Rongeurs

Pour tester si deux cibles pharmacologiques combinées freinent la fibrose du foie liée à l'obésité, 270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime gras pendant vingt semaines, puis un gavage oro-pharyngé quotidien pendant vingt-huit jours et quatorze incisions de la veine de la queue pour mesurer leur glycémie. Le porteur reconnaît que ce régime peut les rendre incapables d'accéder à la nourriture et à la boisson, provoquer un état dépressif et de l'anxiété, et que l'isolement en cage individuelle des vingt-huit derniers jours sera une source d'angoisse prolongée. L'effet chez les patients reste au conditionnel, les deux molécules ayant chacune été testées séparément sans que leur combinaison ait été évaluée.

Objectifs

La prévalence mondiale de l’obésité est en constante progression. L'obésité est un facteur de risque majeur pour le développement du diabète de type 2 et de perturbations cardiométaboliques dont la MAFLD (Metabolic dysfunction-Associated Fatty Liver Disease). Cette pathologie est principalement caractérisée par une profonde perturbation du métabolisme du foie et par un développement de fibrose. Aucune approche médicamenteuse efficace n’est commercialisée à l’heure actuelle. L’objectif de notre projet est d’étudier les potentielles interactions entre 2 cibles thérapeutiques sur l’évolution de fibrose dans un modèle de souris souffrant de MAFLD.

Bénéfices attendus

La prise en charge et le traitement du diabète de type 2 et de ses complications est un enjeu de santé publique de plus en plus prégnant. Les stratégies médicamenteuses, bien que multiples, voient leurs limites dans le fait qu’elles ne ciblent généralement qu’un récepteur et donc qu’un point précis du métabolisme, limitant ainsi leur efficacité. Ce projet permettra de nous renseigner sur le réel potentiel thérapeutique d’une double approche pharmacologique dont les deux stratégies ont chacune déjà démontré des effets hépato-protecteurs. Ceci pourrait avoir un réel impact pour les patients.

Procédures

Pendant les 20 premières semaines de la procédure, les souris seront manipulées hebdomadairement pour monitorer leur masse corporelle. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 10 minutes par souris cette période. Pendant les 28 jours de traitements pharmacologique, la masse corporelle sera évaluée quotidiennement. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 14 minutes par souris cette période. De plus, l’administration quotidienne des traitements pharmacologiques par gavage oro-pharyngé nécessitera l’immobilisation de chaque animal pendant 10 secondes supplémentaires, soit 19 minutes au total par animal sur cette période et 29 minutes sur l’ensemble du projet. Pour chaque test nécessitant une mesure de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local afin de prélever du sang total et ainsi réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et aura lieu 14 fois par animal (2 x 7 prélèvements à 5 jours d’intervalle).

Impact sur les animaux

En plus d’une altération des paramètres métaboliques, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer les capacités motrices de l’animal au point de le rendre incapable d’accéder à la nourriture et la boisson. Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété. Enfin, l’hébergement en cages individuelles pendant les 28 derniers jours de la procédure sera une source d’angoisse prolongée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’action mis en jeux.

Remplacement

L’obésité, le diabète de type 2 et le développement de MAFLD sont le fruit de dérégulations multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin et une perturbation de l’homéostasie lipidique ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier ces aspects, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier, justifiant ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur les molécules antidiabétiques, nous avons pu, au cours des projets, réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de réaliser des effets doses, ni de multiplier les temps de traitements, pour un large spectre de molécules, dont celles utilisées dans ce projet. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux. Ainsi, des tests in vivo et des prélèvements d’organes seront réalisés chez les mêmes animaux. Pour ces raisons, avec une seule dose et un seul temps de traitement, nous avons réduit le nombre d’animaux pour mener à bien ce projet et obtenir un puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe (10 animaux par cages) pendant les 20 premières semaines avec un enrichissement de leur milieu de vie, dans une pièce calme et tempérée. Les aliments et l’eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins pourront être apportés si l’état de santé des rongeurs le nécessite. Pendant les traitements pharmacologiques, les souris seront amenées à être hébergées de manière individuelle afin de pouvoir monitorer la prise alimentaire quotidienne pouvant être influencée par les différents traitements. Par conséquent, un enrichissement plus important sera apporté dans chaque cage. De plus, le contact visuel et olfactif entre animaux sera maintenu via l’utilisation de cages transparentes sans couvercle filtrant.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’espèce humaine. Dans ce sens, dans le cadre de la recherche fondamentale, il paraît déterminant de choisir un modèle animal dont la physiologie et la physiopathologie sont les plus proches possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris, qui sur le plan neurobiologique et métabolique, présente de multiples similarités avec l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le début du projet fera appel à des souris de 12 semaines. Considérant les 20 semaines de régime WD, les animaux seront âgés de 32 semaines lors du commencement de l’approche pharmacologique et de 36 semaines lors de la fin de l’expérimentation.

