sera effectuée préalablement à sa réintégration au protocole. Les souris seront habituées progressivement à porter ce dispositif en se basant sur les protocoles d’habituation existants pour d’autres espèces. Un renforcement positif après les anesthésies sera mis en place en donnant quelques gouttes de lait concentré aux souris. Lors de la procédure d’évaluation, un test de prototype par jour par animal aura lieu pour limiter le mal être et les biais sur les résultats. Pour la procédure de validation, afin de limiter un biais éventuel dû à la présence du manipulateur dans la salle d’expérimentation, le manipulateur surveillera le comportement des souris via un suivi par vidéo, depuis une salle adjacente. Des points de contrôle seront réalisés à des temps réguliers. Chaque étape constituant la procédure de validation sera séparée par un temps de repos d’au moins une nuit. Si un des points limites prédéfinis est atteint (perte de poids importante, déshydratation, isolation dans un coin, automutilation, altération de la respiration etc…), la procédure sera arrêtée pour cet animal.
Choix des espèces
La souris représente environ 60% des modèles animaux utilisés à des fins scientifiques en France en 2021. Ce modèle est utilisé de manière importante dans des domaines nécessitant d’avoir accès aux constantes physiologiques des animaux pour répondre aux différentes thématiques de recherche ou pour suivre l’état des animaux au cours des expérimentations. Les souris seront utilisées à 10 semaines d’âge, le premier jour de l’expérience. Les animaux, à cet âge, sont les plus utilisés en recherche, et sont considérés comme adultes. Ceci permettra donc de toucher la plus grande gamme de souris utilisée dans le domaine de la recherche.
Détermination de la toxicocinétique d’un candidat médicament en vue de son utilisation clinique dans la lutte contre la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
52 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 36 en gravité sévère. Elles reçoivent chaque matin pendant onze jours, par voie orale, un candidat médicament contre la maladie de Huntington à doses croissantes, avec des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tuées pour examiner leurs organes et l'atteinte du cerveau, pour mesurer la toxicité du composé. Le porteur reconnaît qu'aux fortes doses la molécule peut provoquer une toxicité et des signes d'inconfort. Il affirme que les études de toxicité sont "obligatoirement" réalisées chez l'animal et constituent une "étape indispensable" avant tout médicament.
Objectifs
La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Un candidat médicament capable de réparer l’activité des neurones humains et de souris a été identifié. Il a été montré qu’un traitement sous cutané avec cette molécule permettait d’améliorer les troubles du mouvements et psychiatriques de la souris atteinte de la maladie de Huntington. Afin de développer un médicament pour les patients atteints de la maladie de Huntington à partir de cette molécule, nous allons dans ce projet : 1/ identifier les éventuels effets toxiques d’une prise répétée à différentes doses de la molécule et 2/ évaluer les effets de plusieurs doses d’administration. Cette molécule est un traitement potentiel pour la maladie de Huntington qui n’a jamais été utilisée auparavant et qui mérite d’être étudiée.
Bénéfices attendus
Il a été démontré que l'administration d’une seule dose de cette molécule avait un effet thérapeutique chez les souris atteintes de maladie de Huntington sans induire de toxicité. Afin de développer un traitement pour les malades, nous allons ici étudier l’effet de cette molécule administrée en dose répétée et voir quelles sont les meilleures doses répétées pour avoir un effet thérapeutique sans toxicité.
Procédures
Le traitement sera réalisé par voie orale tous les matins pendant 11 jours. Ce geste, d’une durée inférieure à 10 secondes, est bien toléré par l’animal. Un prélèvement sanguin sera réalisé à l'extrémité de la queue de l'animal à trois temps différents après gavage, le premier et le dernier jour du traitement. 30 secondes seront nécessaires au prélèvement sanguin et n’engendrera qu’un léger stress à l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris d’âge adulte. Le traitement sera administré oralement, voie d’administration obligatoire car c’est celle qui sera utilisée chez l’homme. La contention et l’administration orale peuvent engendrer un léger stress chez l’animal. Une toxicité induite par le traitement est possible aux fortes doses, se traduisant par des signes d’inconfort chez l’animal.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'observer l'aspect des différents organes après administration du traitement ainsi que de mesurer l’atteinte du cerveau par cette molécule.
Remplacement
Les études de toxicité sont obligatoirement réalisées chez l’animal. Elles sont une étape indispensable à la validation d’une molécule avant d’en envisager son utilisation comme médicament chez le patient. Notre étude permettra de documenter les éventuels effets toxiques de cette molécule et aidera à définir les doses répétées à utiliser.
