Rongeurs

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles courent sur un tapis pendant quatre à huit semaines pour induire une fatigue physique et mentale, puis subissent huit tests comportementaux non précisés, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau, afin de mettre au point un modèle de fatigue cognitive liée au sport. Le porteur reconnaît que l'entraînement fatigue les animaux et que les tests provoquent un stress modéré. Il indique que ce projet mené avec trois industriels servira ensuite à tester un extrait végétal, et affirme que le modèle "ne peut pas être développé in vitro".

Objectifs

L'exercice intense et répété est associé à une fatigue cognitive. Un des objectifs des industriels est de développer des compléments alimentaires qui réduisent la fatigue cognitive associée à la pratique sportive intense et régulière. Ainsi, ce projet s’inscrit dans le cadre d’un partenariat entre 2 laboratoires académiques et 3 industriels afin de démontrer l’efficacité d’un extrait végétal sur les performances cognitives et la fatigue après un entrainement physique intense chez la souris ainsi que les mécanismes d’action. Cette partie de projet dont il est question dans cette demande d'autorisation de projet (DAP) vise à développer un modèle d’entrainement physique en utilisant un tapis de courses qui induit une fatigue physique et mentale. La suite de ce projet (qui sera soumis dans une autre DAP) sera de déterminer si la supplémentation nutritionnelle avec l’extrait végétal améliore ces états.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de mettre en place au laboratoire le modèle d’entrainement physique chez la souris afin de tester, par la suite, dans une autre DAP, l’effet d’extraits végétaux sur les paramètres mesurés dans ce projet. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre de recherche portant sur la nutrition préventive et personnalisée. Les résultats attendus sont donc une amélioration des symptômes de troubles de la fatigue chez les souris et une amélioration des comportements anxieux et cognitifs. L'objectif général de ce projet est de valider l'efficacité d'un complément alimentaire en vue de réduire la fatigue cognitive associée à la pratique sportive intense et répétée.

Procédures

Les animaux réaliseront un entrainement physique pendant 4 ou 8 semaines après lequel ils effectueront 8 tests comportementaux qui durent au maximum 10 minutes afin d'évaluer leur fatigue physique ou mentale.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux induiront des stress modérés aux animaux le temps de ces dits tests qui ne durent pas plus de 10 minutes. L'entrainement physique des animaux induira une fatigue.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer le cerveau et réaliser des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Le modèle d’entrainement physique ne peut pas être développé in vitro. L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, des performances cognitives et de la fatigue ne peuvent être réalisées que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au mieux en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. D’après les études scientifiques sur l’analyse de marqueurs comportementaux et cérébraux, nous estimons que 10 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour atteindre une signification statistique.

Raffinement

Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgique et sédation avant mise à mort) et l’inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l’hébergement) des animaux. Les tapis de course que nous avons acquis insufflent de l’air pour encourager les animaux à courir et n’induisent pas de choc électrique comme la majorité des tapis utilisés. L’hébergement se fera à 5 souris/cage et l’environnement sera enrichi : igloo et carré de coton. Les expérimentateurs et soigneurs sont titulaires de leur certificat d’expérimentation animale niveau concepteur et/ou opérateur. Les expérimentateurs travaillent avec des animaux depuis de nombreuses années et sont très fortement sensibilisés au sujet du bien-être animal de par leur thématique de recherche (stress, anxiété, bien-être cérébral) et de par le travail de la cellule SBEA. La SBEA procède à des contrôles réguliers de respect des procédures et de bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. La souris est un mammifère comme l’Homme, avec des cycles de reproduction rapides. Il est largement utilisé dans le champ de la cognition, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec les études antérieures. C’est un animal sur lequel les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille (faciles à manipuler) et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. L'objectif du projet est d'améliorer la fatigue cognitive de sportifs adultes. Les souris mâles et femelles arriveront à l’animalerie à l’âge adulte (3 mois).

1 013 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes sont enfermées 45 minutes par jour dans un espace confiné à partir du douzième jour de grossesse, et leur descendance, porteuse de mutations liées à Alzheimer, subit pendant un mois des tests de mémoire et d'anxiété avant que tous les animaux soient tués pour prélever leur cerveau, afin d'étudier le stress prénatal comme facteur de risque de la maladie. Le porteur présente ce stress de contention comme sans douleur physique et n'annonce aucune souffrance chez les souris transgéniques. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ou informatique ne reproduit la grossesse et le placenta, invoquant un "besoin d'animaux de placentation".

Objectifs

L’objectif du projet est de identifier de nouvelles causes possibles de la maladie d'Alzheimer. Nous proposons d'étudier si et comment un stress pendant la gestation peut endommager le développement neurologique qui se manifestent ensuite au cours du vieillissement, augmentant le risque de développer la maladie d'Alzheimer.