Mises en accouplement pendant environ six mois, leurs petits anesthésiés pour un prélèvement de tissu destiné au génotypage, 279 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles appartiennent à quatre lignées qui développent spontanément une fibrose des voies biliaires et une hypertension portale, entretenues pour étudier une cible thérapeutique dans la cholangite sclérosante primitive. Le porteur ne compte parmi les dommages que la douleur transitoire du prélèvement, alors que la pathologie hépatique, ictère compris, tient à la lignée elle-même et se déclare sans intervention. Les reproducteurs sont tués à huit mois, avant l'apparition de signes cliniques significatifs, et les jeunes rejoignent d'autres projets expérimentaux.

Objectifs

Ce projet a pour but la gestion de 4 lignées qui développent spontanément une maladie hépatique caractérisée par une fibrose biliaire et une hypertension portale. Ces 4 modèles de souris vont nous permettre d’étudier l’implication d’une cible thérapeutique sur le développement de la cholangite sclérosante primitive. La cholangite sclérosante primitive est une maladie inflammatoire chronique des voies biliaires qui entraîne une fibrose et une destruction progressive des canaux biliaires, menant à des complications très sévères, telles qu’une insuffisance hépatique et des tumeurs hépatobiliaires. La cholangite sclérosante primitive est relativement rare, touchant environ 1 personne sur 10 000 dans la population générale. Elle est plus fréquente chez les hommes que chez les femmes et est souvent diagnostiquée chez les patients atteints de colite ulcéreuse. À l’exception de la greffe du foie, qui est réservée aux patients les plus gravement touchés, il n’existe actuellement aucun traitement pour cette maladie. Ainsi l’objectif de ce projet est la gestion de deux lignées de souris qui permettrons d’étudier la cholangite sclérosante primitive afin de comprendre cette pathologie et optimiser la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

La gestion de ces lignées permettra d’optimiser l’élevage et donc leur reproduction pour nos projets scientifiques. L’utilisation de ces deux lignées vise à évaluer l’implication de l’expression d’une cible thérapeutique sur le développement de la CSP. Les résultats permettront de comprendre comment cette cible participe à l’évolution de la maladie et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront mises en accouplement durant 6 mois environs afin de produire les souris nécessaires pour réaliser nos projets scientifiques. Les petits générés par ces croisements pourront subir un prélèvement de tissus pour caractériser leur génotype. Ce prélèvement se fera sur animaux anesthésiés et prendra moins d’une minute à être réalisé.

Impact sur les animaux

Ce modèle de souris développe spontanément une maladie hépatique caractérisée par une cholestase intrahépatique avec ictère, une fibrose biliaire, une hypertension portale. Une diarrhée peut être observée à partir de 12 semaines d’âge (5% des cas). Le prélèvement de tissu induit une douleur aigüe transitoire.

Devenir

Utilisation continue : utilisation vers le projet scientifique prévu pour ces animaux. Les souris produites au fur et à mesure seront utilisées pour les projets scientifiques et les couples seront utilisés en continus pour les prochains accouplements. Les reproducteurs seront mis à mort lorsqu’ils auront atteint 8 mois d’âge (avant apparition de signe clinique significatif).

Remplacement

L’étude de cellules isolées ne permet pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, où plusieurs organes interagissent entre eux. Une étape supplémentaire chez l’animal est donc nécessaire pour comprendre précisément les mécanismes biologiques impliqués et évaluer la sécurité et l’efficacité du traitement avant toute application chez l’être humain.

Réduction

La production est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistiques. Les tailles d’effectifs ont été déterminées en se basant sur le strict minimum dont nous avons besoin pour la reproduction de nos souris pour générer le nombre de souris nécessaire à nos projets scientifiques. Toutes les données recueillies seront analysées avec des méthodes statistiques adaptées afin d’exploiter au maximum les informations obtenues et d’éviter toute utilisation animale supplémentaire inutile.

Raffinement

L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. C’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour l’étude de cette pathologie. De plus le modèle de souris que nous utilisons est génétiquement modifiée pour ne pas exprimer notre cible thérapeutique au niveau du foie afin de compléter nos études sur cette cible. À présent, ce modèle n’est donc disponible que dans la souris. Les animaux seront utilisés à partir d’un âge adulte de 7-8 semaines minimum pour les reproductions afin d’optimiser l’élevage.

2 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Le protocole enchaîne des tests métaboliques avec injections intrapéritonéales et prélèvements sanguins à la queue, une injection de glycérol ou de cardiotoxine dans le quadriceps sous anesthésie pour léser le muscle, un régime enrichi en lipides destiné à rendre les animaux obèses, des mesures de force et d'endurance en isolement, et un transport entre deux établissements. Le porteur reconnaît que l'inconfort lié à l'obésité induite "pourrait durer plusieurs semaines". Il fonde l'effectif sur les habitudes expérimentales de l'équipe et sur des expériences préliminaires, un calcul de puissance étant jugé difficile à mettre en œuvre, et les souris sont tuées par groupes d'âge, à 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois.

