Rongeurs
Rôles fonctionnels de PAK1 dans la plasticité de la myéline chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la déclaration en comptant 600 en souffrance légère et 1 040 en souffrance modérée. À dix jours, les petits subissent, éveillés, un tatouage sur deux doigts au plus et le prélèvement d'un millimètre de queue, puis les souris porteuses du génotype recherché reçoivent à l'âge adulte cinq jours d'injections dans le péritoine, pour supprimer une protéine des cellules qui forment la myéline. Une partie vit ensuite seule ou en groupe pendant huit semaines avant un test de sociabilité de 50 minutes, que le porteur ne nomme pas, une autre subit à trois mois, sous anesthésie, une chirurgie qui crée une lésion de la myéline par une injection dans la moelle, et des souris non modifiées reçoivent un traitement par la bouche chaque jour pendant six semaines. Le porteur décrit la souris comme un "animal grégaire" aux "fortes interactions sociales", et ce trait devient, selon ses mots, "le contexte de l'étude" : l'isolement contre le groupe.
Objectifs
Dans le système nerveux central (cerveau et moelle épinière), les neurones communiquent sous forme d’influx électrique, appelé influx nerveux, transporté le long de leurs axones. Afin d’assurer le bon transport de l’information électrique, la formation de gaines isolantes autour de l’axone est essentielle. Ces gaines sont nommées ‘gaines de myéline’. Elles sont formées par des cellules appelées les ‘oligodendrocytes’ et permettent donc de moduler la vitesse de conduction de l’influx nerveux afin que les messages transmis dans le cerveau se déplacement de façon coordonnée. Ces gaines de myéline sont formées au cours du développement post-natal mais sont dynamiques et modifiées tout au long de la vie afin d’assurer l’adaptation du circuit cérébral à l’environnement. Certaines pathologies, telles que la sclérose en plaque, sont caractérisées par une perte de ces gaines, menant à une perte de l’axone et un défaut cognitif et/ou moteur en fonction du site de la perte myélinique. Il a été démontré que la gaine de myéline peut parfois se reformer spontanément, mais les mécanismes à l’origine de cette remyélinisation ne sont pas bien compris. Il a été démontré qu’une protéine A, présente dans les oligodendrocytes, est essentielle à la formation de ces gaines de myéline, de par son action sur le « cytosquelette d’actine », un des échafaudages de la cellule lui permettant d’adopter plusieurs morphologies. Une première étude de cette protéine A chez la souris a permis de valider son rôle dans la myélinisation du cerveau au cours du développement. L’objectif de ce projet est de continuer l’étude du rôle de la protéine A dans la formation des gaines de myéline chez la souris afin de mettre en évidences de nouvelles cibles thérapeutiques. En effet, nous voulons étudier en profondeur les effets la protéine A sur (1) la modulation des gaines de myéline à l’âge adulte et (2) la réparation de la myéline (remyélinisation). La validation potentielle de la protéine A en tant que cible moléculaire permettant d’actionner cette dynamique chez l’adulte représente ainsi un espoir thérapeutique très important dans plusieurs pathologies de la myéline. Selon nos résultats préliminaires la protéine A est un excellent candidat à cibler pour exercer l’un de ces rôles, voire éventuellement les deux. En effet, puisque cette protéine régule la myélinisation développementale, il est possible qu’elle contrôle également la myélinisation adaptative et, ou la remyélinisation.
Bénéfices attendus
A terme, l’étude approfondie du rôle de la protéine A dans le contrôle de la myélinisation adaptative (myélinisation adulte) et de la remyélinisation permettra de mettre en avant de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de stimuler la myélinisation et sa réparation.
Procédures
Pour obtenir les souris porteuses du génotype d’intérêt permettant cette étude, nous devons générer des accouplements de souris. Les petits issus de ces croisements seront tatoués pour les identifier (tatouage sur deux doigts maximum effectué par une personne compétente à P10 sur animal vigile) et génotypés (prélèvement d’un bout de queue de 1mm maximum par une personne compétente à P10, une seule fois sur animal vigile) (moins de 2 minutes pour les 2 actes par animal, réalisé une seule fois). Cela permettra de sélectionner les bons animaux qui sont porteurs des gènes d’intérêt. L’ensemble des souris génétiquement modifiées, porteuses du génotype d’intérêt seront sujettes à une injection en intrapéritonéal (injection à l’âge adulte sur animal vigile, P60, sur cinq jours consécutifs), cela permettra de supprimer la présence de la protéine A dans les oligodendrocytes de ces souris. Puis, une partie de ces souris sera inclue dans une expérience de sociabilisation (hébergement groupé ou isolé pendant huit semaines, puis à l’issue de ces huit semaines, évaluation de la sociabilisation par un test non invasif de 50 minutes au total). Une autre partie des souris sera sujette à une chirurgie à P90 afin de créer une lésion démyélinisante et observer comment l’absence de la protéine A affecte les capacités de la souris à remyéliniser cette lésion. Cette chirurgie sera effectuée une seule fois (une heure au total au maximum), par une personne compétente sur souris anesthésiées et analgésiées avant, pendant et après l’opération. Elles seront suivies de près en postopératoire afin de détecter au plus tôt les signes de souffrance ou d’infection potentielle. Une partie de l’étude sera effectuée sur souris sauvages, non génétiquement modifiées. Ces souris recevront un traitement thérapeutique quotidien par voie orale pendant 6 semaines. L’euthanasie des animaux sera effectuée en fin de période de maintien par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Un stress peut être observé chez les souris transgéniques suite à la contention et à l’injection d’une molécule en intrapéritonéal (but de ce traitement : supprimer l’expression de la protéine A dans les cellules d’intérêt. Les nuisances attendues sont principalement liées à l’acte chirurgical lors de l’étude de la remyélinisation : injection au niveau de la moelle sous anesthésie générale de la souris (hypothermie, douleur au point d’injection, hématome, risque anesthésique, saignement, infections). Il est possible que les animaux soient stressés suite à l’étude en condition d’isolement. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress pour les animaux : nouvel environnement et manipulation. Une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage et au moment du tatouage au niveau de la pulpe digitale. L’identification et le prélèvement pour génotypage ont lieu au même moment.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés : -Soit avant le sevrage puisqu’ils ne seront pas porteurs du génotype d’intérêt -Soit à des fins expérimentales pour une étude structurelle de la myéline -Soit s’ils sont devenus trop vieux pur être utilisés comme reproducteurs
Remplacement
La myéline est une structure en trois dimensions : une extension de la membrane des oligodendrocytes qui s’enroule autour d’un axone électriquement actif. Suivant le principe de remplacement, nous avons déjà étudié en détail le rôle de la protéine A de manière in vitro (sur des cellules). Cependant, il est essentiel dans le cadre de cette étude, de passer par une étude in vivo (chez la souris) de la mutation afin de pouvoir observer la formation de la myéline impactée par toutes les interactions cellulaires présentes dans le cerveau. D’autant plus que nous voulons étudier le rôle de la protéine A sur la modulation de la myéline à l’âge adulte (myélinisation dite ‘adaptative’, modulée par l’expérience sociale) et sur la remyélinisation. Les interactions sociales et leurs impacts ne peuvent être observées que sur un animal complexe susceptibles d’interagir avec des congénères.
Réduction
Nous optimiserons l’utilisation de nos animaux (1640 souris). Ainsi, le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables. Toutes les expériences seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d’évaluer la présence éventuelle d’un sex-ratio. Toutes les quantifications se feront en aveugle. Nous travaillerons en étroite collaboration avec des statisticiens pour définir toutes les tailles d’échantillons et les tests statistiques appropriés (taille des effectifs calculés avec un calcul de puissance, test statistiques fiables pour une bonne interprétation des résultats).
Raffinement
L’animalerie est agréée, les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (coton, bâtonnet à ronger), d’alimentation et soins quand nécessaires seront contrôlés. Une période d’habituation à la manipulation par l’expérimentateur d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale pour ne pas stresser l’animal. Les animaux seront suivis régulièrement (deux fois par semaine de façon générale, tous les jours pendant une semaine après la chirurgie) et de manière adaptée aux différentes procédures par notre équipe et la zootechnie, ainsi que par notre vétérinaire. Pour la condition expérimentale d’animal hébergé de façon isolée, un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage (papier kraft, maison en carton). Les injections de cette étude seront toutes faites par des personnes compétences. La lésion de démyélinisation (chirurgie) sera pratiquée sous analgésie et anesthésie, et reste localisée pour éviter les conséquences d’une démyélinisation plus globale. Des points limites sont mis en place et respecter pour éviter toute souffrance, sans décision ou prise en charge rapide des animaux.
Choix des espèces
De toute évidence, l’étude de la myéline nécessite l’utilisation de modèles animaux vertébrés. En effet, seuls les systèmes nerveux de vertébrés sont myélinisés. De plus, puisque nous étudions une voie moléculaire spécifique dans l’établissement de la myélinisation avec une visée thérapeutique future, il est indispensable que le modèle que nous choisissions ait une forte homologie de séquence génétique de cette dite voie moléculaire avec l’Homme. Le modèle souris présente plusieurs avantages pour notre étude : c’est un vertébré dont les gènes codant la voie étudiée présentent une forte homologie de séquence avec ceux de l’Homme. La plasticité de la myéline, similaire à celle retrouvée chez l’Homme, a été bien établie chez la souris, ce qui nous permet de mener à bien nos expériences de plasticité et de sauvetage de la myéline à l’âge adulte. Les souris entretiennent de fortes interactions sociales (animal grégaire) qui vont être le contexte de l’étude ici (isolement versus groupe). Pour la génération de lignée de souris transgénique, les souris seront mises en accouplement à partir de 8 semaines (âge de maturité sexuelle). Pour l’étude sur la myélinisation adaptative, nous induirons la délétion de l’expression de la protéine A chez le jeune adulte (P60) et étudierons les conséquences de cette délétion plus tard, à P120. Ainsi, nous pourrons étudier comment l’absence de la protéine A influence le cerveau déjà formé (le cerveau adulte). Pour l’étude de la remyélinisation, nous induirons la délétion de l’expression de la protéine A (ou bien nous modulerons l’activité de cette protéine) chez le jeune adulte (P60). Nous effectuerons la lésion démyélinisante un mois après (donc à P90). L’étude des animaux sera ensuite effectuée à quatre stades post-chirurgie (4, 7, 14 et 30 jours après la lésion démyélinisante), afin d’observer successivement l’évolution des différents stades mis en jeu dans la remyélinisation.