Réduction
Pour cette procédure, nous limitons le nombre d’animaux au minimum afin de pouvoir réaliser des analyses quantifiables et reproductibles. Au final, les animaux seront répartis dans 13 groupes de 4 animaux. Ces effectifs seront suffisants pour calculer les valeurs de concentrations de la molécule dans le sang et pour doser les différents paramètres de toxicité. Également, cet effectif sera suffisant pour nous permettre d’écarter le risque de conclure à une toxicité macro ou micro qui serait due au hasard par des analyses statistiques.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés dans des cages en respectant les normes en vigueur. Les cages sont équipées de litière (avec possibilité de faire un nid) et d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, le tout changé toutes les semaines. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites (poils hérissés, prostration, isolement dans la cage), et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement par gavage sera réalisé par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ce geste.
Choix des espèces
Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à préparer les études de toxicité réglementaires qui seront réalisées sur animaux adultes, notre étude sera également réalisée sur des animaux adultes.
Evaluation du potentiel thérapeutique de la modulation de deux gènes pour traiter les dysferlinopathies 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
163 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie musculaire rare, elles subissent des tests de force et de coordination, une course forcée jusqu'à l'abandon entretenue par de petits chocs électriques, un isolement de douze heures et des prélèvements allant jusqu'à 15 % de leur volume sanguin, avant un test terminal sous anesthésie et la mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur signale une faiblesse musculaire dès quatre mois, une angoisse modérée et des douleurs musculaires liées à la course forcée. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne suffit pas à évaluer une thérapie et qu'il faut mesurer les effets sur l'ensemble de l'organisme.
Objectifs
Les dysferlinopathies font partie des maladies rares du muscle et regroupent notamment la myopathie distale de Miyoshi et la myopathie des ceintures 2B. Les principaux signes cliniques sont la faiblesse musculaire et une atrophie prononcée des muscles, pouvant mener à des déficiences fonctionnelles sévères. A ce jour, il n'existe aucun traitement pour ces maladies, et aucune preuve de concept thérapeutique permettant de restaurer les fonctions motrices de souris modélisant cette myopathie. L'objectif de ce projet est ainsi d'étudier le potentiel thérapeutique de la modulation de deux gènes jouant un rôle important dans le muscle et s'étant déjà montrée efficace pour d'autres types de myopathies présentant des dérégulations similaires.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d'évaluer deux potentielles thérapies et pourrait permettre de fournir une première preuve de concept thérapeutique en vue de traiter des patients atteints de dysferlinopathie. En outre, cette étude apportera de nouvelles clés de compréhension sur les mécanismes associés à cette maladie et sur les acteurs impliqués.
Procédures
Des tests de force et de coordination non invasifs réalisés sur un temps court (une minute environ et 5 mins respectivement) seront réalisés trois fois durant la période d'étude des souris (de 4 à 6 mois d'âge). Chaque test sera réalisé trois fois avec un temps de repos de 10 minutes. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à abandon sera réalisé 1 à 3 fois durant la vie de l'animal et durera au maximum 1h40. Les mouvements spontanées de l'animal seront également quantifiés durant 12h en laissant l'animal seul dans une cage. Des prélèvements de sang de 15% du volume total de l'animal seront réalisés toutes les deux semaines au maximum. Un dernier test sous anesthésie précédant l'euthanasie des animaux permettra de mesurer la force musculaire des souris. Ce test durera au maximum une heure, et l'animal sera surveillé.
Impact sur les animaux
Les premiers signes cliniques apparaîssent à 4 mois chez les souris et se limitent à de la faiblesse musculaire au niveau des membres, pouvant induire une angoisse modérée chez l'animal. Les animaux seront euthanasiés à 6 mois afin d'éviter la progression de la maladie et pour réaliser par la suite des analyses moléculaires. Les nuisances causées par les différents tests sont la chute de l'animal dans une cage remplie de litière entraînant une légère peur chez l'animal, l'extension de l'animal par tirement progressif de la queue par l'expérimentateur, l'isolement de l'animal pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques pouvant entraîner des douleurs musculaires sur le court terme et l'anesthésie générale de l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des deux procédures afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et histologiques. Les animaux issus des accouplements ayant pour but le maintien de la lignée durant la durée du projet seront euthanasiés avant l'apparition des signes cliniques.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de thérapies sur les fonctions locomotrices et la fatigue musculaire. Malheureusement, l'utilisation d'un modèle cellulaire ne suffit pas pour évaluer le potentiel d'une thérapie dans le cas d'une maladie musculaire. En effet, il est nécessaire de pouvoir évaluer les effets sur la contractilité du muscle ainsi que sur l'ensemble de l'organisme. Le modèle murin, étant suffisamment proche de l'homme physiologiquement et structurellement, permet de pouvoir étudier la physiopathologie ainsi que les effets d'une thérapie.
