Rongeurs
Evaluation de molécules à visée thérapeutique dans des modèles de cystite interstitielle (chronique ou aigu) chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
8 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 1 410 d'entre eux et sévère pour 7 090. Une cystite interstitielle leur est induite par injection de cyclophosphamide, avant l'administration de molécules candidates, l'application répétée de filaments de force croissante sur l'abdomen pour mesurer la douleur, un placement en cage à métabolisme et, pour certains, une chirurgie d'implantation de cathéters vésicaux pouvant provoquer saignements et hémorragies. Le porteur indique que les rats ressentiront douleurs abdominales, brûlures vésicales et mictions fréquentes, et qu'il ne peut pas anticiper les effets des molécules testées, dont il ignore la nature. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne reproduit la maladie et conclut que le recours aux rats est "incontournable".
Objectifs
Actuellement, le modèle expérimental de cystite interstitielle le plus utilisé au sein de la communauté scientifique internationale est le modèle cyclophosphamide (CYP) aigu ou chronique de par son induction aisée (injection i.p. de CYP) et de ses symptômes proches de la clinique humaine. Ce modèle est donc particulièrement adapté pour tester des candidats médicaments ciblant cette pathologie pour laquelle il n’existe toujours pas de traitement efficace. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques dans des modèles de cystite interstitielle aiguë ou chronique induits par le CYP chez le rat (évaluation nociceptive et / ou de la fonction vésicale).
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de cystite interstitielle.
Procédures
Les animaux recevront une ou plusieurs administrations intrapéritonéales de cyp pour induire la pathologie. En parallèle, ils seront administrés avec des candidats médicaments (voies d’administration dépendantes de chaque protocole expérimental). De plus, les animaux subiront plusieurs fois un test comportemental qui consiste en l’application de filaments de force croissante sur l’abdomen des animaux et d’observer leur comportement. Tous ces gestes sont très rapides mais peuvent procurer un stress à l’animal du fait de la contention, de la douleur de l’aiguille. En parallèle du test de comportement, les animaux pourront être mis dans des cages à métabolisme pendant 24 H maximum pour évaluer leur profil mictionnel. Ils pourront également subir une chirurgie pour l’implantation de cathéters extériorisés afin de réaliser une cystométrie. Cette chirurgie assez rapide (environ 20 minutes) peut induire des douleurs post-opératoires (même avec l’utilisation d’antalgiques), des saignements voire des hémorragies… Des prélèvements sanguins durant l’expérimentation ou en terminal juste avant la mise à mort pourront être réalisés sur animal vigil ou anesthésié (geste rapide).
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Nous allons induire une cystite interstitielle aux animaux, par conséquent ces derniers vont ressentir les symptômes de cette pathologie telles que des douleurs abdominales, une augmentation de la fréquence des mictions, des sensations de brûlures vésicales, une perte de poids possible.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés et des prélèvements de tissus pourront être réalisés.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la cystite interstitielle. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Ce modèle est très bien établi dans notre laboratoire et nous le réalisons en routine. De par notre expérience et en accord avec la littérature, un nombre de 10 animaux par groupes expérimentaux est le minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats statistiquement différents et interprétables. Des t-tests seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre deux groupes et des tests ANOVA pour évaluer la différence entre plusieurs groupes (tests paramétriques ou non-paramétriques selon la normalité des groupes). De plus, étant donné que nous souhaitons modifier les doses de cyp dans le modèle chronique suite à une demande de l’un de nos clients, une étude pilote sera réalisée afin de redéfinir les doses efficaces et de limiter le nombre d’animaux utilisés (utilisation d’animaux d’un autre protocole possible). Dans cette procédure, des méthodes non invasives pour l’évaluation de nos paramètres expérimentaux seront utilisées (cages métaboliques, Von Frey) réduisant le stress des animaux. De plus, nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe.
Raffinement
En accord avec la règle de raffinement, les procédures nécessitant une anesthésie générale seront réalisées en maintenant la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Les procédures chirurgicales (implantation de cathéters) seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou fixe avec utilisation d’analgésiques afin de limiter les douleurs post-opératoires. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ses congénères. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement (tunnel, aspen brick à ronger) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes comme prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure… pouvant amener à des points limite. Si un animal présentait des symptômes de douleur, prostration, plaies… il sera soigné (désinfection de la plaie par exemple), isolé si nécessaire, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, et qu’un des points limite était atteint, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.
Choix des espèces
Le modèle de cystite induite par l’administration de CYP est un modèle expérimental classiquement développé chez le rat. De plus, l’exploration de la fonction vésicale chez l’animal éveillé (quel que soit la pathologie) est largement décrite chez le rat. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 semaines afin d’avoir des animaux adultes sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.
Evaluation du potentiel immuno-modulateur d’extraits de plantes et de probiotiques et de leur capacité à renforcer et à stimuler la réponse immunitaire anti-infectieuse au cours du vieillissement.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent pendant quinze jours des extraits de plantes et des probiotiques par voie orale, une vaccination antigrippale sous anesthésie, puis des prélèvements sanguins répétés à la mâchoire ou en rétro-orbital jusqu'à trois mois, avant l'euthanasie et le prélèvement de la moelle, de la rate et du foie. L'objet réel est de tester si ces compléments renforcent la réponse au vaccin chez des souris âgées de 18 à 20 mois, les retombées pour les personnes âgées restant présentées comme une validation à venir. Sur le remplacement, le porteur affirme que la culture cellulaire ne peut pas mimer la réponse vaccinale et conclut au recours aux souris âgées.
Objectifs
Le vieillissement croissant de la population impose de prévenir les infections sévères et fréquentes par des vaccins. Néanmoins le vieillissement altère l’intensité et la qualité des réponses vaccinales, limitant ainsi la portée des recommandations vaccinales dirigées contre la grippe, le pneumocoque, la coqueluche mais également le tétanos ou le zona après 65 ans. Toutes les étapes des réponses vaccinales sont altérées par le vieillissement du fait de l’altération du système immunitaire appelés l’immunosénescence. Ce projet nous permettra d’une part de mieux comprendre les mécanismes de l’immunosénescence et les raisons de ces limitations. Le second objectif sera donc de définir des stratégies de renforcement de la réponse immunitaire via l’administration d’extraits de plantes et de probiotiques. Ainsi, nous avons montré dans une étude précédente la capacité d’extraits de plantes à renforcer et à stimuler la réponse immunitaire anti-infectieuse au cours du vieillissement. Ces données nous amènent à investiguer leur impact en association de souches probiotiques sur la réponse immunitaire à la vaccination antigrippale au cours de l’âge. L’objectif étant de déterminer in vivo le potentiel adjuvant d’extraits de plantes et d’une association de souches probiotiques à renforcer et /ou prolonger la réponse immunitaire antigrippale au cours du vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’une part de mieux comprendre les mécanismes de l’immunosénescence et les raisons du défaut de réponse vaccinale chez le sujet âgé. D’autre part, cette étude permettra de valider la pertinence scientifique d’utiliser des extraits actifs de plantes et des probiotiques pour renforcer le système immunitaire et améliorer la réponse vaccinale.
Procédures
Afin de définir des stratégies de renforcement de la réponse immunitaire antigrippale au cours du vieillissement, nous administrerons pendant 15 jours des extraits de plantes et des probiotiques quotidiennement par voie orale à des souris jeunes (5 mois) et âgées (18-20 mois) . Après 15 jours de traitement, ces souris seront vaccinées contre la grippe saisonnière par voie intra-dermique au niveau de la patte sous anesthésie générale ou par voie intrapéritonéale. Le choix du mode d’injection sera fait sur l’étude « pilote ». Le traitement sera poursuivi 7 jours post-vaccination. Sur l’ensemble des souris, des prélèvements sanguins seront réalisés 1 jour avant la vaccination, puis à 15 jours, 30 jours, 60 jours et 90 jours après vaccination, pendant 3 mois afin d’évaluer l’apparition d’anticorps au cours du temps. Une numération de la formule sanguine sera réalisée, ainsi que le dosage des anticorps IgG anti-HA dans le sérum. Ces prélèvements sont prévus au niveau mandibulaire et seront alternés d’un côté et de l’autre et pourront être remplacé par un prélèvement retro-orbital. Le sang sera prélevé en rétro-orbital sous anesthésie générale et analgésie locale. Ensuite après une injection intra-péritonéale de l’antigène viral, l’efficacité vaccinale sera déterminée en étudiant différents paramètres immunologiques sur les organes prélevés après euthanasie des souris. Pendant toute la durée du protocole, un suivi journalier de l’état général et un suivi hebdomadaire du poids des animaux seront effectués.
Impact sur les animaux
L’administration quotidienne des extraits de plantes et l’association de souches probiotiques pourrait altérer la prise alimentaire des souris. Afin d'éviter le stress de la manipulation aux animaux, le suivi du poids se fera de manière hebdomadaire. Les prélèvements de sang peuvent entrainer des lésions. Ces prélèvements sont prévus au niveau mandibulaire seront alternés d’un coté et de l’autre et pourront être remplacé par un prélèvement retro-orbital.
Devenir
A la fin de la procédure les animaux seront euthanasiés ce qui permettra de réaliser différents prélèvements d’organes (moelle osseuse, rate, foie…)
Remplacement
Les mécanismes de la réponse vaccinale sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité et ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Les souris âgées nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, en tenant compte des expériences déjà réalisées au laboratoire. Les groupes d’animaux seront constitués de 6 à 10 individus pour permettre une étude statistique. Les extraits ou probiotiques évalués ont recut des autorisations d'utilisation pour l'homme. L’innocuité et la toxicité des extraits ou probiotiques seuls ou en association seront déterminées in vitro par l’évaluation de leur cytotoxicité. Le choix des extraits ou probiotiques est effectué avant administration aux animaux.