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 2 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux établissements utilisateurs (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

Deux injections intraveineuses sous anesthésie à cinq jours d'intervalle, une injection intrapéritonéale sur animal vigile, trois prises de sang, 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs reins. Le modèle induit une dégradation progressive de la fonction rénale sur quinze jours, pour tester si une protéine, la clusterine, freine l'atteinte rénale dans une vascularite auto-immune. Le porteur présente le traitement visé comme moins invasif et plus spécifique que les immunosuppresseurs actuels, dont il rappelle les effets indésirables chez les patients. Sur les atteintes subies par les souris, il écrit qu'"aucune modification significative du bien-être animal n'a été décrite dans la littérature scientifique", alors que le protocole consiste à dégrader leurs reins.

Objectifs

Les vascularites sont un groupe de maladies auto-immunes touchant les petits vaisseaux. La prise en charge thérapeutique de ces pathologies est complexe. Elle repose sur des traitements immunosuppresseurs « lourds » , qui doivent être mis en place le plus rapidement possible pour éviter des séquelles rénales et pulmonaires,notamment ; elles-mêmes pouvant grandement impacter les chances de survie. En effet, le pronostic est relativement mauvais, puisque jusqu’à 30% des patients présenteront une insuffisance rénale chronique terminale, nécessitant une dialyse à vie, ou seront décédés à 5 ans du diagnostic. D’autre part, les traitements immunosuppresseurs, bien qu’efficaces, peuvent provoquer des effets indésirables sur le système cardio-vasculaire et considérablement accroître les infections et le développement de cancers chez le patient. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux protocoles pour enrichir l’arsenal thérapeutique disponible et permettre une meilleure prise en charge des patients en diminuant les effets indésirables à long terme. L’objectif de ce travail est d’évaluer le potentiel de nouvelles thérapeuties ciblant des mécanismes cellulaires récemment décrits comme étant impliqués dans la physiopathologie des vascularites

Bénéfices attendus

Les vascularites sont des pathologies difficiles à prendre en charge. Cette étude permettra d’enrichir la compréhension de la maladie et d’améliorer l’arsenal thérapeutique grâce à un traitement moins invasif, plus spécifique et pouvant être débuté plus rapidement pour diminuer les séquelles. L'objectif est d'améliorer la condition de vie des patients, de diminuer le risque des effets secondaires et donc d’augmenter la survie des patients

Procédures

Pour chaque animal du projet, l'induction de la pathologie sera réalisée par une injection intraveineuse (< 1 minute) sous anesthésie générale (< 5 minutes) , suivie, cinq jours plus tard, d'une deuxième injection intraveineuse sous anesthésie générale, et d'une injection intrapéritonéale sur l'animal vigile. Une prise de sang sera réalisée sur chaque animal pour des analyses biochimiques, une semaine avant le début de la procédure, puis deux fois au cours des deux semaines suivantes, pendant l'induction de la pathologie. Afin de minimiser le stress lié à ces prélèvements (< 1 minute), les animaux seront anesthésiés (< 5 minutes). Des échantillons d'urine seront également collectés sur animaux vigiles au même moment, en les laissant uriner à leur convenance.

Impact sur les animaux

Le modèle induira une altération progressive de la fonction rénale sur les 15 jours d'induction de la pathologie. Aucune modification significative du bien-être animal n'a été décrite dans la littérature scientifique. Cependant, les souris seront au minimum trois fois par semaine par le personnel en charge des procédures, et le bien-être animal sera évalué selon une grille décrite dans chacune des procédures.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car les reins seront prélevés pour des analyses histologiques.

Remplacement

Les études in vitro ont permis de démontrer dans des systèmes cellulaires simples, l’efficacité de la molécule testée dans ce projet. Cependant, ces modèles ne permettent pas de restituer la complexité des interactions cellulaires au sein d’un organe et d’un organisme complet pour étudier l’efficacité thérapeutique de notre molécule dans un contexte aussi complexe que celui de la vascularite.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour l’étude a été défini en fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables et fiables. Ce nombre constitue toutefois une estimation haute et pourra être ajusté à la baisse en fonction des résultats obtenus.