Réduction
Les tests phénotypiques prévus sont faiblement invasifs et permettent donc un suivi longitudinal des souris, ce qui réduit fortement le nombre de souris nécessaires. Les analyses histologiques et moléculaires seront effectuées sur les mêmes animaux après euthanasie. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans une étude traitant des déficits moteurs du même modèle de souris et permettant d'observer des différences de démarche, d'activité locomotrice et de poids de muscles entre les souris myopathes et les souris saines dès 15 semaines d'âge.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu'au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre. En cas de difficultés locomotrices des animaux, la nourriture sera placée dans la cage. Lors des mesures in situ, le stress et la douleur liés à la procédure seront éliminés par injection intrapéritonéale d'un mélange d'anesthésiants et d'analgésiques. Durant toute l'expérience, la température corporelle de l'animal sera maintenue à sa valeur basale au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Un contrôle visuel de sa respiration sera effectué. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et observé quotidiennement pour vérifier que leur état ne se dégrade pas. Dès lors qu'une perte de poids est observée, les animaux seront alors pesés quotidiennement. L'animal sera sorti de sa cage par les mains du manipulateur disposées en coupe. Avant chaque test phénotypique, l'animal sera familiarisé avec le matériel pour minimiser son stress.
Choix des espèces
Les souris sont suffisamment semblables à l'homme physiologiquement pour être un bon modèle d'étude des maladies musculaires. Dans notre projet, par exemple, la mutation présente chez les souris provient d'une mutation spontanée d'une lignée murine récapitulant les principaux signes cliniques observés chez l'homme. Les souris seront utilisées entre 4 mois et 6 mois d'âge, i.e. adultes. Cet âge correspond à l'apparition des signes cliniques moteurs chez les souris déficientes en dysferline. Le phénotype dégénère progressivement tout au long de la vie de la souris, il est donc préférable de réaliser les tests phénotypiques le plus tôt possible afin de limiter l'angoisse animale.
Etude de l’effet de différentes molécules ciblant les récepteurs à peptide RFamide sur la modulation de la nociception chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, réparties entre deux établissements. Selon les protocoles, elles reçoivent des injections répétées et subissent des tests de douleur par immersion de la queue dans l'eau chaude, pression sur la queue, filaments de Von Frey ou plaque froide, certaines après une chirurgie de constriction d'un nerf, pour tester des molécules ciblant des récepteurs de l'hypersensibilité à la douleur. Le porteur décrit un abaissement du seuil douloureux, des inflammations aux points d'injection et de suture et des troubles de la locomotion et de l'alimentation. Il affirme que l'évaluation de la douleur n'est "réalisable que sur l'animal entier" et présente la souris comme "incontournable" en neurosciences.
Objectifs
La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs. Par contre, leurs effets indésirables sont nombreux, dont notamment la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur. Il y a donc des points communs entre l’hypersensibilité induite par les opiacés et le développement de l’hypersensibilité induite par les douleurs chroniques. Nos résultats récents indiquent que les récepteurs à neuropeptides RFamide sont impliqués dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques peu ou pas caractérisées jusqu'à présent. Pour ce faire, nous avons récemment identifié des composés capables de bloquer sélectivement ces récepteurs à neuropeptides RFamide impliqués dans l’hypersensibilité. L’évaluation de l’activité de ces molécules dans différents modèles de douleur chez la souris nous permettra de mieux comprendre le rôle de chaque récepteur dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ainsi il nous sera possible d’envisager le développement de nouveaux traitements de la douleur plus sûrs et présentant moins d’effets secondaires que les traitements existants. Le même projet est déposé dans deux établissements utilisateurs pour des raisons de disponibilités d’équipements scientifiques dont le planning des utilisations n’est pas connu à ce jour. Toutefois, le nombre d’animaux annoncé : 3020, sera utilisé sur l’ensemble des deux établissements.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, les résultats de ce projet, combinés aux résultats obtenus par l’approche génétique, permettront d’affiner le rôle de chacun de ces récepteurs à neuropeptides RFamide et de leurs ligands endogènes (molécules naturellement synthétisées par les neurones pouvant s’y fixer) dans la modulation de la nociception, c’est-à-dire de la perception de stimulus douloureux et dans le développement de l’hyperalgésie induite par les opiacés et les douleurs persistantes. Ils pourraient permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur.