Bénéfices attendus

40 % des cas de maladie d'Alzheimer pourraient être évités en agissant sur les facteurs environnementaux. Bien que de nombreux facteurs liés au mode de vie, notamment l'alimentation, l'exercice et l'éducation, aient été reconnus comme des facteurs de risque de développer la maladie d'Alzheimer, on ne sait toujours pas si le début de la vie influence le développement de cette maladie liée à l'âge. Les effets à long terme du stress sur le cerveau en développement fœtal sont encore largement inconnus. Ce projet permettra de clarifier les mechanismes moléculaires et cellulaires sous-jacentes aux effets à long terme du stress prénatal et d'évaluer si et comment ces événements peuvent constituer un risque concret de développer des pathologies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer. Compte tenu de l'absence quasi totale de traitements pour cette maladie humaine, ce projet contribuera au développement de nouvelle strategies de traitement et prévention de ces pathologies neurodegeneratives.

Procédures

Des souris subiront un paradigme du stress gestationnelle à partir du jour 12 jusqu’à la fin de la grossesse. Ce paradigme consiste à être positionné dans un espace confiné pendant 45 minutes par jour. La descendance de souris stressé et non stressées seront entrainées pour des analyses de comportement afin de comprendre leurs capacités de mémorisation et leurs niveaux d'anxiété. Ces analyses de comportement dureront quelques minutes par jour par souris sur une durée d'un mois.

Impact sur les animaux

Le paradigme de stress que nous allons utiliser est un modèle accepté qui induit un état de stress lié à la réduction de l'espace environnant, mais qui n'implique pas de douleur physique ni de traumatisme pour l'animal. A terme, si une certaine forme de souffrance est constatée, soit chez les souris transgéniques, soit suite à une intervention (telle qu'une injection intrapéritonéale pour les traitements), différentes procédures seront mises en place afin de limiter au maximum cet état d'inconfort, dont l'accès à de la nourriture et de l'eau, une manipulation réduite ou éventuellement des sacrifices.

Devenir

La mise à mort est prévue pour tous les animaux afin de prélever les cerveaux pour l'analyse biologique.

Remplacement

Pour ce projet, nous avons besoin d'utiliser des animaux comme modèle. Les autres méthodes scientifiques alternatives ne sont pas suffisantes. Par exemple, les expériences en laboratoire avec des cellules ou les simulations informatiques ne peuvent pas reproduire des processus complexes comme la grossesse et la façon dont le placenta fonctionne, ce qui est essentiel pour notre projet. Les expériences en laboratoire avec des cellules sont utiles pour étudier des maladies au niveau moléculaire et cellulaire, mais notre projet nécessite d'étudier le comportement des animaux et d'examiner leur cerveau et leur corps dans son ensemble, ce que les expériences en laboratoire ne peuvent pas faire. Nous utilisons des animaux qui sont déjà largement utilisés dans la recherche scientifique pour étudier leur comportement. De plus, nous utilisons des souris génétiquement modifiées avec des mutations qui ressemblent le plus possible à la maladie d’Alzheimer humaine. Ces souris sont essentielles pour comprendre comment cette maladie se développe.

Réduction

Nous allons utiliser le moins d'animaux possible tout en obtenant des résultats biologiquement et statistiquement significatifs pour notre projet. Nous utilisons des calculs statistiques pour déterminer combien d'animaux sont nécessaires, en nous basant sur des données déjà disponibles dans des études similaires. Nous avons également réduit au minimum le nombre de mâles utilisés pour la reproduction. Dans notre étude, nous allons combiner différents types d'analyses, comme l'observation du comportement des animaux, l'étude de leur cerveau et de leur façon de fonctionner. En regroupant toutes ces analyses dans un même groupe d'animaux et en utilisant des modèles qui développent la maladie à 100%, nous pouvons réduire de moitié le nombre d'animaux nécessaires sans compromettre la fiabilité de nos résultats.

Raffinement

Dans notre étude, nous faisons tout notre possible pour que les animaux ne souffrent pas. Nous utilisons un modèle qui expose les souris enceintes à un certain niveau de stress en réduisant leur espace, mais cela ne leur cause pas de douleur physique. Après ce stress, nous surveillons quotidiennement le bien-être des animaux et nous prenons toutes les mesures nécessaires pour les maintenir en bonne santé. Si un animal montre des signes de détresse, nous examinons s'il y a un problème médical sous-jacent et nous utilisons des médicaments pour soulager toute gêne. Si nécessaire, nous utilisons une méthode indolore pour mettre fin à leur vie. En ce qui concerne les souris génétiquement modifiées que nous utilisons, elles développent des caractéristiques similaires à la maladie d’Alzheimer, mais elles ne montrent pas de signes de stress ou de souffrance. Elles vivent dans un environnement adapté à leurs besoins. Nos expériences se déroulent dans des installations spécialement conçues pour cela, où nous nous assurons que les animaux sont traités avec le plus grand soin. HEBERGEMENT : Les souris son hebergés dans des cages avec nourriture et aeux à diposition. Chaque cage possède un abri, un bâton de bois à ronger et des cotons pour la nidification. Les animaux seront maintenus au minimum 2 par cages sans isolement.