Raffinement
A l’arrivée des souris, l’enrichissement de leur cage d’arrivée est maintenu pour minimum 15j d’acclimatation. Des igloos ou tunnel seront disposés au fond de la cage. Du papier sera disposé dans les cages afin de permettre la formation de nid. L’hébergement est en cage collective sur portoir ventilé (atmosphère contrôlée, avec alternance jour/nuit) avec accès illimité à l’eau et à l’alimentation standard. Les procédures font l’objet d’un suivi du bien-être des animaux adapté à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures sur l’état de santé global des animaux. Afin de diminuer le stress et la douleur, des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour les actes pouvant présenter de la douleur. Les souris seront surveillées quotidiennement (prostration, apathie, ventilation, comportement, aspect des poils, piloérection) et le suivi du poids une fois par semaine ou quotidiennement si une perte de poids est constatée. Une grille d'évaluation permet au personnel en charge de la surveillance et/ou du suivi des procèdures d'évaluer de manière objective ces critères permettant de déterminer les points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances . L'étude sera conduite par des personnes qualifiées et formées au respect des conditions de bien-être des animaux.
Choix des espèces
Les mécanismes de la réponse vaccinale sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité et ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Les souris âgées nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches. Souris jeune (adulte) minimum 5 mois et souris âgées (15/18mois) afin d'étudier l'impact des extraits de plantes et des probiotiques sur la réponse immunitaire au cours du vieillissement
Interaction entre les neurones sensoriels et le système immunitaire pendant l’infection par le virus herpès
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
4 651 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère à modérée, dont 2 479 individus en gravité modérée. Leur peau est abrasée puis infectée par le virus de l'herpès, avec des injections cutanées répétées et une molécule les rendant insensibles à la chaleur, pour étudier le rôle des neurones sensoriels dans la réponse immunitaire. Le porteur précise qu'aucun analgésique ne pourra être administré sans compromettre les résultats, alors que les procédures peuvent provoquer des douleurs modérées. Il affirme que ces interactions entre système nerveux et système immunitaire ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Objectifs
Les neurones sensoriels permettent à un organisme de détecter le danger grâce à une sensibilité aux stimuli mécaniques, thermiques et chimiques. Ces neurones sensoriels sont impliqués dans la perception de la douleur à ces différents stimuli. Il est de plus en plus évident que les neurones sensoriels et le système immunitaire interagissent pour réguler la douleur, l'inflammation et les défenses de l'hôte contre les pathogènes. Lors d’’une infection, des molécules inflammatoires activent les neurones dont les terminaisons nerveuses sont présentes dans les tissus, permettant ainsi la transmission de signaux au cerveau et la sensation de douleur. Ces neurones libèrent également des neuropeptides au niveau de la lésion, qui peuvent en retour moduler les cellules immunitaires présentes localement. Les neurones sensoriels innervant la peau sont hétérogènes : certains sont impliqués dans la détection de la chaleur et d’autres dans la détection du toucher. Ces différences sont dues à l’expression de différents marqueurs qui nous permettent de modifier génétiquement des animaux afin qu’ils ne soient plus capables de détecter ces sensations. Ainsi, l’objectif de notre projet de recherche est de comprendre comment les neurones sensoriels de la peau régulent l’inflammation et la réponse immunitaire au cours d’une infection par le virus herpès.
Bénéfices attendus
L'influence des neurones sensoriels sur la régulation de la réponse immunitaire inflammatoire lors d'une infection virale par le virus herpès reste inexplorée. Outre son aspect fondamental, la compréhension des mécanismes sous tendant cette régulation permettrait d'identifier de nouvelles approches thérapeutiques basées sur l'inhibition ou l'activation locale des neurones sensoriels dans le cas d'infections virales, ou pour aller plus loin, lors de pathologies inflammatoires très invalidantes, telles que la polyarthrite rhumatoïde.
Procédures
L’infection cutanée par le virus herpès nécessite une légère altération de la peau, celle-ci étant réalisée par une légère abrasion de la couche superficielle de la peau pendant 20 secondes réalisée sous anesthésie générale (par injection intrapéritonéale d’un anesthésiant). Les animaux subiront également des injections intradermiques quotidiennes de traitements immunomodulateurs afin d'évaluer leurs rôles potentiels dans la régulation de la réponse immunitaire et donc dans la résolution de l'infection. Pour évaluer le rôle des neurones sensoriels qui détectent la chaleur, les animaux seront injectés en sous-cutanée avec une molécule spécifique qui rend les animaux insensibles à la chaleur. Les injections intrapéritonéales (ip), intradermiques (id) et sous-cutanées (sc) n’excédant pas 10 secondes. Les ip seront réalisées 1 seule fois par animal, les id seront réalisées quotidiennement pendant 4 jours et les sc 3 fois pendant 3 jours. Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse légère.
Impact sur les animaux
Les animaux seront infectés par le virus herpès après une légère abrasion de la peau. L’infection va déclencher une réponse immunitaire inflammatoire et une plaie cutanée se développera à partir du point d’infection. En revanche, cette plaie se résout spontanément chez une souris sauvage, ainsi que chez les souris qui n’ont plus de neurones sensoriels. Nos expériences sont susceptibles de déclencher des douleurs modérées chez les animaux. Compte tenu de la nature même du projet qui propose d'explorer l'effet des neurones impliqués dans la perception de la douleur, aucun analgésique ne pourra être utilisé sans compromettre les résultats expérimentaux. Après l'infection, un pansement sera appliqué au niveau du flanc des souris pendant 2 jours. Cela peut induire des difficultés pour se mouvoir. Le suivi de la taille des plaies cutanées ainsi que les procédures incluant des injections cutanées peuvent induire du stress chez l’animal liées aux contentions. Les injections de molécules immunomodulatrices sont connues pour induire des démangeaisons légères sans induire d'auto-blessure de l'animal. Les tests comportementaux peuvent induire une douleur légère si le génotype de l'animal fait qu'il développe une hypersensibilité accrue suite à l'infection par le virus herpès.
Devenir
Mise à mort des animaux à la fin des procédures expérimentales pour récupérer les organes d'intérêts (peau et ganglions).
Remplacement
Nous proposons que les neurones sensoriels régulent l'évolution de la réponse immunitaire locale au niveau de la peau au cours de l'infection par le virus herpès. Seuls les modèles animaux permettent d'étudier le développement de l'activation simultanée du système immunitaire et du système nerveux sensoriel. En effet, ce sont des événements progressifs et multifactoriels qui dépendent des interactions tissulaires, cellulaires et moléculaires, localement sur le site inflammatoire mais également à distance dans les ganglions qui innervent la peau infectée. Ces interactions ne peuvent pas encore être modélisées in vitro ou in silico. Cependant, pour la recherche du mécanisme de l'interaction neurone/cellule immunitaire ou des molécules produites par ces neurones sensoriels après infection, nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques ex vivo déjà maitrisées au laboratoire, telles que la culture cellulaire de neurones et de cellules immunitaires.
Réduction
Le plan de nos expériences est construit de sorte à limiter le nombre de souris. Le modèle d'infection par abrasion du flanc est un modèle très bien décrit et maitrisé au sein du laboratoire permettant à l'infection de se développer dans quasiment 100% des souris infectées. Nos données obtenues dans un projet précédent nous ont permis de déterminer le nombre de souris nécessaires par expérience, en limitant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Pour une différence clinique et statistiquement significative, nous avons estimé que la taille d’un groupe était de 11 souris pour les infections par le virus herpès en considérant des moyennes de taille de lésion de 2,5 mm2 pour les souris contrôles, une différence significative de 1,5 mm2 et un écart-type commun de 1,2 mm2. Ainsi, des lots de 11 souris seront constitués pour chaque condition testée afin de répondre aux exigences de test statistique de rang non paramétrique. Pour chaque groupe d'animaux utilisés, tous les paramètres quantifiables seront vérifiés (poids, taille de la plaie, comportement) et tous les organes nécessaires à notre étude seront prélevés (peau, rate et ganglions) afin d'éviter de répéter inutilement les expériences inutiles. Pour minimiser l'impact du microbiote intestinal sur le développement de l'infection et donc la variabilité de nos expériences, nous avons choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec les souris provenant de la même portée mais non génétiquement modifiées.
Raffinement
Pour réduire le stress des animaux, un temps d'acclimatation d'au minimum une semaine sera respecté après un transfert d'une animalerie à l'autre ainsi qu'avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 souris par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons en dôme. Eau et nourriture seront fournies ad libitum et les animaux seront libres de leur déplacement. Pour réduire la souffrance : une surveillance quotidienne sera réalisée. Les points d’observation seront réalisés quotidiennement suivant l’infection et consisteront en une vérification du poids, de la vivacité et de l'état du pelage des animaux. Au besoin et au moindre signe de dégradation de l'état général, d'autres points d'observation intermédiaires seront assurés. Une souris qui aura perdu 20% de son poids initial sera systématiquement mise à mort. De la nourriture humide sera déposée systématiquement dans la cage des animaux pendant 2 jours suivant l'infection pour faciliter au maximum l'alimentation.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle idéal pour notre étude. Le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme (dans notre cas, les schémas des systèmes immunitaires et neuronaux sont très similaires entre l’homme et la souris), l’état actuel des connaissances, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de génération court font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaire et nerveux. De plus, le modèle murin est un modèle de choix par l'existence de souris génétiquement modifiées. Des souris d'âge minimum de 7-8 semaines seront utilisées afin d'avoir un système immunitaire et sensoriel mature.