Procédures
Gestes techniques subit par animal selon la procédure et le groupe auquel il appartient : PE1 : Injection composé x5 (10 secondes) / 10 tests Tail Immersion Test (TIT) d’une durée de 30 secondes / 10 tests Tail Pressure test (TPT) d’une durée de 30 secondes PE2 : Injection é x20 (10 secondes) / 15 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 15 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE3 : Injection x5 (10 secondes) / 10 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 10 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE4 : Groupe 1 : Injection x6 (10 secondes) / 10 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 10 tests TPT d’une durée de 30 secondes Groupe 2 : Injection x9 (10 secondes) / 14 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 14 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE5 : Groupe 1 : Chirurgie CCI (20 minutes) / Injection x10 (10 secondes) / 15 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 15 tests de la plaque froide d’une durée de 5 minutes Groupe 2 : Chirurgie CCI (20 minutes) / Injection x10 (10 secondes)/ 15 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 15 tests de la plaque froide d’une durée de 5 minutes PE6 : Chirurgie incisionnelle (5 minutes) / Injection (10 secondes) x7 / 10 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 10 tests du plantar d’une durée de 15 minutes PE7 : Groupe 1 : Injection ITH sous anesthésie générale gazeuse (10 minutes anesthésie comprise) / 11 tests TIT d’une durée de 30 secondes Groupe 2 : Injection ICV sous anesthésie générale gazeuse (10 minutes anesthésie comprise) / 11 tests TIT d’une durée de 30 secondes PE8 : Injection composé (10 secondes) x1 / Injection anesthésie générale x1 (10 secondes) / injection analgésie locale x1 (10 secondes) / Ouverture thoracique (30 secondes) / Prélèvement de sang (30 secondes) / Perfusion / Prélèvement du cerveau PE9 : Injection composé (10 secondes) x1 / Prélèvement sanguin sur animal vigile (30 secondes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, d’alimentation. Nous pouvons aussi nous attendre à une amélioration du niveau de douleur pour les molécules qui s’avéreront efficaces.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait de l'administration de substances pharmacologique et des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.
Remplacement
Les molécules testées in vivo sont au préalable sélectionnées sur la base d’évaluations in vitro afin de déterminer leur affinité et leur activité sur le récepteur d'intérêt ainsi que leurs caractéristiques physicochimiques. Ces expériences permettent de limiter fortement le nombre de molécules à tester sur l'animal. Cependant l'évaluation de leurs effets sur la nociception n’est réalisable que sur l’animal entier ; il n’existe, à ce jour, pas de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail. Nous avons choisi la souris pour pouvoir comparer les résultats obtenus avec le phénotype des souris knockout pour les différents récepteurs RFamide disponibles au laboratoire dans les mêmes modèles de douleur.
Réduction
En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, le nombre d’animaux est limité à 10 par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. L’évaluation préalable in vitro de nos molécules permet de réduire grandement le nombre de molécules à évaluer in vivo et par conséquent réduit également fortement le nombre d’animaux nécessaires pour leur évaluation. Les expériences seront menées sur les mâles et étendues aux femelles dans les modèles de douleur les plus pertinents.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et après concertation auprès de la structure chargée du bien-être animal. Dès que cela est possible, les gestes douloureux sont réalisés sous anesthésie générale, accompagnées d’une analgésie locale et sur tapis chauffant afin d’améliorer le confort de l’animal. Le réveil se fait individuellement en cage propre sous lampe chauffante.
Choix des espèces
Les objectifs du projet consistent à étudier les effets de ligands des récepteurs RFamide sur l’hyperalgésie induite par les opiacées ou associée aux douleurs persistantes. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. L’ensemble de nos expérimentations animales est réalisé sur des souris dont le fond génétique permet de visualiser au mieux le développement de l’hyperalgésie. Par ailleurs, c'est également ce fond génétique que nous avons utilisé pour générer des souris génétiquement modifiées pour les différents récepteurs RFamide, ce qui nous permettra de comparer les conséquences du blocage pharmacologique et génétique de ces différents récepteurs. A leur arrivée au laboratoire, les souris sont âgées de 6 semaines avec un poids allant de 25 à 30 grammes. Les animaux sont soumis aux procédures expérimentales à partir de 8 semaines, ce qui correspond à l’âge de la maturité sexuelle et à un développement complet du système nociceptif.