Evaluation de l’activité et d’absence de toxicité de produits synthétiques de transfert d’acides nucléiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Le but affiché est de commercialiser des agents qui font entrer de l'ADN ou de l'ARN dans les cellules, et les essais sur des souris doivent en vérifier l'activité et l'absence de toxicité. 1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit jusqu'à trois injections, sous la peau, dans la veine, le muscle, le péritoine ou par le nez selon le produit, puis une prise de sang sous anesthésie avant d'être tuée pour l'examen de ses organes, avec un risque de thrombose, de réactions inflammatoires et de troubles de la démarche. Le porteur affirme que l'administration par voie locale ou générale est "nécessaire pour permettre de valider l'activité et l'absence de toxicité des produits", et choisit la souris parce qu'elle permet "d'induire une réponse inflammatoire facilement identifiable".
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le développement de solutions pour la production de thérapies biologiques, cellulaires et géniques. Le but est de commercialiser des agents pour libérer in vivo de l’ADN et de l’ARN. Dans le cadre des développements, de la production commerciale et des études de stabilité des produits précliniques et cliniques, des essais sur des modèles in vitro sont réalisés. Néanmoins, ces derniers ne reflètent pas le comportement des produits in vivo, notamment en termes d’activité et de toxicité. Pour cela, l’administration par voie locale ou systémique est nécessaire pour permettre de valider l’activité et l’absence de toxicité des produits. Ainsi, dans le cadre de ce projet, des vecteurs de transfection ou des acides nucléiques synthétiques seront testés chez la souris selon différents modes d’injection (sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou intra-nasal) en fonction de leur composition. L’objectif sera de valider l’efficacité de transfection in vivo, l’absence de toxicité mais aussi d’évaluer l’élimination des produits testés.
Bénéfices attendus
Ces agents, une fois testés chez la souris, pourraient être transférables à des applications thérapeutiques en clinique humaine. Ce projet aura pour but de dégager des conditions optimales d’utilisation du système ayant une bonne distribution dans différents types cellulaires et sans impact toxique sur la souris.
Procédures
Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection (durée 2-3 minutes). On réalisera ensuite un prélèvement sanguin (durée 2-3 minutes) avant l'euthanasie en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection et un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3%). Une potentielle toxicité suite aux injections pourra être observée dans ces études, avec notamment un risque de thrombose, de réactions pro-inflammatoires, ou encore du trouble du comportement en particulier de la démarche.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales afin de collecter les organes pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d'évaluer l'administration de produits de transfection délivrant ADN ou ARN. Les premières évaluations seront réalisées in vitro, dans des systèmes cellulaires. Les réactifs retenus seront ensuite évalués in vivo, en vue d'utilisation dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, de l'immunothérapie et de la vaccination.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé suite à des projets précédents. Nous avons effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que l’effectif de 6 animaux pour chaque condition utilisée dans l'étude constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux. Le test statistique utilisé sera un test paramétrique (comparaison des animaux traités avec des animaux contrôles).
Raffinement
Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.
Choix des espèces
Le systèmes évalués dans ce projet sont essentiellement utilisés dans les phases de recherche, qui sont majoritairement effectuées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux standardisés comme la souris permet d’induire une réponse inflammatoire facilement identifiable. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 semaines, âge qui permet d'identifier une activité maximale des produits lipidiques, autrement dit des réactifs de transfection.
Rôle du récepteur au Tumoral Necrosis Factor de type 2 (TNFR2) des lymphocytes T régulateurs (Treg) au cours des états d’immunosuppression induite par les infections sévères
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
1 424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans le plexus veineux derrière l'œil, par la trachée, par gavage ou dans l'abdomen, et sont infectées par des bactéries pour provoquer un sepsis suivi d'une perte de poids et de poils hérissés. Le porteur indique retenir un inoculum faible censé éviter la mortalité, et précise qu'aucun anti-inflammatoire ne peut être administré sur un projet portant sur le système immunitaire. Il étudie le rôle de lymphocytes régulateurs dans l'immunodépression qui suit une infection sévère et affirme que seule l'étude in vivo permet cette approche globale.
Objectifs
Notre laboratoire a montré que suite d’une infection sévère, une cicatrice immunitaire se mettait en place, avec des perturbations prolongées des capacités des organismes à se défendre contre une nouvelle infection. Cette cicatrice immunitaire associé à un plus haut risque de complication infectiologique secondaire est associée à l’apparition de plusieurs populations de lymphocytes dont l’activation des lymphocytes dit « T régulateurs » spécialisés dans le contrôle de l’inflammation. Nous avons montré qu’une sous population ces lymphocytes T régulateurs porteur d’un récepteur de type 2 au Tumoral Necrosis Factor (aussi appelé TNFR2) jouaient un rôle majeur la survenue de cette immunodépression faisant suite à une infection sévère. Les objectifs du projet sont de caractériser le rôle de ces populations de lymphocytes T régulateurs porteur du récepteur TNFR2 au cours de la défense anti-infectieuse et lors de la phase d’immunodepression post-septique.
Bénéfices attendus
Notre projet nous permettra d’améliorer nos connaissances des mécanismes d’extinction des capacités de réaction du système immunitaire faisant suite à une infection sévère aussi appelée immunosuppression post-septique (IS). Ce projet nous aidera à comprendre les modifications induites par le sepsis sur les fonctions des lymphocytes des Treg et les conséquences de ces modifications au cours d’une 2ème infection. Ceci nous permettra la mise en place de traitements adaptés pour lutter contre les infections bactériennes.
Procédures
Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-veineuse retro-orbitale sous anesthésie générale. Un tiers des animaux de ce projet est soumis à une administration intra-trachéale sous anesthésie générale. Deux tiers des animaux sont soumis à une administration unique per os (sonde de gavage pour l’administration du traitement) en condition vigile. Un tiers des animaux est soumis à des injections intrapéritonéales en condition vigile. Tous les gestes sont de courte durée (au maximum 1 minute) et pour les souris anesthésiées, le réveil est quasiment instantané. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées d’analgésiques pourraient être réalisées.
Impact sur les animaux
Modèles d’infection bactérienne : Le modèle d’infection par administration de bactéries par voie intra-veineuse, a déjà été validé dans ce projet, nous utiliserons des souches bactériennes de référence de laboratoire. Nous réaliserons une injection dans le plexus veineux sous orbitaire d’une suspension bactérienne. Suite à l’administration de bactéries (inoculum faible concentration) par voie intra-veineuse, une inflammation est attendue durant les 4 premiers jours avec comme signes cliniques une perte de poids inférieure à 20% et des poils hérissés, suivis d’une récupération progressive de leur poids au 5ième jour du sepsis. Cette injection entraine une septicémie sans induction de mortalité, permettant d'évaluer l'impact d'une seconde infection et d'éviter les biais de sélection. Les procédures de gavage et de transfert adoptif utilisées au cours des procédures expérimentales n’induisent pas d’effets indésirables connus chez la souris. La pesée de référence est réalisée au J0 avant le début de l’induction du sepsis ou de tout autre procédure. Avec l’utilisation d’un inoculum bactérien faible pour l’induction du sepsis (permettant de reproduire l’IS), aucun signe de souffrance n’est observé en dehors d’une perte de poids inférieure à 20% et les poils hérissés. L’effet de la délétion du TNFR2 sur les Treg sur le sepsis. Il est envisageable que les Treg étant moins suppresseurs, les effets du sepsis sur l’état général des souris pourraient être plus marqués. Il en est de même pour l’effet du traitement par des anticorps anti-TNFR2 sur le sepsis. Pour ces raisons, Les animaux seront observés quotidiennement pendant 3 jours après l’induction du sepsis et pesés tous les 48 à 72h de façon à s’assurer que s’il y des effets, ils ne soient pas durables dans le temps. Les modèles d’inflammation respiratoires aiguës sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (inférieure à 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Les mécanismes responsables d’une immunosuppression suite au sepsis sont à l’heure actuellement mal compris. Les méthodes in vitro développées par d’autres laboratoires de recherche ne permettent pas une étude globale des modifications entrainées par une activation du système immunitaire. L'étude du rôle des Treg dans cette maladie et la mise au point de nouveaux traitements ne peut se faire qu'in vivo. Cependant, dès que la question scientifique le permet nous privilégions l’utilisation de méthodes substitutives (méthode in vitro et ex vivo) pour y répondre. Nous avons développé des protocoles de culture de Treg primaires permettant de disposer d’une grande quantité de Treg.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=7) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Le test statistique utilisé sera une Anova suivie d’un test post-hoc. Une valeur de p inférieure à 0,05 sera considérée comme significative.