Choix des espèces

Afin d'obtenir les résultats énoncés dans ce projet, il n'est pas possible d'utiliser une autre méthode scientifiquement valable et pratiquement applicable qui n'implique pas l'utilisation de la souris. En effet, pour mimer un modèle de stress prénatal et étudier les effets sur le développement cérébral, il existe un besoin d'animaux de placentation. Le modèle animal implique l'utilisation d'un modèle murin de maladie d'Alzheimer qui sera soumis à un paradigme de stress largement consolidé et utilisé dans de nombreux laboratoires à travers le monde, permettant ainsi la comparaison des résultats obtenus avec d'autres publiés. En plus, la complexité de réseaux neuronaux qui sous-tendent les fonctions cognitives et comportementales que nous allons analyser ne sont pas présentes dans des modèles d’animaux invertébrés. L’étude se focalise sur les effets du stress pendant la gestation sur le développent du gerveaux qui peuvent être associé à un risque augmenté de la maladie d'Alzheimer. En conséquence, les stades de développement ou les analyses seront effectués vont des derniers stades gestationnels (dernère semaine de gestation) au 13 mois de vie pour évaluer les effets liés au vieillissement.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie développe un diabète, et chaque animal reçoit jusqu'à 112 injections d'un composé, des contrôles de glycémie et un test de tolérance au glucose avec cinq heures de jeûne et six prélèvements à la queue, avant d'être tué pour examiner le pancréas, pour tester cinq variantes d'un composé censé régénérer les cellules bêta. Le porteur décrit un inconfort modéré lié aux piqûres, aux prélèvements et au jeûne, et un diabète qu'il annonce sans souffrance particulière. Il affirme que le diabète s'exprime à l'échelle de l'organisme entier et que son étude "ne peut être remplacée".

Objectifs

Le pancréas joue un rôle clef dans le maintien du taux de sucre sanguin. Cet organe contient de nombreux types cellulaires dont les cellules bêta sécrétant de l'insuline, une hormone permettant de diminuer le taux de sucre sanguin en cas d'apport sucré. Notre recherche se concentre sur le diabète de type 1, une maladie qui se caractérise par la perte sélective de cellules bêta. Sans traitement, cette maladie peut avoir de graves conséquences telles que des dommages vasculaires, des risques de cécité, d’amputation, ou même la mort. Les traitements actuels consistent en l’injection d'insuline pour compenser la déficience en cette hormone. Cependant, des facteurs environnementaux (l'alimentation, l’âge, le stress, etc...) peuvent provoquer de fortes variations des niveaux de glucose sanguin, malgré un traitement à l'insuline, et donc éventuellement conduire aux complications présentées précédemment. Dans le but de pallier aux limitations des thérapies actuelles, nous nous intéressons à la régénération des cellules bêta. Nous avons ainsi récemment identifié un composé pharmacologique capable d'induire la régénération des cellules bêta pancréatiques. Le but de notre projet est donc de tester 5 différentes variations de ce composé (visant à le rendre encore plus efficace) dans un modèle de diabète. Nous utiliserons 600 souris afin d’évaluer et comparer les capacités de ces composés à contrer un diabète. Une attention particulière est portée sur l’application stricte de la règle des 3R.

Bénéfices attendus

Le but de ces travaux est de démontrer une activité accrue de l’une (ou plusieurs) de nos protéines afin d'induire la régénération des cellules beta pancréatiques et ainsi contrer les effets de la perte des cellules beta pancréatiques. il s’agit donc de travaux dont la finalité est le traitement thérapeutique du diabète.

Procédures

Les animaux recevront des injections quotidiennes ou hebdomadaires de protéines (le nombre total d’injections intrapéritonéales reçues par les animaux sera au maximum de 112 pour les seuls traitements, chaque injection durant une dizaine de secondes). Des prélèvements sont prévus pour suivre la glycémie des animaux (1 fois par semaine, 1 goutte de sang). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures de glycémie) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets attendus sont un inconfort modéré dû aux piqures, aux prélèvements et à la mise à jeun de 5 h. Une partie des animaux développeront un diabète modéré n’entrainant pas de souffrance particulière.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour examen post-mortem des organes et du pancréas en particulier.

Remplacement

Le diabète est une maladie complexe. C'est une pathologie qui s’exprime à l’échelle d’un organisme et qui fait intervenir tous les organes susceptibles de stocker ou consommer du glucose (la plupart donc). Son apparition et sa gravité résultent donc de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’application de tests statistiques nous a permis de réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables et sans prévoir de répétition des expériences.

Raffinement

Durant toute la procédure, les animaux seront suivis en s’appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer et d’objectiver les éventuelles souffrances, et de mettre en oeuvre des points limites précoces et adaptés. La bonne santé ou la souffrance des animaux seront observés selon des grilles d'évaluation. En amont de chaque procédure, des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi (maisonettes et buchettes), en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Le diabète est une maladie d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. Les souris utilisées ici représentent un modèle de choix pour nos travaux visant à contrer un diabète : il est en effet très difficile de trouver une autre espèce animale développant un diabète provenant d'une attaque des cellules beta pancréatiques. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines, cet interval d'âges correspondant à une période sans diabète. Nous souhaitons en effet initier nos traitements avant l'apparition du diabète (et ainsi contrer son développement).