Etude préclinique de la récupération fonctionnelle et de la plasticité cérébrale après accident vasculaire cérébral ischémique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, dont 960 individus en gravité sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par injection de thrombine ou occlusion au chlorure de fer, suivi d'examens IRM et de tests moteurs, cognitifs et émotionnels répétés sur soixante jours. Le porteur décrit un affaiblissement de la patte, des douleurs post-opératoires et une mise à mort si la perte de poids dépasse 15 % ou si le score de douleur est trop élevé. Il rappelle que les traitements neuroprotecteurs efficaces chez l'animal ont échoué chez l'humain, tout en affirmant que les méthodes sans animaux n'apportent pas le même niveau d'information.
Objectifs
A l’échelle mondiale, l’accident vasculaire cérébral (AVC) est l’une des causes majeures de décès, d’invalidité et de perte socioéconomique. Face à ce fardeau, le seul traitement pharmacologique approuvé consiste en l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Néanmoins, il existe des critères d’éligibilité stricts qui excluent une grande majorité des patients. Il est donc indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. Lors d’un AVC ischémique (i.e. dû à une occlusion vasculaire), le débit sanguin cérébral (DSC) diminue drastiquement et les tissus cérébraux alentours sont altérés de manière plus ou moins définitive. Selon différents facteurs tels que la durée et l’ampleur de la diminution du DSC, l’étendue de la lésion cérébrale et sa localisation, les handicaps résiduels post-AVC peuvent être de différentes natures (moteurs, cognitifs et/ou émotionnels) et extrêmement invalidants. Plusieurs agents thérapeutiques ont été développés et ont montré un bénéfice en termes de neuroprotection chez l’animal. Cependant, la transposition des effets neuroprotecteurs des modèles animaux à l’Homme reste un échec. En effet, alors que la récupération fonctionnelle est au cœur des préoccupations humaines, les études précliniques se sont principalement concentrées sur l’évaluation du volume de lésion cérébrale pour évaluer l’efficacité d’un traitement. Par ailleurs, l’’étude comportementale après un AVC chez les modèles expérimentaux est encore peu utilisée, incomplète voire inadaptée. En effet, la majorité des études ayant travaillé sur les déficits fonctionnels n’ont examiné que les déficits à court terme et particulièrement les déficits moteurs. L’objectif de ce projet consiste donc à caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la plasticité cérébrale et les déficits fonctionnels chroniques de l’accident vasculaire cérébral ischémique, afin de mettre au point de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de ces troubles.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes de plasticité cérébrale et de récupération fonctionnelle après un AVC ischémique. Elle permettra également de proposer des pistes pour caractériser de nouvelles stratégies thérapeutiques en combinaison ou non avec le tPA, afin d’améliorer de manière optimale la récupération des patients.
Procédures
Chaque animal fera l'objet d'une pose de cathéter intraveineux pour l'injection de traitements (15 minutes). 1 - Le modèle d'ischémie par injection de thrombine sera réalisé (1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (30 minutes) 24h après l'intervention chirurgicale. L'évolution du tractus de fibres (plasticité cérébrale) sera évaluée par IRM de manière longitudinale (24h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) (50 minutes). La récupération fonctionnelle sera également évaluée de manière longitudinale (48h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) à travers l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; 10 jours). 2 - Le modèle d'ischémie par occlusion au chlorure de fer sera réalisé (1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par IRM (30 minutes) 24h après l'intervention chirurgicale. L'évolution du tractus de fibres (plasticité cérébrale) sera évaluée par IRM de manière longitudinale (24h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC ; 50 minutes). La récupération fonctionnelle sera également évaluée de manière longitudinale (48h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) à travers l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; 10 jours). 3 - La totalité des animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleurs quelques heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée lors de l’AVC) qui disparait dans la première semaine après l’AVC. Une perte de poids, des douleurs post-opératoires ou un stress pourraient être observés les jours suivants. Lors des tests comportementaux, les animaux peuvent être soumis à un stress dû à la manipulation, l’isolement (
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Les organes prélevés post mortem permettront de réaliser des analyses protéomiques et transcriptomiques.
Remplacement
Les expériences in vitro ou ex vivo ne permettent pas de mimer parfaitement la pathologie en raison de multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein du système nerveux central. De plus, les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. Des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d’apporter le même niveau d’information pour évaluer une récupération fonctionnelle et cognitive de manière longitudinale. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale, la récupération fonctionnelle et la plasticité cérébrale. La physiologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisés est prévue par une limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables, et déterminée selon la sensibilité des méthodes utilisées et l’expertise nécessaire à la bonne réalisation des techniques. Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé grâce à nos expériences antérieures et selon les données disponibles dans la littérature. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel GraphPad Prism (version 9). Nous vérifierons en premier lieu si les échantillons suivent la loi normale (hypothèse gaussienne) à l’aide de tests de Shapiro-Wilk. Le cas échéant, des tests paramétriques seront utilisés (ANOVA suivi de tests post-hoc en cas de différence significative) ; dans le cas contraire, des tests non paramétriques seront réalisés (comparaisons intergroupes : test de Kruskal-Wallis suivi de tests U de Mann-Whitney en cas de différence significative ; comparaisons intragroupes : test de Friedman suivi de tests de Wilcoxon en cas de différence significative).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le transport des animaux en salle d’expérimentation sera réalisé en limitant les secousses, le bruit et la lumière selon le cycle. La température en salle d’expérimentation sera contrôlée et adaptée au bien-être des animaux. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs, soigneusement nettoyés et désinfectés. Au cours de l’intervention chirurgicale, les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. Pour optimiser le réveil de l’animal, la cage de réveil sera disposée de manière à avoir une partie sur un tapis chauffant, laissant le choix à l’animal de la température dans la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront mis à mort si une perte de poids de plus de 15 % est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose (petites maisons), des carrés de cotons et des paillettes seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront mis en place jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle et la plasticité cérébrale suite à un AVC ischémique. Les souris C57BL/6 utilisées dans cette étude seront âgées de 8 semaines car cela correspond au stade de développement jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l’étude des AVC.
Rôle de l’homéostasie chlorure spinale dans l’hypersensibilité nociceptive induite par une séparation maternelle néonatale
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
176 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier l'hypersensibilité à la douleur induite par une séparation maternelle précoce. La moitié des nouveau-nés est séparée de leur mère, puis soumise à des tests de douleur et à des injections dans la moelle épinière, l'autre moitié subit une chirurgie sans réveil avec ablation d'une vertèbre pour enregistrer la moelle jusqu'à huit heures. Le porteur indique aussi que toutes les mères sont mises à mort après le sevrage, au motif que la séparation altère leur système nerveux. Il affirme que la nociception est un processus intégré, impossible à étudier sans sujets vivants dotés d'un cortex développé.
Objectifs
Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN) est un modèle reflétant la prématurité humaine et des études ont montré que les animaux exposés à la SMN présentent des déficit de comportements et une hypersensibilité douloureuse. Des études récentes suggèrent également un déréglement de l'expression de certaines molécules pouvant ainsi contribuer aux altérations comportementales observées suite à la SMN. Dans ce contexte, nous chercherons à évaluer le rôle de certaines de ces molécules exprimées par les neurones de la moelle épinière impliqués dans la transmission de l'information douloureuse. L’objectif du projet sera d’étudier l’effet du bumétanide (BTD), qui pourrait rétablir a) les seuils de douleur chez l’animal SMN adulte et b) la transmission de la douleur par des neurones dans la moelle épinière d'animaux SMN.
Bénéfices attendus
Le modèle de séparation maternelle a permis de décrypter nombre des mécanismes d’altération du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, l’étude permettra de mieux comprendre les voies et mécanismes impliqués dans la douleur qui sont altérés lors d’un stress néonatal non douloureux, et plus particulièrement une séparation précoce avec la mère. Ce projet vise aussi à caractériser l’action potentiellement bénéfique du bumétanide sur le comportement modifié des animaux séparés et sur les modifications moléculaires observées dans ce modèle.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis au protocole de séparation maternelle néonatale, tandis que l'autre moitié des nouveau-nés resteront avec leur mère. Des tests d'évaluation de la douleur (durée 10min/animal), n'induisant pas de stress accru chez les animaux seront effectués une fois chacun du jour 30 au jour 60 postnatal pour la moitié des animaux. Ceux-ci recevront un total de 4 injections sous anesthésie générale 30 minutes avant chaque test comportemental. Une chirurgie durant 45 minutes sera effectuée sur l'autre groupe d'animaux puis des enregistrements de la moelle épinière seront effectués. Ces enregistrements dureront 8 heures maximum.
Impact sur les animaux
Le modèle de séparation maternelle néonatale chez le rat est un modèle de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation altère le fonctionnement de son système nerveux, induisant potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. Les nuisances possibles liées à l'injection intrathécale seront le stress lié à l’anesthésie ainsi qu'une inflammation ou infection potentielle du site d’injection. Les tests comportementaux induisent un changement d’environnement pour les animaux et donc un stress.
