Rongeurs
Modele preclinique de neuropathie – souris DIO-STZ
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
2 550 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, 2 250 étant classées en souffrance sévère. Rendues obèses puis diabétiques par injection de streptozotocine, molécule que le porteur décrit comme "particulièrement toxique", elles subissent des prélèvements sanguins répétés et divers tests avant mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur reconnaît que ce projet "n'est pas le plus adapté en termes de réduction" et qu'un nombre important d'animaux est prévu du fait d'une mortalité attendue après l'injection. Il conclut que la culture cellulaire ne peut se substituer à la souris pour reproduire l'atteinte multi-organique du diabète.
Objectifs
Le diabète de type 2, associé à l’obésité, est associé à des atteintes nerveuses et rénales. Les atteintes nerveuses sont des conséquences invalidante du diabète détériorant la santé et la qualité de vie des patients. Elle se traduit par de l’incontinence, des désordres gastrointestinaux, des douleurs chroniques, des sensations de froid ou de chaud continues, une transpiration excessive, des défauts sexuels, une intolérance à l’effort ou encore des malaises. La conséquence la plus grave étant les altérations nerveuses au niveau cardiaque pouvant entrainer la mort. Les atteintes rénales touchent 20 à 40% des patients atteints de diabète. Elles peuvent entrainer une dialyse à vie dont le seul traitement consiste en la transplantation de nouveaux reins. Ces atteintes ont également des conséquences très importantes sur les fonctions cardiovasculaires augmentant le risque de maladies cardiovasculaires. Aujourd’hui, aucune stratégie thérapeutique efficace n’est envisagée dans le cadre de ses conséquences du diabète. Les seules stratégies envisagées sont le contrôle de la glycémie par les anti-diabétiques classiques et des recommandations diététiques et/ou le traitement par antidépresseurs dans le cas de la neuropathie. Ainsi, la mise en place d’un modèle animal diabétique présentant ces atteintes nerveuses et rénales permettrait aux clients de tester des molécules anti-diabétiques sur ces atteintes nerveuses et rénales ou bien de tester des molécules protégeant les reins et les nerfs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra le développement de nouveaux médicaments ciblant les complications rénales et nerveuses du diabète. Ce projet permettra également un gain de connaissance sur le développement de ces complications associées au diabète.
Procédures
- Les animaux subiront des prélèvements répétés de sang à la veine caudale, en vigile et au sinus retroorbitaire sous anesthésie gazeuse ou locale au cours de l’étape de screening, en milieu de traitement, au cours du test de tolérance au glucose et de la mesure de la vidange gastrique, en respectant les recommandations éthiques. Les prélèvements de sang effectués en cours d'étude se feront en respectant les volumes ciculant et les périodes de récupérations pour les prélèvements uniques et répétés. - Les animaux subiront diverses types d’injection notamment lors de la phase d’induction avec la streptozotocine, molécule induisant le diabète, la phase de traitement, le test oral de tolérance au glucose, la mesure de l'éléctrocardioagramme et du débit de filtration glomérulaire. Les volumes d’administration respecteront les recommandations éthiques. -Les animaux seront stimulés au niveau des pattes arrières lors du test de sensibilité mécanique. Le nombre de mesures n'ira pas au delà de 5, avec une minutes de repos entre chaque mesure. Une phase d'habituation sans stimulation de 30 minutes sera prélalablement effectuée - Les animaux subiront des mise à jeun notamment avant le test de tolérance oral au glucose, la mesure du débit de filtration glomérulaire et l’euthanasie. - Les animaux seront isolés 2 à 18 heures lors de la mesure du débit de filtration glomérulaire et lors de la mise en cage à métabolisme. Enfin, lors de leur mise à mort, dans le but de récupérer leur cerveau, un prélèvement sanguin maximal sous anesthésie générale sera réalisé et les animaux seront perfusés avec de la saline et/ou de la formaline par injection intracardiaque sur coeur battant et la confirmation de la mort se fera par l’arrêt permanent de la circulation.
Impact sur les animaux
La molécule utilisée pour induire le diabète et les complications associées est particulièrement toxique et peut altérer l’état général de l’animal les quelques jours qui suivent l’injection. Une fois, l’état stabilisé il ne se détériore part au cours des 2 mois d'étude. Notre équipe SBEA ainsi que le personnel formé a mis en place la surveillance des signe cliniques afin d'anticiper la mort de l'animal et éviter sa souffrance prolongée et réaliser l'euthanasie dans les conditions éthiques. L’augmentation de la prise hydrique, de la production d'urine et des niveaux de glucose sanguins sont les caractéristiques du diabète. Le traitement testé sur ce modèle préclinique aura pour but d’améliorer leur diabète et les atteintes nerveuse et rénale. Aucun effet indésirables est attendu au cours de la phase de traitement . Aucun effet indésirable est attendu après le test de tolérance au glucose et les prélèvements de sang associés ou l’électrocardiogramme. L’analyse de la sensibilité mécanique au niveau des pattes peut induire un inconfort ou possiblement une douleur. La mesure de la fonction rénale nécessitant une anesthésie isoflurane et une injection intraveineuse a des conséquences sur la prise alimentaire et hydrique les heures suivant le réveil, modifie la vision dans le cas de l’injection au sinus rétro-orbitaire, ou la survie si l’animal ne répond pas bien à l’anesthésie. Enfin, la cage métabolique, où l’animal est isolé et dans une cage sans litière peut induire un stress et modifier le comportement de l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser la collecte d'organe nécessaire aux analyses qui permetrront de valider ou non l'efficacité des traitements testés.
Remplacement
Le diabète est une pathologie touchant de nombreux organes et la neuropathie et la néphropathie sont des conséquences de ce dérèglement multi organique qui se passe de façon séquentiel dans un ordre bien précis lors du développement de la maladie. Pour trouver un traitement efficace ciblant ces deux comorbidités, l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour mimer à la fois l'atteinte multi-organique et l'évolution de la pathologie au cours du temps. La culture de neurones et de cellules rénales peut être envisagée dans un premier temps et constitue un des axes de recherche et développement de la société. Cependant cette méthode, bien qu'elle puisse diminuer l'utilisation d'animaux à des fins de recherche, ne pourra pas se substituer à l'utilisation de ces derniers puisque les commorbidités citées sont la conséquence de ce déréglement multi-organique. L'utilisation de la streptozotocine pour induire le diabète peut être également remplacé par l'utilisation d'animaux spontanément diabétique grâce à des mutations génétiques et sont des modèles auxquels la société s'attarde dans ses axes de recherche et développement.
Réduction
Ce projet n’est pas le plus adapté en termes de réduction. En effet, pour le modèle de souris obèses puis injectées à la streptozotocine, un nombre important d’animaux doit être envisagé pour l’injection de streptozotocine puisqu’un taux de mortalité et d’absence de réponse est attendu. Cependant, nous optimisons le nombre d’animaux utilisé en proposant de réaliser toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie ou sa résolution le cas échéant sur un même animal. De plus, nous réduisone également le nombre d'animaux utilisé dans le groupe dit sain, non malade puisqu'aucune mortalité n'est attendu dans ce groupe.
Raffinement
En termes de raffinement, les animaux obèses sont hébergés par 3 ou par 4 pour respecter les normes d’hébergement compte-tenu du poids et puisque la souris est un animal social. De l’enrichissement est également ajouté dans les cages d’hébergement afin que la souris puisse y faire son nid. Suite à l’injection de streptozotocine, l’état physique des souris est monitoré et scoré 2 fois par jour les 14 jours suivant l’injection de streptozotocine, c’est-à-dire jusqu’à stabilisation du phénotype diabétique. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution saline est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Dans le cas d’atteintes sévères, l’animal est euthanasié. L’injection de solution saline en cas de déshydratation se fera selon les volumes d’injection saccepté éthiquement. Ces mêmes volumes seront utilisés lors de la phase de traitement.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien connu pour l'étude du diabète.
Anomalies rétiniennes dans le syndrome DYRK1A
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Modifiées pour reproduire le syndrome DYRK1A, elles subissent des imageries rétiniennes et une électrorétinographie sous anesthésie, avec pose d'électrodes, puis sont tuées avant réveil pour prélever cerveau et rétines. Le porteur présente les imageries comme sans contact et indique que la principale gêne tient au stress du transfert et à l'anesthésie. Il écarte le poisson zèbre, porteur de deux gènes proches, et conclut que la souris est l'espèce "la mieux adaptée".
Objectifs
Si l’augmentation d’expression d’un des gènes du chromosome 21 humain est considérée comme la cause de nombreux symptômes affectant les sujets atteints de trisomie 21, la diminution de son expression / de l'activité de la protéine codée par ce gène induit également des défauts de développement et de fonctionnement du système nerveux central. Le syndrome associé, initialement appelé MRD7, pour Retard Mental autosomal Dominant de type 7, a récemment été renommé syndrome DYRK1A. Il combine une déficience intellectuelle, une microcéphalie, des crises épileptiques et des troubles du spectre autistique. Trisomie 21 et syndrome DYRK1A sont également associés à des symptômes ophtalmologiques. Parmi eux, un épaississement rétinien a été observé chez les sujets trisomiques, et est retrouvé dans les modèles rongeurs. Aucune étude structurelle n’a encore été publiée en ce qui concerne les patients atteinst du syndrome DYRK1A, mais une pâleur du nerf optique a été rapportée. Elle pourrait être causée par un amincissement de la rétine, comme celui qui a été observé dans un modèle murin de la maladie. Dans ce dernier, une des deux copies du gène a été inactivée, ce qui conduit à une baisse d’expression de la protéine de 50%. Or chez les patients, on retrouve de nombreuses mutations ponctuelles n’affectant pas forcément le niveau d’expression de la protéine, ce qui peut influencer les symptômes – il y a de plus en plus d’indications que la quantité de protéine peut influencer sa répartition dans les cellules et/ou la répartition des protéines avec lesquelles elle interagit. Nous proposons donc d’étudier les conséquences de plusieurs mutations identifiées chez les patients, à travers la caractérisation ophtalmologique de modèles murins dans lesquels ces mutations ont été introduites.
Bénéfices attendus
Les données moléculaires disponibles pour certaines des mutations identifiées chez les patients atteints du syndrome DYRK1A laissent envisager des conséquences hétérogènes sur l’activité et/ou la stabilités des protéines mutées. Au niveau clinique, si nous mettons en évidence que ces différentes mutations conduisent à des changements rétiniens distincts et facilement détectables chez les patients, notamment à travers un examen rapide et non invasif (imagerie sans contact), on peut escompter une prédiction plus précise des conséquences de mutations nouvellement identifiées et donc une prise en charge adaptée plus précoce. Au niveau fondamental, disposer de données structurelles et fonctionnelles globales sur les rétines des différents modèles aidera à déterminer sur lesquels porter en premier nos efforts pour identifier l’impact sur les différentes populations neuronales de la rétine, une partie du système nerveux central dont la structure fine et régulière facilite les approches histologiques et fonctionnelles.