1 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent dès deux jours de vie l'injection chirurgicale d'un vecteur de thérapie génique dans l'oreille, puis des injections répétées de corticoïdes, deux mesures auditives sous anesthésie avec pose d'électrodes sous la peau et des prises de sang, pour tester si un anti-inflammatoire améliore une thérapie génique de la surdité. Le porteur indique que la chirurgie, les injections et la pose d'électrodes provoquent des douleurs légères à modérées. Il affirme qu'il n'existe "aucune alternative à l'expérimentation animale", faute de pouvoir mettre en culture ou simuler le système auditif dans son ensemble.

Objectifs

Entendre, c’est pouvoir identifier et localiser les sources sonores dans l’espace, de jour comme de nuit ; l’audition contribue ainsi à la sécurité des individus. L’audition est devenue chez l’homme le sens prépondérant sur lequel repose la communication inter-individuelle. Or, l’importance de l’audition continue d’être fortement sous-estimée : le risque que la perte de l’audition fait peser sur les individus, risque qui inclut le déclin des fonctions cognitives, n’est pas compris, ni anticipé et les campagnes d’information et de prévention ont été jusqu’ici peu fructueuses. Par leur ampleur et leurs conséquences, les atteintes de l’audition constitueront, avant 2030, la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien, selon l’organisation mondiale de la santé. On estime que plus de la moitié des cas de surdité congénitale sont attribués à des causes génétiques et les mutations d’un gène sont les causes les plus fréquentes. La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies génétiques. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds mais également tardifs et progressifs. Nous avons obtenu des résultats prometteurs de preuve de concept d’efficacité thérapeutique pour le traitement des surdités causées par le gène en utilisant des vecteurs viraux codant pour le gène (thérapie de remplacement). Le présent projet consiste à évaluer la possibilité d’améliorer l’efficacité de nos stratégies de thérapie génique.

Bénéfices attendus

La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds. Il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétique donc potentiellement traitable par thérapie génique. Cependant de nombreuses études ont montré que l’injection d’un produit de thérapie génique dans l’organisme est susceptible d’entrainer une réponse inflammatoire et immunitaire. De plus cette réponse inflammatoire et immunitaire pourrait être potentialisée par le traumatisme chirurgical ce qui limiterait d’autant plus l’efficacité de la thérapie. Les bénéfices attendus de l’administration de produit anti inflammatoire de type corticoïdes seront l’augmentation de l’efficacité thérapeutique de vecteur à savoir une récupération de l’audition plus forte et plus durable (via une augmentation de la transduction et/ou la persistance du transgène). Si les résultats sont probants, ce projet pourrait poser les bases d’un développement clinique.

Procédures

L’injections du vecteur de thérapie génique se fera sous anesthésie gazeuse. L’ensemble de la chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes. Les animaux seront soumis à des tests auditifs au nombre de 2 avec un intervalle minimal d’au moins un mois entre chaque test. Le test complet correspond à une anesthésie fixe puis une mesure de la réponse auditive. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. Les tests auditifs seront réalisés au plus tôt à 1 mois. Un échantillon de sang sera prélevé (quelques secondes pour chaque prélèvement) à chaque temps d’analyse (15 jours, 1 mois et 2 mois après la naissance).

Impact sur les animaux

Pour ce projet, les nuisances et effet indésirables potentiellement attendus sur les animaux sont les douleurs légères à modérées consécutives aux actes de chirurgie, d’injections intrapéritonéales répétées, de pose d’électrodes sous cutanées au niveau de la face et du dos lors des tests auditifs et de prises de sang répétées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’unique procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car nous prélevons des tissus pour des analyses histologiques.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble. Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.

Réduction

Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet. Ils seront donc mis à mort. Nous appuyons sur les données obtenues dans nos précédentes expériences pour le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire.

Raffinement

Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (perte de poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Un bâtonnet de coton sera ajouté dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification, ainsi qu’un igloo pour les femelles avec portée. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies des animaux. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des animaux qui subiront la chirurgie. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant pour la maman. Les animaux opérés seront surveillés tous les jours pendant une semaine après chirurgie puis deux fois par semaine minimum la semaine suivante pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans la grille d’évaluation fournie par la structure du bien-être animal.

Choix des espèces

Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de 10 jours après la naissance ; avant 8 jours après la naissance le système auditif est immature, 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, 30 jours après la naissance et au-delà,le système auditif est mature. L’administration du vecteur de thérapie génique se fera 2 jours après la naissance .

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules humaines de cancer de la prostate sous la peau, avec des mesures de la tumeur trois fois par semaine, avant d'être tuées à l'atteinte du volume limite ou au bout de cent jours pour prélever les tumeurs, afin de valider ce modèle dans le laboratoire. Le porteur reconnaît que la croissance tumorale peut provoquer une perte de poids, des douleurs, une ulcération et une nécrose. Il affirme que l'étude ne peut se faire que sur un "organisme entier" et présente le recours à la souris immunodéprimée comme "nécessaire".