Devenir
Toutes les mères de cette étude seront mises à mort après sevrage de leurs petits (P21) puisque la séparation altère le fonctionnement de son système nerveux, induisant potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. En fin d’expérience, tous les animaux seront aussi mis à mort. Pour la moitié des animaux, la chirurgie subie est sans réveil puisqu'une vertèbre est ôtée lors de celle-ci et que leur moelle épinière est manipulée. Les animaux y prenant part seront mis à mort par excès d'anesthésie.
Remplacement
La nociception étant un processus intégré, ce projet nécessite l’étude d’un système intégré et mature. De plus, l’étude vise à caractériser les propriétés et le mode d’action d’une molécule d’intérêt dans notre modèle, et il est donc impossible de se passer de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable de restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans les comportements observés.
Réduction
Chaque groupe de rats requiert 2 portées différentes (comportant chacune minimum 10 animaux) pour une bonne analyse statistique et confirmation des tests comportementaux. L’intégralité des animaux de chaque portée sera analysée à chaque fois, permettant également de préciser les différences mâles-femelles si elles sont observées. Les résultats obtenus sont alors statistiquement robustes et exploitables.
Raffinement
Durant la SMN, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Leur prise de poids sera contrôlée 2 fois par semaine. Les animaux sont hébergés en cages collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à disposition de la frisure pour un nid, un bâton à ronger et un tunnel. Les animaux sont suivis quotidiennement par les zootechniciens de l’animalerie et par les expérimentateurs afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental. Si des changements sont observés, le vétérinaire sera contacté pour décider de la procédure. Pour l’appréciation de la perte de poids, si lors d’une pesée hebdomadaire, il est observé qu’un animal ne prend pas de poids ou en perd par rapport à la pesée précédente, des aliments humides seront mis à disposition dans les cages pour faciliter la prise alimentaire. Si l’un de ces changements persiste plus de trois jours et est observé par un zootechnicien ou l’expérimentateur, le vétérinaire sera contacté et l’animal sera retiré de l’étude. Les injections seront effectuée sous anesthésie générale profonde (isoflurane 3%) pour limiter le stress des animaux. Les tests comportementaux sont realisés après une semaine d’habituation (manipulation par l'expérimentateur 5 minutes par animal chaque jour) afin de réduire le stress.
Choix des espèces
Le rat est un standart en tant que modèle expérimental pour ce type d’expérience impliquant des processus intégrés. Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de SMN a déjà été bien caractérisé chez cette espèce, permettant de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus, ce modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3ème trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3ème trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3ème trimestre de gestation chez l’Homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie postnatales chez le rat. Le protocole de SMN intervient au stade nouveau-né, entre le jour 2 et le jour 12 postnatal. Cependant, les conséquences de ce stress seront observées à l’âge adulte (45 jours postnatal).
Exploration des effets vasculaires de l’apolipoprotéine A-I et de composés mimant son action
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
704 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, dont 320 individus en gravité sévère. Elles sont soumises à un régime gras, à des chirurgies pour poser des cathéters dans les vaisseaux des pattes et du cou, puis à des mesures prolongées de la fonction cardiovasculaire sur animal conscient. Le porteur décrit des douleurs, de la fièvre, des blessures possibles des vaisseaux et une gêne pour s'alimenter après les actes sur les carotides. Il affirme que la coordination in vivo de signaux nerveux, hormonaux et cardiovasculaires ne peut être remplacée, tout en prévoyant quelques études sur cellules en culture.
Objectifs
Dans le cadre de la recherche fondamentale, ce projet permet d'étudier, le rôle de certains récepteurs ou cibles sur les vaisseaux dans le maintien de la fonction vasculaire et l'amélioration de la perfusion des tissus. Il permet en particulier d'évaluer leur contribution dans la régulation de la glycémie ce qui est d'un intérêt pour la prise en charge des sujets diabétiques. Nos résultats préliminaires obtenus sur des souris saines explorant le rôle de ces cibles au niveau du vaisseau, montrent que leur activation induit une vasodilatation. Des travaux publiés suggèrent que ces récepteurs auraient un rôle protecteur au cours des maladies métaboliques dans le sens qu'il induiraient une diminution de la formation de l'athérome au sein des parois des vaisseaux. D'autres études discutent aussi un rôle potentiel dans l'amélioration de la sensibilité périphérique à l'insuline.
Bénéfices attendus
Sur nos modèles expérimentaux, il est attendu une amélioration des paramètres vasculaires et métaboliques chez les animaux transgéniques sains ou malades avec un fond génétique dit contrôle. Cet effet sera mesuré sous l'action d'un traitement et, ce bénéfice sera mesuré par comparaison aux animaux transgéniques invalidés pour les cibles moléculaires étudiées. Il est aussi attendu l'absence d'amélioration voire une aggravation de la maladie (athérome, diabète, ...) chez les animaux transgéniques invalidés pour les cibles moléculaires d'intérêt. Ce projet permet aussi dans le cadre de la recherche translationnelle de pré-établir des données expérimentales pour la mise au point de futurs médicaments.
Procédures
Nous avons estimé un besoin de 704 animaux dans le projet de recherche. Les souris seront placées sous un régime gras favorisant le développement de l’obésité et du diabète (352 souris vigiles). Leur statut diabétique sera évalué lors d’un test de tolérance au glucose. Ce dernier sera administré dans l’abdomen lors d’une injection puis la glycémie sera mesurée sur du sang prélevé à la queue à différents temps à l’aide de bandelettes et d’un lecteur de glycémie. Les souris seront par la suite soumises à des interventions chirurgicales au cours desquelles elles seront anesthésiées afin de poser un cathéter intraveineux dans un vaisseau de la patte (durée: 15 minutes, 384 souris anesthésiées). Cette chirurgie est suivie quelques jours après, d'une autre chirurgie permettant la pose, sur un vaisseau de la seconde patte arrière, d'un dispositif de mesure du débit sanguin et du rythme cardiaque (durée: 30min, 384 animaux anesthésiés). Ces deux chirurgies permettront par la suite d’étudier sur l’animal vigile, les effets de l'insuline sur le système cardiovasculaire, et, la sensibilité des tissus à son action antidiabétique (durée: 3h, 384 souris vigiles). Sur une autre série d'animaux, un cathéter sera posé dans un vaisseau du cou (carotide) de la souris anesthésiée afin de mesurer la pression artérielle sur les animaux vigiles (durée: 90min, 320 animaux vigiles).
Impact sur les animaux
Les expérimentations peuvent induire des effets indésirables ou des nuisances sur les animaux. La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, leur isolement dans certaines procédures, ou lors de l'administration au niveau de l'abdomen d'un produit anesthésiant avant un acte chirurgical. Une nuisance de l'anesthésie est d'induire une hypothermie, une sensation de fatigue en période de réveil, une petite douleur au point d'injection. D'autres nuisances peuvent survenir à l'occasion de procédures chirurgicales comme une blessure du vaisseau lors de l'introduction du cathéter. Il est aussi possible d'induire une blessure d'un organe lors de l'injection dans l'abdomen de substances (anesthésiant, par exemple). D'autres nuisances possibles, sont la sensation de fatigue, la douleur ou de la fièvre qui peuvent être observées au cours des actes chirurgicaux où l'expérimentateur pose à demeurre une cathéter intraveineux ou une sonde à ultrasons de mesure du débit sanguin. Les actes chirurgicaux portés sur les vaisseaux du cou (carotides) peuvent induire au réveil, une douleur locale gênant les mouvements de la tête en particulier pour la prise alimentaire. L'animal peut aussi ressentir au réveil, de la fatigue et développer une fièvre.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés. Ceci est nécessaire afin de prélever les tissus et organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses. Ces examens donnent des informations complémentaires aux données mesurées sur l'animal vivant. Ils permettent de comprendre les mécanismes biologiques mis en jeu dans un tissu ou organe, le développement des lésions au cours du temps, et, les cellules impliquées. Ces prélèvements permettent aussi de réduire le nombre d'animaux dans les expérimentations.
Remplacement
Nos travaux visent à étudier dans un tissu ou organe, au sein d'un organisme vivant, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques. Il s'agit d'études fondamentales bien en amont d'un transfert à l'homme. Il s'agit de mesurer in vivo des mécanismes biologiques en considérant la participation de mécanismes nerveux, endocriniens et les adaptations mises en jeu par le système cardiovasculaire. Pour ces explorations spécifiques coordonnant l'action de multiples signaux in vivo, l'animal ne peut pas être remplacé. Par contre, il peut-être envisagé des études in vitro sur des cellules cultivées afin d'étudier des mécanismes précis portant sur des intéractions pures mises en jeu entre cibles et composés étudiés. Ainsi, des études, in vitro, sur des lignées de cellules endothéliales commercialisées sont prévues pour comprendre les réactions biochmiques immédiates à l'échelle de la cellule et limiter pour ce champ d'exploration précis, dans la mesure du possible, l'utilisation des animaux à cette fin.
Réduction
1/Plusieurs données peuvent être obtenues avec un même animal : la mesure de la tolérance au glucose, la mesure de la sensibilité périphérique à l'insuline, la vasodilatation, des prélèvements de tissus, le prélèvement de plasma pour l'étude des lipoprotéines (profils), le prélèvement de foie ,... 2/ Une réflexion biostatique (recherche bibliographique et examen de travaux similaires avec le nombre d'animaux nécessaires pour démontrer une différence statistiquement significative) est réalisée en amont de la procédure/expérience, pour limiter le nombre d'animaux. Il est aussi prévu d'utiliser des tests statistiques comme le t de Student et l'ANOVA (logiciel Graphpad) pour estimer le nombre d'animaux nécessaires au cours de nos expérimentations. 3/La formation et l'encadrement des expérimentateurs dans les procédures permet d'optimiser l'obtention de mesures/données fiables et interprétables sur un faible nombre d'animaux. 4/ Les animaux seront utilisés dans les expériences/procédures jugées indispensables en fonction de l'avancée du projet.