Raffinement

Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, afin d’éliminer ou de réduire au maximum toute angoisse, souffrance ou douleur selon des critères couramment utilisés en expérimentation animale et une grille de score décrite pour chaque procédure. Les animaux, 5 par cage de type 2L, seront hébergés dans une animalerie aux paramètres environnementaux contrôlés (portoirs ventilés). Un enrichissement de leur milieu par des tunnels, abris et objets à ronger, permettra de rétablir le répertoire comportemental des souris. L’entretien des animaux, et les gestes techniques effectués seront pris en charge par du personnel habilité et compétent. De plus, les sites d’injection et les prélèvements de sang seront alternés, permettant une cicatrisation des tissus Les plasmas, et organes prélevés post-mortem constituerons une tissuthèque pour des marquages tissulaires et des dosages biochimiques ultérieurs.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les espèces les plus couramment utilisées en recherche préclinique. Ceci est dû à la facilité d'introduire une modification génétique chez ces espèces, à la grande taille des portées, au temps de génération court et à la relative facilité d'hébergement et de soins. Les modèles de vascularites induits sont décrits dans la littérature chez le rat ou la souris. Un modèle murin a été privilégié car notre équipe a une expertise de travail chez cette espèce et le modèle de vascularite est déjà connu par l’un des chercheurs en charge des procédures, qui l’a déjà expérimenté chez notre équipe partenaire. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines afin d'avoir atteint un stade de développement adulte et d'avoir un poids adéquat (~20-25 g) pour être mises en expérimentation. Nous laissons une marge d’âge allant jusqu’à 10 semaines (pas plus) pour maintenir une homogénéité des poids. L’induction de la pathologie ainsi que le traitement des souris se dérouleront sur 4 semaines. L'induction de la pathologie a été démontrée chez des souris de cet âge.

264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever poumons, foie, rate, cerveau et ganglion médiastinal. Les souris reçoivent une puce d'identification, une infection intranasale par Mycobacterium bovis sous anesthésie, puis une prise de sang par semaine et deux pesées hebdomadaires. Parmi les bénéfices attendus, le porteur place la mise au point d'une vidéosurveillance des animaux infectés en isolateur, présentée comme un moyen de détecter plus tôt les comportements annonçant les points limites. Il indique partir de vingt-quatre souris pour en conserver six au dernier jour du protocole, un quart des animaux contrôlant l'infection en formant des granulomes, les dix-huit ou dix-neuf autres se dégradant jusqu'aux points limites et étant tués entre le vingt et unième et le trente-cinquième jour.

Objectifs

La tuberculose bovine est une pathologie majeure en santé animale. L'espèce mycobactérienne adaptée aux animaux, Mycobacterium bovis (Mb), est le principal agent pathogène responsable de la tuberculose bovine en Europe et au Royaume-Uni. C'est un pathogène zoonotique multi-hôtes capable d'infecter les ruminants (bovins, caprins, ovins), la faune sauvage et l'homme. Les programmes de surveillance et d’éradication, basés sur des campagnes de tests et l'abattage systématiques des bovins réactifs, n'ont pas permis d'éradiquer la tuberculose bovine (bTB). La bTB représente donc un risque direct pour les économies agricoles, la santé animale et humaine et la biodiversité dans les pays touchés. Il existe une hétérogénéité dans la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par Mb, ce qui influence directement le risque de transmission par les bovins infectés et la faune sauvage. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogènes lors des infections à Mb est essentielle pour développer de nouvelles approches visant à éradiquer la tuberculose bovine. Le projet a pour objectif de comprendre comment Mb interagit avec le système immunitaire de l’hôte et comment cette bactérie module la progression et la transmission de la maladie. Pour cela, nous souhaitons identifier les gènes de Mb essentiel pour sa persistance et sa dissémination. Pour cela nous souhaitons i) Comparer la virulence de mutants de Mb (ii) Suivre la réponse immunitaire et le développement du granulome en réponse aux différents mutants.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous mettrons au point pour la première fois la vidéosurveillance d’animaux infectés en isolateur pour raffiner nos points limites (détection plus précoce de comportements). La validation du matériel, son installation, et de la méthode d’analyse permettra de proposer ce suivi pour nos prochains projets. Les résultats permettront de caractériser le rôle de 3 gènes de virulence pour la physiopathologie et la dissémination de Mb. Enfin, nous nous attacherons à une description exhaustive des réponses immunitaires chez les animaux infectés par les différentes souches.

Procédures

Pose de la puce d’identification et télémétrique : 1 fois et 1min/animal. Anesthésie par administration médicamenteuse par voie intrapéritonéale + infection par voie intranasale : 1 fois et 15 min/animal. Prise de sang : 1 fois par semaine et 3 min/animal/prélèvement. Pesée : bi hebdomadaire et 1min/pesée/animal. Les prises de sang peuvent engendrer un hématome et la contention peut engendrer du stress pour l’animal.

Impact sur les animaux

Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourraient être observés. Nous savons par expérience que les souris sont sensibles aux infections mycobactériennes. Ces animaux sont plus susceptibles d'atteindre les points limites lors d'infections avec la souche M.bovis de référence. Nous pourrons observer une perte de poids assez rapide associée à une prostration des animaux. Afin d'assurer un bon suivi de ces animaux, une grille d'évaluation de bien-être des animaux a été mise en place basée sur une observation quotidienne et une pesée bi-hebdomadaire.