Objectifs

Le projet présenté vise à valider dans notre laboratoire la prise et la croissance tumorale de cellules cancéreuses humaine de cancer de la prostate dans une souche de souris avec un système immunitaire déficient. Le cancer de la prostate souvent diagnostiqué chez les hommes de plus de 50 ans, est responsable chaque année d’un peu moins de 9000 décès en France et 350 000 au niveau mondial ce qui correspond à un pourcentage élevé de décès masculins liés à un cancer : 6.8%. Ce second cancer masculin fait donc parti des cancers à fort besoin thérapeutique, c’est pourquoi nous nous intéressons ici à la mise en place d’un modèle animal afin de pouvoir étudier ce type de cancer dans notre laboratoire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra dans un premier temps de mettre en place un modèle de cancer de la prostate chez la souris, qui par la suite servira à étudier l’efficacité de potentiels nouveaux traitements anticancéreux plus efficaces ou avec moins d’effets indésirables que ceux déjà sur le marché.

Procédures

Injection de cellules cancéreuses en sous-cutané (réalisée une fois au début de l'expérimentation, quelques secondes). Mesures tumorales au pieds à coulisse 3x/semaine (quelques secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir des injections sous cutané qui génèreront du stress à la contention et une douleur courte à l’injection. La pousse tumorale peut engendrer de la perte de poids, des douleurs au niveau de la tumeur, et potentiellement de l’ulcération et de la nécrose. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress lors de la contention et éventuellement de la douleur au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour atteinte du volume éthique ou 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai pour prélèvement des tumeurs.

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire, même incomplet (ici ne manquent que les lymphocytes-T), et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). L’étude de développement d’une tumeur et par la suite l’étude de l’efficacité de potentielles molécules anticancéreuses sur cette tumeur ne peut se faire que sur l’organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de conclure de façon statistiquement fiable à un taux de prise et de croissance tumorale permettant de réaliser par la suite une étude d’efficacité de composés. Dans cette étude le point final correspondra à l'atteinte d'un volume tumoral défini selon les points limites, il faut donc que nos cellules injectées puissent former une tumeur mais qui va aussi pousser et pouvoir atteindre ce volume. Un test statistique fiable a été utilisé pour déterminer le nombre de souris nécessaires au vu de la forte variabilité de taille et du caractère aléatoire de la prise tumorale dans ce modèle. Nous ferons les experiences en incrément et nous passerons à la concentration plus élevée uniquement si la concentration précédente n'était pas effective, ce qui réduira potentiellement de moitié le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Tous les animaux seront mis à mort au plus tard 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai pour prélèvement des tumeurs. Par ailleurs, le personnel animalier renseigne quotidiennement une grille de suivi basée sur des critères comportementaux et physiques relevant de points limites adaptés. Les animaux seront hébergés dans un environnement qui présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux).

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec des animaux présentant un système immunitaire déprimé pour éviter le phénomène de rejet. L'utilisation d'une souche murine immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter ce phénomène. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif, la souche Nude étant athymique, est un modèle qui permet une prise tumorale avec de nombreuses lignées humaines. En effet la souris immunodéprimée Nude est une souche reconnue pour l’implantation de xénogreffes. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit cinq injections d'une protéine de microsporidie avec adjuvant de Freund, avant d'être tué par prélèvement cardiaque sous anesthésie pour récupérer tout son sang, afin de produire des anticorps servant à détecter ces parasites dans l'eau ou les aliments. Le porteur signale que l'adjuvant peut provoquer une inflammation au point d'injection et, dans de rares cas, des ulcérations et des abcès. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'est "aussi fiable" que la production d'anticorps chez l'animal et écarte les approches in vitro faute de compétences et d'équipement.