Procédures
La totalité des animaux (192) sera examiné par deux techniques d’imagerie rétinienne sans contact, la tomographie par cohérence optique (OCT) et le fond d’œil, qui sont complémentaires. Ces deux modalités seront pratiquées, après dilatation des pupilles (application d’une goutte de mydriatique par œil) sur une même anesthésie gazeuse (maximum de 15 minutes), destinée à obtenir l’immobilité durant l’examen. Deux tiers des animaux (128) seront examinés par électrorétinographie, qui permet d’évaluer la fonctionnalité de la rétine (durée de l’examen < 30 minutes). Après dilatation de la pupille, les animaux seront endormis par une injection intrapéritonéale d’anesthésique. Des électrodes de référence sous-cutanées seront insérées au niveau des joues et de la base de la queue, et des électrodes DTL (fins filaments souples conducteurs) placées sur les cornées. Pour les différents examens, les animaux seront placés sur des coussins chauffants pour maintenir leur température corporelle, et du gel ophtalmique appliquée sur les cornées pour les maintenir hydratée.
Impact sur les animaux
Les deux modalités d’imagerie, toutes deux sans contact, sont réalisées sur une courte anesthésie gazeuse (15 minutes au maximum), utilisée uniquement afin d’obtenir l’immobilité de l’animal. La seule nuisance en découlant est donc le stress lié au transfert de la souris de sa cage d’hébergement à la cage d’induction et l’exposition au gaz anesthésiant. L’euthanasie étant effectuée avant le réveil, la seule nuisance associée à l’électrorétinographie découle également de l’anesthésie (contention et injection intra-péritonéale).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort avant leur sortie d’anesthésie, soit à l’issue de l’imagerie (64), soit à l’issu de l’électrorétinographie (128), pour prélever cerveau et rétines pour les études histologiques ou moléculaires.
Remplacement
Il est impossible à l’heure actuelle d’obtenir une rétine complète in vitro. Obtenir des données structurelles et fonctionnelles facilement transposables à la clinique ne peut se faire que sur des modèles vertébrés, l’œil de invertébrés étant très différent dans son organisation. Le poisson zèbre ne peut être considéré ici, car il existe chez cette espèce deux orthologues de notre gène d’intérêt, ce qui rend délicat de reproduire l’impact d’une perte d’une copie ou de mutations ponctuelles. Le modèle murin hétérozygote est par contre bien caractérisé et reproduit de nombreux symptômes des patients atteints du syndrome DYRK1A. De plus, plusieurs lignées portant des mutations ponctuelles sont d’ores et déjà disponibles. La souris nous semble donc l’animal modèle le mieux adapté pour mener à bien le présent projet.
Réduction
Au cours d’une étude précédente portant sur des groupes de 12 mâles, nous avions constaté, chez les souris n’ayant qu’une copie fonctionnelle de notre gène d’intérêt, un net amincissement de la rétine ainsi qu’une réduction du nombre des vaisseaux sanguins, et un léger allongement des segments externes, effet miroir de ce que nous avons observé chez des souris ayant trois copies de ce gène. Un effectif de 12 mâles et 12 femelles par génotype permettrait de confirmer ces observations en ayant autant de femelles que de mâles pour chacun des génotypes, et de pouvoir détecter des variations d’amplitude des différents effets entre mutants. Nous n’avons encore effectué aucun enregistrement avec l’équipement électrorétinographique qui vient d’être récupéré auprès d’un autre laboratoire. En absence de données nous permettant d’estimer la dispersion des mesures dans nos conditions d’enregistrement, nous nous orientons vers les effectifs classiquement utilisés pour les études électrorétinographiques, avec 8 souris par génotype et par sexe. Afin de tirer au mieux parti des données acquises, nous utiliserons un test statistique permettant de considérer séparément les mesures obtenues sur les deux yeux d’un même animal, plutôt que leur moyenne, afin d'augmenter la puissance statistique.
Raffinement
Les animaux seront stabulés avec l’enrichissement classiquement utilisé dans notre animalerie (matériel de nidification). Les tests consistent en deux modalités d’imagerie non invasive (OCT et fond d’œil), ainsi que des enregistrements électrorétinographiques. Les deux premières procédures seront effectuées sur une même anesthésie gazeuse (15 minutes au maximum) afin d’obtenir l’immobilité de l’animal. Du gel ophtalmologique sera appliqué sur les deux cornées dès que l’animal sera endormi, ainsi qu’à la fin de la séance d’imagerie, afin d’éviter tout desséchement cornéen. L’animal sera placé sur un coussin chauffant pendant l’imagerie et jusqu’à son réveil, qui intervient très rapidement après une anesthésie courte comme ici. L’électrorétinographie nécessite une anesthésie plus longue et sans mouvements oculaires pouvant nuire à la stabilité des enregistrements, comme parfois observés sous isoflurane. Les animaux seront donc anesthésiés à travers l’injection intra-péritonéal d’un mélange de kétamine et de médétomidine, et maintenus sur un coussin chauffant avec du gel ophtalmique appliqué sur les deux cornées. Des électrodes DTL (fins filaments souples) seront préférés aux anneaux d’or souvent utilisés chez l’animal. Les animaux seront euthanasiés avant leur réveil par dislocation cervicale soit à la fin de l’imagerie (4 animaux par génotype et par sexe), soit après les enregistrements électrorétinographiques (8 animaux par génotype et par sexe).
Choix des espèces
Obtenir des données structurelles et fonctionnelles sur la rétine, facilement transposables à la clinique humaine, ne peut se faire que sur des modèles vertébrés, l’œil de invertébrés étant très différent dans son organisation. Parmi les espèces dans lesquelles l’inactivation ou la mutation ponctuelle d’un gène peuvent être facilement obtenues, le poisson zèbre ne peut être retenu, car il possède deux autres gènes très proches du gène d’intérêt, rendant délicat la modélisation d’une perte de copie ou d’une mutation ponctuelle de ce gène. Le modèle murin hétérozygote est par contre bien caractérisé et reproduit de nombreux symptômes des patients atteints du syndrome DYRK1A. Plusieurs lignées avec des mutations ponctuelles sont déjà disponibles. La souris nous semble donc l’animal modèle le mieux adapté pour mener à bien le présent projet. Les souris devant être sacrifiées à 8 semaines pour des prélèvements histologiques, l’évaluation ophtalmologique sera réalisée au cours de la 8ème semaine, les animaux étant euthanasiés avant le réveil de l’anesthésie. A cet âge, la morphologie de la rétine est bien établie et les réponses électrorétinographiques stables.
Rôle des macrophages dans le dévelopement et l’homeostasie de la glande surrénale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 086 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Elles reçoivent un inhibiteur de macrophages dans la nourriture ou l'eau de boisson et des injections intrapéritonéales, avant mise à mort pour prélever les glandes surrénales, afin d'étudier le rôle des macrophages dans cet organe. Le porteur indique que les traitements oraux n'induisent pas d'effet indésirable en eux-mêmes mais qu'une dérégulation de la surrénale pourrait provoquer des changements de poids ou de l'hypertension. Il affirme d'abord chercher à remplacer les manipulations in vivo par de la culture cellulaire, puis conclut à la "nécessité" de recourir aux souris.
Objectifs
La glande surrénale fait partie des organes endocriniens dont le bon fonctionnement est clé pour la régulation de l’homéostasie de l’organisme. Bien que l’activité endocrine du cortex de la surrénale repose majoritairement sur l’axe hypothalamo hypophysaire et le système Rénine/Angiotensine, d’autres modulations de l’activité endocrine, notamment par des cellules du microenvironnement immunitaire, ont été décrites. En 1984, de nombreuses recherches ont montré que les macrophages résident généralement dans les organes endocriniens, y compris la glande surrénale. Postérieurement, des études dans le pancréas ou dans le testicule ont mis en evidence que les cellules endocrines avaient besoin de la fonction trophique des macrophages pour assurer le maintien de la structure tissulaire et bon fonctionnement de l’organe. En effet, il semblerait exister une symbiose entre les cellules endocrines et les macrophages, chacun influençant profondément l'un l'autre. Cependant, la fonction des macrophages dans la glande surrénale est encore mal comprise. Dans ce projet, nous visons donc à étudier le rôle des macrophages dans l’homéostasie de la glande surrénale et leur association potentielle au dévelopement des maladies surrénaliennes.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet nous permettra de démontrer un rôle global encore méconnu des macrophages dans le contrôle de la maturation et de l'homéostasie du cortex surrénalien. De même, notre projet envisage la réalisation du premier atlas haute résolution de toutes les cellules surrénales, y compris leur microenvironnement, grâce à des techniques d’analyse cellulaire à grande échelle. Tout cela nous permettra d’avoir un aperçu complet du rôle des macrophages dans le cortex surrénalien normal, et ouvrira la voie à des études futures visant à comprendre leur rôle potentiel dans les maladies surrénaliennes.
Procédures
Les souris seront soumises aux interventions suivantes : - Alimentation supplémentée avec ou sans inhibiteur des macrophages : les souris, mâles et femelles confondus, âgées entre 3 semaines et 6 mois seront nourris une seule fois avec de la nourriture formulée avec l’inhibiteur des macrophages pendant différents temps (allant de 1 semaine de traitement à 6 mois) selon les expériences scientifiques et les analyses pour lesquelles elles seront utilisées. - Traitement avec un agent permettant de mesurer la prolifération cellulaire dans l’eau de boisson : les souris, mâles et femelles confondus, âgées de 8 semaines, seront traitées une seule fois oralement via l’eau de boisson avec le composant permettant de mesurer la prolifération cellulaire pendant 1 semaine. Cet agent est largement utilisé chez la souris pour étudier la prolifération cellulaire. - Traitement avec du KCl (chlorure de potassium) dans l’eau de boisson : les souris, mâles et femelles confondus, âgées de 8 semaines, seront traitées une seule fois oralement via l’eau de boisson avec du KCl pendant 24 heures. Cet agent est largement utilisé chez la souris pour faire des tests de réponse hormonale. - Traitement avec un agent permettant de stimuler la sécrétion hormonale dans l’eau de boisson : afin d’induire une atrophie de la glande surrénale, les souris, mâles et femelles confondus, âgées de 8 semaines, seront traitées une seule fois oralement via l’eau de boisson avec le composant permettant de stimuler la sécrétion hormonale pendant 1 semaine. - Injections intrapéritonéales : cette technique ne nécessite pas d’anesthésie préalable. Les souris (mâles et femelles confondus, âgées de 8 semaines), seront injectées soit avec l’agent permettant de mesurer la prolifération cellulaire, l’agent permettant d’induire l’expression d’un système de marquage cellulaire ou l’agent permettant de stimuler la sécrétion hormonale à différents temps. Ces injections seront réalisées au maximum deux fois en combinaison avec une ou plusieurs procédures décrites auparavant.