Raffinement
Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voir supprimer la douleur et le stress, et, améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre: - les animaux seront élevés et hébergés dans une animalerie agrée. - les moyens pour limiter le stress aux animaux sont appliqués: enrichissement des cages, animaux manipulés avec delicatesse dans les procédures ce qui facilite les prélèvements et les mesures (par exemple: en laissant l'animal libre dans la cage et en assurant un geste délicat, naturel, lors du passage de la main sur la queue pour le prélèvement de sang lors du test de tolérance au glucose), expériences réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur - en cas de transport de l'animal, un transporteur agrée pour transport d'animaux sera réquisitionné (par exemple, une navette qui permet d'acheminer des animaux depuis l'établissement éleveur vers l'établissement principal) - des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits. - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après l’opération (anesthésie/analgésie), - la réduction de la durée de certaines études (surtout toxicologiques), - la mise en place de procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
Nous souhaitons d'utiliser la souris pour plusieurs raisons: Nous disposons d'une grande expertise de l'utilisation de cet animal (manipulation, procédures chirugicales, expérimentations spécifiques). Nous disposons aussi d'outils d'exploration des effets vasculaires des molécules étudiées appliqués aux vaisseaux de souris. Dans la littérature, les effets vasculaires de l'apoA-I sont pour beaucoup décrits avec les souris (sauvages et transgéniques) ce qui constitue une base pour notre recherche. Des souris transgéniques, porteuses de mutations sur des gènes qui nous interessent, sont disponibles, et, nous permettent de réaliser le projet. Les souris sont utilisées à partir de 8 semaine de vie. A cet âge elles pourront débuter le régime gras, ce qui est classique dans les études explorant la mise en place de l'athérome au cours du développement de l'animal. Le régime gras sera maintenu sur 30 à 40 semaines maximum. Les différentes explorations sont prévues sur des animaux âgés de 8 semaines à 50 semaines maximum.
Etude de l’impact du polymorphisme N363S du gène NR3C1 codant le Récepteur Glucocorticoïde sur le rétrocontrôle négatif de l’axe corticotrope par les glucocorticoïdes exogènes
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris d'une nouvelle lignée, porteuse d'une mutation du récepteur des glucocorticoïdes, passent deux fois dans leur vie un test comportemental de stress de cinq minutes, destiné selon le porteur à l'évaluation du "bien-être" de la lignée. Une partie des adultes reçoit une injection sous anesthésie locale, d'autres sont opérées sous anesthésie générale pour la pose sous la peau d'un dispositif qui délivre un traitement pendant cinq semaines, et repassent cinq semaines plus tard un test de stress de cinq minutes, sans que le texte précise lequel. 240 souris vont être utilisées, la déclaration en comptant 132 en souffrance légère et 108 en souffrance modérée, certaines passant par plusieurs procédures. La déclaration ne prévoit aucune souris gardée vivante, et le texte annonce leur mise à mort à la fin des procédures, lorsque les analyses de sang et d'organes l'exigent.
Objectifs
Les hormones glucocorticoïdes sont sécrétées par la glande surrénale. Elles sont sécrétées pour permettre à l’organisme de s’adapter en cas de stress et de diminuer la réponse inflammatoire. C’est pourquoi les glucocorticoïdes sont largement utilisés comme traitement. Ils sont utilisés notamment dans le traitement des maladies inflammatoires, des allergies, de l’asthme ou de nombreux cancers. Les glucocorticoïdes n’agissent pas seulement sur la réponse inflammatoire mais sur de nombreux autres organes. C’est pourquoi, lorsqu’il y a un déséquilibre, ils peuvent entrainer des effets secondaires. Lors d’un traitement prolongé par glucocorticoïdes, il n’y a plus de production par l’organisme de glucocorticoïdes. Lorsqu’on arrête le traitement, la production de glucocorticoïdes par l’organisme ne reprend pas chez 40% des patients. Cela entraine un manque de glucocorticoïdes qui peut entrainer des complications graves et s’appelle l’insuffisance corticotrope. Pour le moment, il est difficile de prédire chez quels patients surviendra cet effet secondaire. C’est pourquoi nous essayons de mieux comprendre cette maladie pour améliorer la prise en charge des patients. Les glucocorticoïdes agissent par l’intermédiaire du récepteur glucocorticoïde. Chez 2% de la population mondiale, il existe une mutation de ce récepteur qui entraine une augmentation de l’effet des corticoïdes et donc, théoriquement, une augmentation du risque de complications. Pour étudier si cette mutation augmente le risque d’insuffisance corticotrope, l’utilisation de modèles cellulaires est insuffisante. En effet, ils ne permettent pas de reproduire la complexité de la sécrétion de glucocorticoïdes ainsi que les différents niveaux de régulation. Aussi, il est nécessaire de générer un modèle murin afin d’évaluer les différents acteurs impliqués dans la régulation de l’axe corticotrope. Ce modèle murin permettra d’étudier l’effet de la mutation sur la sécrétion de glucocorticoïdes et d’évaluer si elle constitue un facteur de risque d’insuffisance corticotrope.
Bénéfices attendus
La variabilité inter-individuelle dans la sensibilité aux corticoïdes est un enjeu important en médecine, en effet on considère que près de 2% de la population mondiale reçoit un traitement par glucocorticoïdes exogène. La mise en évidence du variant N363S, retrouvé chez 2-4% de la population, comme facteur de risque pourrait permettre d’adapter de façon personnalisée leur prescription afin de limiter la survenue d’effets indésirables.
Procédures
Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée génétiquement modifiée, les animaux seront soumis à un test comportemental d’évaluation du stress, d’une durée de 5 minutes, 2 fois au cours de leur vie. Une partie des souris adultes recevront une injection après anesthésie locale. D’autres souris seront opérées par anesthésie générale pour mise en place d’un système de délivrance de traitement par perfusion pour une durée de 5 semaines. Ce dispositif permet de ne faire qu’un geste chirurgical, sans avoir à faire plusieurs injections. De plus, les souris seront soumises 5 semaines plus tard à un test comportemental d’évaluation du stress, d’une durée de 5 minutes.
Impact sur les animaux
La modification génétique des animaux ne devrait pas entrainer de souffrance spécifique puisqu’il n’existe pas chez l’être humain de pathologie liée à cette mutation. Cependant, les personnes ayant cette mutation ont tendance à avoir plus de troubles métaboliques et à être plus à risque d’obésité, ces aspects seront donc recherchés et pris en charge le cas échéant chez les animaux génétiquement modifiés. Les nuisances des procédures proposées sont faibles à modérées pour les animaux. L’injection de traitement peut entrainer une douleur au niveau du point d’injection et la pose d’un dispositif sous cutané peut entrainer des douleurs. Ces douleurs sont prévisibles et prises en charge par l’anesthésie.
Devenir
Dès que possible, les animaux seront utilisés dans plusieurs procédures, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire. Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures quand cela sera nécéssaire pour permettre les analyses de sang et des organes post-mortem.
Remplacement
Les corticoïdes agissent sur l’ensemble de l’organisme et sont sous le contrôle de l’axe corticotrope, composé de plusieurs niveaux, comprenant une partie du cerveau, la glande hypophyse et la glande surrénale. Leurs effets sont très finement contrôlés car un excès de corticoïdes entraine des complications métaboliques, psychiatriques et cardiovasculaires et un manque de corticoïdes entraine le décès. Pour permettre cet équilibre, leur sécrétion est contrôlée à différents niveaux, qui est difficile d’étudier de façon dissociée. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à un modèle vivant permettant de reproduire le dialogue entre les différents organes impliqués. L’utilisation de modèles cellulaires in vitro est compliqué, d’une part car il existe un seul modèle de cellules corticotropes immortalisées hypophysaires, issu de cellules tumorales ne réagissant pas forcément de la même façon que des cellules saines aux corticoïdes. D’autre part, car la culture cellulaire ne permet pas de rendre compte de la dynamique de l’axe corticotrope au cours du temps.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un calcul de puissance afin d'inclure uniquement le nombre d'animaux nécéssaire pour répondre à la question posée dans chaque procédure. Le nombre minimal d’animaux a été choisi pour l’ensemble des procédures. Dès que possible, les animaux seront utilisés dans deux procédures pour permettre la réduction du nombre d'animaux nécéssaires.
Raffinement
Les conditions d’élevage et d’hébergement seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages durables que pourraient ressentir les animaux : cages adaptées à l’animal et à sa taille en maintenant les animaux par deux minimums dans chaque cage, et par enrichissement du milieu par copeaux de bois/tunnel en carton et cabanes. * Souris : 5 animaux par cage au maximum (nombre susceptible de varier en fonction de la taille des animaux) - Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaître les points limites. - Les mesures des animaux (poids, taille) seront couplés afin de réaliser l’analyse de plusieurs paramètres pour limiter au maximum le stress des animaux. - Une anesthésie générale ou locale de courte durée sera réalisé pour chaque procédure entrainant une douleur.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris, en effet, les souris sont souvent utilisées dans la recherche car les manipulations génétiques sont bien connues et maitrisées dans cette espèce. De plus, la séquence du gène chez la souris est très proche de celle de l’être humain, ce qui permettra d’extrapoler les données obtenues. Les souris étudiées seront des souris adultes, car les effets attendus de la mutation s’expriment à l’âge adulte.