Raffinement
L’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation par scoring des points limites adapté aux modèles a été mis en place. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de buprénorphine seront réalisées. L’utilisation d’anti-inflammatoire n’est pas possible dans le cas de projet sur le système immunitaire. Comme indiqué dans notre tableau de points limites, il est également prévu un apport d’enrichissement en cas de signes cliniques légers ou modérés, définis par les scores de 1à 14 suivant notre échelle de suivi (cf annexe). Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d’anesthésiant local afin d’anesthésier localement la trachée. Une anesthésie générale est réalisée pour les procédures d’injection intraveineuse. Pour les injections IV en retro-orbital, en plus de l'anesthésie par inhalation, une anesthésie ophtalmique sera réalisée sur l'œil qui recevra l'injection. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent aucun phénotype dommageable, en comparaison des souris contrôles, elles ne développent aucune forme de maladie apparente même à l’âge d’un an.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infections bactériennes sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature
Impact de la « cellule d’origine » sur le phénotype de la tumeur
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Chaque souris, immunodéficiente et pré-pubère, subit deux chirurgies pour l'"humanisation" d'une glande mammaire puis la greffe de cellules tumorales humaines, et développe ensuite une tumeur du sein. Le porteur reconnaît le développement d'une pathologie potentiellement grave et cherche à comprendre comment la "cellule d'origine" façonne le type de tumeur. Il valide des étapes préalables in vitro mais juge le modèle in vivo "indispensable" pour reproduire l'environnement tumoral.
Objectifs
Au cours des dix dernières années, les progrès des technologies de séquençage et de la biologie computationnelle ont conduit à une nouvelle ère de médecine de précision en oncologie. Les tests génomiques permettent d'adapter la prise en charge clinique à chaque patient cancéreux en fonction des altérations génomiques des cellules cancéreuses. L'état actuel de l'oncologie de "précision" repose sur l'administration de médicaments ciblés capables de contrôler les voies mutées. Malgré les grands espoirs que suscite cette approche, seule une fraction des cancers répond aux interventions "ciblées". Le succès décevant de la médecine génomique dans le domaine du cancer est dû à une relative inefficacité à détecter des altérations exploitables ainsi qu’à un manque de compréhension fonctionnelle de la dépendance des voies moléculaires d'une masse tumorale donnée. Il est donc crucial de définir le schéma cellulaire et moléculaire de causalité conduisant à la progression tumorale et à la résistance thérapeutique. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment l'initiation du cancer du sein peut conduire à différents sous-types de tumeurs mammaires avec une réponse spécifique aux thérapies. Plus précisément, nous voulons examiner comment la cellule de l’épithélium mammaire soumise à la première agression oncogénique - la "cellule d'origine" - peut avoir un impact sur la tumeur résultante en termes de paysage moléculaire et de réponse au traitement. Dans ce but, nous voulons mettre en place un modèle expérimental dans lequel nous pouvons suivre l'effet d'un oncogène sélectionné dans différentes cellules à l'origine de la hiérarchie de différenciation de l'épithélium mammaire et ensuite étudier la tumeur résultante.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre comment une agression oncogénique donnée dans des cellules différentes de l’épithélium mammaire (les cellules d’origines) donne naissance à des tumeurs dont les caractéristiques phénotypiques et l’agressivité varient. Ceci permettra par la suite de mieux comprendre les mécanismes de l’initiation tumorale et de prédire l’évolution d’une tumeur et sa réponse aux traitements.
Procédures
L’ensemble des animaux subira deux procédures chirurgicales (sous anesthésie+analgésie) : l’humanisation de la paire de glandes mammaires numéro 4 qui durera environ 20 minutes et l’implantation des cellules tumorales dans la glande mammaire humanisée qui durera approximativement 15 minutes. L’induction in vivo sera réalisée par l’injection ip de doxycycline qui durera quelques secondes pour chaque souris.
Impact sur les animaux
Les animaux seront transplantés avec des cellules tumorales et développeront donc une pathologie potentiellement grave. Les gestes chirurgicaux et l'anesthésie associée ainsi que l’injection de doxycycline constitueront une nuisance sur les animaux. Les manipulations et les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
A l'issue de la procédure, les souris seront mis à mort et les tumeurs seront prélevées, dissociées afin d’analyser l’immunophénotype et les caractéristiques moléculaires des cellules tumorales.
Remplacement
En amont de l’étape in vivo, l’expression des oncogènes et leur impact seront validés in vitro avant d’envisager leur transplantation. Cependant, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma, l’angiogenèse péritumorale, le contexte cytokinien, sont des mécanismes cruciaux lors de la croissance tumorale et qui ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro et c’est pourquoi le modèle expérimental in vivo reste actuellement indispensable.
Réduction
Nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant l’obtention de résultats statistiquement robustes. Pour cela, nous nous appuierons sur la méthodologie de calcul disponible sur le site http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/ qui permet d’estimer statistiquement la fréquence de cellules à l’origine de l’apparition de tumeurs.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture et eau ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de des lanières de papier compacté utiles à la nidification et d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. Les procédures de transplantation seront réalisées sous anesthésie associée à une analgésie afin d’éviter toute douleur. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l’apport d’un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). Des souris pré-pubères de 3 à 4 semaines seront incluses dans les procédures expérimentales, avant le développement du tissu épithélial mammaire. En effet, le développement de la glande mammaire est un processus postnatal. A la naissance, chez la souris, le rudiment mammaire comprend un canal primaire bien formé et quelques ramifications secondaires. La glande mammaire reste quiescente jusqu’au début de la puberté (4 semaines), puis les canaux mammaires s’allongent et se ramifient intensivement, envahissant progressivement tout le stroma adipeux qui entoure la glande. Il est donc nécessaire de faire la résection de la glande mammaire et l’injection de fibroblastes humains avant la formation des canaux mammaires afin d’« humaniser » la glande mammaire murine. Deux à quatre semaines après l’« humanisation » des glandes mammaires, les souris pourront alors être greffées avec des cellules épithéliales mammaires humaines transformées par des oncogènes classiques des cancers du sein chez la femme.
Analyse de l’innervation cornéenne en imagerie in vivo chez des souris agées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Une lésion est provoquée sur la cornée de chaque animal, qui subit ensuite jusqu'à cinquante-deux séances d'imagerie sous anesthésie, à raison d'une par semaine pendant un an. Le porteur reconnaît que la répétition des anesthésies peut entraîner une détresse respiratoire et une opacification de la cornée. Il étudie le vieillissement de l'innervation cornéenne et juge l'animal "indispensable", sans alternative in vitro.
Objectifs
Les maladies de la cornée sont la deuxième cause de cécité dans le monde après la cataracte. Leur origine peut être génétique, dégénérative (vieillissement, diabète) et/ou environnementale. Il est donc essentiel de mieux comprendre la physiologie de la cornée pour proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients souffrant de défauts de la cornée. L'atteinte de l'innervation cornéenne se traduit par des symptômes allant d'une diminution de la sensibilité oculaire sans lésion cornéenne au syndrome de l'oeil sec en passant par la kératite neurotrophique et la perforation cornéenne. Actuellement, il n'existe aucun traitement disponible en routine pour la gestion de l'innervation cornéenne. Dans ce projet, nous souhaitons étudier comment l’innervation cornéenne est affectée par le vieillissement. Grâce à des techniques d’imagerie en temps réel combinés à l’utilisation de souris transgéniques, nous sommes capables de suivre l’innervation de la cornée des souris au cours du temps.
Bénéfices attendus
La bonne compréhension des mécanismes de dégénérescence de l’innervation de la cornée ainsi que les interactions se produisant entre les nerfs et les cellules immunitaires pourront servir de base pour développer et tester des traitements contre la dégénérescence de l’innervation cornéenne
Procédures
Un partie des animaux recevra une injection unique par voie intrapéritonéale (réalisé sur animal vigil, l'acte dure moins de 1 min par animal). L'induction de la lésion de l'épithélium cornéen concerne tous les animaux du projet, l'acte est réalisé sous anesthésie, par une personne expérimentée et dure moins de 5 min par animal. Chaque animal sera imagé 1x par semaine pour une durée allant jusqu'à 1an (soit 52 sessions d'imagerie réalisées sous anesthésie d'une durée de 40-45min chacune). Les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation par une méthode réglementaire en vue des prélèvements et analyses complémentaires.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux recevront une injection unique en intrapéritonéale. Au moment de la réaliser, la contention et l'introduction de l'aiguille peut être source de stress pour les animaux. Pour réaliser ce projet, nous allons induire une lésion de l'épithélium cornéen chez les animaux pour étudier la réinnervation de la cornée. Cette lésion induit une perte de sensation au niveau de la cornée. L'imagerie en temps réelle est non invasive et n'engendre pas de douleur à l'animal. Cependant, la répétition des anesthésies peuvent augmenter le risque de détresse respiratoire lors de celles-ci. Toute difficulté respiratoire (gasp) entraînera l’interruption de la procédure en cours. Egalement, les sessions d'imageries répétées peuvent provoquées dans de rares cas une opacification de la cornée des animaux étudiés. L'anesthésie peut dans de rare cas amené un stress thermique ou une potentielle détresse restpiratoire chez les animaux.
Devenir
A l'issus de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques complémentaires (les yeux seront prélevés et l'ensemble des cornées des animaux sera disséqué).
Remplacement
Du fait de la complexité de la complexité de l’innervation cornéenne et des interactions avec les cellules immunitaires et le tissu épithélial de la cornée, l’utilisation de l’animal nous est indispensable. Il n’y a pas d’alternative par des modèles in vitro.
Réduction
Ce projet impliquera au maximum 150 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique de ce projet. Un test de puissance a été réalisé pour determiner le nombre minimal d'animaux requis. Des tests statistiques adéquats seront utilisés pour analyser les résultats obtenus.