Impact sur les animaux
Les traitements réalisés par voie orale (formulées dans la nourriture ou dans de l’eau de boisson) n’induisent pas d’effets indésirables/délétères sur les animaux par eux-mêmes ni par la méthode d’administration. Cependant, on pourrait observer des effets indésirables associées à une possible dérégulation de la glande surrénale en absence de macrophages ou suite aux différents traitements, tels que des changements de poids ou de l’hypertension. En cas d’observation de ces effets indésirables sur les animaux, les traitements seront vite arrêtés et un retour à des conditions normales/physiologiques devrait avoir lieu dans les heures suivantes. Pourtant, on ne prévoit pas une durée de plus de 3 jours pour ces effets indésirables. De même, bien que de courte durée (quelques secondes), la contention et les injections intrapéritonéales peuvent induire un stress sur les animaux.
Devenir
Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses ciblant le rôle des macrophages dans les divers processus impliqués dans le contrôle de l’activité endocrine de la surrénale.
Remplacement
Afin d’eviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux sacrifiés sans manipulation préalable. Cette technique est un bon modèle alternatif pour tester des facteurs clés pouvant participer à la communication entre les macrophages et les cellules endocrines. Cependant, les processus de differentiation et mort cellulaire, production hormonale, réponse immunitaire ou renouvellement tissulaire sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que la glande surrénale est un tissu complexe composé de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour générer une régulation hormonale correcte. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.
Réduction
Dans l’optique de réduire de nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultannées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour une extraction d’ARN pour une analyse de qPCR et l’autre pour des analyses d’immunohistochimie. De même, le sang des animaux sacrifiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimun nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 8 souris. Pour les expériences impliquant le dosage hormonal, et compte-tenu de la variabilité intrinsèque de ces analyses, nous avons estimé à 12 le nombre d’animaux minimum nécessaires par groupe. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Les animaux nourris avec de la nourriture formulée avec l’agent pharmacologique inhibiteur des macrophages, seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, jusqu’à leur mise à mort. Les points limites de nos expériences sont déterminés en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Ainsi, les expériences seront arrêtées suite à la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Pour tous les signes indicateurs de douleurs (activité réduite, perte de poids, automutilation…) nous suivrons une échelle de points limites stricte.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’endocrinologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant des altérations dans les glandes surrénales, mimant les pathologies humaines. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. La maturation de la glande surrénale a lieu entre 3 et 6 semaines après la naissance. Pour cela, nous allons déterminer le rôle des macrophages pendant la maturation de la glande surrénale chez des souris agées de 3 semaines (souris jeunes non sevrées). Une fois mature, la glande surrénale, est renouvellée constamment pour s’assurer du bon fonctionnnement tout au long de sa vie. Dans le but de caractériser le rôle des macrophages dans le renouvellement et la production hormonale de la glande surrénale, des souris adultes âgées de 2 à 6 mois seront utilisés dans ce projet.
Évaluation par imagerie moléculaire d’une stratégie thérapeutique à base d’apeline-13 dans un modèle d’ischémie cérébrale murin d’âge avancé
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
60 rats âgés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, 48 étant classés en souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par chirurgie, suivi d'injections d'apeline, de jusqu'à sept prélèvements sanguins, d'imageries répétées et de tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur indique que l'infarctus peut entraîner une perte de mobilité, des troubles de la déglutition avec risque d'asphyxie et de mort, et une perte de poids. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne prend en compte l'ensemble de ces paramètres et décrit le rat comme donnant les déficits "les plus comparables" à ceux de l'humain.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) constitue la première cause d’handicap acquis chez l’homme, la 2ème cause de démence et la 3ème cause de mortalité en France. Elle est causée par l’obstruction d’une artère cérébrale par un caillot de sang (=ischémie). Cette occlusion réduit de manière conséquente l'apport en oxygène et en nutriments des cellules cérébrales et engendre ainsi une crise énergétique. Cette dernière est à l'origine d'une destruction rapide et définitive d’une zone du cerveau. Malgré l’avancée des traitements permettant la désobstruction de ces vaisseaux sanguins cérébraux, 50% des patients traités gardent des séquelles aussi bien motrices que cognitives. Bien qu'une zone cérébrale soit définitivement détruite suite à l'ischémie, la zone se trouvant à sa périphérie peut encore être secourue. Cette zone demeure sensible aux changements tels que la création de nouveaux vaisseaux ou la réorganisation des neurones ce sont les mécanismes de plasticité vasculaire et neuronale qui sont le pivot de la récupération pos-AVC. Suite à une ischémie, ces différents mécanismes compensatoires sont activés, cependant ils s'avèrent fréquemment insuffisants pour assurer une reperfusion efficace. C'est pourquoi, plusieurs pistes expérimentales sont étudiées pour améliorer la récupération post-AVC. Parmi ces pistes, le couple Apeline (un peptide)/APJ (son récepteur) font l'objet d'un intérêt croissant. Ce couple joue un rôle important dans le système cardiovasculaire, le métabolisme énergétique, et l'angiogenèse (création de nouveau vaisseaux sanguins) aussi bien physiologique que tumorale. La littérature récente, suggère que ce couple de molécule aurait un effet neuroprotecteur après une lésion aigue d’ischémie-reperfusion cérébrale. Cependant, ces études se limitent à une administration unique d’Apeline le jour de l’ischémie et les bénéfices comportementaux ne sont évalués qu'à très court terme.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel neuroprotecteur d'injections répétées d’Apeline dans un contexte d’accident vasculaire cérébral chez un modèle murin. À ce jour, ceci n’a jamais été rapporté dans la littérature. Nous suivrons églement la récupération fonctionnelle ainsi que cognitive des animaux. En effet, les troubles cognitifs induits par l'AVC ont des répercussions négatives sur la qualité de vie du patient, sur le taux de mortalité dans les 4 années suivant l’AVC, et représentent un impact médicosocial considérable pour la société. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de réduire ces troubles cognitifs. L’Apeline est un peptide dont l’effet neuroprotecteur est décrit en per- opératoire. Néanmoins, dans ce modèle, les conséquences neurovasculaires de l’administration d’apeline sont encore très peu décrites. Ce projet à donc pour objectif de mettre en évidence l’intérêt d’un traitement répété sur une durée plus longue et ainsi d’évaluer l’impact de ce traitement sur la réduction des altérations moléculaires, motrices et cognitives après la survenue d’un AVC.
Procédures
Toutes les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie (isoflurane ou sévoflurane). Les animaux seront soumis à une chirurgie (acte chirurgical d'environ 30 minutes) visant à induire l'ischémie cérébrale. Les animaux seront soumis à des injections dans le but de leur administrer le traitement (de 1 à 3 injections selon le groupe). Les animaux seront soumis à un maximum de 7 prélèvements sanguins à la queue lorsqu'ils seront endormis. Les tests comportementaux seront réalisés à J1, J7 et J14 de manière à évaluer la sévérité de la lésion ainsi que la récupération post-AVC. Ces tests durent de 15 à 20 minutes par animal lors de chaque session de test. Les imageries auront lieu à J2, J3, J8 et J17 post-ischémie et devraient durer 30 minutes chacune. Des frottis vaginaux seront effectués à J0 et J17.
Impact sur les animaux
Ce projet nécessite des prélèvements sanguins itératifs, de petits volumes, qui seront effectués suite à la pause d'un cathéter au niveau de la veine caudale et pourraient engendrer de petites lésions au niveau de la queue ainsi qu'une douleur au moment de la piqure. La première nuisance est l'acte chirurgical en soi. Par la suite, la chirurgie va avoir pour conséquence de générer un infarctus cérébral conduisant à une perte de mobilité plus ou moins transitoire et d’intensité variable. De même, la zone incisée puis suturée engendre une plaie cutanée. Durant les premières heures, l'animal ne sera peut-être pas capable de boire ou manger, car il peut présenter des troubles de la déglutition, entrainant fausse route, asphyxie et décès. Une perte de poids peut être observée dans les jours suivants la chirurgie. Les imageries sont réalisées relativement tôt après la chirurgie et de manière répétée au cours du protocole pouvant engendrer un stress pour l’animal. L’anesthésie prolongée lors de la chirurgie et des imageries peut induire un risque d’hypothermie. Plusieurs injections intraveineuses de radiotraceurs dans les veines caudales seront réalisées et pourraient engendrer une douleur au niveau de la zone d'injection. Des frottis vaginaux seront effectués à J0 et J17,et pourraient être à l'origine de légère gènes au niveau du vagin suite aux pipetages répétés. Enfin, les animaux seront soumis à divers tests comportementaux, sensorimoteurs et cognitifs, au cours du protocole qui pourrait engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après la dernière imagerie à J17 pour obtenir des tissus cérébraux destinés à des analyses histologiques et de biologie moléculaire.
Remplacement
L'étude de l'effet d'un médicament sur les suites d'un accident vasculaire cérébrale (AVC), nécessite de prendre en compte l'étude des lésions cérébrales et les impacts moteurs et sensoriels qui en découlent. De nos jours, aucun modèle in vitro ne permet de prendre en compte l'ensemble de ces paramètres. C'est pourquoi, nous avons choisi un modèle d'obstruction temporaire de l'artère cérébrale moyenne chez le rat, car en plus d'être bien d'écrit dans la littérature, il permet d'obtenir les déficits les plus comparables à ceux observés chez l'Homme. De plus, cette espèce permet l'obtention de prélèvements sanguins répétés avec un volume suffisant sans impacter le bien être de l'animal.