Devenir

L'ensemble des animaux du projet seront euthanasiés à la fin du protocole afin de permettre le prélèvement post mortem des organes (poumons, foie, rate, cerveau, ganglion médiastinal) et fluides biologiques (sang, urine et fèces). Ces prélèvements nous permettront d'effectuer l'ensemble des analyses souhaitées comme l'analyse de charge bactérienne, des lésions, du recrutement cellulaire ou de la sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants a été réalisé. Pour les données mesurées que ce soit le recrutement cellulaire, cytokines secrétées, nous obtenons une puissance de test pour un effectif de 6 animaux de 87% pour un test statisitique. Pour obtenir un groupe de 6 souris au dernier jour du protocole, nous savons qu’il nous faut partir d’un groupe de 24 animaux. En effet, tous les animaux ne réagissent pas pareil à l’infection, certains la contrôlent en formant des granulomes pulmonaires matures (25% des animaux), et les autres doivent être sacrifiés au fur et à mesure du protocole car ils atteignent les points limites (entre J21 et J35 classiquement). Chez ces animaux sensibles, des lésions désorganisées sont observables dans le poumon. En résumé, nos protocoles comprennent 24 souris, nous analysons les réponses immunitaires de deux groupes : les animaux résistants (5-6 souris) et sensibles (18-19 souris). Nous utilisons des souris consanguines dont la variabilité génétique est très faible. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques spécialement conçus pour comparer des groupes de petits effectifs. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène).

Raffinement

Les animaux seront élevés en communauté dans des cages enrichies avec du papier essuie tout, tunnel carton. Des visites des animaliers seront quotidiennes et la vidéosurveillance sera mise en place pour mieux suivre les souris. Les animaux seront 6 par cage de 530 cm2. Nous réduisons, et limitons au maximum l'inconfort, la douleur, pouvant être subie par les animaux. les animaux seront habitués en amont à la cellule d’expérimentation, une semaine avant le début de l’expérimentation Pour cela les animaux sont anesthésiés lors des infections et leur état général est suivi tout le long de l’expérimentation (poids, prostration…). Ainsi les animaux sont euthanasiés dès l’apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruités ou rondelle de banane séchée ou popcorn sera réalisée.

Choix des espèces

Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse immunitaire d'un organisme entier. De plus, les modèles murins d'infections mycobactériennes sont très bien établis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. De plus le modèle murin permet une manipulation en animalerie A3 et nous avons à notre disposition de nombreux outils pour cette espèce. Le modèle murin nous offre la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées pour les voies de signalisation ou cytokines impliquées dans les réactions immunitaires. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 semaines (sexe indifférent). Pour ce projet, il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.

1 500 souris, toutes tuées à l'issue, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous la peau, puis de vingt à trente administrations du composé testé, jusqu'à soixante en cas de deux prises quotidiennes, avec une contention tous les deux jours pour mesurer la tumeur qui pousse sous sa peau. Les inhibiteurs testés visent le mélanome et les cancers du côlon et du pancréas, en combinaison avec les immunothérapies existantes. Le porteur écrit que ces expériences sont "cruciales pour l'avancée du projet et les levées de fond nécessaires" dans le cadre d'une collaboration avec une start-up, et qualifie la souris d'"indispensable" pour répondre à la question posée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de traitements utilisant des inhibiteurs de la protéine NFkB Inducing Kinase (NIK) et leurs dérivés sur les cancers solides tels que le mélanome et les cancers du côlon et du pancréas en monothérapie ou en combinaison avec les immunothérapies actuelles sur des modèles de cancers chez la souris. Ceci permettra de proposer des solutions à des patients en échec thérapeutique. En effet si les Immunothérapies ont été une avancée majeure pour le traitement de certains types de cancers une proportion de patients ne répond pas à ces traitements et des combinaisons avec des molécules permettant de restaurer cette réponse aux immunothérapies seraient une avancée majeure.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la mise en évidence de l'efficacité in vivo de nos inhibiteurs de NFkB Inducing Kinase (NIK) contre la croissance tumorale ainsi que de l'intérêt de leur utilisation pour potentialiser l'effet des immunothérapies dans des modèles ayant des taux de réponse variables en fonction des modèles cellulaires utilisés. Dans le cadre de notre collaboration avec une start-up, ces expériences sont cruciales pour l’avancée du projet et les levées de fond nécessaires au passage vers les études pré-cliniques puis cliniques.

Procédures

Les animaux subiront : - 1 injection de cellules tumorales (5 secondes) - 1 injection/ jour avec nos molécules ou 1 à 2 traitement oral/ jour avec nos molécules (5 secondes) pendant la durée du traitement. - 1 contention pour mesurer la taille des tumeurs tous les deux jours. Ceci sur une durée de traitement de 2 à 3 semaines, 3 à 4 semaines pour les modèles de cancer du pancréas. Les souris recevront de 20 à 30 injections/administrations selon le modèle et de 40 à 60 en cas d'administrations 2 fois par jour.