Objectifs

Les microsporidies sont des champignons se développant dans les cellules de leur hôte. Chez l’Homme, elles peuvent causer divers syndromes, dont notamment des troubles digestifs responsables de diarrhées aqueuses profuses, qui évolueront vers la chronicité voire la mort chez les sujets ayant un système immunitaire affaibli. La contamination se fait essentiellement par voie orale lors de l’ingestion d’eau ou d’aliments souillés par des microsporidies. Les quantités de microsporidies dans les prélèvements, en particulier environnementaux (aliments, stations d’épuration), sont souvent faibles ce qui est problématique pour les études épidémiologiques. Nous souhaitons développer une méthode d’enrichissement/purification par l’utilisation de billes magnétiques recouvertes d’anticorps dirigés contre des protéines présentes à la surface des microsporidies. Ainsi les anticorps permettront la capture des microsporidies, puis par l’intermédiaire d’un aimant, les billes magnétiques préalablement fixées aux anticorps seront récupérées, permettant ainsi la purification des microsporidies. Pour mener ce projet, nous avons donc besoin de produire des anticorps dirigés contre les microsporidies. Des protéines de surface des microsporidies ont été reproduites en amont, elles seront injectées à des souris, qui vont alors s’immuniser contre ces protéines étrangères. En effet, des anticorps sont produits par le système immunitaire des animaux vertébrés en réponse à l’entrée d’un antigène dans l’organisme de l’animal. Ils sont libérés dans le sang de l’animal à partir duquel ils sont facilement purifiables pour obtenir des anticorps dits polyclonaux, c’est-à-dire un mélange d’anticorps dirigés contre plusieurs fractions de la protéine d’intérêt. La production d’anticorps polyclonaux implique donc l’injection répétée de la protéine d’intérêt à un animal, puis la récupération de la totalité du sang lors du sacrifice de l’animal. Ce projet d’une durée de 5 ans, utilisera un maximum de 150 souris. A notre connaissance, aucune méthode alternative et aussi fiable que la production d’anticorps polyclonaux chez l’animal n’est disponible. Comparés aux anticorps polyclonaux, les anticorps monoclonaux (dirigés contre une seule fraction de la protéine d’intérêt) sont très spécifiques, mais également moins sensibles et ne peuvent donc pas répondre à notre objectif final qui est de capturer dans une matrice complexe des microsporidies présentent en faible quantité.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux obtenus grâce à ce projet devraient nous permettre d’enrichir et purifier les spores de microsporidies présentes dans différentes matrices. En effet, la charge en microsporidies est souvent très faible. Dans l’exemple d’une station d’épuration, cela permettra de déterminer si les eaux d’entrée et de sortie de station sont positives, et si oui, d’identifier les génotypes présents grâce à des outils de séquençage et d’établir une surveillance de la circulation des microsporidies. Dans l’exemple des aliments, en cas d’épidémie suspectée dans la population, il sera possible de tester différents aliments, pour identifier celui responsable de l’épidémie. Ainsi de nombreuses applications pourront découler de la mise au point de cet outil d’immunocapture.

Procédures

Manipulation des animaux lors de l’identification par micro-tatouage à la phalange à l’aide d’une seringue hypodermique. Manipulation des animaux lors de l’injection intra-péritonéale : contention et injection. Ces 2 interventions prennent en moyenne moins de 5 minutes par animal. Les animaux seront soumis à 5 injections sur la durée du projet. Manipulation des animaux lors de la mise en boîte à induction pour la réalisation de l'anesthésie gazeuse. Anesthésie gazeuse, puis prélèvement cardiaque sur animaux endormis, avant euthanasie de ces derniers. Ces interventions prennent en moyenne 10 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Une inflammation liée à l'adjuvant de Freund peut survenir au site d'injection, et des lésions, de type ulcération et abcès, peuvent apparaître dans de très rares cas. Certains animaux peuvent avoir une modification de leur activité, et de leur aspect physique (pelage terne ou hirsute).

Devenir

A l'issue de l'expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer la totalité du sang et donc les anticorps produits.

Remplacement

Pour pouvoir réaliser des expériences d’immunocapture, nous avons besoin de sondes ayant une forte spécificité et une bonne affinité envers nos protéines cibles. Les anticorps permettent de répondre à ces exigences. Nous ciblons des protéines spécifiques des agents pathogènes étudiés pour lesquelles aucun anticorps n'est disponible dans le commerce. Les alternatives non animales seraient de produire des anticorps monoclonaux selon une approche de fabrication d’anticorps synthétiques d’emblée (anticorps sources) par la technique de phage display. Cette technique nécessite un travail secondaire in vitro pour améliorer la spécificité et la sélectivité. Il est aussi à noter qu’il peut être plus difficile d’obtenir des anticorps synthétiques contre des protéines dénaturées, or nos protéines que nous avons produites étant très peu solubles, nous sommes contraints de les extraire en condition dénaturantes. Une autre alternative animale serait la production d’anticorps monoclonaux in vitro, où la production d’anticorps sources se fait par immunisation d’animaux. La sélection des anticorps puis leur production en culture in vitro est une procédure complexe pour laquelle nous n’avons pas les compétences et les équipements. De plus comme précisé précédemment, les anticorps monoclonaux sont peu adaptés pour notre projet. Comparés aux anticorps polyclonaux, les anticorps monoclonaux sont très spécifiques, mais également moins sensibles et ne peuvent donc pas répondre à notre objectif final qui est de capturer dans une matrice complexe des microsporidies présentent en faible quantité.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux, il est prévu d'immuniser 2 animaux par antigène étudié, ce qui permet d’obtenir un volume de sérum suffisant. Si les sérums des animaux immunisés ne sont pas spécifiques de l'antigène étudié, une purification des immunoglobulines sera réalisée. Une deuxième série d'immunisation contre le même antigène sera envisagée si les anticorps ne détectent pas l'antigène même après purification. Si des anticorps produits chez le 2ème couple d’animaux venaient également à ne pas répondre à l'antigène, l'étude portant sur cet antigène sera définitivement abandonnée. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux générés, nous utiliserons autant que possible des animaux sur-numéraires provenant de reproductions issues d’un autre protocole apafis obtenu au laboratoire et ces souris sont de fond génétique C57BL6/J.