Réduction
Cette étude nous permettra d’évaluer s’il existe ou non, un effet du traitement répété à l’Apeline sur la réduction du volume final de l’infarctus/réduction des troubles cognitifs dû à la survenue d’un AVC. Nous prévoyons un maximum de 60 rats pour cette procédure. Pour évaluer le modèle AVC chez la rat au cours du temps nous utiliserons l’imagerie moléculaire in vivo, technique permettant des études non invasives, longitudinales, multiparamétriques et quantitatives, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux nécessaire. Le modèle d'AVC chez le rongeur a des impacts physiologiques et fonctionnels interindividuels très variés. Dans notre étude nous évaluerons les effets d’un traitement précoce d’Apeline sur 3 jours sur la récupération au cours des 2 premières semaines post-AVC. Nous nous baserons sur notre expérience du modèle chez le rat pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant pour prendre en compte la variabilité interindividuelle et utiliser différentes méthodes d'analyses moléculaires.
Raffinement
Les chirurgies, prélèvements sanguins, les injections intraveineuse et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l'animal ainsi que son réveil rapide. Les rats anesthésiés seront toujours placés sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées, en plus de l’anesthésie générale, d’une analgésie locale et/ou générale par injection sous cutanée de morphinique. Pendant une heure après la chirurgie, une surveillance accrue des animaux sera mise en place, pour éviter toutes complications post-opératoires. L’accès à la nourriture et à l’eau ne sera permis qu’une fois que l’animal sera parfaitement réveillé pour éviter les problèmes de fausse route. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour la prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, rat prostré, en retrait, ou une perte de poids, par exemple, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieure à 20% du poids initial, l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance inutile. Les conditions d’hébergement sont classiques et comprennent des animaux hébergés en groupe, avec accès à la nourriture et l’eau sans restriction . Les cages seront enrichies de tunnels et de la nourriture humidifiée sera placée dans la cage pour faciliter l'accès aux croquettes (rendu plus difficile en raison des séquelles motrices) mais aussi contribuer à la réhydratation. En cas de mort du congénère, l'animal survivant pourra être associé à un autre animal pour éviter la sollitude au cours du protocole.
Choix des espèces
Le rat présente des similitudes anatomo-fonctionelles avec l'être humain au niveau du système vasculaire cérébral (contrairement à la souris). De plus, les mécanismes cellulaires sous-jacents à la mort neuronale, induit par l'AVC chez le rat sont également proches de ce qui a été observé chez le patient. Il permet, en outre, à partir de tests comportementaux ou moléculaires de vérifier l'efficacité de nouvelles stratégies de rééducation dans des études précliniques. De part la difficulté du modèle AVC et les nombreuses pertes qu'il peut engendrer, aucune étude n'a, à notre connaissance, adapté ce modèle à des rats plus âgés. Pourtant, l'incidence de l'AVC augmente avec l'âge et l'apparition de nombreuses commorbidités. Ainsi, nous avons choisi de tester un traitement pharmacologique chez des rats plus âgés, de 6 à 8 mois, permettant d'augmenter la transférabilité de notre étude à la clinique. Pour se faire, des rats femelles âgées de 6 à 8 mois seront utilisées dans cette étude et auront atteint un poids compris entre 300g et 400g (stable depuis le 4ème mois).
Evaluation de composés pour diminuer le choc anaphylactique lié à des allergies alimentaires dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
8 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sensibilisées à un allergène puis soumises à un déclenchement provoquant une réaction allergique pouvant devenir systémique, elles reçoivent des composés dont la voie et la fréquence d'administration sont fixées "selon le choix du sponsor", avec prélèvements de sang et de fèces. Le projet, mené pour des partenaires commerciaux, vise à évaluer des candidats médicaments contre le choc anaphylactique. Le porteur affirme que la culture cellulaire ne peut se substituer à la souris pour reproduire les mécanismes de l'allergie alimentaire.
Objectifs
Il n'existe aucun traitement curatif de l'allergie alimentaire, seuls les symptômes sont pris en charge. Cette pathologie peut affecter la qualité́ de vie des patients mais également avoir des conséquences graves dans le cas de choc anaphylactique ou œdème de Quincke. Le choc anaphylactique est un réaction immunitaire allergique grave en réponse à l’exposition à un allergène. Cet allergène peut venir des aliments, de certains médicaments, d’une piqûre d’insecte, du contact avec du latex, voire d’un effort physique intense après ingestion d’un aliment légèrement allergène. Si le risque de décès par suite du choc anaphylactique existe, il demeure rare, de l’ordre de 0,3 %. Cette réaction peut atteindre le système cardiaque, respiratoire, cutané, gastro-intestinal, entrainant notamment des difficultés respiratoires, des réactions cutanées, des nausées/diarrhées, une baisse de la tension artérielle et possiblement la mort. La recherche menée ici a pour objectif de tester de futurs candidats médicaments ou substituts alimentaires qui pourront permettre de mieux prendre en charge cette pathologie et de la traiter de façon durable. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles expérimentaux permettant une meilleure compréhension et analyse des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement de ces maladies inflammatoires ainsi que l'efficacité́ de nouvelles molécules thérapeutiques visant à̀ améliorer la santé des patients. Pour cela nous proposons plusieurs modèles de sensibilisation présentant comme allergène : l'ovalbumine, la bétalactoglobuline bovine (BLG), des extraits contenant de l’arachide, du gluten, du blé, du sésame, des fruits à coques, du sésame, des coquillages, des crustacés, des poissons (liste non exhaustive). La molécule à tester sera administrée par différentes voies recréant les diverses possibilités d’administration médicamenteuses chez l’Homme et selon la voie d'administration conseillée pour ce composé.
Bénéfices attendus
Les modèles animaux d'allergie alimentaire utilisés dans cette étude sont pertinents pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le processus inflammatoire de l'allergie alimentaire afin de répondre à un besoin important de santé, celui des conséquences graves dans le cas de choc anaphylactique ou œdème de Quincke pouvant porter atteinte à la vie des patients souffrants d'allergies alimentaires.
Procédures
Dans le but de réaliser une réaction allergique plus importante un jeûne de 4 heures pourra être réalisé avant chaque sensibilisation et/ou lors du challenge final. La molécule à tester pourra être administrée dans l’eau de boisson, dans l’alimentation, par gavage, inhalation, injection intra péritonéale, intravasculaire, sous-cutanée, intradermique ou intramusculaire selon le choix du sponsor. La fréquence de l'administration est variable en fonction de la demande de nos partenaires. Les animaux seront pesés quotidiennement. Au cours de l'étude, le sang sera prélevé en respectant un volume maximum de 7,5% du volume sanguin circulant pour une période de récupération de 7 jours. Les fécès pourront également être prélevés maximum 1 fois par semaine au cours de l’étude. D'autres prélèvements seront possibles en fonction des demandes du sponsor. Des relevés de température rectale ainsi qu'un scoring clinique pourront être effectués quotidiennement pour surveiller l’inconfort des animaux. Les animaux sont ensuite anesthésiés sans réveil et le sang total est prélevé au niveau de l'aorte abdominale ainsi que d'autres organes.
Impact sur les animaux
Le principal effet indésirable est le développement d'une réaction inflammatoire à un niveau local et possiblement systémique en fin d'étude, lors du challenge.
Devenir
Tous les animaux du protocole sont euthanasiés à la fin et des prélèvements sont réalisés pour l'analyse.
Remplacement
Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude des allergies alimentaires. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.
Réduction
Dans le respect de la règle des 3R nous cherchons à̀ : - réduire le nombre des animaux utilisés en utilisant un nombre très proche du nombre minimal de 6 animaux nécessaire à une étude statistique. Basé sur la bibliographie et notre précédente expérience du modèle le nombre de 10 animaux permet de répondre à la fois à l’hétérogénéité et la variabilité individuelle tout en respectant la puissance statistique et la nécessité de réduire les animaux.
Raffinement
Dans le respect de la règle des 3R nous cherchons à̀ : - raffiner en apportant du soin et une observance accrue aux animaux en souffrance ou en angoisse suite à l'induction des maladies. Ces pathologies étant basées sur l'inflammation, un traitement pharmacologique visant à̀ réduire la souffrance de l'animal ne pourra être envisagé sans compromettre les résultats de l'étude. L'état de santé des animaux sera évalué́ quotidiennement selon des critères d'apparence physique et comportementaux selon le tableau détaillé́ dans le paragraphe. Les souris sont hébergées selon les conditions de la règlementation 2010/63/UE en unités individuelles ventilées de type III ou IV avec enrichissement de l’environnement (composants de nidification et igloo). L'enrichissement pourra être augmenté si nécessaire.
Choix des espèces
Les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'allergie alimentaire sont complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces évènements par une approche substitutive de culture cellulaire. La souris est largement décrite dans la littérature pour être une espèce de choix dans ce modèle. Les allergies alimentaires pouvant survenir à tout moment de la vie d'un individu, les souris seront préférentiellement utilisées à l'âge adulte (8-12 semaines) au début des investigations, car elles présentent un système immunitaire mature. Cependant selon la population ciblée, l’âge pourra être laissé à l’appréciation du sponsor, les animaux pourront être plus jeune ou plus âgés. L'âge minimal étant de 3 semaines et l'âge maximal sera déterminé par l'âge de la population ciblé et peut être de 3 ans.
Développement d’un modèle de migraine à l’aide d’injections répétées d’isosorbide dinitrate (ISDN) chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1 994 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une injection quotidienne d'isosorbide dinitrate pendant cinq jours pour induire une migraine chronique, puis subissent des tests répétés de sensibilité douloureuse tactile de la face et de la patte et de sensibilité thermique de la patte. Le porteur indique que les animaux restent douloureux et sont pour cette raison tués dès la fin de l'expérience. Il conclut que l'étude d'un analgésique doit se faire sur l'animal vigile, seule option selon lui pour restituer les composantes sensorielle et émotionnelle de la douleur.
Objectifs
La migraine est un trouble de la douleur neurologique. Elle a un impact sur la santé mais aussi socio-économique. Selon des rapports épidémiologiques, la migraine touche 1 personne sur 10 dans le monde et son incidence continue d'augmenter (2017). La migraine était la sixième maladie la plus courante parmi 328 maladies et méfaits. En plus des céphalées, les migraineux présentent d’autres symptômes comme des nausées, de la fatigue, une photo et/ou phonophobie et des allodynies mécaniques et thermiques. L’allodynie est un stimulus normalement non douloureux ressentie comme douloureux. Il est particulièrement ressenti au niveau de la face des patients. Les traitements médicamenteux actuelles sont pas sans effets secondaires. De plus, certains patients répondent mal à ces traitements. Il est donc important de développer de nouveaux traitements. Pour cela, nous souhaitons mettre au point un modèle de douleur migraineuse induit par injection intrapéritonéale répétée d’isosorbide dinitrate. Ce modèle, décrit dans la littérature, permet de montrer les mêmes symptômes qu’une personne migraineuse (allodynie thermique et mécanique). De plus la physiologie de l’animal est impactée de la même manière que chez l’homme. Dans le cadre de ce travail, nous souhaitons donc mettre au point ce modèle et tester la détection d’allodynie mécanique et thermique. Dans un second temps, nous testerons la réversion de l’allodynie par une molécule de référence.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la mise au point d’un modèle fiable et reproductible. Ce modèle pourra servir à la mise au point de nouveaux traitements afin de proposer une meilleure prise en charge poiur le patient. La caractérisation de ce modèle par de nombreux tests pourra donner lieu à un poster dans le cadre d’un congrès afin de partager la connaissance du modèle.