Impact sur les animaux

Lors des injections des cellules tumorales en sous-cutané, il peut y avoir un risque d’irritation et de gonflement aux zones d’injection. Les souris vont ensuite subir une croissance tumorale sous-cutanée. Pour les traitements en injection intrapéritonéale, il peut y avoir un risque d’irritation, gonflement, infection aux zones d’injection et absence de toilettage. Pour les traitements par voie orale, les risques sont des fausses routes et de légers saignements.

Devenir

A la fin de chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort. Nous prélèverons la tumeur et les organes (foie, rate, poumons) afin de réaliser les études qui nous apporterons le plus de renseignements possibles sur le fonctionnement de nos nouvelles molécules thérapeutiques.

Remplacement

Nous avons tout d’abord caractérisé et testé nos composés in vitro et sélectionné les plus efficaces sur les cellules tumorales et vérifier leur innocuité sur des cellules normales. Il est maintenant nécessaire de passer chez le rongeur afin d’avoir une approche plus physiologique et étudier les combinaisons avec les immunothérapies. Nous pourrons ainsi déterminer lesquels de ces traitements sont les plus efficaces dans les modèles cancéreux utilisés (mélanome, cancer du côlon et pancréas) pour diminuer la croissance tumorale et potentialiser une réponse immunitaire antitumorale. Le passage chez l’animal est crucial avant le développement potentiel de ces molécules chez l’homme, ce qui permettrait une alternative à l’échec thérapeutique des traitements actuels.

Réduction

Des statistiques prédictives ont été réalisées. Nous avons choisi de faire des groupes de 10 souris et de refaire l’expérimentation 3 fois. Si après 2 expériences, les résultats sont significatifs, nous ne reproduirons pas une 3ème fois (réduction du nombre d’animaux). Les données de volume tumoral seront analysées statistiquement (comparaison de la croissance tumorale suivant les différents traitements).

Raffinement

Nous réaliserons aussi un suivi attentif des animaux par observation, et une pesée des souris deux fois par semaine, qui permettra l’arrêt de l’expérience dès que les souris présenteront un mal-être ou une souffrance. Les souris seront réparties aléatoirement dans les différents groupe de traitement afin de ne pas biaiser l'analyse. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie.

Choix des espèces

La souris représente le modèle préclinique le plus pertinent pour ce projet, car elle possède un système immunitaire complet, fonctionnel et étroitement comparable à celui de l’homme. L’étude des interactions entre tumeur, immunité et modulation pharmacologique — notamment via les inhibiteurs de NFkB Inducing Kinase (NIK) — nécessite impérativement un organisme immunocompétent. Les mécanismes de surveillance immunitaire et la réponse aux immunothérapies sont conservés chez la souris, permettant de modéliser fidèlement les phénomènes étudiés. Aucun autre modèle animal ou in vitro ne permettrait de reproduire de manière aussi fiable la complexité de ces interactions, rendant la souris indispensable pour répondre à la question scientifique. Les souris seront utilisées à l’âge de 5 semaines. Elles seront commandées à 4 semaines et acclimatées pendant 1 semaine. La croissance tumorale est optimale pour les souris à cet âge-là et ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà effectuées au laboratoire ainsi qu’avec les données de la littérature.

Génétiquement modifiées pour exprimer un gène humain, les souris de ce projet sont élevées et transportées dans des cages séparées pour ne pas être mêlées à d'autres lignées. 400 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous la peau, puis une chimiothérapie ou des anticorps par voie intrapéritonéale, la croissance de la tumeur étant suivie jusqu'à cinq semaines, avec mise à mort le jour même si le score de douleur atteint 8 ou si la tumeur s'ulcère. Toutes sont tuées par inhalation de CO2, pour une ponction cardiaque post mortem et le prélèvement des ganglions, de la rate et de la tumeur.

Objectifs

De nombreux mécanismes suppresseurs déjouant la surveillance du système immunitaire ont été mis en évidence lors du développement des tumeurs. Parmi ceux-ci, les points de contrôles immunitaires notamment ceux exprimés par les cellules myéloïdes représentent donc des cibles thérapeutiques intéressantes pour restaurer une réponse immunitaire efficace et éradiquer les tumeurs. La compréhension de ces points de contrôles immunitaires représente ainsi un enjeu crucial en sante pour les patients atteints de cancer et permettent de développer l'immunothérapie pour bloquer ces points de controle qui a révolutionné les traitements des patients cette dernière décennie. Aussi, il est important de déterminer le rôle de ces points de contrôles dans des modèles in vivo de tumeurs chez la souris par le blocage à l'aide d'anticorps thérapeutiques pour établir la preuve de concept de leur potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Le blocage de la molécule chez le rongeur permettrait de mettre en évidence l'importance de la molécule étudiée dans le développement du cancer et ainsi de générer à long terme de nouveaux médicaments pour les patients atteints de cancers.