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux, ceux-ci seront acclimatés deux semaines dans l'animalerie avant le début des expérimentations. Ils seront hébergés selon les normes en vigueur. Ils seront hébergés par groupe de 4 avec un enrichissement de leur environnement (maison en plastique). Une surveillance des animaux sera réalisée quotidiennement. Les animaux présentant une modification de comportement, d'aspect physique ou de poids seront euthanasiés afin d'éviter toute souffrance, Une liste de points limites sera à vérifier quotidiennement. Les injections seront réalisées alternativement sur les côtés gauche et droit de l’animal afin de limiter l’apparition de lésions au site d’injection.

Choix des espèces

Deux raisons principales nous ont amenés à choisir la souris pour cette production d'anticorps. 1- les anticorps polyclonaux que nous envisageons de produire seront utilisés exclusivement à des fins de recherche pour des expériences (expériences d'immunolocalisation, d’immunocapture, mise au point d’ELISA) qui nécessitent de faibles volumes d’anticorps ; 2- les antigènes proviennent d'espèces éloignées phylogénétiquement de la souris, ce qui limite les risques de réactions croisées et la non validité des anticorps obtenus. De plus, aucune approche in vitro ne permet de produire des anticorps polyclonaux même s'il est possible en théorie, de créer des préparations "polyclonales" par mélange d'anticorps monoclonaux, eux-mêmes d'origine synthétique, mais ces mélanges (parfois appelés "multiclonaux") ne reprennent jamais la totalité des performances des anticorps polyclonaux. Nous utiliserons des animaux nés à l'animalerie. A l'âge de 6-8 semaines, la première injection sera réalisée. Ainsi les 4 rappels seront réalisés entre 8-10 et 11-13 semaines. Cela nous permet de travailler sur des souris jeunes adultes qui ont une réponse immune suffisamment développée et qui ne sont pas encore (trop) affectées par des challenges immuns. De plus, la robustesse de la réponse immune diminue avec l'âge après le début de l'âge adulte.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux mâles sont manipulés dès le lendemain de la naissance et reçoivent chaque jour par pipette un médicament bloquant la différenciation des spermatogonies jusqu'à dix-huit jours, avant d'être tués entre quinze et dix-neuf jours par une dose létale d'anesthésique suivie de la perfusion d'un fixateur, pour prélever leurs testicules et étudier le rôle de l'acide rétinoïque dans la méiose. Le porteur renvoie les retombées annoncées, des pistes sur l'infertilité masculine humaine et un éventuel contraceptif masculin, au conditionnel et au long terme. Il affirme que seule une expérimentation sur animaux répond à la question et qualifie le remplacement in vitro d'"impossible", au nom de l'"organisme entier".

Objectifs

Dans ce projet nous bloquons la différenciation des spermatogonies par une méthode pharmacologique puis nous induisons la différenciation contrôlée et simultanée de toutes les spermatogonies par une méthode pharmacologique également, pour étudier le déroulement d’une des étapes de leur différenciation, à savoir la méiose. Les testicules des animaux traités servent à réaliser les analyses qui doivent permettre de comprendre le rôle de l’acide rétinoïque dans cette étape.

Bénéfices attendus

Dans la mesure où le médicament utilisé dans cette étude bloque la différenciation des spermatogonies dans de nombreuses espèces, y compris les êtres Humains, il est logique de penser que les mécanismes régissant la spermatogenèse qui sont découverts ici chez la souris sont pertinents pour les êtres Humains. Ainsi, en comprenant comment l'acide rétinoïque agit sur les spermatogonies chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour évaluer si des cas d'infertilité Humaine, qui sont en augmentation constante dans le monde, sont liés à des altérations du fonctionnement de l'acide rétinoïque. La possibilité de perturber temporairement la signalisation de l'acide rétinoïque représente également une stratégie pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux, à condition de bien caractériser et comprendre au préalable tous les mécanismes mis en jeu dans un modèle expérimental comme la souris.

Procédures

Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). - Administration d’un médicament pour bloquer la différenciation des spermatogonies. Réalisée quotidiennement dès la naissance jusqu'à l'âge de 18 jours au maximum. – Administration d’un médicament pour rétablir et synchroniser la différentiation des spermatogonies. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’anesthésique/analgésique en dose létale pour perfuser un fixateur histologique. Etape finale de mise à mort réalisée entre l’âge de 15 jours et 19 jours. Les souris sous anesthésie générale profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Il y aura une nuisance liée au fait que les souriceaux seront manipulés à partir du jour suivant leur naissance. Ils reçoivent quotidiennement par voie orale (à l'aide d'une pipette) le médicament permettant de bloquer la différenciation des spermatogonies. La pointe de la pipette (contenant le médicament) sera proposée à la bouche du souriceau jusqu'à ce qu'il commence à boire. En ce qui concerne l'administration du médicament pour rétablir et synchroniser la différentiation des spermatogonies ou l'administration d’anesthésique, la douleur sera similaire à celle provoquée par l'introduction d'une aiguille sous la peau.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour prélever les testicules.