Raffinement
Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Des points limites ont été définis (tels que la surveillance du poids des animaux, l'absence de locomotion, l'état du pelage, la prostration). Pour l'étape d'induction de la lésion et pour les sessions d'imagerie, les rongeurs bénéficieront d'une anesthésie gazeuse complémenté par une anesthésie locale de la cornée.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet plus de 98 pourcent de son génome est identique à celui de l’Homme. Par ailleurs, ce modèle permet la transgénèse et donc de pouvoir étudier in vivo les conséquences de la délétion d’un gène. La souris, et en particulier avec le fond génétique C57Bl6J, est un modèle utilisé depuis de très nombreuses années pour l’étude du système nerveux et de l’innervation cornéenne. De ce fait de nombreuses données sont déjà disponibles sur lesquelles notre étude peut se reposer. Le modèle animal est requis pour ce projet car seule l'utilisation d'animaux transgéniques permet de visualiser les interactions entre les neurones et les cellules immunitaires. Il a été observé une dégénérescence de l'innervation cornéenne à partir de 6ème mois, due au vieillissement des animaux. Ainsi, nous induirons les lésions de l'innervation de la cornée au 6ème mois de vie des animaux pour étudier le potentiel de régénération de l'innervation dans un contexte de vieillissement. Comme il n'est pas attendu d'effet lié au sexe des animaux, nous utiliserons indifféremment les souris mâles et femelles.
Exploration des effets de la kétamine aux niveaux comportemental et électrophysiologique dans un modèle de dépression.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
450 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent six semaines de stress chronique destiné à provoquer un état anxio-dépressif chez la moitié d'entre eux, quatre-vingt-dix d'entre eux étant en outre opérés pour l'implantation d'électrodes intracérébrales, avant des tests comportementaux de locomotion et d'anxiété. Le porteur reconnaît que le protocole de stress peut induire de l'agressivité entre congénères et impose un isolement en cage individuelle. Il cherche des biomarqueurs de la réponse à la kétamine et affirme qu'on ne peut se passer de l'"animal entier" pour ce type d'exploration.
Objectifs
Dans le cadre de la dépression, il existe une catégorie de patients résistants aux traitements conventionnels, qu'ils soient pharmacologiques ou basés sur la stimulation transcrânienne. Récemment, la kétamine a été proposée pour ses effets bénéfiques chez ce type de patients. Notre étude fait partie d'un projet translationnel, comprenant un versant clinique et un versant préclinique. Dans notre laboratoire elle a pour but de déterminer chez un modèle animal de dépression résistante aux traitements conventionnels, des biomarqueurs permettant de mieux comprendre et prédire la réponse à la kétamine.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de révéler les biomarqueurs les plus pertinents de la réponse à la kétamine comme traitement antidépresseur afin d'améliorer nos connaissances sur ces effets et améliorer la prise en charge des patients et leur orientation vers un tel traitement.
Procédures
Dans le projet, 180 rats seront soumis à un protocole de stress léger chronique pendant 6 semaines en tout, lors d'une première session d'une durée de 4 semaines, puis lors d'une deuxième session d'une durée de 2 semaines à la suite de procédures comportementales. Ce protocole de stress léger chronique comportera plusieurs situations stressantes légères - une par jour - d'une durée allant de 6 à 12 heures. Quatre-vingt-dix des 450 rats seront soumis à une opération chirurgicale sous anesthésie gazeuse et analgésie d'une durée de 150 minutes. Tous les rats seront soumis à 3 sessions de tests comportementaux visant à analyser leur comportement locomoteur (durée 24h) ou d’anxiété (durée moyenne de 5 minutes) répartis sur 2 sessions de 1 semaine et 1 session de 2 semaines avec une durée de 2 jours entre chaque test quand il y en aura plusieurs.
Impact sur les animaux
L’exposition à des situations stressantes légères répétées induit du stress pouvant conduire sur 50% des rats à l’apparition d’un comportement anxio-dépressif incluant notamment une prise de masse inférieure sur la durée du protocole de stress comparé à des rats non stressés, ce qui est l’objet de la question ; de plus, l’une des situations stressantes pourrait induire de l’agressivité entre congénère, qui serait immédiatement arrêtée si elle se produisait. La chirurgie peut induire de l’inflammation et une perte de masse transitoires. Les tests comportementaux peuvent induire un stress transitoire.
Devenir
Les rats seront mis à mort à des fins expérimentales dans toutes les procédures, soit, dans le cadre de la procédure expérimentale 1, pour vérifier histologiquement la position des électrodes d'enregistrement intra-encéphaliques, soit, dans le cadre des procédures expérimentales 2 et 3, pour prélever le cerveau afin de pratiquer les mesures correspondant à chaque procédure expérimentale (procédure expérimentale 2: électrophysiologie in vitro; procédure expérimentale 3: mesure de régulations génétiques et épigénétiques).
Remplacement
Il n'est pas possible de se passer de l'animal entier dans des études visant à étudier une stratégie thérapeutique dans le cadre de la dépression, avec des explorations comportementales incluant des tests d'anhédonie et d'anxiété.
Réduction
L’étude a été mise en place afin de réduire le nombre de rats utilisés selon les contraintes statistiques. Notre expérience nous a appris que les résultats lors des tests comportementaux suivent une loi normale avec un effectif de 15 rats par groupe selon une analyse de pouvoir statistique. Ce nombre de 15 rats par groupe sera appliqué aux rats témoins ; en ce qui concerne les rats soumis au SLC, comme le protocole de SLC entraine un phénotype anxiodépressif chez 50 % des rats ("vulnérables"), les 50 % restant étant "résistants", il faudra donc, pour obtenir des groupes de 15 rats, doubler le nombre de rats soumis au départ SLC, par rapport au nombre de rats témoins. Les données obtenues seront analysées statistiquement afin d'observer les conséquences comportementales néfastes du SLC et si ces dernières sont contrecarrées par l'administration de kétamine.
Raffinement
Tout sera mis en oeuvre pour limiter la souffrance et l'inconfort des animaux tout au long de cette étude. Si les animaux soumis au protocole de stress léger chronique devont être en cage isolée, les animaux des groupes témoins seront maintenus à 2 par cage avec des pièces de bois à ronger constamment présentes. Les procédures chirurgicales se feront sous anesthésie générale et analgésie. La température corporelle des animaux sera maintenue pendant toute la durée de la procédure chirurgicale, ainsi que pendant la phase de réveil, grâce à un tapis chauffant. Pendant les deux semaines suivant la chirurgie les animaux seront suivis quotidiennement et leur état général évalué selon une grille de scoring validée par notre structure du bien être animal. En cas de signes d'infection suite à la procédure chirurgicale, ou en cas de blessure ou de mal-être pouvant survenir suite à certaines situations du protocole de stress léger chronique, des décisions seront prises en accord avec la structure du bien-être animal et la vétérinaire référante.
Choix des espèces
Le Rat est un bon modèle de la physiologie humaine en ce qui concerne les réseaux cérébraux impliqués dans la réponse au stress et la dépression. L'exposition à un protocole de stress léger chronique est un modèle validé et reconnu en ce qui concerne la dépression résistante aux traitements conventionnels. Il a de plus été démontré que la kétamine produit des effets antidépresseurs sur ce modèle. Nous utiliserons des animaux adultes au moment du démarrage de la procédure de SLC car nous avons besoin d’un système nerveux arrivé à maturité afin de constater les effets du stress et de la kétamine.
Production d’antigènes de parasite permettant de fabriquer des tests de diagnostic
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Tests réglementaires
6 000 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Chaque animal est infesté par des larves de schistosome qui pénètrent sa peau lors d'un pataugeage, laissé porter le parasite pendant 49 jours au maximum, puis saigné à mort sous anesthésie pour récolter les vers adultes. Le porteur revendique une infestation indolore et arrête la maturation avant l'apparition des symptômes, mais l'objet du projet reste la production en série d'antigènes pour des tests de diagnostic commercialisés. Il affirme le recours à l'animal comme obligatoire, aucune culture in vitro ne maintenant le cycle du parasite.
Objectifs
La Bilharziose ou schistosomose est une maladie parasitaire humaine, classée seconde après le paludisme. Environ 600 Millions de personnes vivent en zone d’endémie et 200 millions de personnes sont infectés. Le cycle biologique comprend deux hôtes obligatoires : un hôte vertébré et un hôte mollusque vecteur. Les passages entre les hôtes se font grâce à des larves nageantes qui pénètrent par la peau de l’hôte cible. Comme toutes les maladies infectieuses le diagnostic est un élément clef dans le contrôle de l’infection. Dans les pays du Nord les diagnostics directs qui identifient la présence active du parasite prennent peu à peu la place des diagnostics indirects qu’ils soient sérologiques ou parasitologiques. Dans les pays du sud, le développement d’outils de diagnostics direct ne sont pas encore développés et les diagnostics indirects sérologiques sont largement majoritaires. Les diagnostics sérologiques détectent les anticorps présents dans le sang du patient lorsqu’il a été contaminé. Pour ce faire, ces tests incluent des protéines appelés antigènes provenant du parasite, qui vont réagir en présence des anticorps contenus dans le sérum des personnes infectées. Aujourd’hui, il n’existe aucune méthode permettant de maintenir le cycle du parasite in vitro. De plus, les schistosomes sont des organismes trop complexes en termes de diversité antigénique pour être « simplifiés » par un seul antigène synthétique ou même par un cocktail d’antigène synthétique. Dans ce contexte, il est nécessaire de produire des antigènes provenant des deux espèces majeures qui infectent l’être humain, Schistosoma mansoni et Schistosoma haematobium. Les vers adultes ou les œufs du parasite sont extraits à partir de hamsters infectés par des larves de ces pathogènes. Par la suite, des extractions sont effectuées pour isoler les antigènes et les intégrer dans les tests sérologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de récupérer des vers adultes et des œufs des parasites du genre Schistosoma sp. qui permettront de produire des antigènes natifs du parasite. Ces antigènes sont indispensables dans la fabrication de kit de diagnostics médicaux humains.
Procédures
Les rongeurs sont soumis à la phase d'infestation qui se fait de manière naturelle, par pataugeage dans un petit volume d'eau contenant les larves du parasite. Cette étape se fait en une fois et dure une heure. Une fois sous anesthésie les animaux sont soumis à un prélévement sanguin qui conduira à la mort de l'animal.