Rôle d’un régulateur dans la production d’oestrogènes au cours du cycle hormonal chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
Entre deux et six frottis vaginaux, les premiers sous anesthésie gazeuse, puis une ponction du cœur sous anesthésie en prélèvement terminal : 30 souris femelles vont subir ces actes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour la récolte de leurs tissus. Le but est de mesurer leur taux d'œstrogènes au fil du cycle hormonal, une protéine régulatrice de la peau n'ayant montré d'effets que chez les femelles dans des résultats préliminaires obtenus sur une lignée développée pour l'étudier. Le porteur choisit la souris pour une organisation des organes qu'il dit "très semblable à l'Homme" et des étapes du cycle hormonal conservées. Sur l'effectif, il écrit seulement que le nombre a été "défini a minima" pour des résultats interprétables, sans calcul ni chiffre par groupe.
Objectifs
L'objectif du projet est de mieux comprendre le rôle d'un protéine régulatrice impliquée dans la physiologie de la peau. Pour cela, un modèle de souris spécifique a été développé, ce qui permet l'étude du rôle de la protéine au sein de la peau. Des résultats préliminaires obtenus sur ce modèle, ont montré son implication dans le développement des vaisseaux sanguins ainsi que dans le métabolisme des lipides, mais cela uniquement chez les souris femelles. Ce rôle sexe-dépendant pourrait être expliqué par les hormones sexuelles, notamment les oestrogènes qui sont des hormones importantes chez les femelles. De plus, un article récent a montré l'expression de la protéine d'intérêt dans l'hypophyse, petite glande située sous le cerveau qui contrôle la sécrétion d'hormones responsables de la production d'oestrogènes. Pour cela, le taux d’œstrogènes dans le sang sera exploré dans le modèle d'intérêt.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances sur le contrôle de la production d'oestrogènes chez la souris. L’apport de connaissances fondamentales est un prérequis pour comprendre la physiopathologie des maladies vasculaires et permettre le développement de thérapies à plus long terme.
Procédures
Entre 2 et 6 frottis vaginaux seront réalisés, geste qui dure une 15aine de secondes par souris. La ponction cardiaque en prélèvement terminal sera réalisé sur souris anesthésiées 1 fois et durera environ 1 minute par souris.
Impact sur les animaux
Le frottis vaginal réalisé pour vérifier le stade hormonal dans lequel les souris sont peut causer un léger stress momentané chez l’animal et sera donc réalisé sous anésthésie gazeuse au début pour diminuer ces effets.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour la récolte des tissus.
Remplacement
Les expérimentations in vitro on déjà été réalisées et ont donné des résultats concluants quant au rôle de la protéine dans la peau. Il est nécéssaire aujourd'hui de confirmer son rôle dans un modèle plus intégré comme la souris. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable.
Réduction
Dans la procédure, le nombre d’animaux a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée au moins trois fois par semaine grâcfe à des points limites précoces et prédictifs qui ont été définis.
Choix des espèces
La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation des différents organes qui nous intéressent très semblable à l'Homme et les différentes étapes du cycle hormonal sont conservées. Les souris utilisées dans ce projet seront âgées de 6-20 semaines pour rester cohérent avec les expériences déjà réalisées sur ce projet.
Traitement de la fibrose par des cellules T génétiquement modifiées pour améliorer la thérapie génique dans les maladies musculaires
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère, pour tester des cellules immunitaires modifiées contre la fibrose musculaire. Ces souris modèles de dystrophie reçoivent des injections de cellules anti-fibrose puis de vecteurs de thérapie génique, une échographie cardiaque sous anesthésie et un test de force par pincement de la queue, avant d'être tuées pour prélever muscles et cœur. Le porteur annonce peu de toxicité attendue et décrit des douleurs liées aux piqûres. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro de fibrose musculaire et que l'interaction des lymphocytes avec les cellules cibles exige un milieu physiologique.
Objectifs
Notre laboratoire cherche à traiter un certain type de myopathies (maladie des muscles) qui comprennent en particulier la dystrophie musculaire de Duchenne et les dystrophies musculaires des ceintures. Ces myopathies sont des maladies génétiques rares, progressivement invalidantes et conduisent à la perte de la marche. Le muscle sans ses protéines structurales finit par se détruire puis l’apparition de la fibrose rigidifie le tissu et entraîne de sévères complications. Aucun traitement curatif n'est actuellement disponible. Des approches de thérapie génique sont en cours d’étude et consistent à introduire un gène médicament dans l’organisme du patient à l’aide d’un vecteur viral inoffensif pour remplacer le gène malade et rétablir le fonctionnement de la protéine. Cependant, la présence de fibrose qui se développe au cours du temps, empêche le vecteur de thérapie génique de pénétrer correctement dans les tissus atteints réduisant ainsi son efficacité thérapeutique. Récemment, il a été montré dans des modèles de souris que certains types de cellules pouvaient être utilisés pour éliminer les cellules responsables de la fibrose. Il s’agit de lymphocytes T qui sont des cellules du système immunitaire et qui participent naturellement à la lutte contre les agents pathogènes menaçant notre intégrité physique. Ces cellules possèdent un récepteur qui va leur permettent de reconnaitre et de se fixer sur un déterminant que l’on appelle antigène, présent à la surface d’autres cellules et ainsi pouvoir éliminer ces cellules ciblées. Il est possible de modifier ce récepteur pour obtenir une cellule avec un récepteur spécifique de la fibrose. Ces cellules sont déjà utilisées chez l’homme dans le traitement de certains cancers du sang. Nous avons déjà démontré l’efficacité de ces cellules pour réduire la fibrose du muscle squelettique dans un premier modèle de souris. Nous souhaitons maintenant étendre cette preuve de principe à un autre modèle présentant des problèmes de fibrose à la fois dans le cœur et le muscle squelettique pour définir si l’approche peut être généralisée. Nous souhaitons enfin modéliser chez la souris une approche thérapeutique combinant un traitement par ces cellules ciblant la fibrose avec une thérapie génique pour traiter les dystrophies musculaires.
Bénéfices attendus
Ce projet se place dans le cadre de la recherche de traitements pour des maladies génétiques humaines touchant le muscle squelettique. Il vise à valider l’effet thérapeutique des cellules anti-fibrose pour un groupe de maladies humaines sur un modèle murin de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie, et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour.
Procédures
- Prélèvement de sang: 1 seul prélèvement sous anesthésie gazeuse pour vérifier la présence des cellules anti-fibrose, durée 5 minutes. - Injection des cellules anti-fibrose sous anesthésie gazeuse : 2 injections à une semaine d'intervalle, durée 5 minutes. - Injection de vecteurs de thérapie génique sous anesthésie gazeuse : 1 seule injection 15 jours après la dernière injection de cellules, durée 5 minutes. - Pour l’évaluation de la fonction cardiaque, les animaux sont soumis à une échocardiographie en fin de protocole. Les animaux sont anesthésiés et maintenus dans cet état tout au long de l’examen d’une durée de 20 minutes. - Pour le test de force musculaire, le test est limité à 5 min et ne peut être réalisé qu’une seule fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : douleur de piqûres pour injection du traitement et pincement de la queue pour le test de force musculaire. Certains actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies.
Devenir
Les animaux de chaque procédure seront tous euthanasiés pour collecter les muscles squelettiques et le cœur et analyser au laboratoire les effets de nos traitements.
Remplacement
Nous réalisons systématiquement des tests préalables in vitro pour exclure les cellules anti fibrose de mauvaise qualité. En effet, les cellules sont d’abord contrôlées et testés fonctionnellement in vitro avant leurs injections. Nous vérifions le phénotype des cellules en mesurant l’expression de différents marqueurs d’activations et de différenciations, et nous testons leurs capacités à reconnaître et à tuer leur cible. Afin de valider l’effet ces cellules sur la fibrose in vivo au préalable à une application chez l’homme, nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris), car aucun modèle in vitro n’est capable de développer cet aspect de la pathologie. En effet, il n’existe pas de modèle in vitro de fibrose musculaire et l’interaction et l’élimination des cellules fibrotiques par les lymphocytes T nécessite un milieu physiologique où la réponse immunitaire peut avoir lieu.
Réduction
Au cours des 5 années du projet, nous avons prévu d’utiliser un total de 212 souris pour faire l'ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Lorsque ce sera possible, nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes en tant que contrôle pour les différents modèles évalués. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Nous administrerons les cellules anti-fibrose par voie sanguine car c’est le moyen le plus efficace et le moins invasif pour cibler tous les muscles de l’organisme. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Le raffinement du projet inclut la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasie appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies. Nous privilégierons des prélèvements de sang à la veine submandibulaire plutôt qu’au sinus rétro-orbitaire. Les quantités de cellules anti fibrose injectées sont faibles donc aucune toxicité n’est attendue. Les doses de vecteurs de thérapie génique administrées aux souris ne seront pas suffisantes pour induire de toxicité hépatique ou cardiaque ni même de douleur. Néanmoins une surveillance de l’état général des animaux sera effectuée régulièrement. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi. Aucun animal n’est seul dans une cage, sauf si problème d’agressivité.