Procédures
Les animaux subissent 1 injection intrapéritonéale par jour pendant 5 jours (30 sec pour injection). Selon les procédures ils peuvent être soumis à des mesures de sensibilité douloureuse tactile (face, patte), de mesure de sensibilité thermique (patte). Ces tests durent moins d’une minute chacun et sont répétés durant une cinétique de 5 points de mesures (15 min minimum de repos entre chaque). Ces animaux pourront recevoir une molécule de références selon une voie d’administration courantes (Intrapéritonéale, gavage orale, sous-cutanée ; temps d'injection de 30sec maximum) afin de tester la réversion de la sensibilité à la douleur.
Impact sur les animaux
Les nuisances que vont subir les animaux sont les injections répétées d’isosorbide dinitrate en intrapéritonéale (1 fois par jour pendant 5 jours). Les tests sont : des stimulations mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation douloureuse est stoppée dès réaction de l’animal. Cette opération est réalisée au maximum 2 fois par jour de D0-D5. Une cinétique de test pourra être réalisée allant jusqu’à 5 points de mesures espacés de 15min minimum. Lors de ce test les animaux sont isolés dans un compartiment en plexiglass ou dans un gant pour la stimulation de la face, le temps de la cinétique. Des traitements en intrapéritonéale, sous-cutanée ou gavage orale pourront être réalisés afin de tester la réversion par la pharmacologie de référence (injection rapide).
Devenir
L’ensemble des animaux sont mis à mort. Le développement du modèle agit sur les mécanismes inflammatoires. Il est donc difficile de connaitre l’impact neurophysiologique sur d’autres modèles utilisés au sein du laboratoire. De plus, les animaux ont un modèle de migraine chronique. Ils restent donc douloureux. Pour l’ensemble de ces raisons, ils sont mis à mort dès la fin de l’expérience.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon la définition officielle, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles. Cet effectif par groupe sera confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance. A la fin de la procédure 1, le nombre d’animaux pourra être réajusté en fonction des résultats.
Raffinement
De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique, papier kraft et briquettes en bois à ronger). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour. Pour les tests, des cut-off (valeur maximale de stimulation) ont été fixé afin de limiter la douleur. De l’habituation aux tests/contention est faite afin de limiter le stress.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein de la structure. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie récemment et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés seront des rats adolescents. Nous garderons les animaux environ 2 semaines. Nous ne souhaitons pas avoir des animaux trop gros afin de pouvoir réaliser les tests sereinement. De plus, les crises de migraines chez l’homme sont souvent intensifiées à la période de l’adolescence avec les changements hormonaux.
Rôle des récepteurs GPVI et GPIbalpha dans les fonctions des plaquettes sanguines
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
288 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ces souris, modifiées pour exprimer des récepteurs plaquettaires humains, reçoivent une injection d'anticorps puis un prélèvement de sang terminal à l'aorte, pour tester deux approches contre la thrombose artérielle. Le porteur indique que l'anesthésie peut perturber la respiration et que l'injection peut provoquer un saignement au point d'injection. Il décrit l'étape sur sang de souris comme un préalable "nécessaire" avant de passer aux essais in vivo.
Objectifs
Lorsqu'on se blesse, notre corps a un système pour arrêter les saignements, appelé hémostase. Les plaquettes sanguines jouent un rôle important dans ce processus. Lorsqu'un vaisseau sanguin est endommagé, les plaquettes se collent au vaisseau et ensemble, s'activent et forment une sorte de bouchon qui arrête le saignement. Cependant, ce processus peut également se produire de manière exagérée dans les artères malades, entraînant une thrombose artérielle qui désigne ainsi la formation d’un caillot sanguin dans les vaisseaux sanguins. Cela peut causer des problèmes graves tels qu'un accident vasculaire cérébral (un caillot au niveau du cerveau). Actuellement, il existe trois classes de médicaments utilisés en clinique pour traiter la thrombose artérielle, mais ils ont comme effet secondaire d'augmenter le risque de saignement. Dans ce projet, nous souhaitons tester deux nouvelles approches thérapeutiques pour réduire la formation de caillot. Elles consistent à cibler spécifiquement des récepteurs avec des anticorps, en utilisant des souris dans lesquelles ces récepteurs ont été remplacés par leurs équivalents humains. En utilisant ces modèles de souris spécialement conçus, nous espérons découvrir de nouvelles options de traitement pour prévenir la formation de thrombose sans augmenter le risque de saignement. Cela pourrait ouvrir la voie à de nouveaux médicaments plus efficaces et plus sûrs pour les patients.
Bénéfices attendus
L'objectif est de trouver des traitements antiplaquettaires qui soient à la fois efficaces pour prévenir les caillots, mais qui aient également moins de risques de provoquer des saignements, ce qui pourrait être le cas de nos anticorps . Cela pourrait aider à améliorer le traitement des patients atteints de thrombose artérielle et à leur offrir des options thérapeutiques plus sûres et efficaces.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection (animal anesthésié) qui prend environ 1 minute. Après l’injection, il faudra attendre environs 10 minutes pour que celle-ci fasse effet et après le prélèvement de sang terminal (animal anesthésié) prend quant à lui environ 10 minutes. Ainsi, la durée totale de la procédure d’injection et de prélèvement est d’environ 20 minutes.
Impact sur les animaux
Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Une autre est le risque de saignement au site d’incision lors du prélèvement de sang. Enfin, l’injection des anticorps anti-GPIbalpha et de l’antiGPVI aux souris pourrait entrainer un saignement au site d’injection.
Devenir
Le prélèvement à l’aorte est un prélèvement terminal car la quantité de sang prélevée est très importante donc il est nécessaire après prélèvement de mettre les animaux à mort.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’anticorps spécifique sur la thrombose artérielle. C’est un processus complexes impliquant l’adhérence, l’activation et l’agrégation des plaquettes. Nous avons besoin de faire nos tests sur du sang de souris pour vérifier l’efficacité de nos approches thérapeutiques avant de pouvoir passer à des études in vivo chez la souris
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 16 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées. Nous avons ajouté des matériaux tels que des carrés de cellulose, des bâtonnets de coton et des morceaux de papier froissé pour qu'ils puissent organiser leur environnement comme ils le souhaitent. Nous avons également veillé à ce qu'ils ne se sentent pas seuls en les plaçant par groupes de 2 à 5 dans chaque cage. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées au maximum afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure). De plus, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi de limiter la souffrance et l’inconfort de l’animal. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entraîné. Les procédures sont sans réveil et l’animal sera anesthésié pendant la totalité des procédures.
Choix des espèces
L’utilisation de sang de souris pour évaluer la formation de caillot sanguin dans un contexte simplifié (in vitro) est un modèle bien maitrisé au sein du laboratoire et qui permet une évaluation précise de la formation d’un thrombus. Nous souhaitons aller vers le développement clinique d’anticorps dirigés contre nos récepteurs d’intérêts. Ainsi, la première étape consiste à étudier l’effet de nos anticorps in vitro avant de passer dans des modèles de thrombose artérielle réalisés dans la souris (in vivo). Il est donc nécessaire d’évaluer leurs efficacités sur sang de souris avant de démarrer les études in vivo. Ainsi, pour étudier nos récepteurs d’intérêt, nous utiliserons des souris spéciales modifiée génétiquement et exprimant ainsi des récepteurs humains. Ceci nous permettra de mieux comprendre les effets sur l’homme des molécules que nous souhaitons tester. Les souris seront utilisées au stade adule entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Etude de l’impact de la surexpression de ABI1 dans le développement de cardiomyopathies hypertrophiques dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, génétiquement modifiées pour surexprimer la protéine ABI1, reçoivent une injection intrapéritonéale et jusqu'à cinq échocardiographies sous anesthésie, avant mise à mort pour prélever le cœur. Le porteur indique qu'elles pourraient développer une insuffisance cardiaque avec oedèmes pulmonaires, des troubles du rythme et des morts subites, et que l'anesthésie sur un cœur défaillant accroît le risque de mort. Il précise avoir d'abord étudié des cardiomyocytes issus de cellules souches de patients mais conclut qu'un "modèle in vivo" est requis pour analyser la fonction cardiaque globale.
Objectifs
Les cardiomyopathies hypertrophiques (CMH) sont des atteintes du muscle cardiaque conduisant à des insuffisances cardiaques d’apparition progressive. Dans certains cas, les CMH augmentent le risque de trouble du rythme cardiaque et de mort subite. Les CMH peuvent avoir une originie génétique. Le plus souvent, ce sont des gènes codant pour des protéines musculaires. Nous avons identifié une mutation conférant à phénotype dominant négatif de la protéine ABI1 chez les patients présentant une CMH. Notre projet a pour objectif d’étudier deux modèles de surexpression de ABI1 pour comprendre la physiopathologie de ces CMH et identifier d’éventuelles voies pour développer des approches thérapeutiques ciblées.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet d’augmenter les connaissances sur la physiopathologie des cardiomyopathies hypertrophiques associées aux mutations de ABI1 et ainsi améliorer au mieux la prise en charge thérapeutique des patients.
Procédures
Les animaux vont être soumis à: - une injection intrapéritonéale unique (environ 1 minute) - entre 1 et 5 échocardiographies sous anesthésie générale gazeuse (30 minutes chacune). Ils peuvent être amenés à présenter des signes d'insuffisance cardiaque, des troubles du rythme et des morts subites.
Impact sur les animaux
Les animaux devraient développer une cardiomyopathie hypertrophique dont nous ne connaissons pas les vitesses d’évolution ou l’impact sur le bien-être. Si les souris développent des symptômes proches de ceux identifiés chez l’homme, elles pourraient développer une insuffisance cardiaque (avec des oedèmes dont des oedèmes pulmonaires associés à des difficultés respiratoires, une fatigabilité et des difficultés à se déplacer) , des troubles du rythme et des morts subites. Les points limites mis en place permettront de limiter au strict miminum la durée de ces effets. Au cours du projet, certains animaux recevront une injection unique par voie intra péritonéale. L'injection sera faite par une personne expérimentée et la principale nuisance attendue est le stress de l'animal lié à la contention. Les échographies réalisées pour le suivi de la fonction cardiaque seront réalisées sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Cependant, les anesthésies pourront être réalisées sur des animaux dont la fonction cardiaque n'est pas optimale. Le risque de mort inhérent à toute anesthésie pourrait être augmenté chez ces animaux.