Impact sur les animaux
L’infestation par les schistosomes provoque une nuisance chronique chez le rongeur par accumulation des œufs notamment dans le foie et les intestins. Les symptômes visuels attendus sur les rongeurs peuvent survenir à partir de deux mois. C’est pourquoi le délai de maturation au cours de ce projet est de 49 jours maximum, afin que les animaux ne subissent pas les symptômes de la parasitose.
Devenir
Le but du projet est de produire des parasites du genre Schistosoma. A la fin du projet, les animaux sont euthanasiés afin de récupérer les parasites adultes.
Remplacement
Le passage par l'animal de laboratoire est obligatoire car on ne peut pas réaliser le cycle in vitro. En effet, le parasite a besoin d’un hôte vertébré et les rongeurs sont connus pour être des animaux réservoirs chez toutes les espèces de schistosomes. De plus, dans les tests sérologiques il n’est pas possible de remplacer la complexité/diversité des protéines natives par une ou plusieurs protéines recombinantes.
Réduction
Expérimentalement les schistosomes infestent : la souris, le hamster et le cobaye. Le hamster est le meilleur hôte, c’est-à-dire celui qui permet de recueillir le plus grand nombre de parasites avec l’utilisation minimale d’individus, sans ressentir aucune souffrance ou mortalité précoce de l’animal. Les schistosomes sont de petits organismes et la quantité nécessaire de vers pour fabriquer les tests de diagnostic justifie l’utilisation de 1200 hamsters par an.
Raffinement
Nous avons fixé le nombre optimal de parasites proposés lors de l’infestation afin d'assurer la production optimale de vers sans engendrer de mortalité prématurée de l’animal. Nous avons donc établi i) la meilleure espèce hôte, ii) la meilleure dose de parasite et iii) le temps de développement optimal pour minimiser le nombre d’animaux à utiliser et éviter la souffrance. Le protocole a été établi pour éviter tout signe de souffrance ou de stress. L’infestation par pataugeage est la forme d’infestation naturelle chez les rongeurs dans le milieu naturel, elle est indolore. Pendant le développement du parasite dans l’animal, une surveillance quotidienne par les zootechniciens est effectuée. Les animaux bénéficient d’enrichissements de milieu permettant qu’ils aient des activités ludiques et sociales. Les animaux ne sont jamais seuls dans leurs cages. La mortalité ne survient quasiment jamais à l’issue de l’infestation. Cependant, durant cette période, tout rongeur retrouvé en souffrance, c’est-à-dire ayant atteint les points limites pourra-t-être euthanasié par un personnel habilité.
Choix des espèces
Le hamster a été choisi car cette espèce permet de recueillir le plus grand nombre de parasites avec l’utilisation minimale d’individus, sans ressentir aucune souffrance ou mortalité précoce de l’animal. Les animaux utilisé sont de jeunes adultes de 6-semaines d’âge pour éviter les mortalité lors de l’infestation
Induction de la satiété par électrostimulation des voies nerveuses sympathiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 523 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance majoritairement sévère (1 506 individus). Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec pose de fibre optique et injection intracérébrale de virus, l'implantation d'électrodes spinales ou abdominales, un régime gras et sucré destiné à les rendre obèses, puis des séances répétées d'électrostimulation sur cinq semaines. Le porteur reconnaît que ces impulsions peuvent déclencher des comportements d'automutilation, auquel cas la stimulation est arrêtée. Il vise un dispositif médical contre l'obésité et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut aborder la question, la souris restant selon lui un prérequis réglementaire au développement préclinique.
Objectifs
Ce projet vise à développer une méthode médicale pour traiter l'obésité en utilisant une technique d'électrostimulation du système nerveux. Contrairement aux traitements médicamenteux actuels, qui ont montré une faible efficacité dans la perte de poids, les interventions chirurgicales comme le bypass gastrique sont actuellement les options les plus efficaces pour traiter l'obésité. Cependant, ces interventions chirurgicales sont irréversibles et peuvent présenter des risques à long terme ainsi que des effets indésirables. Des études récentes ont suggéré que les effets bénéfiques du bypass gastrique sont liés au système nerveux sympathique. En conséquence, la stimulation électrique de ce système pourrait représenter une alternative moins invasive à la chirurgie pour traiter l'obésité. Plusieurs données scientifiques soutiennent cette approche, notamment la démonstration de l'inhibition des signaux nerveux spécifiques responsables de l'augmentation de la prise alimentaire. Le développement d'un dispositif médical utilisant l'électrostimulation du système nerveux pour réguler la prise alimentaire et le métabolisme pourrait être une solution prometteuse pour lutter contre l'obésité. Dans ce projet, l'objectif est d'étudier l'effet de l'électrostimulation du système nerveux sur la régulation de la prise alimentaire. Pour cela, des souris génétiquement modifiées sont utilisées comme modèle animal, permettant de surveiller en temps réel l'activité des neurones responsables de la satiété chez l'animal éveillé.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de réduire efficacement le poids chez les personnes obèses ou en surpoids. Cependant, cette surcharge pondérale peut entraîner plusieurs problèmes de santé tels qu'une élévation de la tension artérielle, un excès de triglycérides et un excès de sucre dans le sang, pouvant à long terme conduire au diabète de type 2 et/ou à des maladies cardiovasculaires (infarctus) et/ou hépatiques (cirrhose). Par conséquent, le développement de traitements plus efficaces est nécessaire pour lutter contre l'obésité. Les expériences menées dans le cadre de ce projet nous permettront d'évaluer, dans un modèle préclinique, les effets de l'électrostimulation des nerfs périphériques ou de la moelle épinière sur la perte de poids chez des animaux rendus obèses.
Procédures
Dans une première série d'expériences, les animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 30 minutes au cours de laquelle nous poserons une fibre optique et réaliserons une injection intracérébrale de virus à l'aide d'un cadre stéréotaxique. Les souris seront soit sacrifiées 3 semaines après la chirurgie par surdosage d’anesthésique pour le prélèvement des cerveaux après perfusion intracardiaque, soit suivies pour un enregistrement en fibre optique pendant 3 sessions d'une heure après un jeûne de 5 heures sur 10 jours, avec isolement en cages individuelles pendant la durée de l'enregistrement. Aucun prélèvement n'est prévu pour cette procédure. Dans d'autres expériences, les animaux subiront deux procédures chirurgicales de moins d'une heure chacune. La première consistera à poser une fibre optique et à injecter par voie intracérébrale un virus, le tout après avoir immobilisé la tête de l'animal sur un cadre stéréotaxique. La seconde consistera à implanter des électrodes de stimulation au niveau spinal ou abdominal. Une semaine après la chirurgie, les animaux seront mis à jeun pendant 5 heures, puis seront soumis à une électrostimulation après avoir été isolés en cages individuelles. Cette électrostimulation sera effectuée selon différents protocoles pendant une durée maximale de 5 semaines, avec un total de 30 sessions de stimulation de 10 minutes par semaine, réparties sur 3 jours hebdomadaires. Aucun prélèvement n'est prévu pour cette procédure. Enfin, concernant certains animaux, ils seront nourris avec un régime enrichi en graisses et en sucres pendant 9 semaines. Ensuite, ces animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 45 minutes, comprenant l'implantation d'électrodes de stimulation au niveau spinal ou abdominal. Une semaine après la chirurgie, les animaux seront placés dans des cages métaboliques pour habituation pendant une semaine puis seront électrostimulés pendant 10 minutes avant chaque repas (fournis toutes les 2 heures) en suivant différents schémas temporels. Cette électrostimulation sera poursuivie pendant 3 semaines avant la mise à mort. Aucun prélèvement n'est prévu.
Impact sur les animaux
Toutes les expériences présentées dans cette demande comportent une phase chirurgicale incluant les éléments suivants : • Injection sous-cutanée d'analgésique préopératoire ; • Perte de poids et douleur durant les 2 à 3 premiers jours chez les animaux après l'intervention chirurgicale ; • Surveillance et manipulation des animaux durant les 4 jours de récupération post-chirurgicale (pesée, palpation) ; • Risques chirurgicaux inhérents à toute opération chirurgicale, tels que les risques d'infection ou de rupture des fils de suture ; • Mobilité entravée par la connexion aux générateurs externes pendant la période d'enregistrement et d'électrostimulation. Par ailleurs, les impulsions électriques peuvent causer un inconfort temporaire chez l'animal, ce qui nécessitera une évaluation et une limitation de la durée au maximum. De plus, certaines expériences impliquent un changement de régime alimentaire pouvant entraîner une prise de poids anormale chez cette souche murine et éventuellement des problèmes de malocclusion. Enfin, bien que les animaux soient en général hébergés avec leurs congénères, des périodes d'isolement (hébergement individuel) seront nécessaires : • pendant les enregistrements par fibre optique (maximum 5 heures par jour, tous les deux jours, pendant une durée maximale de 5 semaines) et • lors du suivi métabolique dans des cages dédiées (3 semaines en tout).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort dès la fin des expériences pour des analyses anatomopathologiques et histologiques.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucune méthode in vitro ou in silico scientifiquement validée pouvant servir d'alternative à l'expérimentation animale pour aborder les questions soulevées par ce projet. En effet, l'étude de l'obésité ne peut être adéquatement réalisée in vitro en raison de sa nature complexe. Elle requiert une approche in vivo, prenant en compte l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. Ainsi, l'utilisation d'une espèce le plus proche possible de l'espèce humaine s'avère nécessaire, car la physiologie digestive est caractéristique de chaque groupe phylogénétique. Par exemple, l'utilisation d'animaux modèles de type insectes ou nématodes n'est pas réaliste pour de telles études. En revenanche, la souris posséde un système digestif proche de celui de l'homme même s'il présente des spécificités dont nous devrons tenir compte. Par ailleurs, l'usage d'un modèle expérimental in vivo murin s'avère essentiel en tant que prérequis pour la phase de développement préclinique, selon les autorités régulant la mise sur le marché de dispositifs médicaux.