Remplacement

La spermatogenèse est un processus complexe qui fait intervenir plusieurs types cellulaires du testicule. Les interactions entre les cellules somatiques et des cellules germinales sont essentielles pour assurer une production continue de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le rôle de l'acide rétinoïque dans un contexte physiologique où ces interactions cellulaires sont préservées. Il est important de souligner que seule une approche expérimentale impliquant des animaux permettra de répondre à ces questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, nous ferons usage d'animaux de type sauvage issus d'un fond génétique mixte. Étant donné que notre étude se concentre sur la spermatogenèse, seuls les mâles (statistiquement, représentant la moitié des naissances) seront employés dans les expériences. Nous réduisons la fenêtre d’observation (donc de prélèvements) sur la période critique de la méiose, qui s’étale sur 5 jours. Nous avons besoin de 10 males pour chaque groupe expérimental : 5 pour des analyses histologiques et 5 pour des analyses moléculaires. Les testicules controlatéraux de chaque mâle serviront à évaluer l'efficacité des traitements administrés en utilisant des analyses en immunohistochimie. Le nombre d’animaux a été calculé de manière précise pour respecter les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés, tout en garantissant la qualité et la robustesse statistique des résultats obtenus. La possibilité d'abandon par la mère ou de cannibalisme au cours de la procédure expérimentale est une préoccupation légitime. Afin de prendre en considération ces risques et de respecter le principe de réduction de l'utilisation d'animaux, nous avons choisi de doubler notre effectif, évitant ainsi la nécessité de recommencer la procédure en cas de perte d'animaux. L’effectif total est de (5 jours) * (10 mâles) * (double) soit 100 souris. Nous mettons ainsi en œuvre la réduction du nombre d'animaux, conformément au principe des 3R.

Raffinement

Toutes les mesures requises sont mises en place pour assurer le bien-être des animaux. Un nid de coton ou un nid végétal est ajouté dans chaque cage pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal. Nous surveillons régulièrement leur état de santé et nous apportons des soins appropriés en cas de besoin, notamment en ce qui concerne l'administration d'analgésiques, le cas échéant. Le bien-être des animaux fait l'objet d'une surveillance quotidienne, et toute modification de leur comportement indiquant une souffrance ou de l'anxiété est immédiatement signalée aux responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) afin de prendre les mesures correctives nécessaires. Les animaux sont manipulés avec précaution et reçoivent quotidiennement le médicament visant à inhiber les rétinaldéhyde déshydrogénases Dès l'âge d'un jour, ils sont habitués à prendre ce médicament par voie orale à l'aide d'une pipette. La pointe de la pipette (contenant le médicament) est placée près de la bouche des souriceaux jusqu'à ce qu'ils commencent à lécher ou à boire. Le médicament est administré sous forme de solution diluée dans de la gomme tragacanthe, connue pour sa viscosité et son goût neutre. Nos collaborateurs nous ont informés que les souriceaux acceptent volontiers cette solution dans ces conditions. Par ailleurs, Le médicament administré n'a pas d'effets notables connus sur la croissance ou le comportement des animaux. Par la suite, le traitement visant à restaurer la spermatogenèse sera administré par injection intrapéritonéale. Les manipulations et les traitements sont effectués par un expérimentateur qualifié afin de minimiser toute perturbation potentielle pour les animaux. Nous appliquons le principe du raffinement (troisième "R" de la règle des 3R) dans notre projet en optimisant les conditions de travail avec les animaux.

Choix des espèces

Notre étude vise à comprendre les effets de l'acide rétinoïque dans un système physiologique à part entière, notamment dans ses fonctions paracrines (entre les différents types cellulaires du testicule) et endocrines (dans l'organisme entier). Seule une approche expérimentale avec des animaux permet de répondre à ces questions. D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’Homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre et impliquant l’acide rétinoïque dans le testicule de souris sont conservés dans le testicule de l’Homme. Dans ce projet, nous entravons le processus de différenciation des spermatogonies en utilisant une méthode pharmacologique (Médicament1) qui inhibe la synthèse d'acide rétinoïque endogène, commençant dès le jour postnatal (P)1 et se poursuivant jusqu'au jour P18. Parallèlement, nous provoquons la différenciation contrôlée et simultanée de toutes les spermatogonies en recourant à une autre méthode pharmacologique (Médicament2) qui apporte de l'acide rétinoïque exogène, à P4. Cette approche nous permet d'obtenir différentes étapes de différenciation à des moments précis et bien définis. Le traitement continu avec le Médicament1 empêche toute influence de l'acide rétinoïque endogène, ce qui a pour résultat de bloquer toute différenciation indésirable de nouvelles spermatogonies. L'évolution de la méiose est analysée entre 11 et 15 jours après l'administration du Médicament2, se situant entre P15 et P19.