Devenir
A l'issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement du coeur et analyse histologique et moléculaire.
Remplacement
Les premières étapes de notre projet ont consisté à étudier les cellules souches induites des patients porteurs de la mutation ABI1 et de les redériver en cardiomyocytes pour analyser la morphologie et la electrophysiologie des cellules du muscle cardiaque. Malheureusement, le développement de l’insuffisance cardiaque ne peut être modélisé avec des cultures cellulaires car le fonctionnement cardiaque est dépendant de nombreux facteurs autres que la contraction des cellules musculaires cardiaques (flux et pression sanguine, système nerveux autonome...). Afin de comprendre l'impact du dysfonctionnement des cellules cardiaques sur la fonction cardiaque globale, nous devons maintenant passer à l’analyse d’un modèle in vivo.
Réduction
Afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet, nous utiliserons différentes approches : - approche séquentielle : nous étudierons les animaux à différents temps de développement et âges croissants. Si nous constatons un phénotype trop sévère aux plus jeunes âges, nous ne produirons pas les animaux les plus âgés. - étude longitudinale : nous avons prévu de réaliser un suivi par échocardiographie des animaux afin d’analyser leur phénotype et son évolution au fil du temps sans sacrifier les animaux pour lesquels ce n’est pas nécessaire. - approche statistique : nous analyserons les données (morphologie et fonction) en utilisant des tests statistiques adaptés. En fonction de ces paramètres, il nous faut au moins 17 souris par groupe. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15%, nous arrivons à un total de 20 souris par groupe.
Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage ce qui permet de réduire la douleur et le stress des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe (jusqu’à 5 dans une cage). L’environnement sera enrichi en fonction des préférence des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton ou de batonnets à ronger. Si des animaux venaient à être isolés (mâles reproducteurs, agressivité au sein du groupe…), la cage contiendra systématiquement deux enrichissements. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress (cupping et tunnels). Le modèle que nous allons utiliser n’a jamais été caractériser d’un point de vue phénotypique. Nous allons donc procéder à des observations très poussée des animaux et identifier de la manière la plus précoce l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la Structure Chargée du Bien Etre Animal (SBEA). Au cours du projet, des échocardiographies seront réalisées sur les souris. Bien que cette technique d’imagerie soit indolore, elle nécessite que l’animal soit immobilisé. Afin de réduire le stress et limiter la contention des souris, l’échographie sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse.
Choix des espèces
L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celles du cœur humain. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes des maladies cardiaques (cardiopathies), de leurs conséquences hémodynamiques (sur le flux sanguin) et de leurs causes génétiques. Dans la première partie de l'étude, les souris auront une surexpression de ABI1 dès les stades précoces du développement cardiaque. Afin de réaliser un suivi au cours du temps de l'apparition de la cardiomyopathie, l'atteinte cardiaque sera analysée dès que le cœur à 4 cavités sera bien formé (13.5 jours post fécondation), juste avant la naissance (18,5 jours post fécondation) ainsi qu’à différents stades en post natal (30 ; 60 ; 90 ; 120 ; 150 ; 180 jours après la naissance). Pour la seconde partie de l'étude, la surexpression de ABI1 sera induite dans le muscle cardiaque chez des souris âgées de 8 semaines et la cinétique sera réalisée jusqu’à l’âge de 6 mois.
Validation d’un traitement pour la maladie de Parkinson chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour tester un peptide censé franchir la barrière qui protège le cerveau et freiner l'accumulation d'alpha-synucléine en cause dans la maladie de Parkinson, 40 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie de 30 à 40 minutes pour provoquer cette accumulation dans son cerveau, puis des injections sous la peau cinq jours par semaine pendant deux ou quatre semaines, et une ouverture du thorax lors de sa mise à mort, pour perfuser le cœur et fixer les tissus. Le porteur cite une douleur "modérée et transitoire" après la chirurgie et le stress de la contention lors des injections, et prévoit des "points d'alerte en amont des points limites" sans en donner les seuils. Sur le remplacement, il affirme qu'il "n'existe pas à ce jour d'alternatives à l'expérimentation animale" pour prouver l'efficacité et la sécurité du peptide, la démonstration de son "innocuité" exigeant selon lui un système immunitaire fonctionnel.
Objectifs
La plupart des molécules destinées à la thérapie de maladies neurodégénératives qui ont une efficacité in vivo n'atteignent pas leurs cibles parce qu'elles sont incapables de traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui protège le cerveau chez les vertébrés et même les invertébrés. L'une des stratégies non invasives les plus prometteuses pour l'administration de médicaments au système nerveux central (SNC) est l'utilisation de peptides qui traversent la BHE. Ces peptides sont capables d'améliorer le passage des composés à travers la BHE sans en altérer l'intégrité. Ils sont économiques, chimiquement polyvalents et non immunogènes selon des résultats déjà obtenus chez la souris saine. De plus, ces peptides combinent un ciblage sélectif et spécifique. Ils sont mieux adaptés que les petites molécules, ils présentent une faible toxicité et sont moins enclins à générer des mécanismes de résistance aux médicaments administrés de façon quotidienne à long terme. La maladie de Parkinson est reconnue comme la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente. Cette pathologie touche environ 1% de la population de plus de 60 ans. La prévalence de la maladie augmente avec l'âge. Le coût économique direct et indirect estimé par patient tourne autour de 100.000 euros. Les traitements existants ne sont pas curatifs et ont des effets secondaires importants. Il s'agit donc d'une pathologie qui nécessite de développer des nouvelles approches thérapeutiques. La thérapie ici proposée utilise les dernières avancées en termes d’ingénierie peptidique pour permettre une pénétrance de la BHE optimisée, et combine cela à une stratégie d’arrêt d’accumulation de la protéine alpha-synucléine qui est clé dans le développement de la maladie de Parkinson. On testera ainsi l’effet protecteur de peptides anti-agrégation d’alpha-synucléine embarqués dans une navette qui les aide à traverser le BHE et arriver au cerveau de la souris parkinsonienne après avoir été injectés sous la peau.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour soigner la maladie de Parkinson, les traitements non-invasifs actuels ne traitent que les symptômes et ont, à terme, des effets secondaires assez importants, menant certains patients à arrêter le traitement. C’est pour cette raison que des nouvelles thérapies non-invasives sont toujours nécessaires. Le traitement que nous proposons est un peptide thérapeutique qui bloque l’interaction entre deux protéines dérégulées dans cette pathologie, une phosphatase et une kinase, et empêche ainsi l’accumulation pathologique d’alpha-synucléine. Ceci devrait conduire à une modification significative de la progression de la maladie de Parkinson si le traitement est administré précocement après le diagnostic.
Procédures
Les souris adultes seront sujettes à une seule procédure chirurgicale (30-40min) pour induire l’accumulation d’alpha-synucléine dans le cerveau, puis à un traitement par administration du médicament 5 jours par semaine (5min/jour) pendant 2 ou 4 semaines selon les groupes expérimentaux. Les souris seront pesées toutes les semaines. Lors de d’euthanasie les animaux subiront une thoracotomie pour permettre une perfusion intracardiaque et fixation des tissus.
Impact sur les animaux
Délivrer l’alpha-synucléine dans le cerveau nécessite une chirurgie ce qui peut entrainer une douleur modérée et transitoire péri-opératoire. Le traitement par injection sous la peau journalière pendant 2 à 4 semaines peut entrainer également un stress de manipulation/contention de l’animal. Une pesée hebdomadaire sera effectuée pour contrôler la normalité de la courbe de poids tout au long de l’expérience.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour d’alternatives à l’expérimentation animale pour faire la preuve de concept d’efficacité et sécurité de notre thérapie/peptide. Il est nécessaire de prouver une efficacité de passage de la BHE en conditions physiologiques chez le modèle animal rongeur puis une bonne distribution dans les régions ciblées dans le cerveau. De même, la démonstration de l’innocuité du traitement impose la présence d’un système immunitaire fonctionnel ce qui est absente dans les cultures cellulaires. Cela justifie donc l’utilisation des modèles murins.
Réduction
Une simulation statistique précise a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs compte tenu de la variabilité de la technique d’analyse prévue (histologie). Cette simulation est fondée, d’une part, sur des données obtenues dans la littérature scientifique et, d’autre part, sur les résultats que nous avons observés dans le passé lors d’expériences similaires menées dans le laboratoire.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi, fournissant une palette de stimulations cognitives et motrices pour les animaux, et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés qui vont du soutien nutritionnel adapté à l’administration de médicaments. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Le protocole d’anesthésie et d’analgésie de la procédure chirurgicale a été défini et validé par une équipe vétérinaire et est implémenté en routine dans le laboratoire avec des résultats satisfaisants. Les animaux bénéficieront d’une période d’adaptation à l’arrivée dans l’animalerie, de récupération après chirurgie et d’adaptation à la manipulation pour traitement quotidien qui ont pour objectif de garantir des conditions physiologiques et d’assurer un minimum de souffrance et stress pendant le protocole. La surveillance rapprochée et la mise en place de points limites (et de points d’alerte en amont des points limites) permettent d’évaluer une perte de poids, une infection, un changement de comportement en lien avec une douleur/ nuisance liée aux interventions.
Choix des espèces
Les régions les plus touchées du cerveau des patients atteints de la maladie de Parkinson sont la substance noire, où résident les noyaux des neurones dopaminergiques, et le striatum où se trouvent leurs terminaisons. Les modèles invertébrés ne possèdent pas de striatum. Les souris envisagées dans ce projet permettent d’étudier les neurones ciblés dans leur environnement cérébral complexe. De la même façon, les peptides utilisés dans ce projet doivent traverser une BHE, ce qui est difficilement atteignable sur des cultures cellulaires. La maladie de Parkinson est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Pour cette raison, les animaux utilisés dans le protocole seront des animaux adultes avant le début de l’induction de l’agrégation d’alpha-synucléine et du traitement pour réduire ou empêcher son agrégation. De plus, l’innocuité du traitement et l’efficacité de passage à travers la BHE nécessite une physiopathologie adulte pour augmenter la fiabilité de la prédiction des résultats chez l’homme.