Réduction
Le nombre de souris a été minimisé tout en restant suffisant pour obtenir des résultats exploitables. Compte tenu de l'expérience pratique des chercheurs, nous estimons qu'un maximum de 17 souris sera nécessaire pour élaborer les différentes étapes du modèle pour la mise au point de la phase chriurgicale. Les chercheurs ont déjà utilisé des points de repère anatomiques et pratiqué des gestes chirurgicaux sur des cadavres de souris, mais l'utilisation d'animaux vivants est nécessaire avant de passer à la phase d'optimisation des paramètres de stimulation. Quant à la deuxième phase, étant donné que le nombre de paramètres d'électrostimulation possibles est pratiquement infini et afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, nous utiliserons des modèles de régression linéaire. Nous estimons qu'au maximum, 582 souris seront nécessaires pour cette procédure. Ce nombre total de souris est une estimation maximale, car nous effectuerons les expérimentations sur des lots de 10 animaux et des évaluations seront effectuées toutes les 20 souris. Ainsi, si 10 paramètres d’électrostimulation satisfaisants sont identifiés (permettant de réduire l'activité des neurones de la satiété) avant la fin de la procédure, nous mettrons fin aux expérimentations. En ce qui concerne les effets de l'électrostimulation sur la prise de poids, nous avons déterminé le nombre d'animaux par une approche statistique reconnue. Étant donné que notre stratégie expérimentale repose sur la comparaison du poids des animaux électrostimulés par rapport à ceux qui ne le sont pas, nous aurons besoin au maximum de 924 animaux, sachant que nous testerons différents schémas d'administration de l'électrostimulation pour les 10 types de stimulation sélectionnés lors de la phase préliminaire. Ce nombre total de souris est également une estimation maximale, car nous arrêterons les expérimentations dès qu’une combinaison de stimulation/schéma d’administration permet de diminuer significativement le poids des animaux.
Raffinement
• Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (tubes en carton pour se cacher, briques de bois à grignoter). • Une période d’acclimatation d'au moins 7 jours aura lieu, au cours de laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera effectué. Il convient de noter que pour la phase mesurant l'impact de l'électrostimulation spinale sur le prise de poids, les animaux recevront un régime alimentaire enrichi en graisse et en sucre et seront observés au moins 3 fois par semaine par les expérimentateurs afin de surveiller leur état de santé général. • Les chirurgies seront réalisées par du personnel compétent, et les animaux seront placés sous anesthésie et analgésie pour prévenir toute souffrance. Les animaux seront observés deux fois par jour pendant les quatre jours suivant l'opération. Les soins post-opératoires incluront notamment l'administration d'analgésiques pendant 3 jours, ainsi que l'administration d'un traitement anti-inflammatoire stéroïdien dans l'eau de boisson, qui sera maintenu pendant les 2 jours suivants. • Les effets potentiellement douloureux de l'électrostimulation seront évalués tout au long de la procédure, afin de mettre fin à l'électrostimulation dès que des signes de douleur apparaissent. Plus particulièrement, des comportements tels que des sauts de l'animal, une course de la souris ou des comportements d'automutilation entraîneront l'arrêt immédiat de l'électrostimulation en cours, y compris les intensités supérieures. • Les effets sur la prise de poids seront évalués sur un nombre d'animaux strictement nécessaire pour évaluer les effets à long terme de l'électrostimulation. • Enfin, des critères limites ont été définis pour anticiper toute détérioration de l'état de santé général des animaux, qu'ils soient sous anesthésie ou conscients. Si nécessaire, des protocoles de soins appropriés seront appliqués. En cas de détérioration de la santé de l'animal, la mise à mort sera effectuée immédiatement sur décision du responsable de l'étude.
Choix des espèces
L'espèce murine sera utilisée en raison des données de la littérature démontrant une implication du système nerveux dans la prise alimentaire sur ce modèle. De plus, c'est la seule espèce pour laquelle un large panel d'animaux modifiés génétiquement existent, permettant ainis de mesurer l'activité neuronale par photométrie. Nous utiliserons des animaux adultes, car l'objectif est de développer un dispositif médical pour les sujets adultes (âgés de ≥ 8 semaines).
Technologie du plasma à gaz médical contre les bactéries résistantes aux antibiotiques infectant les plaies chroniques : Partie 3 : Efficacité des plasmas froids contre des plaies aigës ou pseudo-chroniques infectées par Staphylococcus aureus chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, deux plaies dorsales leur sont créées au biopsy punch avec pose d'une attelle et de sutures, puis infectées par la bactérie Staphylococcus aureus, avant l'application d'un plasma froid ou d'un antibiotique et quatre prises de sang. Le porteur signale une douleur et une gêne au réveil, ainsi qu'un risque de blessures si les souris se grattent ou se mordent, l'objet étant de tester le plasma froid contre les bactéries résistantes des plaies. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour cette phase et présente le porc, dont la peau est plus proche de la nôtre, comme écarté pour des raisons logistiques.
Objectifs
L’objectif est à la fois d’optimiser les technologies plasmas existantes et de développer de nouvelles technologies pour éliminer les bactéries résistantes responsables d’infections nosocomiales. Ceci est accompli dans un consortium interdisciplinaire et international qui met en synergie ses expertises démontrées. Les sources de plasma sont testées dans différents contextes pour leur efficacité antimicrobienne in vitro et in vivo en utilisant un modèle murin de plaie infectée. Des études mécanistiques sur la destruction bactérienne médiée par le plasma froid sont effectuées tandis que des échantillons de plaies provenant de patients facilement disponibles sont utilisés pour fournir du matériel réaliste pour étudier l’efficacité de cette nouvelle approche. Enfin, le traitement de plaies colonisées par des bactéries résistantes aux antibiotiques fournira les données d’une preuve de concept. Les résultats ne serviront pas uniquement à rendre prometteur l’utilisation du plasma froid contre les plaies infectées, mais également à améliorer la cicatrisation de plaies afin de lutter contre le développement de l’antibiorésistance en médecine humaine et vétérinaire. Le projet se déroule en trois étapes et feront l’objet de plusieurs demandes d’autorisation de projet. Première étape : Le premier objectif a été de mettre au point un modèle murin de plaie pseudo-chronique et de montrer l'efficacité des plasmas à froid sur la cicatrisation. Cette étape est donc validée et a permis de mettre en place le modèle de chirurgie, les soins à la douleur et le traitement à plasma froid.
Bénéfices attendus
Au sein du projet global, il est attendu que l’utilisation de plasma froid avec différents gazs soit efficace pour lutter contre l’infection par des bactéries résistantes aux antibiotiques ou pas et pour améliorer la cicatrisation des plaies présentant un déficit cicatriciel. Cela se traduirait notamment par une baisse significative de la colonisation bactérienne de la plaie, et une éventuelle accélération de la cicatrisation des plaies. Un nouveau dispositif à plasma sera également utilisé et ses effets seront comparés à ceux du plasma de référence, déjà utilisé dans des cas cliniques en Allemagne. Il est attendu que ce nouvel outil soit aussi efficace, sinon plus, que le plasma de référence quant à la désinfection et la cicatrisation des plaies, car il permettrait de traiter une surface de plaie plus importante plus rapidement et d’augmenter l’efficacité de la réponse immunitaire. A plus long terme, cela pourrait permettre de généraliser l’utilisation de divers dispositifs à plasma à l'être humain, chez des patients souffrant de troubles de la cicatrisation (diabète, immunodépression, etc.) ; mais aussi de lutter contre l’antibiorésistance s’installant notamment sur ces plaies dans le cas d’infections nosocomiales. Cela pourrait également offrir des opportunités de traitement dans divers domaines (chirurgie, ophtalmologie, oncologie, etc.). La généralisation de l’utilisation de cette technologie pour entièrement décontaminer du matériel médical en milieu hospitalier pourrait être envisagée.
Procédures
Des puces d’identification dorsales seront injectées en sous-cutané à tous les animaux, sous anesthésie (5 minutes par animal). Les animaux seront soumis à une anesthésie générale et à la chirurgie visant à créer les plaies chroniques (biopsy punch et pose de l’attelle avec points de suture, 20 minutes par animal). 4 prises de sang à la veine submandibulaire seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une aiguille. Tous les animaux seront vigiles (2 minutes par animal). Pendant 3 jours après la chirurgie, tous les animaux recevront des injections d’analgésiques en sous-cutané pour gérer la douleur au maximum (2 minutes par animal). Les plaies des animaux seront infectées par Staphylococcus aureus (dépôt de solution non invasif, 5 minutes par animal). Des prélèvements seront effectués à la surface des plaies de chaque animal à l’aide d’un coton-tige (10 secondes par animal). Les traitements plasma à froid ou avec antibiotique seront appliqués sur les plaies (5 min par animal vigile).
Impact sur les animaux
Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourrait être observés. Suite à la création des deux plaies dorsales, une douleur et une gêne possible dans les déplacements sont attendues au reveil de l’animal sans analgésie. Si les souris se grattent ou se mordent, des blessures pourraient apparaitre sur le dos ou les flancs. La contention lors des prises de sang peut engendrer du stress pour l’animal. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés. Des symptômes de l’infection pourraient être observés après l’inoculation de S. aureus.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort soit les 672 souris. Des prélèvements de tissus seront effectués post-mortem pour la partie histologie (zone de biospsie et rate) pour l'analyse biologique de la reconstruction de l'épiderme cutané, ainsi que des prélèvements de la surface de la plaie pour analyses bactériologiques. La décision est prise par les responsables scientifiques et concepteurs.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale pour cette partie du projet, puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur l'infection et la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro. Les premières expériences du projet global sont des expériences in vitro qui ont confirmé la nécessité d’une phase in vivo pour obtenir des résultats supplémentaires et plus précis quant à l’objectif final : la phase clinique.