Choix des espèces
Ce projet se place dans le cadre de la recherche de traitements pour des maladies génétiques humaines touchant le muscle squelettique. Les modèles murins inclus dans ce projet portent des anomalies génétiques ciblant le gène de la pathologie chez l’homme qui va entraîner le plus souvent des désordres musculaires sans impact sur l’activité naturelle de la souris. Ces modèles permettent d’analyser les perturbations de la fonction musculaire et sont donc pertinents pour nos études. Le développement de la fibrose musculaire est progressif et varie d'un muscle à l’autre. Typiquement, dans les deux modèles de souris, pour des souris âgées de 2 mois, le diaphragme et un muscle spécifique du mollet (gastrocnemius) sont déjà très fibrosés alors que le cœur n’est pas encore atteint. Il faut attendre minimum 6 mois pour voir apparaitre du collagène dans le cœur de souris malades. D'autres muscles du mollet (par exemple le tibialis anterieur) présentent une fibrose variable à 2 mois alors qu’à 6 mois le processus fibrotique est déjà terminé. Chacun des deux modèles étudiés développent de la fibrose entre 2 et 6 mois en fonction des cycles de régénération musculaire. Nous utiliserons donc pour ce projet des souris jeunes d’environ 2 mois pour lesquelles le processus de fibrose est juste présent dans les muscles squelettiques et des souris plus âgées de 6 à 10 mois dans lesquelles le processus de fibrose est présent dans le cœur.
Etude et manipulation du micro-environnement tumoral dans les méningiomes de haut grade chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier le micro-environnement des méningiomes de haut grade. Elles reçoivent des injections intracrâniennes de cellules tumorales ou de virus pour induire des tumeurs cérébrales, suivies d'injections modulant le système immunitaire. Le porteur décrit des symptômes possibles comme une perte de motricité empêchant l'alimentation, un amaigrissement et des crises convulsives, avant une mise à mort pour analyse du cerveau. Il affirme qu'aucune culture cellulaire de méningiome n'existe et juge le modèle murin "primordial" pour cette étude.
Objectifs
Les méningiomes sont les tumeurs primitives du système nerveux central les plus fréquentes chez l'adulte. Les formes de haut grade ont une fréquence élevée de mutations NF2 et représentent un quart des méningiomes avec des récidives multiples associées à une morbidité et une survie réduite sans option disponible médicamenteuse ou d’immunothérapie. Les méninges jouent un rôle clé dans la communication neuro-immunitaire par la diversité de leurs cellules immunes et la présence de vaisseaux lymphatiques méningés. Les données récentes, montrent une infiltration fréquente des méningiomes bénins par des cellules immunitaires. Notre hypothèse est que le microenvironnement immunitaire constitué par les cellules immunes méningées et les lymphatiques méningés, régule la progression histologique maligne des méningiomes NF2-mutés et leur comportement d’échappement à la surveillance immunitaire. Nos principaux objectifs sont d’utiliser nos modèles de souris de méningiomes de différents grades de malignité en manipulant le micro-environnement pour déterminer (i) si les lymphatiques méningés régulent effectivement la malignité des méningiomes et (ii) évaluer la participation des populations de cellules immunitaires dans l'initiation et la progression du méningiome.
Bénéfices attendus
Notre projet va permettre de caractériser précisément le rôle du microenvironnement immunitaire dans la malignité des méningiomes-NF2 en manipulant ses composantes lymphatiques et immunitaires dans les méninges, pour pouvoir ultérieurement potentialiser les approches thérapeutiques associées à l'immunothérapie dans les méningiomes agressifs chez l’homme.
Procédures
Les procédures suivantes seront réalisées après une prise en charge première de la douleur par des médicaments, et hydratation. Les souris sont ensuite anesthésiées par anesthésie gazeuse. Les interventions sont réalisées en conditions stériles chirurgicales. Un protocole de prise en charge de la douleur sera suivi en post opératoire. On identifie les procédures suivantes qui seront réalisées selon le plan expérimental en fonction des groupes d’animaux : 1. Injection intra-crânienne pour induire des tumeurs – de lignées celullaires ou de virus recombinants (Durée : 1 heure, préparation 30 min). 2. Injection intra-cérébrale pour augmenter le drainage lymphatique (Durée : 1 heure, préparation 30 min) Les autres procédures ne nécessiteront pas d’analgésie ou d’anesthésie de l’animal et consiste en : 1. Une injection sous-cutanée au niveau de la peau du crane (Durée : 3 minutes, préparation : 10 minutes) 2. Une injection intra-péritonéale (Durée : 3 minutes, préparation : 10 minutes) . les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de protocole en vue des prélèvements.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent développer des symptômes cliniques liés à la présence de méningiomes malins, pas bénins. Les symptômes observés chez l’animal peuvent être : une perte de motricité empêchant l'alimentation, un amaigrissement, des crises convulsives. Les gestes pratiqués chez les souris dans ce projet inclure les nuisances suivantes : Les risques anesthésiques lors de l’injection sous durale et intracérébrale tels que dépression cardio vasculaire, hypothermie, hypovolémie, sécheresse cornée et les douleurs post-opératoires. Le stress de la contention et la douleur de très courte durée lors de l’introduction de l’aiguille pour les injections intra-péritonéales ou sous-cutanées dans les expériences de modulations des cellules immunitaires.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux à la fin de l'ensemble des procédures est justifié par la nécessité de réaliser une analyse histologique complète du cerveau pour répondre aux objectifs de l'ensemble des procédures expérimentales.
Remplacement
Les modèles in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l'obtention de méningiomes avec un aussi grand niveau de complexité et de reproduction de la pathologie humaine que les modèles souris déjà existants. La complexité du cerveau/méninges des souris est nécessaire pour une observation comparative avec le cerveau/méninges humain. L’utilisation d’un modèle murin est donc primordiale pour cette étude.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés (Nombre total : 540 animaux) pour nous permettre de générer des données statistiques solides. Afin d'assurer la fiabilité statistique et de limiter le nombre d'animaux, nous avons estimé l’effectif a priori sur la base de travaux antérieurs et sur un calcul de puissance, et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interpétation fiable des résultats.
Raffinement
A la réception des animaux en provenance de l’exterieur, une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilé par groupes de 3 afin de fournir un environnement social enrichi. Les animaux auront à disposition des composants de nidification, des bâtonnets à ronger et des maisons sont également disponibles. Ils auront à disposition de la nourriture en permanence et accès à l’eau. Si l’animal a du mal à se déplacer, par exemple juste après une chirurgie, les croquettes seront mouillées et déposé sur la litière et une solution d’hydratation gélifiée sera mis en place. Les paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie,) seront surveillés quotidiennement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement par l’équipe zoothechnique et chaque jour de la semaine par un des membres de l’équipe de recherche (et plus si nécessité). Le poids des souris sera vérifié deux fois par semaine tout au long de la procédure expérimentale à partir de la première expérimentation (à l’âge de 2 mois) jusqu’à l'euthanasie (entre 5 et 15 mois selon les procédures). Le cahier opératoire sera rempli le jour de l’intervention pour renseigner le temps per-opératoire et post opératoire immédiat, à J1-J2 et J8 post chirurgie. Il servira à notifier les éléments de surveillance, ainsi que les administrations d’antalgiques.
Choix des espèces
Le modèle animal est le seul moyen de pouvoir manipuler le micro-environnement des méningiomes bénin ou malin, notamment en raison de l'absence de cultures cellulaires de méningiomes en général et plus particulièrement avec le profil mutationnel désiré et les différents composants du micro-environnement. Les autres expériences prévues dans le projet doivent être réalisées chez la souris car elles utilisent un modèle souris déjà publié et validé par la communauté scientifique internationale. Les animaux seront utilisés de 2 à 15 mois de manière similaire aux précédents modèles de meningiomes publiés précédemment, un suivi d’au moins 12 mois étant nécessaire pour les modèles souris de méningiomes bénin génétiquement modifié où les méningiomes apparaissent de manière tardive
Etude de l’effet de différentes molécules ciblant le récepteur GPR103 à peptide RFamide sur les effets négatifs de la prise chronique de morphine et les symptômes anxio-dépressifs dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère à modérée, dont 672 individus en gravité modérée. Elles reçoivent de la morphine de façon répétée pour induire une hypersensibilité à la douleur et une dépendance, puis subissent des dizaines de tests douloureux et un sevrage déclenché par la naloxone. Le porteur décrit ce sevrage, avec tremblements, sauts, claquements de dents et diarrhées, comme désagréable et précise qu'il ne peut pas être atténué puisqu'il fait partie des objectifs. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'observer ces comportements et retient un fond génétique de souris qu'il juge "incontournable" en neurosciences.
Objectifs
La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs malgré leurs nombreux effets indésirables dont la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur également appelée hyperalgésie, caractérisée par une exacerbation de la sensibilité à un stimulus nociceptif ce qui sous-entend des points communs entre l’hyperalgésie induite par les opiacés et le développement de l’hyperalgésie induite par les douleurs chroniques. Des résultats récents indiquent que le récepteur à neuropeptides RFamide GPR103 est impliqué dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques et anti-hyperalgésiques sur des cibles peu ou pas caractérisées jusqu'à présent.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, les résultats de ce projet permettront de valider l’efficacité de nouveaux antagonistes du récepteur GPR103 contre l’hyperalgésie induite par les opiacés mais également les troubles anxio-dépressifs. Ce projet permettra de valider de nouveaux antagonistes du récepteur GPR103 dans le but d'un éventuel développement clinique.