Traçage neuroanatomique rétrograde des motoneurones phréniques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Posées sur le dos, les souris qui ne parviennent plus à se retourner en moins de 10 secondes, ou qui ont perdu 20 % de leur poids en 48 heures, sont mises à mort. 600 souris, dont des souris d'une lignée génétiquement modifiée qui développe une sclérose latérale amyotrophique, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. 576 d'entre elles reçoivent sous anesthésie générale une injection dans le cerveau dès la naissance, puis une injection intrapleurale entre 30 et 50 jours, avant d'être tuées par perfusion à 60, 90 ou 120 jours, ce dernier âge correspondant à un stade avancé de la maladie, avec paralysie des membres postérieurs, et 24 autres reçoivent la seule injection intrapleurale. Leur mise à mort permet de compter les motoneurones qui commandent le diaphragme, pour savoir si une protéine du virus de Borna, qui prolonge la survie de cette lignée selon l'équipe, agit en les préservant.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte sélective et progressive des neurones cortico-spinaux (neurones du cortex moteur) et des motoneurones bulbaires et spinaux (neurones innervant les muscles). L’atteinte de ces neurones aboutit à raideurs musculaires involontaires et des faiblesses musculaires évoluant vers une paralysie complète du patient. Une insuffisance respiratoire entraine la mort du patient 3 à 5 ans après le diagnostic. Aucun traitement curatif n’existe à ce jour, seul le riluzole augmente l’espérance de vie des patients d’environ 90 jours. Parmi les nouvelles pistes thérapeutiques investiguées, une stratégie consiste à détourner une protéine virale à des fins neuroprotectrices. Cette protéine appelée protéine X est une petite protéine du virus Borna. Nous avons récemment montré l’intérêt thérapeutique de cette protéine dans un modèle murin de SLA (une souche de souris génétiquement modifié). Dans ce modèle, la phase symptomatique débute vers l’âge de 90 jours par une faiblesse des membres postérieurs et évoluant vers une paralysie des membres postérieurs. L’étude in vivo menée sur ces animaux a mis en évidence un rôle de préservation des capacités motrices de ces souris, une diminution de la neurodégénérescence des motoneurones de la moelle epinière lombaire et une augmentation de l’espérance de vie des souris. Afin de déterminer si l'augmentation de l'espérance de vie est due à une augmentation de la survie des motoneurones respiratoires nous proposons ici de marquer spécifiquement les motoneurones du diaphragme afin de les identifier et de les quantifier après traitement avec la protéine X.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si l'augmentation de la survie des souris observée apres traitement avec la protéine X est lièe a une diminution de la dégénérescence des motoneurones innervant le diaphragme.Par consequent, ce projet permettra de montrer l’efficacité de la protéine X sur les capacités respiratoires des animaux et donnera des pistes thérapeutiques pour les patients qui meurent de déficience respiratoire.
Procédures
576 souris du projet seront soumises à 3 procédures chirurgicales : 1) Injection cérébrale (à la naissane) sous anesthésie générale , durée 10 minute par animal 2) Injection intrapleurale (entre 30 et 50 jours), sous anesthésie générale durée 30 min 3) Euthanasie pour prélevement d’échantillons à 3 stades symptomatiques (60 jours ; 90 jours ou 120 jours) durée de la perfusion 5 min . 24 souris du projet seront soumises à une injection intrapleurale à un âge compris entre 30 et 50 jours
Impact sur les animaux
1) Injection cérébrale : bien que cela soit très peu observé au cours de ces procédures, les nouveau-nés présentant une absence de poche de lait, une hypothermie ou peu de mobilité seront sacrifiés 2) Injection intra-diaphragmatique, si les souris développent une infection post-opératoire ou présentent un état létargique ou une perte de poids, les animaux seront traités en conséquence avec des traitements médicamenteux. La grille de score sera utilisée pour déterminer les points limites et determiner un sacrifice de l'animal si son état l'impose. 3) Perfusion intracardiaque : Concernant les animaux vivant jusqu'à des stades symptomatiques avancés (jusqu'à l’âge de 120 jours) : à partir des premiers signes de paralysie (membres posterieurs) les animaux seront observés quotidiennement et la douleur sera évaluée selon la grille d’évaluation), organisée selon 5 grands critères : apparence physique, comportement naturel, évolution de la maladie, comportement provoqué, et changement de poids corporel. L’accès à la nourriture et à la boisson seront facilités avec des doses de DietGel placées dans la cage. Le réflexe de retournement et le poids seront également determinés quotidiennement. Lorsque ces animaux placés sur le dos ne seront plus capables de se retourner en moins de 10s (score 4 - comportement provoqué) ou lorsque 20% de leur poids sera perdu en 48 heures, ils seront sacrifiés.
Devenir
Afin de préléver les tissus et de pouvoir identifier la survie des neurones respiratoires les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives telles que les cultures de lignées cellulaires ne permettent pas d’appréhender un système aussi complexe que le système moteur. Le recours à l’animal entier est déterminant dans les études précliniques, en effet, seule une approche intégrée peut rendre compte de l’efficacité de la molécule sur le retard de l’apparition et de la progression de la maladie ou encore sur la prolongation de la survie des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux a été determiné par une approche statistique. Ce nombre est par ailleurs à mettre en rapport avec le nombre de conditions et les différents stades de la maladie. La dégénérescence des motoneurones respiratoires sera d'abord confirmée pour chaque stade chez les animaux contrôles. Si la dégénérescence n'est pas révélée à des stades précoces par exemple (souris agées de 60 jours), l'effet du traitement sur ces stades ne sera pas étudié.
Raffinement
Une étude pilote sera réalisée sur une douzaine de souris anesthésiée afin de limiter la douleur en testant deux protocoles medicamendateux analgésiques pré et post-opératoire. Le protocole le plus adapté sera ensuite celui appliqué dans le projet. Les animaux seront placés dans des cages enrichies (carrés de cellulose lab’nest). Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle de lumière inversé. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Une grille de score sera utilisée pour déterminer les points limites et déterminer une mise à mort de l'animal si son état l'impose.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisée est un modèle d’étude classique de la Sclérose Latérale Amyotrophique. Les injections des différentes constructions génétiques seront réalisées chez les souris à la naissance. Ces injections précoces augmenteront les chances de couvrir la fenêtre temporelle à laquelle la protéine du virus Borna aura potentiellement un effet. Les animaux recevront ensuite des injections dans le diaphragme entre 30 et 50 jours puis les expériences d’immunohistochimie seront réalisées chez des animaux adultes à 60, 90 ou 120 jours. Ces différentes périodes ont été choisi afin de suivre l’évolution de la maladie. 60 jours correspondent à un stade asymptomatique, 90 jours à un stade symptomatique débutant et 120 jours à un stade symptomatique avancé.
Rôle de protéines régulatrices du cytosquelette dans les plaquettes murines
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
3 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. Les procédures expérimentales, courtes, se déroulent sous anesthésie générale et les souris sont tuées avant tout réveil pour prélever leurs organes, 1 228 relevant d'une souffrance sans réveil et 1 852 d'une souffrance déclarée légère liée à l'élevage et au génotypage. Le projet vise à comprendre le rôle de deux protéines du cytosquelette des plaquettes sanguines comme cibles thérapeutiques éventuelles. Le porteur indique que les plaquettes ne peuvent être mises en culture et affirme qu'il est "nécessaire" de disposer de plaquettes issues de sang frais, ce qui l'a conduit à générer deux lignées de souris.
Objectifs
Les plaquettes sanguines sont des cellules vitales par la formation d'un bouchon qui vient colmater les vaisseaux pour arrêter le sang de couler après une blessure. Dans des conditions pathologiques, de part leur implication prépondérante en hémostase, des déficites plaquettaires peuvent aboutir aussi bien dans des troubles hémorragiques (saignement) que thrombotiques (gros caillots). Le fonctionnement correcte dans la circulation des plaquettes nécessite une série de changements en interne de la cellule, le squelette de la plaquette (appelé cytosquelette). Des anomalies dans ces processus peuvent conduire à des défauts de fonctionnalité. Récemment, il a été montré que des défauts chez l'homme de ce squelette touchant certaines molécules des plaquettes avaient une répercussion sur la capacité du sang à coaguler. Le projet a pour objectif de comprendre le rôle de deux protéines de ce squelette, présentes dans les plaquettes, et de finir si elles peuvent représenter de futures cibles thérapeutiques chez l'homme.
Bénéfices attendus
Dans son ensemble, ce projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la formation et les fonctions plaquettaires, et de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies hémorragiques et thrombotiques liés aux plaquettes sanguines.
Procédures
Toutes les procédures expérimentales se feront après une anesthésie générale. A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés sans retour au préalable à la conscience. Quatre procédures expérimentales seront mises en place d'une durée courte: de 10 à 60 minutes maximun.
Impact sur les animaux
Lors de la procédure d'élevage, un stress lors de la contention des animaux afin de réaliser le tatouage et le génotypage peut être généré. Le projet ne comporte que des procédures expérimentales sans réveil sous anesthésie générale. Il n'y a donc pas de contraintes pour les animaux lors des procédures expérimentales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure (sans réveil). Des prélèvements d'organes post-mortem seront alors effectués.
Remplacement
Dans ce projet, une partie de notre étude repose sur de la culture cellulaire. Ces modèles cellulaires sont essentiels pour orienter nos recherches mais ces lignées ne sont pas des plaquettes. En effet, les plaquettes sont des cellules qui ne peuvent pas être mise en culture car elle ne possèdent pas de noyau et peuvent donc pas se multiplier. Par ailleurs, hors d'un organisme vivant, leur survie est limitée à quelques heures. Il est donc nécessaire de disposer de plaquettes isolées à partir de sang fraichement collecté. Nous avons alors généré deux modèles de souris pour comprendre le rôle de protéines multifonctionelles dans les plaquettes. Ces souris permettront d'étudier les plaquettes sanguines dans un organismes vivant, d'évaluer les interactions entre toutes les composants du sang et d'évaluer les risques de saignement ou d'occlusion thrombotique des vaisseaux.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire dans les procédures expérimentales est de 1228 pour deux lignées de souris différentes. Nous avons pu définir au plus juste ce nombre sans compromettre les résultats (qui resteront statistiquement analysables) en nous basant sur notre expérience personnelle, les données de la littérature et par une validation de ce nombre par un logiciel de statistiques (GPower3.1).