Procédures

Les animaux (400 au total) seront injectées par des cellules tumorales par voie sous cutanée (en 15 secondes) et seront traités par de la chimiothérapie ou des anticorps thérapeutiques en intrapéritonéal en 5 secondes). Le suivi des souris (croissance de la tumeur) sera suivi sur 5 semaines maximum et certaines souris seront prélevées pour leurs organes 14 jours après l'injection des cellules tumorales.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir une souffrance au niveau de la peau injectée par la tumeur en sous cutanée mais il est rarrement observé de dégradation de leur état général (attitude prostrée, poils hérissés, etc..).

Devenir

A l'issue de chaque procédure, nous prélèverons le sérum du sang (ponction cardiaque après la mort), les ganglions, rate et la tumeur à jour 14 après euthanasie de l'animal par inhalation de CO2. Les animaux seront tous mis à mort à la fin des procédures experimentales car ces animaux ayant reçu des injections de cellules tumorales ne peuvent pas être réutilisés pour d'autres expérimentations.

Remplacement

Le meilleur modèle pour regarder l'effet d'une molécule sur la croissance tumorale et la survie est in vivo et en utilisant des animaux génétiquement modifiés; il existe une alternative de modèles tumoraux en 2 dimensions, ou organoïdes. Cependant, à ce stade avec des organoïdes, il ne serait pas possible d'analyser le rôle de cette molécule dans ce contexte tumoral car pour l'instant les études sur les organoides de tumeurs permettent uniquement de regarder des molécules exprimées par les lymphocytes T et non des molécules exprimées par des cellules myéloides comme c'est le cas ici. Par ailleurs, la réponse immune anti-tumorale est complexe et fait intervenir de multiples acteurs cellulaires qu'il est difficile à reproduire à l'heure actuelle dans les modèles in vitro lorsque l'on souhaite étudier la réponse immune anti-tumorale dans sa globalité.

Réduction

Pour les expériences in vivo, le calcul de la taille de l'échantillon a été effectué à l'aide du logiciel en ligne « Experimental Design Assistant » (https://eda.nc3rs.org.uk/eda/login/auth) en fonction de l'ampleur estimée de l'effet et de l'écart-type (variabilité basée sur les données antérieures obtenues) pour les différents tests non paramétriques, avec un seuil de signification p < 0,05 et une puissance fixée à 0,90. La taille de l'échantillon avec EDA indique un total de 10 souris par groupe (controle et injecté par anticorps) par procédure respectivement, dans au moins 2 expériences distinctes. Les données seront analysées à l'aide de GraphPad Prism. La mise en évidence de différences éventuelles entre ces groupes sera effectuée à l’aide de tests statistiques non paramétriques, sur des séries non appariées, puisque ni la normalité des distributions parentes, ni l’analyse de l’égalité des variances ne peuvent être réalisées dans de tels protocoles sans sacrifier un nombre important d’animaux. Les analyses statistiques porteront majoritairement sur des comparaisons de moyenne à l’aide du test U de Mann-Whitney.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans l'animalerie selon les normes qui leur sont propres afin de ne pas ajouter un stress supplémentaire au protocole utilisé. Les animaux sont suivis tous les 3 jours pour la croissance tumorale dans les modèle sous cutanés d'adénocarcinome du colon et de fibrosarcome afin de suivre la croissance tumorale et détecter le plus précocement une douleur et d’y mettre un terme, soit par traitement antalgique, soit par sacrifice de l’animal si la souffrance ne peut pas être contrôlée. L’observation d’une perte de poids et/ou d’une attitude indiquant un état non naturel (attitude prostrée, poils hérissés, etc..) et de souffrance conduira à l’euthanasie de l’animal selon le système de score indiqué en tableau en annexe et si le score est supérieur ou égal à 8, l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié le jour même par inhalation de CO2. Par ailleurs, l'animal sera systématiquement euthanasié si une ulcération de la tumeur est observée.

Choix des espèces

Pour étudier le rôle de CLEC-1, nous devons utiliser des souris hCLEC-1 (Knock In KI) pour tester son rôle dans des modèles expérimentaux de développement tumoral. Ces souris ont été génétiquement modifiées pour exprimer le gène humain clec1a. Ces souris sont donc spécifiquement confinées dans des cages bien répertoriées lors de l'élevage et du transport et ne sont pas mélangées à d'autres types de souris. La preuve de concept in vivo de l'effet de l'anticorps est essentielle et ces souris qui ont cette modification génétique avec le CLEC-1 humanisé permettent de réaliser ce type d'expérience in vivo pour mimer ce qui se passe en clinique. Les souris receveuses de tumeurs seront utilisées entre 8 et 12 semaines d'âge (souris adultes) car il faut un système immunitaire adulte. Les souris seront également prélevées pour leurs organes lymphoïdes secondaires ou leur moelle osseuse à 8-12 semaines (âge adulte). Pour les chimères, les souris seront utilisées entre 10-12 semaines après reconstitution pour que le repeuplement hématopoïétique soit optimal.