Procédures
Un premier lot d’animaux subira des 23 injections (sur animal vigil) d’une minute environ pendant 11 jours. Ces animaux subiront au total 66 tests nociceptifs d’une durée de 1 min environ espacés sur une période de 4 semaines. Au premier jour de l’expérience ainsi qu’au 10 jours, le délai entre chaque test est de 30 min et les animaux subissent 8 tests. Les autres jours, les animaux subissent 1 seul test toutes les 24h. Un second lot d'animaux subira une injection d'une durée de 1 min réalisée sur animal vigile puis une semaine après, une autre injection d'une durée de 1 min réalisée sue animal vigile et un test de 10 min. Un troisième lot d'animaux subira une injection d'une durée de 1 min réalisée sur animal vigile puis un test d'une durée de 300 sec pour mesurer les comportements dépressifs, puis une semaine après, une autre injection d'une durée de 1min réalisée sue animal vigile et un test de 6 min.
Impact sur les animaux
L’administration chronique de morphine induit un effet analgésique mais également un développement progressif d’une hypersensibilité à la douleur. Ces administrations répétées de morphine induisent également un état de dépendance physique que l’on observe uniquement lors de la précipitation du sevrage par administration de naloxone. Ce syndrome comportemental de sevrage est désagréable et transitoire, les animaux présentent alors pendant une vingtaine de minutes des tremblements, des sauts, des claquements de dents et des diarrhées et une perte de poids. Cet état de sevrage ne peut être atténué puisque c’est l’un des objectifs de notre étude. Il peut y avoir dans de rares cas un développement d’infection lors d’administration répétés. Les tests comportementaux inclus dans ce projet induisent soit une douleur sur laquelle l'animal garde le contrôle: le retrait de la queue de l'animal met fin au test, soit mettent les animaux dans des situations légèrement anxiogènes. L’administration des antagonistes devraient réduire les symptômes de douleur et/ou d’anxiété dépression et ne devraient pas induire de symptôme indésirable.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des analyses post-mortem des tissus cérébraux.
Remplacement
Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, la caractérisation de la modulation de la douleur et des effets anxiolitiques ou antidépresseurs des molécules nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec 12 animaux/groupe.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi avec de la frisure pour faire un nid et des battons en bois à rogner, et observés quotidiennement par l’expérimentateur (afin de repérer immédiatement tout signes de bagarre et/ou de blessure), ou une personne compétente de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les animaux subiront une période de 2 semaines d’habituation aux locaux avant le début du protocole expérimental. Les souris sont habituées à l’expérimentateur (par une période de manipulation de 3 jours) et à l’expérimentation (habituation aux dispositifs et à la contention pour les injections) afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis afin de soustraire l'animal à la souffrance. En cas de nécessité des décisions seront prises en accord avec le vétérinaire de l’institut pour stopper tout signe de mal-être de l’animal.
Choix des espèces
Les objectifs du projet consistent à étudier les effets des antagonistes du récepteur RFamide GPR103 sur l’hyperalgésie induite par les opiacées ou sur les symptômes anxieux ou dépressifs. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. L’ensemble de nos expérimentations animales est réalisé sur des souris C57BL6/N, fond génétique le plus courament utilisé dans la littérature pour le modèle d'hyperalgésie induite par les opiacés utilisé. De plus, nos résultats préliminaires ont été obtenus sur ce fond génétique. A leur arrivée au laboratoire, les souris sont âgées de 7 semaines avec un poids allant de 25 à 30 grammes. Les animaux sont soumis aux procédures expérimentales à partir de 9 semaines, ce qui correspond à l’âge de la maturité sexuelle et à un développement complet du système nociceptif.
Effet des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma sur le développement à long terme de pathologies cardiovasculaire (cœur/poumon) et trouble du rythme associé chez la souris (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
414 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier les effets cardiovasculaires de faibles doses de rayonnements gamma. Elles reçoivent une irradiation du corps entier ou localisée, des examens cardiaques répétés pendant plusieurs mois, un transport entre deux sites, et pour les mâles une contention en tube puis une chirurgie finale. Le porteur affirme que l'irradiation à faibles doses n'entraîne ni douleur ni lésion, tout en reconnaissant un stress possible, des douleurs liées aux aiguilles et un risque d'arrêt cardiaque sous anesthésie. Il présente le projet comme un appui aux normes de radioprotection et juge le recours à la souris "nécessaire", faute d'études in vitro suffisantes.
Objectifs
Il est important de connaitre les effets à court et long terme des irradiations faibles doses sur le système cardiovasculaire et d’en comprendre les mécanismes car cela touche des populations vivant dans des zones contaminées mais aussi des femmes traitées par des rayons X pour un cancer du sein. Les effets cardiovasculaires à long terme des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants seront évalués sur des souris afin d’apporter des réponses très attendues qui permettront d’alimenter le système de radioprotection. Ce projet permettra aussi d’identifier les cellules et les voies de régulation qui sont impliquées dans les effets à long terme de ces rayons. Ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances sur les pathologies qui peuvent se développer chez les populations exposées à des rayonnements faibles ou localisés afin d’actualiser les connaissances et participer à la détermination des normes en radioprotection pour des institutions du domaine de la radioprotection. La connaissance des cellules et voies impliquées permettra ensuite de poursuivre les études in vitro.
Procédures
Au total 414 souris (234 femelles et 180 mâles) seront utilisés pour 1 procédure modérée. 180 animaux subiront 1 fois une irradiation corps entier à des doses faibles n’entrainant ni douleur, ni brulure que ce soit pendant l’irradiation ou après celle-ci. 234 animaux subiront une irradiation localisée à de faibles doses. Les 414 animaux subiront ensuite des examens non douloureux et non invasifs sous anesthésie et vigiles (1 par mois pendant 3, 9 ou 15 mois). Les animaux seront ensuite transportés en voiture dans une autre animalerie pour permettre l’investigation cardiovasculaire. Ces investigations comprennent des mesures non invasives et non douloureuses sur animaux vigiles mais aussi des investigations invasives sous anesthésie. Les 180 mâles seront placés 5 minutes, 1 fois par jour pendant 5 jours dans un tube à contention. Les altérations cardiovasculaires déjà observées sur des groupes sont modérées et non douloureuses. L’intervention finale pour les 180 mâles sera une intervention chirurgicale qui durera 10 minutes sera effectuées sous anesthésie et analgésie par des personnes agrémentées. L'intervention finale pour les 234 souris femelles sera un prélèvement sanguin de 1mL sous anesthésie générale. les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire à l’issue de la chirurgie pour les mâles et du prélèvement de sang pour les femelles. Les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire à l’issue de la chirurgie pour les mâles et du prélèvement de sang pour les femelles.
Impact sur les animaux
L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de lésion pour les animaux. Ils pourront développer des maladies cardiovasculaires qui restent peu sévères et indolores. Un stress (peur ou détresse) des animaux est possible lors de la mise en boite d’irradiation (414 animaux) et dans les tubes à contention (concernant 180 mâles). Les procédures avec aiguille peuvent potentiellement conduire à une douleur, à une peur et à des infections (pour les 414 souris). L'anesthésie générale peut entrainer même rarement un arrêt cardiaque et durant la chirurgie il peut y avoir une hémorragie. Le transport des 414 animaux entre les 2 sites peut engendrer une peur temporaire et un stress thermique de courte durée.
Devenir
A la fin de la procédure toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.
Remplacement
Pour mimer une irradiation localisée ou en corps entier, il est nécessaire d’avoir recours à une exposition d’animaux vivants permettant l’étude sur un modèle intégré des différentes fonctions cardiovasculaires. La régulation des paramètres cardiovasculaires, la participation de cellules au remodelage vasculaire ne peuvent être évaluées qu’in vivo, c’est pourquoi ce projet nécessite des modèles murins. De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique. En effet, il est très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules. Néanmoins pour une partie du projet (dès que possible, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture (progéniteurs en culture, cellules vasculaires en culture).
Réduction
Au total, 414 animaux seront prévus dans ce projet (234 souris femelles et 180 souris mâles). Le nombre d'animaux par groupe (8-10 pour les feemeellees et 15 pour les mâles) a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum et pour conserver un nombre d’animaux suffisant pour nos analyses statistiques et compte tenu de la diversité des analyses prévues sur les différents organes. A notre connaissance, ces expériences n'ont jamais été réalisées ni en France, ni dans le monde, par d'autres équipes dans un protocole expérimental semblable.
Raffinement
Les volumes injectés sont les plus petits possibles. Les animaux sont pesés régulièrement tout au long de la procédure. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs (2 à 6 souris par cage) et l’isolement est évité. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier, morceau de bois et maison en carton. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet selon un tableau. La profondeur de l'anesthésie sera vérifiée en testant l'absence de réflexe de retrait de la patte (après pincement). Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement par application de Vétédine, crème ou spray antiseptique. Les points limites adaptés ont été établis pour chaque étape et leur absence sera vérifiée de façon appropriée.
Choix des espèces
La souris est un modèle mieux caractérisé que le rat pour les études sur le système cardiovasculaire et déjà utilisé pour les études sur la toxicité radio-induite à long terme. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux et cardiovaculaire sont matures. Les animaux arriveront entre 4-6 semaines pour avoir des groupes d’hébergement stable et limiter ainsi les bagarres. Les animaux auront pour les longs termes entre 3 et 15 mois lors des réalisations des protocoles décrits dans cette demande.