Raffinement
Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximun l'inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, traitement analgésiques...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de s'assurer de leur bien-être. De plus, le personnel impliqué, formé, dans ce projet est qualifié sur le plan technique et est formé en continu sur les pratiques d'expérimentation animale. Pour limiter le stress des souris, les animaux seront sortis de la zone d'hébergement de l'animalerie juste avant la procédure exprérimentale. Les souris sont anesthésiées et analgésiées dont l'effet perdure tout au long des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d'ordres scientifiques, pratiques et éthiques. Sa génétique bien connue facilite la création de modèles transgéniques. Des anticorps ont été développés permettant des analyses de qualité, avec des anticorps dirigés contre des antigènes de la plaquette de souris. Par ailleurs, notre structure utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d'animalerie, d'élevage, d'expertises techniques pour l'expérimentation animale, mais également un atout majeur dans le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. La souris est l'animal de laboratoire le plus utilisé en hémostase par la communauté scientifique internationale ce qui permet de comparer les résultats obtenus. Enfin la méthodologie envisagée dans ce projet est adaptée au modèle murin et nous avons acquis au cours des années une expertise notable et de bonnes pratiques expérimentales avec cette espèce. Les souris aussi bien mâles que femelles, seront agées entre 3 semaines et 1 an.
Evaluation de l’efficacité d’un candidat médicament, le masitinib dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et de son impact sur la réponse inflammatoire à l’aide d’un modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE).
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, 189 étant classées en souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par trois injections pour reproduire une paralysie progressive des muscles proche de la sclérose latérale amyotrophique, avec administration orale de masitinib jusqu'à 42 jours et tests moteurs hebdomadaires de force, coordination et endurance. Le porteur décrit un déficit moteur menant à des paralysies chroniques et une perte de poids, et indique qu'aucun animal ne pourra être réutilisé du fait de ces signes irréversibles. Il présente l'évaluation du masitinib comme "critique et nécessaire" pour renseigner les agences réglementaires et affirme que le modèle animal est "indispensable et non substituable".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative neuromusculaire qui conduit généralement au décès des patients dans les 3 à 5 ans qui suivent le diagnostic. Elle se caractérise par un déficit moteur puis une paralysie progressive des muscles (incapacité à marcher, manger, parler, respirer). Cette paralysie est dû à la mort progresse des cellules nerveuses dans le cerveau et dans la moelle épinière. La SLA est la plus fréquente des maladies du neurone moteur (2.7 cas/an pour 100 000 habitants en France). Il n’existe aucun traitement curatif à ce jour. Un seul traitement est approuvé en Europe, le Riluzole (Zentiva) qui ralenti modestement l’évolution fatidique de la maladie. Le besoin médical est donc urgent et critique. Le masitinib est une molécule qui un effet protecteur des neurones dans le système nerveux central et périphérique. Il actuellement est en dernière phase de développement clinique pour la SLA et la sclérose en plaque (SEP). Cette molécule a reçu la désignation de médicament orphelin dans la SLA à la fois de l’Agence Européenne du Médicament (EMA) et de la Food and Drug Administration américaine (FDA). En 2023, la FDA a validé une molécule appelée neurofilament comme marquer de l’efficacité d’un candidat médicament pour les maladies du système nerveux. Le but de ce projet est d’étudier l’impact du masitinib sur la libération de ces marqueurs comme le demande la FDA. De plus, la mise en perspective des signes cliniques et des analyses biomoléculaires effectués sur les prélèvements de sang permettra également de comprendre les mécanismes biologiques conduisant à la maladie. Le modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle le plus couramment utilisé pour étudier les maladies neurodégénératives telles que la SLA, SEP, la maladie de Huntington (HD),…. L’EAE a été choisi pour ces nombreuses similitudes avec la SLA: - Les signes cliniques : déficit moteur lié à la mort progressive des cellules nerveuses - Les mécanismes biologiques impliqués (comme l’inflammation) qui conduisent à la mort des motoneurones - Les marqueurs de la maladie tels que les neurofilaments demandés par les agences règlementaires.
Bénéfices attendus
Le masitinib est actuellement à la fin de sa phase de développement clinique dans plusieurs pathologies neurodégénératives dont la SLA, la SEP et la maladie d’Alzheimer. Il a d’ores et déjà reçu la désignation de médicament orphelin pour la SLA à la fois de l’EMA et de la FDA. En 2023, la FDA a validé l’application d’une molécule appelée neurofilament comme marqueurs des pathologies neuro-dégénératives. Ce marqueur est un point de terminaison nécessaire aux développements d’un candidat médicament. Il est donc aujourd’hui critique et nécessaire d’évaluer l’impact des nouvelles thérapies, dont le masitinib, sur le taux de neurofilament dans des modèles précliniques dédié à la SEP et la SLA. Les résultats de ce projet permettront donc de renseigner les agences réglementaires et ainsi d’accélérer la mise à disposition du masitinib aux patients, avant même l’achèvement des études cliniques en cours. Le masitinib pourrait ainsi devenir la première molécule thérapeutique dans le traitement de la SLA. Par ailleurs, la mise en perspective des modifications des signes cliniques avec les analyses biologiques des échantillons de sang permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de la molécule et potentiellement d’étendre son utilisation à d’autres pathologies (Parkinson et Huntington) qui partagent les mêmes marqueurs et certains mécanismes biologiques.
Procédures
Le modèle utilisé consiste à induire les signes cliniques en stimulant le système immunitaire. L’induction de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est effectuée en 3 injections : 1 injection en sous-cutanée et 2 injections en intrapéritonéale. Pour étudier l’action neuro-protectrice du masitinib, la molécule sera administrée par voie orale 1 fois par jour pendant au maximum 42 jours. Tout au long de la période expérimentale, les souris feront l’objet d’un suivi très étroit : - observations quotidiennes. - Enregistrement du poids et les observations cliniques au minimum 3 fois/semaine - Evaluation des capacités motrices (force, coordination, endurance) 1 fois par semaine Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. A l’issu de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont essentiellement liées au modèle EAE et les signes cliniques associés: - L’induction se fait par une injection d’un produit qui peut être irritant. En effet, le produit injecté induit une réaction inflammatoire désiré sur le même principe que la vaccination. Cette réaction peut générer une douleur modérée et transitoire (
Devenir
Le modèle d’EAE utilisé reproduit chez l’animal les signes cliniques de la SLA. Aucun animal ne pourra donc être réutilisé en raison de ces signes sévères, irréversibles et inévitables. A la fin du projet, tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Le masitinib est actuellement en phase final de développement clinique et a donc été caractérisé de manière très précise par des études préalables. Pourtant, aucune de ces études vitro ou ex-vivo n’a pu permettre d’étudier les liens entre les mutations génétiques, les mécanismes moléculaires et les signes cliniques. En effet, les maladies neurodégénératives comme la SLA sont des maladies multifactorielles et complexes. Ces maladies ne peuvent être réduites à une simple mutation ou à un simple mécanisme dans des cellules isolées. Le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour : •Analyser les paramètres biologiques tels que la réponse immunitaire, l’accès de la molécule au cerveau, l’évolution des marqueurs au cours du traitement comme le demande les agences règlementaires (FDA). •Valider l’effet du médicament sur les signes cliniques et donc confirmer le mécanisme d’action à l’échelle moléculaire.
Réduction
Le candidat médicament testé est le masitinib qui est actuellement en phase final de développement clinique. La toxicité de la molécule et les schémas de traitement sont donc parfaitement maîtrisés. Le nombre d’animaux utilisé sera donc réduit au strict minimum pour répondre à la problématique du projet. Le nombre d’animaux a été déterminé mathématiquement sur la base d’une méthode validé et consensuelle de façon à n’utiliser que le strict minimum d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. D’après les calculs, le nombre d’animaux à utiliser est de 13 animaux par groupe. Ce nombre d’animaux par groupe est inférieur aux effectifs communément utilisés (± 15 animaux par groupe) dans le cadre des recherches académiques ou dans les laboratoires de recherche privés.
Raffinement
Pendant toute la durée du projet, les souris sont suivies quotidiennement, leur poids sera enregistré et les observations cliniques seront évaluées 3 fois par semaine. L’EAE est un modèle très utilisé et très bien décrit. Dans la majorité des publications, la progression de la maladie est évaluée sur la base des observations cliniques selon un scoring strict, validé et utilisé par l’ensemble de laboratoire utilisant ce modèle. Dans ce projet, nous allons utiliser plusieurs méthodes de mesures indépendantes (score + poids + 2 tests de performances musculaires) pour garantir une évaluation précise, quantitative et donc objective de l’évolution de la maladie. Le croisement des informations facilitera les analyses et permettra conclusion étayée par plusieurs variables. Cette analyse associée à la parfaite connaissance du modèle d’EAE, permettra de prévenir de manière plus précoce l’apparition des signes cliniques dommageable. De plus, une attention particulière sera prêtée à l’environnement local, étant donné que les animaux ayant contracté l’EAE présenteront des déficits moteurs significatifs. Les cages comporteront un sol en dur, une litière de sciure, des refuges et des matériaux de nidification adéquats, ainsi que des blocs à ronger. Des pellets mouillés (disposées sur le fond de la cage) et un complément alimentaire gélifié (riche en eau et en ions) seront apportés aux animaux pour faciliter la nutrition et à l’hydratation.
Choix des espèces
Le modèle d’EAE a été choisi par ce que c’est un modèle éprouvé et largement utilisé pour étudier les maladies neurodégénératives tel que la SLA, sclérose en plaque (SEP) ou encore la maladie de Huntington (HD). Pour étudier le masitinib, l’EAE a été choisi pour ces nombreuses similitudes avec la SLA: - Les signes cliniques: déficit moteur progressif menant à la paralysie des muscles - les mécanismes : inflammation du système nerveux central et périphérique qui entraîne la mort des cellules nerveuses - Les marqueurs de la maladie: neurofilament qui est désormais demandé par les agences règlementaires Le modèle d’EAE est développé et utilisé uniquement sur des souris. Ce modèle mime parfaitement la SLA et la SEP qui se développe très majoritairement chez les adultes. De plus, en termes de méthode, l’ensemble des publications indiquent qu’il faut utiliser des souris de 9-13 semaines lors de l’induction. Nous utiliserons par conséquent dans ce projet des souris adultes. Les animaux utilisés seront uniquement des femelles comme préconisé par la littérature scientifique. En effet, il existe une différence significative entre les 2 sexes. Les femelles sont beaucoup plus sensibles à l'induction que les mâles : - Le taux d’immunisation est supérieur chez la femelle que chez le mâle ce qui aura pour conséquence la réduction du nombre d’animaux dans ce projet. - Les signes cliniques sont plus marqués chez la femelle que chez le mâle, les effets seront donc plus marqué ce qui améliore la significativité des résultats.