Soumises à trois jeûnes nocturnes de douze heures, puis à des prélèvements sanguins pratiqués au niveau de l'œil sous anesthésie, 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite par dislocation cervicale. Le projet compare la production d'un médiateur inflammatoire après un repas entre des souris porteuses d'une mutation rendant ce système plus actif, des souris ordinaires et des souris privées de certains éléments du système immunitaire. Le porteur qualifie la mise à jeun d'"indispensable" à la réalisation de tests métaboliques. Il justifie par ailleurs le recours à l'animal par la complexité de la réponse immunitaire "contre les infections sévères" et invoque un modèle d'infection "bien validé", alors que le protocole décrit ne comporte aucune infection.

Objectifs

L’inflammation est une réaction normale et bénéfique de l’organisme, car elle aide à lutter contre les infections et à réparer les tissus. Cependant, lorsqu’elle devient chronique ou excessive, elle peut avoir des effets néfastes et contribuer au développement de maladies métaboliques comme le diabète. Nous nous intéressons à une protéine située à l’intérieur des cellules et impliquée dans la modulation de la réponse inflammatoire. Lorsque cette protéine est activée, elle entraîne la production d’une molécule essentielle de l’inflammation, un médiateur pro-inflammatoire bien connu. Une alimentation trop riche ou un excès de nutriments peuvent activer ce système et favoriser une inflammation légère mais persistante, souvent associée à des troubles métaboliques. Notre équipe a identifié de nouveaux mécanismes qui régulent cette protéine et montré que certaines modifications chimiques de celle-ci peuvent influencer son activité. Pour mieux comprendre ces phénomènes, nous étudions des souris porteuses d’une mutation qui rend ce système légèrement plus actif. Nous comparerons leur production de ce médiateur clé de la réponse immunitaire après un repas à celle de souris normales et de souris dépourvues de certains éléments du système inflammatoire. Pour cela, les animaux subiront une période de jeûne nocturne, suivie d’une réalimentation pendant deux heures, puis d’un prélèvement sanguin destiné à analyser différents marqueurs de l’inflammation. Ces travaux visent à mieux comprendre le lien entre nutrition, inflammation et maladies métaboliques, afin d’éclairer les mécanismes en jeu et d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Plus largement, ces expériences aideront à comprendre la réponse inflammatoire transitoire après un repas et le rôle de certaines protéines dans ce processus, ce qui pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements, par exemple en ciblant les médiateurs pro-inflammatoires et des protéines impliquées dans la modulation de la réponse inflammatoire.

Procédures

Chaque souris est soumise à 3 jeûnes de 12h, 6 pesées (5sec chacune) et 3 prélèvements sanguins sous anesthésie (durée 5 secondes).

Impact sur les animaux

La mise à jeun pendant la nuit peut induire un certain stress chez la souris. Toutefois, cette procédure est indispensable pour la réalisation de tests métaboliques, conformément aux pratiques couramment utilisées dans ce domaine. Elle permet d’harmoniser le statut métabolique des animaux avant l’étude des marqueurs métaboliques et immunologiques après le repas. Les prélèvements sanguins au niveau de l’œil peuvent également être sources de stress ou d’inconfort. Cependant, ils seront réalisés sous anesthésie générale, complétée par l’application d’un analgésique local (pommade oculaire) afin de limiter la douleur et d’assurer le bien-être des animaux.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans procédure seront mis à mort selon une méthode réglementaire. Les souris seront euthanasiées par la dislocation cervicale après la procédure.

Remplacement

Un modèle utilisant uniquement des cellules isolées ou l’utilisation d’outils informatiques ne pourraient refléter toute la complexité de la réponse du système immunitaire contre les infections sévères et les relations entre les cellules de l’immunité. L’étude sur un animal entier est donc indispensable à visée exploratoire et nous utiliserons un modèle d’infection bien validés dans d’autres études..

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux par groupe a été réalisé afin de pouvoir mettre en évidence des différences significatives entre les groupes. Au cours de chaque expérience, de multiples analyses utilisant des techniques différentes seront réalisées sur les différents prélèvements afin de minimiser le nombre de souris utilisé. L’utilisation des mâles et des femelles limitent ainsi la perte d’animaux.

Raffinement

Les procédures expérimentales ont été optimisées pour réduire au maximum l’inconfort et le stress subis par les animaux. Leur bien-être est scrupuleusement pris en compte dans la procédure. L'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique. De plus, les souris seront hébergées en groupe. Les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des animaux. La surveillance des animaux deux fois par semaine nous permettra d'identifier précocement tout changement physique (blessure), ou de comportement qui sont des signes de stress. Des points limites bien définis permettent de limiter la souffrance animale a minima.

Choix des espèces

Les souris sont les animaux les plus utilisés en immunologie, avec un large choix de solutions techniques dédiées disponibles commercialement. Des modèles génétiquement modifiés sont d'ores et déjà disponibles. Il s'agit de jeunes adultes (6 à 24 semaines) dont le système immunitaire est à maturité.