Réduction
Les volumes de sang à prélever par animal et leur fréquence étant contraints, les volumes prélevés à chaque prise de sang seront « poolés » par 2 (même couple d'animaux pour chaque prise de sang). Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques et en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique pour l’étude de la réponse immunitaire et de l’effet de l’infection sur les dérivés oxygénés produits notamment. Deux plaies dorsales seront réalisées sur chaque animal. Cela permet de réduire le nombre d'animaux car le nombre d’échantillons par animal est multiplié par deux, plutôt que de n’avoir qu’une seule plaie plus étendue par animal.
Raffinement
Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation est prévue pour permettre l'adaptation des animaux à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour à partir du jour de la chirurgie (J0) : relevé télémétrique de la température de J0 à J10, signes cliniques tels que le poids, l’aspect du faciès et le comportement général. En cas de mal-être suspecté, de la nourriture sera déposée sur le sol de la cage pour limiter les efforts nécessaires aux animaux. Pour éviter toute souffrance, les animaux seront euthanasiés par inhlalation contrôlée de CO2 dès que leur état état clinique se dégradera en dépit du traitement analgésique mis en place. En particulier, l’expression de trois des signes cliniques suivants sur une période de 24h entrainera leur mise à mort : hypothermie, de J0 à J2, hyperthermie de J2 à J10, comportement anormal, prostration, amaigrissement (>15%), poil hérissé, isolement, diarrhée. Les souris bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid et objet à ronger). Les souris sont hébergées 4 par cage dans une animalerie A2 en portoirs ventilés. Afin de diminuer la douleur de l'injection de la puce, les animaux seront sous anesthésie générale et un léger massage au niveau de la zone d’injection est effectué. Pour la partie chirurgie et le suivi post-opératoire : Période préopératoire : injection pré-opératoire 'un analsgésique (0,1 mg/kg, SC), au moins 20 minutes avant le début de la chirurgie, maintien au chaud sous lampe chauffante Période opératoire : anesthésie gazeuse : 4% pour l’induction, 1-2% pour le maintien, sur tapis chauffant Période postopératoire : injection post-opératoire immédiate d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (10 mg/kg, SC), maintien au chaud sous lampe chauffante. Injection d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (même dose) le soir. Injection d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (10 mg/kg SC, 1 fois/jour, à J1 et J2). Injection d'un analsgésique (même dose) (2 fois/jour, à J1 et J2), voire J3 en fonction du résultat de l'évaluation de la douleur, si elle n'est pas contrôlée par le méloxicam. Visite animalier matin et soir de J0 à J10. En cas d’hypothermie, les souris seront placées sous une lampe chauffante n’émettant pas de lumière. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchés fruitées ou des rondelles de bananes sèches ou popcorn sera réalisée.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus utilisé en expérimentation animale, en particulier quand il s’agit d’expériences impliquant un dispositif médical. Puisque l’objectif est de généraliser l’utilisation du plasma à froid à l’être humain, le porc aurait pu être choisi car la structure de l’épiderme est plus proche de la nôtre. Cependant, il est tout de même préférable de commencer par des expérimentations sur souris d’un point de vue logistique et statistique. Age des souris = 6-7 semaines pour la lignée de référence (déjà validée pour la chirurgie et l'infection à S. aureus). Les souris doivent être de jeunes adultes pour avoir la place de faire les biopsies (décrits dans les modèles publiés) et avoir un système immunitaire mature. Age des souris = 12-13 semaines pour la lignée diabétique Les souris doivent présenter un diabèté confirmé au moment de la réalisation des plaies pour mimer au mieux ce qui se déroule chez le patient.
Etude des conséquences de l’inactivation et de la surexpression de gènes impliqués dans des maladies neurodeveloppementales
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
15 946 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une laparotomie au cours de laquelle l'utérus est exposé et chaque embryon transpercé par un capillaire de verre avant l'application d'un courant électrique, technique d'électroporation in utero destinée à modifier l'expression de gènes dans le cerveau en développement. Les femelles sont tuées pour collecter embryons et nouveau-nés, ces derniers subissant une injection dans le cerveau ou une perfusion intracardiaque terminale, tous étant tués pour prélever les cerveaux. Le porteur affirme que la complexité du cortex ne peut pas être recréée in vitro et conclut à la nécessité de la souris.
Objectifs
Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Un grand nombre de gènes y ont été reliés. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies. Chez certains patients avec des maladies du développement cortical, il existe des mutations dans des gènes qui montrent une forte probabilité d’être la cause de la maladie. Ces pathologies sont associées aussi bien à des défauts de prolifération, de migration et de différenciation neuronale. Comprendre les mécanismes par lesquels la mutation entraine la pathologie est essentiel pour faciliter le diganostic d’autres maladies et envisager un traitement. Pour comprendre ce qu’il se passe dans les neurones, nous allons adopter une approche génétique visant à modifier l’expression ou la fonction des molécules étudiées. Nous utiliserons l’électroporation in utero chez la souris. Cette technique permet l’introduction de matériel génétique contrôle et muté dans les cellules progénitrices de la zone ventriculaire du cerveau en développement, permettant donc l’étude de la structure, de la fonction et du développement du système nerveux central. Elle offre l’avantage d’un contrôle spatio-temporel de la délivrance d’ADN, permet des études de perte et de gain de fonction et est simple, rapide et efficace. On pourra ainsi étudier l’effet d’un gène : # sur la prolifération : électroporation au stade embryonnaire (un seul stade par gène selon le pic d’expression du gène étudié) et analyse du devenir des cellules modifiées 1 ou 2 jours plus tard. Dans ce cadre, les mères recevront une ou deux injection(s) nous permettant des analyses de données plus fines# sur la migration des neurones : électroporation au stade embryonnaire et analyse du devenir des cellules modifiées 3 ou 4 jours après # sur la différenciation et la connectivité neuronale en introduisant le gène d’intérêt au stade embryonnaire et en analysant 2, 4, 8 ou 21 jours après la naissance .
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de comprendre la fonction de protéines ou d'autres molécules impliqués dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquels leur déplétion ou surexpression conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées pour les patients. En effet, notre collaboration avec des cliniciens nous permet de tester par cette approche des variants retrouvés chez des patients présentant des maladies du développement du cerveau. Comprendre les mécanismes peut permettre d’envisager des pistes thérapeutiques.
Procédures
Les femelles gestantes vont subir une injection d’analgésique (environ 5 secondes), suivie d’une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, pour une durée de 1 à 10 secondes pour chaque embryon). La durée totale de la chirurgie n'exèdera pas 45 minutes ( en moyenne 25 minutes pour un chirurgien expérimenté). Un courant électrique sera appliqué sur la paroi utérine, en 5 pulses de 50 ms espacés de 1 seconde (temps total entre 5 et 6 secondes par embryon). Elles seront par la suite placées dans des cages isolées. Certaines recevront une ou deux injections (5 secondes) 1-2 jours après la chirurgie. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (entre 1 et 10 secondes). Certains nouveaux nés vont subir une injection d’analgésique (environ 5 secondes) puis d’un anesthésique (environ 5 secondes) avant de subir une chirurgie de perfusion intracardiaque terminale sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
La barrière cutanée des femelles gestantes donc rompue en plusieurs endroits (site d'injection dans le dos entre les omoplates, aiguille très fine, cicatrice de la laparotomie sur le ventre), il en résulte une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages isolées et de ce fait privées de congénères pendant quelques jours de convalescence. Certaines recevront une ou deux injections sous cutanées 1-2 jours après la chirurgie, pouvant entrainer un stress et d'autre(s) rupture(s) le la barrière cutanée. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin aux stades embryonnaires ainsi que l'application d'un courant électrique sur leur tête. Certains nouveaux nés vont subir une injection d’analgésique puis d’un anesthésique (pouvant entrainer du stress) avant de subir une chirurgie terminale de perfusion intracardiaque.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles sont mises à mort pour collecter les embryons ou dès collecte des nouveaux nés. Les embryons ou nouveaux nés sont mis à mort pour collecter les cerveaux.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cortical qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération de gènes sur le développement embryonnaire cortical.
Réduction
Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, aucune nouvelle expérience ne sera effectuée avant qu’une analyse complète des précédentes ne soit réalisée. Les experiences (prolifération, migration, maturation) seront choisies en fonction de la nature du gène étudié, son profil d’expression et du phénotype observé chez les patients. Aussi toutes les expériences ne seront pas systèmatiquement éffectuées. Seules celles relevantes seront faites. En ce qui concerne les études post-natales, et afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et d’éviter le cannibalisme des souris, nous avons adapté nos croisements pour obtenir des souris moins agressives et meilleures nourrices. La bonne maitrise de la technique chirurgicale acquise par l’équipe tout au long de ces dernières années permet d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons (40-80%) ce qui limite fortement le nombre de femelles gestantes manipulées. Nous prévoyons aussi dans cette étude 10 femelles gestantes pour la formation de nouveaux expérimentateurs afin de nous assurer de leur succès et d’un bon taux de survie.
Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Avant le début de l’expérience, les femelles reçoivent une injection d'analgésique 30 minutes avant l’anesthésie. Durant l’expérimentation les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse. Leurs yeux sont protégés de la deshydratation. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’anesthésie. Un anti-inflammatoire non-stéroïdien, est injecté à la fin de l’opération afin de prendre le relais de l’analgésique pendant 24h. L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections postchirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
La technique d’électroporation dans le cerveau a été mise au point chez la souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par animal rend cette méthode efficace. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neuro-développementales chez l’homme. 1) Etude de la prolifération : Femelles adultes gestantes de 13 jours ou 14, stades auxquels la proliferation des progeniteurs est à son maximum. Le choix du stade se fera en fonction du profil d’expression deu gène d’intérêt (un seul stade sera retenu pour les expériences, celui avec le pic d’expression de la protéine d’intérêt) : l’électroporation du matériel génétique d’intérêt en même temps qu’un marqueur fluorescent permettra de suivre la prolifération de ces cellules. Analyse à 14 ou 15 jours de gestation, stade d’étude de la prolifération cellulaire. 2) Etude de la migration cellulaire : Femelles adultes gestantes de 13,5, 14,5 ou 15,5 jours, stades auxquels les neurones migrent le long de la glie pour atteindre leur localisation finale. L’electroporation à ces trois stades permettra de visulaiser la migration de types neuronaux diffèrents (nés à chacun de ces stades). Analyse à 18,5 jours de gestation pour les visualiser grâce à un marqueur fluorescent électroporé en même temps que le matériel génétique à étudier. 3) Etude de la maturation neuronale et connectivité : femelles adultes gestantes de 15,5 jours (stade auquel les neurones callosaux sont générés). L’electroporation des embryons à ce stade permettra d’intégrer le gène à étudier uniquement dans ces neurones et de suivre leur développement grâce à un marqueur fluorescent. Etant donné que les étapes majeures de la formation du corps calleux sont la croissance des axones, le passage dans l’autre hémisphère et la phase terminale de l’invasion par les axones du cortex contralatéral à 2, 4 et à 8 jours après la naissance respectivement et le branchement des axones à 21 jours post-natals, nous prévoyons 4 stades afin d’évaluer ces différentes étapes.
Ciblage thérapeutique d’une population cellulaire impliquée dans la résistance tumorale prostatique chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lésions précancéreuses de la prostate leur sont induites par des injections répétées, puis elles reçoivent pendant 28 jours des composés par injection intrapéritonéale ou par gavage, seuls ou combinés. Le porteur affirme que l'induction n'entraîne "pas de douleur ni de souffrance dans la fenêtre choisie" et n'attend pas d'effet indésirable des composés testés, l'objet étant de cibler une population cellulaire liée à la résistance du cancer. Il indique que des études en culture ont précédé le projet et envisage des organoïdes en trois dimensions s'ils reproduisent fidèlement les tumeurs.
Objectifs
Le cancer de la prostate est la 3ème cause de mortalité par cancer chez l'homme. Dès lors qu'il est invasif, il conduit inévitablément au décès du patient par échappement aux traitements actuels. Notre laboratoire et d'autres ont identifié des populations des cellules épithéliales résistantes aux traitements dans des modèles "souris" qui reproduisent l'évolution du cancer de la prostate chez l'homme. Par des analyses moléculaires, nos collaborateurs ont identifié des molécules régulatrices de cellules résistantes aux traitements. Ces facteurs réprésentent donc des cibles thérapeutiques potentielles pour les formes aggressives du cancer de la prostate. L'efficacité des composés chimiques ciblant ces facteurs a déjà été demontré par nos collaborateurs dans des systèmes cellulaires en culture. Nous aimerions continuer leur charactérisation dans le modèle de souris pour étudier l'effet de ces drogues sur les tumeurs prostatiques aggressives.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'effectuer l'analyse des potentielles cibles thérapeutiques sur un modèle du cancer de la prostate aggressif.
Procédures
Les animaux seront sujets à des traitements par des injections au niveau de l'abdomen pendant 5 jours pour induire l'apparition des lésion précancéreuses prostatiques. Une fois que les lésions précancéreuses deviennent sufisamment avancées (3 ou 5 mois après injection initiale), des injections quotidiennnes d'un des composés en intra-péritonéale pendant 28 jours seront réalisées (30 souris/lot). Un autre composé sera administré aux souris par gavage tous les 3 jours pendant 28 jours (30 souris/lot). Enfin, une thérapie combinée sera également vérifiée avec un composé injecté en intrapéritonéal et l'autre - administré par gavage à la même souris (30 souris/lot). Les injections intra-péritonéales comprennent une préhension de souris et l'injection en elle-même ce qui prend environ 10 secondes. Les gavages comprennent une préhension de souris et le gavage en lui-même, environ 15 secondes sont réquises pour effectuer ce geste par le personnel formé.
Impact sur les animaux
Les injections répétitives peuvent induire l'irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d'injection. Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables liés aux gavages.Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables liés aux composés administrés. L'induction des lésions précancereuses dans notre modèle de souris conduit à une augmentation de taille de prostate mais ne cause pas de douleur ou de souffrance dans la fenêtre choisie pour cette étude d'après les analyses longitudinales de cette lignée effectués dans le cadre du projet antérieur.
Devenir
Tous les animaux de l'étude seront mis à mort et sa prostate sera utilisé pour les analyses moléculaires et cellulaires.
Remplacement
Des études préliminaires ont été ménées par nos collaborateurs sur les modèles cellulaires en culture pour montrer l'efficacité des drogues sur les cellules épithéliales similaires à celles retrouvées dans notre modèle de souris. Nous allons mettre en place des cultures d'organoides (cultures cellulaires en 3D) à partir des souris non-traîtées et si ces derniers reproduisent de manière assez fidèle les charactéristiques moléculaires de nos tumeurs, nous envisageons de les utiliser davantage dans le cadre de ce projet.
Réduction
Nous prévoyons d'utiliser 30 souris par lot expérimental dont 10 souris pour les analyses histologiques, 10 souris pour les analyses de populations cellulaire et 10 souris pour les expériences sur les organoides. A l'aide des calculs statistiques, nous avons estimé que 10 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet de traitement sur les populations cellulaires étudiées.
Raffinement
Immédiatement après et la semaine suivante les injections intra-péritonéales, la souris sera surveillée afin de détecter les signes de douleurs, des irritations ou d'inflammation du site d'injection. De plus, les injections seront réalisées en altérnant les côtés d'injection. Immédiatement après le gavage oral, la souris sera surveillée pour détecter les signes de passage de traitement dans les conduits respiratoires. Suite aux traitements, les souris seront pésées quotidiennement. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage en cas de perte de poids. Tout animal en souffrance sans possibilité de soulagement sera sorti de l'étude et mis à mort.
Choix des espèces
Notre modèle de souris récapitule de manière fidèle l'évolution des lésions précancéreuses et du cancer de la prostate chez l'homme. Etant donné que le but de l'étude est d'évaluer l'efficacité des traitements, nous allons étudier l'effet systémique de ces traitement ce qui est impossible en utilisant les systèmes in vitro. Seuls les souris mâles adultes seront utilisés pour ce projet car l'induction de lésions précancéreuses doit se faire sur des prostates matures et donc après la puberté.
Développement post-natal de la souche KI-L178A : Impact physiopathologique du blocage de l’interaction du tPA avec les récepteurs NMDA.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 240 tuées sans réveil et le reste dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou modéré. Issues d'une lignée génétiquement modifiée bloquant l'interaction entre le tPA et un récepteur cérébral, elles sont caractérisées du stade nouveau-né à l'âge adulte par des tests sensorimoteurs, cognitifs et émotionnels, une partie subissant la pose d'un cathéter et un amincissement du crâne pour l'imagerie du couplage neurovasculaire. Le porteur signale une possible perte de poids, des douleurs post-opératoires et des déficits fonctionnels, l'objet restant de comprendre le rôle physiologique de cette interaction. Il affirme le "caractère de stricte nécessité" des procédures et l'impossibilité de les remplacer.
Objectifs
L'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une sérine protéase, connue pour être synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour intervenir dans la fibrinolyse. Ces propriétés font que le tPA est utilisé comme traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est également considéré comme un neuromodulateur au sein du système nerveux central (SNC). Il est produit par les neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales. Il est impliqué dans de nombreux processus physiologiques. Le tPA est connu pour interagir avec différents récepteurs et que l'interaction entre le tPA et un récepteur d'intérêt (tPA/NMDAR) était impliquée dans certains processus physiologiques et pathologiques (AVC, processus inflammatoires). Afin de mieux comprendre le rôle spécifique de cette interaction et de pouvoir élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à celle-ci, nous avons généré, avec la clinique de la souris une nouvelle souche de souris. La spécificité de cette nouvelle souche est une mutation entrainant le blocage de l’interaction du tPA avec ce récepteur d'intérêt. Ainsi, dans ce projet, nous allons caractériser phénotypiquement ces souris et leurs contrôles en conditions physiologiques au cours du développement (des stades post-nataux jusqu’au stade adulte) et évaluer l’impact du blocage de cette interaction sur l’unité neurovasculaire, par l’étude du couplage neurovasculaire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre l’interaction entre le tPA et notre récepteur d'intérêt dans des processus physiologiques.
Procédures
1-Prélevements : La totalité des animaux seront mise à mort pour prélèvement des organes (n=240, durée de la procédure : 15 minutes). 2/3- Comportements : La totalité des animaux seront soumis (selon les groupes établis) à l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; n=240, durée de la procédure : 30minutes/tests). 4-Couplage Neurovasculaire : Chaque animal fera l'objet d’une pose de cathéter intraveineux pour l'injection de traitements (n=120, durée de la procédure : 15 minutes). Puis le modèle de couplage neurovasculaire sera réalisé (n=120, durée de la procédure : 1 heure). Après un amincissement du crâne, un train de stimulation des vibrisses sera effectué sous imagerie (fUS ou Doppler/Speckle).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du SNC.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (AVC, SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’évaluation du couplage neurovasculaire, les souris seront sous anesthésie générale (isoflurane 2% O2/N2O 30/70 puis médétomidine à 0,1 mg/kg) et sous anesthésie locale (Xylocaine 5%, nébuliseur). Les yeux des souris seront couverts (vitamine A en gel et gel oculaire) afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques, les souris KI-L178A déficientes pour le site d’interaction du tPA sur la sous-unité GluN1 du NMDAR. Ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Les procédure 1 et 2 concernent une évaluation développementale de l’influence du blocage de l’interaction du tPA avec les NMDAR chez les animaux, à savoir des stades P0, P3, P5, P15, P30 et P60. Concernant les autres procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires.