Rongeurs
Évaluation dans un modèle murin d’une méthode d’immunothérapie pour traiter le paludisme
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de protéines puis de parasites du paludisme, un traitement, des prélèvements sanguins tous les un à deux jours et, sous anesthésie, une exposition de 45 minutes à des piqûres de moustiques. Le porteur signale un affaiblissement, une anémie et de possibles symptômes neurologiques liés à l'infection, l'objet étant de tester une immunothérapie redirigeant des anticorps existants vers les globules rouges infectés. Il indique qu'aucune culture continue de ce parasite ne permet de remplacer la souris pour produire et sélectionner les parasites transgéniques.
Objectifs
Le paludisme est dû à l’infection par le parasite Plasmodium, qui se multiplie dans les globules rouges. L’émergence de parasites résistants aux médicaments antipaludiques actuels impose de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet a pour objectif d’évaluer dans un modèle murin une nouvelle stratégie d’immunothérapie contre le paludisme, visant à rediriger une réponse anticorps pré-existante vers les globules rouges infectés pour entraîner leur destruction par le système immunitaire. Une preuve de concept de cette stratégie a déjà été établie contre des cellules cancéreuses.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à apporter la preuve de concept de l'efficacité d'une stratégie d'immunothérapie contre le paludisme dans un modèle pré-clinique murin. Le développement de thérapies basées cette méthode, interférant avec la pathogénicité et/ou la transmission du parasite, pourrait offrir de nouvelles alternatives de contrôle du paludisme.
Procédures
Administrations sur animaux vigiles: injection intrapéritonéale d'anesthésiants (1 injection, durée 10 secondes), injection sous-cutanée de protéines (3 injections espacées de 2 semaines, durée du geste 10-15 secondes), injection intrapéritonéale de protéines (2 injections espacés de 2 jours, durée du geste 10-15 secondes), injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes), injection intraveineuse de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes), injection intrapéritonéale de médicament (3 injections espacées d'1 jour, durée du geste 10 secondes), administration de médicament dans l'eau de boisson (durée 7 à 10 jours). Prélèvements sur animaux vigiles: prélèvement d'une goutte de sang ( tous les 1 à 2 jours pendant 3 à 21 jours, durée du geste 10 secondes). Prélèvements sur animaux anesthésiés: prélèvement de sang (acte unique, durée 10 minutes, suivi immédiatement par une euthanasie par une méthode réglementaire). Exposition d'animaux anesthésiés à des piqûres de moustiques (pendant 45 minutes).
Impact sur les animaux
Stress lié à la contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales, intraveineuses ou sous- cutanées sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, douleur au site des injections sous-cutanées, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie, symptômes neurologiques).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.
Remplacement
Le projet vise à évaluer dans un modèle murin une nouvelle stratégie d'immunothérapie contre le paludisme, notamment à l'aide de parasites génétiquement modifiés. Le projet nécessite l'utilisation d'un organisme immuno-compétent, en l'occurrence la souris. De plus, il n'existe pas à l'heure actuelle de système de culture continue des Plasmodium berghei in vitro permettant le remplacement du modèle murin pour la production et la sélection de parasites transgéniques.
Réduction
Au total ce projet utilisera 320 souris. Le nombre d'animaux a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs des procédures. La taille des effectifs a été établie à l'aide d'un calcul de puissance pour permettre de détecter un effet significatif par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères (2 à 5 par cage) dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Les conditions environnementales des locaux d’hébergement sont réglementaires. Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Une période d'habituation sera également respectée dans l'appareil de contention avant les injections intraveineuses sur animaux vigiles, afin de réduire le stress. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur. La présence de points limites définis permettra d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection par Plasmodium berghei. Afin de faciliter l’alimentation et l'hydratation chez les animaux infectés par Plasmodium, la nourriture pourra être donnée sous forme de bouillie ou de gel directement dans la cage. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal permettant des études fonctionnelles chez Plasmodium berghei, un parasite qui reproduit de multiples aspects du paludisme causé par les parasites infectant l'homme. La souris est un hôte doté d'un système immunitaire permettant d'évaluer l'efficacité de stratégies d'immunothérapie contre le paludisme. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.
Test d’une nouvelle génération de vecteurs pour la Sclérose Latérale Amyotrophique liée aux mutations SOD1 chez un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 460, modéré pour 130 et sévère pour 130. Issues d'une lignée transgénique qui développe une sclérose latérale amyotrophique, elles perdent du poids vers 90 jours puis se paralysent jusqu'à la mort vers 130 jours, une partie étant suivie jusqu'à ce point limite. Elles reçoivent une injection dans la moelle épinière et une injection dans le cerveau, puis des prélèvements sanguins et des tests moteurs répétés, pour tester des vecteurs de thérapie génique visant à réduire la protéine SOD1 toxique. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire n'existe et que le modèle murin est "indispensable".
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie qui se traduit par la perte des motoneurones (cellules de la moelle épinière) et conduit à la paralysie puis au décès des patients dans un délai de 5 ans après le diagnostic. La maladie se présente sous forme sporadique (90% des cas) ou héréditaire (10%). 20% de la forme héréditaire sont dus à une mutation dans le gène SOD1 et sont à l'origine d'une accumulation de la protéine correspondante dans les cellules, entrainant toxicité et mort cellulaire. C’est sur cette forme de la pathologie que notre projet est focalisé. A l'heure actuelle il n’existe pas de traitements efficace chez l’Homme. L’étude sera réalisée sur une souche de souris transgéniques qui est le modèle le plus communément utilisé dans l’étude de cette maladie car les animaux développent les même symptômes que les patients. Ces animaux déclarent les premiers symptômes à 90 jours, puis leur état général se dégrade jusqu’à la mort à 130 jours environ. Ayant démontré l’efficacité d'une thérapie génique dans la SLA, nous avons maintenant pour but d’optimiser cette thérapie génique en testant l'efficacité d'une nouvelle génération de vecteurs, afin de diminuer la dose de vecteur à injecter (ce qui permettrait de réduire les effets secondaires tels qu’une réaction immunitaire, une toxicité…) tout en gardant l’efficacité du premier produit testé.
Bénéfices attendus
Ce projet mené à terme nous permettra de constater l'efficacité de notre traitement sur la réduction des niveaux de SOD1 toxique et par conséquent sur l'augmentation de la survie, l'amélioration des signes moteurs et le retard de l’apparition des symptômes, avec pour objectif à long terme, de proposer un traitement dans le cadre de thérapies géniques dans la Sclérose Latérle Amyotrophique chez l'homme. Il n’existe actuellement aucun traitement dans cette maladie
Procédures
Les souris élevées pour ce projet sont susceptibles de développer un phénotype dommageable caractérisé par une perte de poids vers 90 jours puis une atteinte musculaire conduisant à la paralysie (vers 120 jours) puis la mort de l'animal. Un prélèvement de queue sera réalisé sur ses souris vigiles afin de vérifier si elles sont ou non porteuses du gène qui nous intéresse. Une anesthésie locale sera réalisée par immersion de la queue de l'animal dans de l'éthanol refroidi. Ce geste ne nécessite que quelques secondes. 4 différentes interventions auront lieu au cours des différentes procédures dont 2 sur souris anesthésiée et 2 sur souris vigiles ; une unique injection intramoelle à J50, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, et d’une durée n’excédant pas les 15 minutes, une unique injection intracérébroventriculaire à J50, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, et d’une durée n’excédant pas les 30 minutes, des prélèvements de sang au niveau de la veine sous-mandibulaire sur souris vigiles, tous les 20 jours de J40 jusqu’au point limite. 1 minute suffit pour réaliser ce geste et, sur souris vigiles, tests comportementaux (pesée, test de force musculaire, neuroscore et test de coordination motrice) une fois par semaine de J50 jusqu’au point limite. Le temps total pour réaliser ces tests comportementaux n’excède pas 20 minutes par souris ; le neuroscore et la pesée sont réalisés l’un après l’autre avec une durée totale d’environ 1min, suivi par le griptest, qui nécessite moins de 5 minutes pour les 3 mesures. Pour finir, le rotarod a une durée totale inférieure à 10 minutes avec 2 mesures (de 2minutes maximum) avec 5 minutes de repos entre les 2. Concernant l'euthanasie, les animaux pour lesquels des prélèvements seront réalisés seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative des motoneurones de l'adulte qui se caractérise par une dégénérescence progressive des motoneurones. Elle provoque une paralysie progressive de l'ensemble des muscles. Les souris utilisées pour la survie présenteront donc des signes de dégénérescence comme la paralysie des pattes et/ou du bassin. Cela entrainera des difficultés pour se déplacer, s'hydrater et s'alimenter. Les différentes procédures réalisées chez l’animal (intramoelle, injection intracérébroventriculaire) sont à même d’entraîner une douleur post-opératoire. Le prélèvement caudal ainsi que les prélèvements sanguins peuvent également être une source de stress et de douleur de courte durée. Les différents tests fonctionnels réalisés chez la souris (pesée, neuroscore, test de force musculaire, test de coordination motrice et neuroscore) peuvent également entraîner un stress chez l’animal.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés selon la méthode justifiée pour chaque procédure afin de prélever tous les organes nécessaires à la réalisation des analyses biochimiques et histologiques prévues dans notre étude. Ces prélèvements sont réalisés post-mortem et nécessite donc l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Actuellement, aucun modèle cellulaire n’existe pour pouvoir mener une étude pré-clinique dans la Sclérole Latérale Amyotrophique. Le modèle animal est indispensable pour optimiser et développer notre approche de thérapie génique pour cette maladie. Ce modèle, particulièrement bien caractérisé, nous permettra de quantifier l’efficacité de notre traitement sur la réduction des niveaux de SOD1 toxique et par conséquent sur la survie, l'amélioration des signes moteurs et le retard de l’apparition des symptômes.
Réduction
Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé, les groupes seront constitués du nombre minimal nécessaire à une interprétation statistique viable. Si possible, les études seront réalisées sur des animaux du même sexe, afin, encore une fois, d'utilisé un nombre minimal d'animaux. Les animaux ne répondant pas aux exigences pour l’étude (porteur ou non de la maladie) seront systématiquement proposés pour d’autres études déjà validées. De plus sur chaque animal utilisé un maximum d’échantillons biologiques sera prélevé pour parer à toute nouvelle analyse à effectuer. Ce qui nous donne : 45 femelles SOD impliqué pour la procédure 2, 35 femelles B6SJL pour la procédure 3, 50 femelles SOD pour la procédure 4 et 65 mâles et 65 femelles SOD pour la procédure 5. Pour la procédure 1, il y aura également 16 mâles reproducteurs ainsi que 380 animaux non inclus en protocole mais nécessaire pour générer les souris en protocole ainsi que 64 souris supplémentaires pour garantir le bon nombre de souris au phénotype attendu, ce qui nous donne un nombre total de 720 souris.
Raffinement
Les animaux seront regroupés par groupe de 6 animaux du même sexe au maximum. Si des bagarres entre mâles sont observées, ceux-ci seront séparés immédiatement. Dans chaque cage un enrichissement sera apporté sous forme de papier craft pour la confection des nids, voir avec des abris en carton si besoin. Lors des injections, un anesthésiant adéquat sera utilisé et la qualité de l'anesthésie testée avant de procéder aux expérimentations et une analgésie adapté apporté si nécessaire. Enfin chaque animal sera suivi quotidiennement de sa naissance à sa mort et un contrôle du poids réalisé une fois par semaine avant l'apparition des symptômes de la maladie et autant de fois que nécessaire après l'apparition des symptômes afin de contrôler précisément les points limites qui, une fois atteint, entraineront automatiquement l'euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance excessive. De plus pour minimiser le stress des animaux, ceux-ci seront manipulés tout au long de l’expérimentation par un nombre limité de personne pour créer une habituation souris/manipulateur. De plus, les souris seront hébergées dans une salle réservée à notre équipe, ce qui limitera les venues dans la pièce et donc, le stress des animaux. Il est à noter qu’un soin particulier sera apporté aux animaux commençant à développer la maladie pour leur faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau. Ainsi des croquettes ou de la bouillie pourront être placés directement dans la cage, ainsi que de l’hydrogel en cas de besoin. Quelque soit la procédure, en cas de douleur aigue, les animaux seront immédiatement euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les modèles animaux les plus communément utilisés pour les projets de thérapie génique pour le traitement de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) sont des lignées murines. Dans notre projet nous utiliserons le modèle murin transgénique pour la SLA. Ce modèle reproduit les principaux symptômes de la SLA et est par conséquent adapté pour évaluer l’efficacité de nos traitements sur la forme génétique de la maladie. Les animaux présentent des symptômes à partir de 90 jours (perte de poids) due à une accumulation de la protéine SOD1 entrainant une paralysie progressive à partir de 115 jours et la mort des animaux à 130 jours. Les animaux seront injectés à l’âge de 50 jours. Ce stade correspond à des animaux adultes pré-symptomatiques pour lesquels l’accumulation de la protéine toxique SOD est déjà commencée. Ce stade est idéal pour mimer un traitement puisque la pathologie est déjà présente et décelable (biochimie) mais les conséquences ne sont pas encore irréversibles.
Cartographie fonctionnelle et spatiale du tPA endogène au cerveau, en conditions normales ou ischémiques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 10 tuées sans réveil. Une lignée génétiquement modifiée rend le tPA cérébral fluorescent, et une partie des souris subit un accident vasculaire cérébral provoqué au laboratoire, suivi d'une imagerie à trois, six, douze et vingt-quatre heures avant le prélèvement du cerveau. Le porteur signale une possible perte de poids, des douleurs post-opératoires, une détresse et des déficits fonctionnels, l'objet étant de cartographier l'origine cellulaire de cette protéase. Il affirme le "caractère de stricte nécessité" du recours à la souris et l'absence de méthode de remplacement.
Objectifs
L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une protéase clé du système fibrinolytique sanguin. Par ses propriétés, le tPA est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est aussi un élément clef dans le système nerveux central (SNC), mais l’élucidation des sources cellulaires de tPA est limitée par un manque d’outils de détection fiable. Cette question est pourtant majeure, pour comprendre comment le tPA favorise ou limite les fonctions et la survie neuronale. L’objectif de cette première étude est de mieux comprendre l’origine cellulaire et les fonctions du tPA dans le SNC par des approches ex vivo/in vivo en se basant sur un nouvel outil original d’étude : une souris génétiquement modifiée, qui d’une part exprime le tPA (associé à une protéine fluorescente) pour le rendre détectable, et d’autre part permet de déléter spécifiquement celui-ci dans les cellules du SNC sans altérer son expression dans les autres compartiments. Cette lignée de souris sera utilisée pour des études histologiques et fonctionnelles, en conditions physiologiques ou dans un modèle d’AVC ischémique développé au laboratoire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles pour comprendre le rôle complexe d’un acteur clef de la physiopathologie cérébrale. Cette meilleure compréhension permettra d’identifier des cibles thérapeutiques pour la prise en charge des patients victimes d’un AVC ischémique.
Procédures
Procédure 1 : Prélèvement sous anesthésie (sans réveil). Procédure 2 : - Chirurgie sous anesthésie ; évaluation des lésions cérébrales et des transformations hémorragiques par imagerie cérébrale : J+3h, J+6h, J+12h, J+24h. - Prélèvement sous anesthésie (sans réveil)
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : une perte de poids/arrêt de la prise alimentaire et de boisson, des douleurs post-opératoires, des signes de détresse, du stress, des déficits fonctionnels.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser autant que possible le nombre minimal d’animaux adéquat, afin de correspondre au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible. Les tests statistiques utilisés pour les résultats de l’étude comprendront des tests non-paramétriques (Test de Kruskal-Wallis, suivi du test post-hoc de Dunn’s) ou un t-test si la distribution des échantillons suit une loi normale (Shapiro-Wilk).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Régulation d’un récepteur antitumoral dans les lymphocytes pour l’élimination de tumeurs par immunothérapie.
- Recherche appliquée
- Cancers
837 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de mélanome leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent des cellules immunitaires modifiées, un suivi par imagerie pendant neuf semaines et des prélèvements sanguins hebdomadaires, une partie étant soumise à un régime carencé en acides aminés. Le porteur reconnaît que ces tumeurs peuvent entraîner une perte de poids importante et gêner les déplacements, l'objet étant de tester un système limitant l'expression du récepteur anti-tumoral à l'intérieur de la tumeur. Il affirme s'appuyer sur de nombreuses données en culture cellulaire mais conclut à la nécessité de la souris pour valider l'approche sur un "organisme entier".
Objectifs
Aujourd’hui de nombreux essais ont démontré l’efficacité de l’immunothérapie par injection de cellules immunitaires modifiées pour exprimer un récepteur leur permettant de détruire les cellules tumorales, notamment dans le cas des leucémies et lymphomes. Cependant leur efficacité est bien moindre quand il s’agit de tumeurs solides telles que les mélanomes, en raison des propriétés de la tumeur qui supprime la réponse immunitaire contre les cellules cancéreuses. La solution proposée est d’équiper les cellules immunitaires du patient avec un nouveau récepteur leur permettant de détecter et détruire efficacement les cellules tumorales. Cependant, ces modifications qui renforcent l’agressivité des cellules immunitaires peuvent engendrer des effets secondaires de destruction des tissus sains de l’organisme. Pour accroitre l’efficacité des cellules immunitaires tout en minimisant les effets adverses, nous préconisons l’utilisation de notre système de régulation pour que les cellules immunitaires modifiées, n’expriment le récepteur anti-tumoral qu’à l’intérieur de la tumeur. En effet cette régulation permet de contrôler spatialement (dans la tumeur) ou temporellement (par le biais d’un traitement pharmacologique ou d’un régime spécial), l’expression du récepteur anti-tumoral à la surface de ces cellules permettant d’allier efficacité et sécurité dans le contexte de ces thérapies. Le contrôle de l’expression du récepteur anti-tumoral permettrait d’éviter les effets secondaires précédemment mentionnés de manière à considérablement accroitre l’efficacité et le contrôle de ces stratégies d’immunothérapies dans le contexte des tumeurs solides. L’étude préclinique proposée constitue une étape indispensable de notre projet de sécurisation des thérapies par récepteur anti-tumoral à l’aide du système de régulation, pour confirmer chez l’animal les résultats précédemment obtenus, montrant l’efficacité de ce système sur cellules isolées.
Bénéfices attendus
Ce projet qui combine des approches en culture cellulaire et chez l’animal, permettra de caractériser, pour la première fois, l’efficacité d’un système de régulation pour l’expression exclusive du récepteur anti-tumoral à l’intérieur de la tumeur à l’aide de conditions présentes de manière systématique dans les tumeurs solides, à savoir une baisse des niveaux de nutriments et d’oxygène. Les avancées remarquables récentes dans ce domaine de recherche, en équipant les cellules immunitaires avec des récepteurs anti-tumoraux pour combattre les cancers, permettent désormais de combiner différentes thérapies innovantes et de décupler l’efficacité de ces nouveaux traitements en les adaptant à chaque patient. Notre projet innovant, met en avant les bénéfices de notre système permettant l’expression du récepteur anti-tumoral par les conditions particulières présentes dans la tumeur et prévient les effets adverses autrement liés à ces traitements. De plus ce système d’expression régulée permettra de rendre possible une thérapie combinant, régimes alimentaire spéciaux, ayant par ailleurs d’importants effets anti- tumoraux. Ces effets combinés sur l’expression du récepteur anti-tumoral et sur la réduction de la croissance des tumeurs peuvent potentiellement favoriser l’effet curatif. Dans ce projet, nous nous attendons à ce que notre système restreigne l’expression du récepteur anti-tumoral spatialement et temporellement, permettant de réduire les risques d’effets secondaires délétères chez les patients. En effet, les connaissances générées par nos travaux pourraient à terme être exploitées dans le cadre des thérapies par l’expression d’un récepteur anti-tumoral dans les cellules immunitaires, chez des patients atteints de tumeurs solides, aujourd’hui dans une impasse thérapeutique.
Procédures
Ce projet inclut des injections sous la peau de cellules tumorales et en intraveineux dans la queue pour les injections de cellules immunitaires. Les injections en sous-cutané seront faites sur souris anesthésiées tandis que les injections en intraveineux seront faite sur souris éveillées et ne dépasseront pas 5 minutes. L’injection sous la peau de cellules tumorales faite au début de l’expérience permettra la croissance d’une tumeur de mélanome et les injections intraveineuses faites 8 jours après l’injection des cellules tumorales, permettront d’administrer les cellules immunitaires, permettant la potentielle destruction de la tumeur. Le suivi de la croissance tumorale sera effectué par imagerie non invasive sur souris anesthésiées (maximum 10 minutes par individu) une fois par semaine pendant 9 semaines. De plus, des prélèvements sanguins (au niveau de la veine la joue; durée 30s) seront effectués une fois par semaine pour quantifier l’état inflammatoire des animaux (9 prélèvements au maximum). Pour tester la combinaison de notre système d’expression avec un régime alimentaire altérant la croissance tumorale, les souris suivront un régime alimentaire à base de croquettes carencées en acides aminés à partir du jour de l’injection des cellules immunitaires. En parallèle, pour tester la combinaison de notre système avec l’utilisation de molécules cliniques permettant de réduire la croissance tumorale, des souris recevront une injection intraveineuse d’une de ces molécules à des doses cliniques, à partir du jour de l’injection des cellules immunitaires.
Impact sur les animaux
Les protocoles de développement de tumeurs utilisées dans ce projet pourraient entraîner une perte de poids importante chez les animaux et une réduction de leur activité. Les tumeurs sous-cutanées sur le flanc de l’animal, même celles considérées comme relativement petites, pourraient causer des problèmes aux animaux lors de leur toilettage ou de leurs mouvements, ainsi que des lésions cutanées bien que celles-ci n’aient pas été décrites. Les procédures d’injection de médicaments intraveineux ne devraient pas produire de nuisances particulières. Par ailleurs, le traitement par un régime alimentaire spécial se fera en utilisant des croquettes spéciales mais ne devrait être associé à aucun effet indésirable important.
Devenir
Tous les animaux intégrés dans les procédures expérimentales seront euthanasiés en fin d'étude. Les tumeurs seront prélevées pour leur analyse histologique ; la rate et le sang seront également prélevés pour l’analyse par immuno- marquage et cytométrie, des cellules immunitaires administrées.
Remplacement
L’étude de l’expression du récepteur anti-tumoral induite dans la tumeur ou par le biais d’un régime alimentaire ou d’un traitement pharmacologique, nécessite des modèles animaux récapitulant des conditions complexes, qu’on ne sait pas modéliser en culture de cellules. Cependant, dans un souci de pratique éthique, en accord avec la règle des 3R (réduire, remplacer, raffiner), la faisabilité de ce projet est basée sur une grande quantité de données préalablement réalisées sur cellules primaires humaines en culture. Ces expériences indiquent dans des modèles de culture de masses de cellules tumorales, qu’il est possible d’induire l’expression du récepteur anti-tumoral par les cellules immunitaires modifiées, grâce à notre système de régulation dans des conditions récapitulant des aspects importants de l’environnement tumoral. Cependant, l’étude chez l’animal, doit permettre de mesurer le bénéfice clinique de la greffe de cellules exprimant le récepteur anti-tumoral de façon régulée dans la tumeur sur un organisme entier, plus proche de la clinique humaine. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser la souris comme modèle d’étude pour ce projet de recherche, car cela permettra d’étudier plus précisément la régulation du récepteur anti- tumoral, dans un contexte de développement tumoral dans un organisme entier. Les résultats obtenus contribueront à l’élaboration de nouveaux traitements pour le ciblage de tumeurs solides en médecine humaine.
Réduction
Pour standardiser nos résultats, nous utiliserons des souris mâles. À la fin de chaque expérience, une étude rétrospective permettra de déterminer la possibilité de réduire le nombre d'animaux dans les expériences suivantes. L’imagerie, nous permettra de faire des observations sur l’animal vivant et ainsi de maximiser l’utilité de chaque animal. Les données et les échantillons issus de tissus seront stockés pour une utilisation ultérieure par nous- mêmes ou par d'autres. Nous utiliserons le nombre minimal d'individus pour chaque procédure tout en garantissant la fiabilité des résultats (reproductibilité et significativité). Nous n’avons pas d’expérience antérieure nous permettant d’évaluer statistiquement la taille des groupes nécessaire pour évaluer un effet biologique avec ce modèle. Cependant de nombreuses publications sur des modèles semblables parviennent à obtenir des différences statistiquement significatives entre groupes de 5 à 9 individus. Aussi, dans notre étude nous prévoyons d’utiliser 9 animaux par groupe pour obtenir des résultats permettant de pouvoir effectuer des analyses statistiques. Après accumulation de plusieurs expériences, si les données sont reproductibles et suivent une distribution normale et peuvent être comparées unilatéralement, le nombre d’animaux nécessaire pour chaque nouvelle expérience sera revue à la baisse.
Raffinement
Une surveillance quotidienne sera mise en place pour permettre un suivi clinique des animaux utilisés avec la mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille de score (grille de signes cliniques prenant en compte l’apparence physique, le comportement, le poids, etc.). Toute souris qui atteindra un point limite sera euthanasiée. Les études menées ne permettent pas l'utilisation d'un traitement anti-inflammatoire en raison d’une possible perturbation de la réponse immunitaire. En cas de signe de douleur (expression faciale, posture voutée) ne justifiant pas l’euthanasie immédiate, les souris seront traitées avec un antalgique. Si 24h après l’administration d’antalgique, l’état de l’animal ne s’améliore pas, nous procèderons à l’euthanasie de l’animal. Une étude rétrospective sera menée pour déterminer les moyens de standardiser les procédures afin de minimiser la variabilité des gestes expérimentaux et ainsi pouvoir réduire le nombre d’animaux dans les expériences suivantes. Le design expérimental a été conçu pour minimiser la douleur des animaux, notamment en limitant le nombre de cellules tumorales injectées, la taille maximale des tumeurs ainsi que la durée des expériences. La grille de score sera utilisée quotidiennement, c’est-à-dire incluant les week-ends, pendant 9 semaines.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal le plus utilisé pour les études concernant le développement tumoral, car le taux de prise de greffe est le plus élevé. De plus, par sa petite taille, la souris est facilement manipulable et il existe dans cette espèce plusieurs types de souris qui acceptent la greffe de cellules d’autres espèces. Aussi, ces dernières sont couramment utilisées pour étudier le fonctionnement de cellules immunitaires humaines dans le contexte d’un cancer implanté chez ces animaux. Les souris sans système immunitaire présentent également la particularité de ne pas avoir de poils, ce qui facilite le suivi de la formation de la tumeur. Le bien-être de la souris est également facilement évaluable notamment par l’observation des signes cliniques et de modifications du comportement et peut être pris en charge. Les souris utilisées seront âgées de 6 à 8 semaines, âge à partir duquel les souris sont considérées comme jeunes adultes.
Evaluation des effets secondaires de composés pharmacologiques de différentes classes à l’aide d’un service de screening basé sur une batterie de tests chez le rat.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1 840 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 640 d'entre eux et modéré pour 1 200, 800 étant tués pour prélèvement de tissus et 1 040 pouvant être récupérés. Ils reçoivent des candidats médicaments par de multiples voies puis subissent une batterie de tests, dont le Rotarod pour la coordination, un prélèvement d'estomac pour évaluer les ulcères et un test au charbon avec prélèvement d'intestin pour la motilité digestive. Le porteur présente l'ensemble comme une "offre de services" commerciale destinée à profiler les effets secondaires des molécules de ses clients. Il affirme que l'étude de la douleur chez l'animal vigile reste la "seule option" avant le passage chez l'homme.
Objectifs
La dimension sensori-discriminative de douleur a été largement étudiée sur une variété importante de modèles animaux et quasiment la totalité des antalgiques disponibles actuellement sur le marché ont été testés dans des modèles précliniques classiques chez le rongeur. Cependant, l’utilisation de ces antalgiques est souvent associée à de nombreux effets secondaires. Il est donc nécessaire d’évaluer ces effets secondaires indésirables sur l’organisme. De plus, une utilisation abusive des opiacés s’est développée ces dernières années mettant à jour une crise appelée « crise des opioïdes ». D’autres classes de molécules comme les anti-inflammatoires non stéroïdiens présentent également des effets secondaires notamment, la formation d’ulcère qui est le principal effet indésirable. De plus, les Gabapentinoides (Gabapentine, prégabaline) qui sont indiqués dans le traitement des crises partielles d’épilepsie et dans les douleurs neuropathiques, provoquent généralement une forte sédation, une somnolence et ont donc un impact sur la démarche et la coordination motrice. Un autre effet secondaire pouvant apparaitre après une prise d’un composé est la catalepsie. Celle-ci se caractérise par est un état comportemental de rigidité musculaire associé aux médicaments antipsychotiques et à plusieurs autres classes de médicaments. L’objectif de ce projet est de pouvoir caractériser les effets secondaires d’un candidat médicament. Cet outil permettra l’évaluation des effets secondaires cités :la formation d’ulcère, la sédation, la catalepsie, la locomotion, la constipation.
Bénéfices attendus
Cet outil d’évaluation sera proposé à l’offre de services de l’entreprise qui pourra ainsi offrir à ses clients la possibilité d’établir des profils de nouveaux candidats médicament en discriminant les effets secondaires potentiels. Ainsi, les molécules testées pourront être orientées vers un profil antlagique d'une certaine classe pharmacologique.
Procédures
Les animaux peuvent recevoir un traitement par voie orale (p.o), intrapéritonéale (i.p), sous cutané (s.c) intraveineuse (i.v), sous-cutané plantaire (s.c.pl), Intramusculaire (i.m), intrathécale (i.t), Intranasal (i.n). Des traitements en co-adminsitration peuvent également se réaliser. Ces injections durent entre 30 secondes et 1minute. Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie (IC, jugulaire, retro-orbital). Ces prélèvements sont rapides et durent quelques minutes. Il peut également y avoir des prélèvements répétés. Le test du Rotarod a pour objectif l'évaluation de la coordination motrice lors d'un test de vitesse de rotation constante. Ce test dure 3minutes, les animaux réalisent 3 passages sur la roue et cela est répété 2 fois. Le test pour évaluer l'apparition d'ulcères consiste à admnistrer un composé qui dure environ 1 minute puis à prélever l'estomac. Le prélèvement dure environ 5minutes. Le test pour évaluer les effets indésirables d'un composé sur la motilité gastro-intestinale consiste à administrer un composé (durée : 1minute) puis une solution de charbon (durée 2minutes) et enfin de prélever l'intestin grêle. Le prélèvement dure environ 2 minutes. Pour ces deux tests décrits (ulcer et test au charbon),une mise à jeun est nécessaire la veille des tests et dure maximum 24h. Enfin le test de l'irwin couplé aux tests de l'openfield et de la catalepsie permettent d'évaluer d'une part les effets d'une nouvelle substance sur le système nerveux et les fonctions physiologiques de l'animal, et d'autre part d'évaluer la rigidité musculaire et la locomotion de l'animal. Pour ces 3 tests, les animaux recoivent une adminsitration d'un composé d'une durée d'environ 1 minute et l'enchainement des 3 tests dure environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus dépendent des procédures, mais pour l'ensemble des animaux, les nuisances pourront être liées à l'administration unique ou répétée de composés (risque d'irritation des zones d'injection, lésion superficielle, nuisance légère). Une injection de produit dure environ 1minute. Lles animaux peuvent également subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé (nuisance modérée); selon la voie de prélèvement le temps est peut être estimé de 30secondes à quelques minutes. Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang unique (intracardiaque,) ou en répété peuvent être réalisés sous anesthésie (jugulaire, retro-orbital, veine caudale, nuisance modérée). Pour certains tests, les animaux sont mis à jeun (nuisance modérée). Pour un test, les animaux peuvent chuter du dispositif d'une hauteur de 30cm (nuisance légère).
Devenir
Pour certains tests, les animaux sont soumis à des prélèvements de tissus, ils sont donc mis à mort. De plus, pour tous les tests décrits, les administrations de candidat médicaments peuvent aussi créer des interactions ou des modifications biologiques difficiles à évaluer dans le cadre de ce travail. Il n’est donc pas cohérent de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité de la société. Pour d'autres procédures, les animaux pourront être récupérés sous réserve d'absence d'effets secondaires.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » . L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=5 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle et confirmé lors des études subséquentes réalisées. Cet effectif par groupe a été confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance via BiostaTGV. De plus, cet outil vise à fournir une évaluation rapide des composés testés dans des conditions très calibrées, il est donc réalisé sans les groupes contrôles usuels (groupe recevant le véhicule des composés, groupe recevant une molécule de référence), ce qui permet une réduction du nombre d’animaux et une démarche 3R.
Raffinement
Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation, habituation des animaux aux dispositifs des tests). Les tests possèdent des valeurs de Cut off afin de limiter le temps d’exposition d’un animal à un stimulus douloureux. De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique et briquettes en bois à ronger). L’anesthésie générale est utilisée pour la réalisation de prélèvements par exemple. Des points limites, pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés sont âgés d’environ 5 semaines pour toutes les procédures. Ces âges et gamme de poids correspondent à ceux d’animaux jeunes adultes couramment utilisés dans les différents modèles de douleur sur lesquels les procédures ont été validées dans l’entreprise. De plus, des rats plus âgés pourraient présenter des pathologies supplémentaires et interférer avec le screening de molécules.
Etude de l’interaction neurone-microglie et son lien avec la fonction motrice dans un modèle murin inflammatoire de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalite auto-immune leur est induite par injection pour reproduire une sclérose en plaques, provoquant troubles de la marche, faiblesse musculaire et perte de poids, avant une série de tests moteurs sur couloir filmé, grille d'agrippement et tapis roulant. Le porteur veut mesurer si un entraînement physique modéré module le dialogue entre neurones et microglie et favorise la rémyélinisation, les applications pour les patients restant formulées au conditionnel. Il indique travailler d'abord sur des modèles in vitro et ex vivo, mais conclut que le modèle murin est "ultimement nécessaire".
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire, démyélinisante et dégénérative du système nerveux central et la première cause d’handicap neurologique non traumatique chez les jeunes adultes. Dans cette maladie, on observe des phases de démyélinisation dans lesquelles l’organisation des fibres myélinisées est altérée, conduisant à des déficits fonctionnels chez les patients. Un mécanisme de réparation existe, mais il est incomplet et très variable selon les patients. Les cellules microgliales, cellules immunes du système nerveux central sont activées précocément lors de la démyélinisation et participent à la réparation de la gaine de myéline. La microglie contacte par ailleurs les neurones et cette interaction peut influencer positivement la réparation post-démyélinisation. Dans ce projet nous souhaitons étudier le lien potentiel entre les interactions microglie-neurones et l’évolution du déficit moteur dans un modèle murin de sclérose en plaques. Nous voulons de plus évaluer comment un entrainement physique d’intensité modérée durant la phase de réparation pourrait influencer les interactions microglie-neurones et ainsi moduler la rémyélinisation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des interactions neurones-microglie dans la sclérose en plaques. La mise en évidence d’effets bénéfiques de l'activité physique sur la réparation via une modulation directe du dialogue neurone-microglie pourrait permettre d'envisager des stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du handicap chez les patients.
Procédures
Les animaux sont entrainés à effectuer des tests comportementaux non invasifs durant une semaine (sessions de maximum 10 min/jour par animal). Ensuite, nous immunisons les souris pour induire l’encéphalite expérimentale auto-immune, le model murin inflammatoire de sclérose en plaques. Le jour de l’induction deux types d’injections sont nécessaires, en injection sous-cutanées et par voie intrapéritonéale. Afin de minimiser le stress et la douleur liée à l’induction de l’encéphalite autoimmune experimentale, les animaux sont préalablement anesthésiés par anesthésie gazeuse, qui est rapidement réversible (durée totale d'anesthésie et du geste 10 minutes/animal). Les animaux ayant déclenché la maladie seront amenés à effectuer de nouveaux les tests comportementaux non invasifs auxquels ils étaient préalablement entrainés. Durant ces tests, les animaux seront amenés à marcher dans des couloirs équipés d’une caméra ou de capteurs mesurant automatiquement les caractéristiques de la marche, agripper une grille avec les quatre pattes pour mesurer la force musculaire ou marcher sur un tapis roulant. Tous les tests ont une durée courte (maximum 10 min/session) avec des intervalles de repos de minimum 2 heures par souris et n’entrainent pas de stress émotionnel ou physique pour les animaux. Les animaux sont euthanasiés en fin d’étude par une méthode réglementaire pour réaliser différents prélèvements tissulaires.
Impact sur les animaux
Nous étudions un modèle murin de démyélinisation inflammatoire, l’encéphalite auto-immune expérimentale, fréquemment utilisé pour étudier la sclérose en plaques. Après immunisation, les souris peuvent développer des troubles de la marche, de la coordination, une faiblesse musculaire et une perte de poids. Ces symptômes s’installent progressivement sur 3-5 jours suivis d’une récupération partielle ou complète. Aucun autre effet délétère n’est attendu chez les animaux en rapport avec les tests fonctionnels et l’activité physique mais une fatigue et un stress léger sont possibles. L’anesthésie gazeuse mise en place pour minimiser le stress lié à la manipulation des souris et la douleur des injections sous-cutanées étant très courte (2 à 3 minutes), le risque de défaillance cardio-respiratoire est infime.
Devenir
Des prélévements et analyses sont réalisés post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux
Remplacement
Dans un effort de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles in vitro et ex vivo. Les modèles murins in vivo sont ultimement nécessaires pour l’étude fondamentale de la sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la démyélinisation et la remyélinisation dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux, effecteurs de l’immunité circulante et apports métaboliques par le réseau sanguin, qui sont des composantes importantes de cette pathologie.
Réduction
Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés, estimés à 150, après des expériences pilotes, et de ne pas sur-dimensionner le nombre d’animaux étudiés lors de nos expériences : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul de puissance après utilisation initiale de 8 à 10 animaux par condition, selon l’expérience considérée. Des tests paramétriques, des tests de corrélation et de régression linéaire seront utilisés pour l’analyse statistique des résultats obtenus, adaptées à chaque expérience et réalisées en partenariat avec des biostatisticiens.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe, dans un environnement à température et d’hygrométrie contrôlées, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs, sous la supervision de la structure bien être animal du vétérinaire désigné. Un environnement enrichi est fourni aux animaux, comprenant nidification (carré de coton, kraft), cachette (maisonnette, dôme) et/ou bâtonnet à ronger. Les animaux sont manipulés uniquement par un personnel qualifié et sensibilisé au bien-être animal. Nous mettons en place des points-limites définis en accord avec le vétérinaire ainsi qu’un suivi quotidien par l’équipe de recherche pour éviter la souffrance de l’animale. Afin de minimiser le stress et la douleur liée à l’induction de l’encéphalite autoimmune experimentale, les animaux sont préalablement anesthésiés par anesthésie gazeuse, qui est rapidement réversible (durée totale d'anesthésie et du geste 10 minutes/animal). Concernant les tests comportementaux, les animaux ont des phases d’habituation et de repos adaptés aux différents tests effectués.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proches de l'Homme. Le modèle d’encéphalite autoimmune expérimentale chez la souris est un modèle classique de sclérose en plaques, permettant de reproduire en partie l’aspect inflammatoire observé chez les patients, et qui apporte une approche intégrée des déficits observés dans la pathologie. Des animaux adultes C57BL6, âgés de 10-12 semaines au moment de l’induction de l’encéphalite autoimmune expérimentale seront utilisés pour cette étude. L’âge adulte est requis pour pouvoir induire l’encéphalite autoimmune expérimentale et faire les tests comportementaux envisagés. L’usage de jeunes adultes reproduit par ailleurs bien les conditions d’initiation de la sclérose en plaques chez l’humain et limite les risques d’artefacts liés au vieillissement de l’animal.
Etude de la maturation du BDNF dans les plexus choroïdes de souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
92 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Elles reçoivent une injection intraveineuse d'une protéase fluorescente, le tPA recombinant, avant un prélèvement de liquide cérébro-spinal, un prélèvement de sang intra-cardiaque et l'extraction du cerveau, une partie servant d'abord à un apprentissage de la pose de cathéter. L'objet est de comprendre si les plexus choroïdes participent à la maturation du BDNF, les retombées pour les patients victimes d'accident vasculaire cérébral ou de sclérose en plaques restant renvoyées à un horizon thérapeutique lointain. Le porteur affirme le "caractère de stricte nécessité" du recours aux souris et l'impossibilité d'un remplacement.
Objectifs
Les plexus choroïdes, structures cérébrales dont le principal rôle est de produire le liquide cérébro-spinal (LCS), sont aussi capables de sécréter de nombreux facteurs neurotrophiques dont le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF). Le BDNF existe sous sa forme précurseur (pro-BDNF) ou, après protéolyse, mature (mBDNF). Malgré leur localisation parfois commune, le mBDNF et le pro-BDNF se distinguent parfois dans leurs (dys)fonctions neurologiques. Différentes protéases semblent capables de réaliser la maturation du pro-BDNF en mBDNF, notamment l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Le tPA est une protéase synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour favoriser la fibrinolyse, grâce à sa capacité à activer le plasminogène en plasmine. Il est également sécrété par les neurones et par d’autres types cellulaires du système nerveux, tels que les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes. Par ses propriétés fibrinolytiques, le tPA recombinant (rtPA) est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. En plus de participer à la maturation du BDNF, l’ARNm (acide ribonucléique messager) du tPA est parfois retrouvé dans les mêmes régions cérébrales que celui du BDNF. De plus, le tPA et le BDNF sont présents dans les mêmes vésicules au niveau des neurones, co-transportés et co-libérés par les dendrites neuronales. Le tPA a précédemment été identifié dans les plexus choroïdes, suggérant également une synthèse endogène de cette protéase dans ces structures. De plus, le tPA vasculaire peut être transporté par des vésicules à travers les plexus choroïdes. Ainsi l’objectif de cette étude est de determiner si les plexus choroïdes peuvent être une zone de maturation et de libération de BDNF et si le tPA (endogène ou exogène) est un acteur de la maturation et/ou de la sécrétion de BDNF dans le LCS par des approches in vivo chez des souris entièrement déficientes en tPA (tPANull) et des souris contrôles (tPAWT).
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales sur la maturation du BDNF dans les plexus choroïdes et sa modulation potentielle par le tPA à des fins thérapeutiques. En effet, une meilleure compréhension de la maturation du BDNF nous aidera d’une part à évaluer le potentiel effet du tPA vasculaire, et d’autre part, à envisager d’améliorer les performances de patients dans des conditions pathologiques, par le couple pro/m-BDNF.
Procédures
L'unique procédure réalisée, consistera en une injection intraveineuse de tPA recombinant couplé à un fluorochrome chez des souris entièrement déficientes en tPA et des souris contrôles, pour suivre son passage du compartiment vasculaire vers le parenchyme cérébral et détecter sa présence en immunohistochimie à différents temps. De même, du LCS et du sang seront prélevés pour réaliser diverses études protéiques et transcriptomiques. - Souris Swiss : phase d’apprentissage (Pose d’un cathéter veineux et prélèvement intra-cisternal de LCS). - Souris contrôles : injection I.V saline ou rtPA. - Souris déficiente : injection I.V saline ou rtPA. Mise à mort des souris de la phase d’apprentissage, immédiatement après le prélèvement intra-cisternal. Mise à mort des souris contrôles/déficientes à différents temps post injection : +10 minutes, à +30 minutes et à +60 minutes. Pour chaque animal : un prélèvement de LCS sera effectué, puis un prélèvement de sang en intra-cardiaque et enfin le cerveau sera extrait.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour cette procédure sans réveil : du stress lié à la manipulation des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (AVC, SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, la procédure expérimentale décrite dans ce projet a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards aux normes. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront pesés tous les jours et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques suivant l’approche chirurgicale. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’ensemble des procédures, les souris seront sous anesthésie générale (et sous anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir leur déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature.
Formation continue en chirurgie expérimentale chez les rongeurs
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 200
300 souris et rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie puis tués avant tout réveil. Ils servent de support à une formation continue à la chirurgie, subissant une canulation de vaisseaux sanguins ou une castration réalisées par des stagiaires, non pour produire des connaissances mais pour que ces derniers soient ensuite autorisés à opérer. Le porteur indique avoir ramené la formation de quatre à deux séances de travaux pratiques et réserver l'entraînement aux sutures à des dispositifs artificiels. Il affirme qu'il est "difficile d'envisager" la formation chirurgicale sur les seuls simulateurs.
Objectifs
Les objectifs du projet sont de former les stagiaires de la formation continue aux gestes de base de la chirurgie chez les rongeurs: préparation des locaux, des animaux, du chirurgien, anesthésie, techniques chirurgicales, sutures, réveil et soins post-opératoires.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’apprendre aux stagiaires de notre formation les bases de la chirurgie chez les rongeurs et qu'ils soient ensuite autorisés à pratiquer la chirurgie. Tout concepteur ou réalisateur de projet en expérimentation animale a l'obligation d'acquérir et de maintenir les compétences qui lui seront nécessaires pour l'accomplissement de ses projets. Notre formation fait partie des formations réglementaires agréées par le ministère de l'agriculture et de la souveraineté alimentaire. Elle entre donc parfaitement dans le cadre de l'aquisition de compétences pour les personnels souhaitant pratiquer la chirurgie sur les rongeurs dans le cadre de leurs projets.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéales d'anesthésiants chimiques sous anesthésie gazeuse. Ils subiront ensuite des opérations chirurgicales: - deux opérations de canulation de vaisseaux sanguins chez des rats (entre 1h et 1h30 pour l'opération complète). - une opération de castration chez la souris (30 min d'opération max). Afin d'éviter de potentielles douleurs post-opératoires, tous les animaux sont mis à mort avant leur réveil.
Impact sur les animaux
Les opérations chirurgicales sont des sources potentielles de douleurs, essentiellement post-opératoires. Les animaux seront traités préventivement pour les douleurs per-opératoires et ils seront mis à mort avant leur réveil pour supprimer toute douleur post-opératoire.
Devenir
Les animaux seront mis à mort immédiatement à la fin des opérations chirurgicales afin d'éviter d'éventuelles douleurs post-opératoires après le réveil.
Remplacement
L'objectif est de former des stagiaires aux principaux gestes chirurgicaux chez les rongeurs. Il est difficile d'envisager cela uniquement sur des dispositifs artificiels. L'entraînement à la réalisation des points de sutures est réalisé sur des dispositifs articifiels.
Réduction
Cette formation comprenait à l'origine 4 séances de travaux pratiques sur les animaux. Petit à petit, nous avons réduit le nombre de séances de travaux pratiques, ce qui a permis de fait de réduire le nombre d'animaux utilisés. Il n'y a plus que 2 séances de travaux pratiques aujourd'hui. Avec l'aide du service audiovisuel de l'Université, nous avons réalisé des vidéos commentées et légendées des différentes opérations chirurgicales réalisées par les stagiaires. Cela nous permet de montrer les opérations aux stagiaires de façon très efficace et sans avoir à faire des démonstrations sur des animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux d'une dizaine d'individus avec présence systématique de dispositifs d'enrichissement ( bâtons à ronger, tunnel en carton, maisonnette en plastique...). Les animaux sont acclimatés dans les locaux pendant au moins une semaine. Les souris et les rats sont hébergés dans des pièces différentes. Les animaux sont surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. Seuls les animaux en parfaite santé seront intégrés dans les procédures de chirurgie.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en expérimentation animale. D’autre part, notre formation est spécifique aux rongeurs. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes. Ils sont ainsi atteint leur taille adulte, mais ne possèdent pas trop de tissu adipeux sous-cutané, ce qui pourrait compliquer les opérations chirurgicales pour des stagiaires peu expérimentés.
Examens IRM sur modèles rongeurs en provenance d’établissements utilisateurs extérieurs
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 200
600 rongeurs, 400 souris et 200 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal peut subir jusqu'à six examens d'IRM sous anesthésie gazeuse de quatre heures, parfois avec injection d'un produit de contraste au gadolinium, le porteur signalant un risque de non-réveil après la narcose. Il s'agit d'un service de plateforme mutualisant un appareil d'imagerie pour des équipes extérieures, chaque animal étant ensuite réintégré au protocole autorisé dont il relève, où les procédures se poursuivent. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ou in silico ne permet d'étudier le cerveau entier et présente l'IRM répétée comme un moyen de réduire le nombre d'animaux.
Objectifs
L'imagerie par résonance magnétique (IRM) du petit animal est une technique non invasive et non destructive des tissus in vivo. Elle permet l'étude longitudinale et tri-dimensionnelle notamment du cerveau normal et pathologique. Les divers types de contrastes et de modalités structurelles, fonctionnelles et spectroscopiques font de l'IRM une technique de choix pour la recherche en neurosciences expérimentales. Les applications de l'IRM expérimentale sont notamment le phénotypage d'une cohorte d'animaux, le suivi longitudinal de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs d'imagerie. Une IRM à très haut champ magnétique ainsi que des antennes dédiées à l’imagerie du cerveau de souris et de rat sont des déquipements de pointe qui peuvent apporter des informations déterminantes dans des projets scientifiques variés impliquant le petit animal via l’utilisation d’un large spectre de protocoles d’imagerie standards mais aussi avancés et innovants. Ce projet a pour but de faciliter la mise en place de collaborations avec des équipes externes pour réaliser des études d’imagerie IRM sur des modèles rongeurs de diverses pathologies ou des modèles de rongeurs sains afin d’investiguer des questions plus fondamentales sur le fonctionnement cérébral. Pour atteindre cet objectif, des expériences sur animaux anesthésiés doivent être menées.
Bénéfices attendus
Ce projet présente des bénéfices scientifiques à long terme aussi bien pour la plateforme que pour les équipes utilisatrices. Du point de vue scientifique, il permet d’intégrer de nouvelles données d’imagerie pour répondre à une question scientifique précise (expliquée dans les projets scientifiques autorisés par le ministère de l’étude concernée) et aider à la compréhension de pathologie humaine sur les modèles animaux en vue d’un traitement thérapeutique ou de l’aide au diagnostic. D’autre part, dans le cas d’étude longitudinale l’imagerie par résonance magnétique (IRM) présente un grand intérêt en réduisant le nombre d’animaux.
Procédures
Les animaux, 600 au total incluant 400 souris et 200 rats, seront soumis à des examens d'imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie gazeuse avec ou sans injection intraveineuse dans la veine de la queue d’un agent de contraste à base de gadolinium selon le besoin de l’étude. La procédure IRM dure 4h maximum (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal). Les examens pourront être répétés au maximum 6 fois sur le même animal avec un délai de 72h minimum de récupération.
Impact sur les animaux
Différents risques sont identifiés : (i) Risques liés à l’anesthésie: stress thermique (hypothermie), difficultés cardio-respiratoires, non récupération de la vigilance suite à la narcose ; (ii) Risques liés à l’injection intraveineuse de produit de contraste : douleur au point d’injection , hématome, saignement possible très localement ; (iii) Risques liés au transport (stress) lors du changement d’établissement utilisateur.
Devenir
A l’issue des examens IRM (imagerie par résonance magnétique), les animaux seront réintégrés dans leur hébergement d’origine pour réaliser les procédures décrites dans le projet scientifique global autorisé par le ministère de l’étude concernée. Les examens IRM ne couvrent qu'une étape dans le cadre du projet scientifique global. Il s'agit ici d'une utilisation continue des animaux et non d'une réutilisation car les animaux ne peuvent être remplacés par d'autres. Ils sont inclus dans un projet scientifique global autorisé par le ministère et subissent une suite de procédures (avant et après les examens IRM) décrites dans le projet global.
Remplacement
Il n’existe pas d'alternatives (études in vitro, in silico ou sur animaux invertébrés) qui permettent d’étudier des mécanismes cellulaires, moléculaires, métaboliques complexes à l’échelle global du cerveau. Le rongeur est une des espèces les plus appropriées pour les études d'imagerie par résonance magnétique (IRM) dans un contexte neurologique, d’autant plus que l’IRM permet l’étude longitudinale des paramètres d’intérêt de façon non invasive.
Réduction
600 animaux au total sont inclus dans le projet dont 400 souris et 200 rats. Le nombre d’animaux est réduit au maximum. Des études pilotes et tests statistiques ont préalablement étaient réalisés pour estimer le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une puissance statistique satisfaisante pour chaque étude. Les tests statistiques seront dépendants des différentes études qui auront une phase d’imagerie dans leurs protocoles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans leur établissement utilisateur avec les mesures de raffinement et conditions d’hébergement décrites dans projet initial autorisé par le ministère. Les animaux sont transportés de leur lieu d’hébergement initial vers le laboratoire au calme dans une cage adaptée avec de la nourriture, de l’eau à dispositions des animaux ainsi que l’enrichissement mis en place dans leur hébergement d’origine. L’arrivée se fait au niveau du quai de livraison où l’expérimentateur réalisant les IRM (imagerie par résonance magnétique) amène les animaux dans la pièce de préparation à l’aide d’un chariot en empruntant un monte charge. Les animaux sont laissés dans leur cage pendant 30 min à 1h dans la pièce de préparation, et une vérification de l’état des animaux (état du poil, comportement dans la cage, position des oreilles et du museau) est réalisée à la fois par l’expérimentateur réalisant les IRM et une personne responsable des animaux de l’établissement extérieur. La tête des animaux est maintenue immobile par un système de contention (barres d’oreille et mors à dent) intégré au berceau. Un anesthésique local est appliqué au niveau des points d'appui des barres d'oreilles, un gel ophtalmique est appliqué pour limiter la déshydratation oculaire. De la vaseline sera également appliquée avant d’introduire la sonde rectale. Tout au long de l’examen IRM (4h maximum), la profondeur de narcose et la température interne de l'animal sont contrôlées. La procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal sorti pour vérification en cas de souffrance/angoisse chez les animaux pendant l’IRM, repérée par : une respiration anormale (trop rapide ou trop basse malgré l'ajustement d'anesthésique) ou une température anormale (trop élevée ou trop basse malgré l'ajustement de la consigne de température du bain marie ou de la modification de l’anesthésie). Nous accorderons également une grande importance à la période de réveil (chambre thermostatée, stimulation régulière de l’animal). Une personne référente des animaux à imager sera présente de façon à guider l’expérimentateur qui réalise l’IRM et à contrôler au mieux l’anesthésie de l’induction au réveil complet de l’animal.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les principales espèces utilisées sur notre plateforme, leur taille permet de les utiliser dans ce type de machine pour acquérir des séquences capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribue à répondre aux questions scientifiques posées. De plus, les rongeurs permettent l’étude de comportements complexes et de nombreux modèles de rongeurs génétiquement modifiés sont développés pour mimer des pathologies humaines. En raison de sa taille, le rat possède un cerveau plus facile à imager (plus gros). Il est donc plus facile d’obtenir un meilleur signal chez le rat, notamment dans des zones cérébrales de petite taille. Cependant, de nombreuses pathologies cérébrales sont préférentiellement induites et étudiées chez la souris que nous pouvons imagées plus aisément avec des antennes adaptées. Le stade de développement sera décrit dans le projet initial autorisé par le ministère de l’étude concernée. L’âge minimum requis pour passer un examen par imagerie par résonance magnétique (IRM) est fixé à 3 semaines (rats et souris confondus), en raison des contraintes de berceau IRM que nous possédons à la plateforme IRM et de l’anesthésie gazeuse qui sera optimale sur des animaux sevrés qui ont acquis une capacité respiratoire suffisante. De même pour la récupération, elle sera plus facile si on travaille sur des animaux qui sont sevrés.
Développement d’outils pour la thérapie des cancers de la prostate résistants à la castration
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 530 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous la peau de cellules tumorales de prostate humaine, 180 d'entre elles subissant en outre une castration, avant l'administration répétée de composés de thérapie génique pendant onze semaines et le prélèvement terminal du sang et des tumeurs. Le porteur décrit une technologie "prometteuse" relevant de la médecine de précision, dont les bénéfices pour les patients sont renvoyés au futur, l'étape immédiate étant de mesurer l'efficacité de composés déjà criblés in vitro. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne peut se substituer à la souris pour cette phase préclinique.
Objectifs
Le cancer de la prostate est l'un des cancers les plus courants dans les pays développés. Les patients atteints d'un cancer localisé peuvent être traités par chirurgie ou radiothérapie, tandis que la castration est utilisée comme traitement initial pour les patients atteints d'une maladie avancée. Bien que la plupart des patients répondent initialement à cette thérapie hormonale, une résistance peut apparaître dans les deux ans, ce qui signifie que le cancer de la prostate devient résistant à la castration. Les chimiothérapies actuelles ne permettent qu'une survie de 12 à 18 mois, provoquant 9000 décès par an et faisant de ce cancer l’un des plus mortels. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de cancer de la prostate résistant à la castration. Une stratégie appelée thérapie d'acides nucléiques ou thérapie génique peut améliorer les traitements actuels en ciblant les gènes actifs après la castration pour retarder ou empêcher l'apparition de la résistance aux traitements. La thérapie génique présente un intérêt thérapeutique pour notre laboratoire. Nous avons développé des composés qui ont été utilisés pour induire la mort des cellules tumorales in vitro et pour réduire la progression tumorale in vivo chez la souris. Notre laboratoire souhaite réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de nos composés de troisième génération. Les modèles que nous utiliserons sont basés sur la transplantation de cellules de prostate humaines résistantes aux traitements à des souris immunodéficientes, capables de mimer la maladie observée en clinique. Il n'existe actuellement aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l'expérimentation animale durant cette étape préclinique.
Bénéfices attendus
La thérapeutique génique est de plus en plus considérée comme une solution prometteuse pour la prise en charge des cancers de la prostate. Elle s'intègre dans la médecine de précision et permet de fabriquer un traitement individualisé en quelques semaines, pour une guérison plus rapide et efficace. Contrairement aux médicaments classiques, qui peuvent prendre jusqu'à dix ans pour être développés et cibler spécifiquement la mutation génétique responsable de la tumeur, la technologie génique agit directement sur des gènes impliqués dans la prolifération tumorale. Notre technologie est conçue pour contourner les principales limites de l'expansion du marché des composés géniques, notamment la faible biodisponibilité, la toxicité et la difficulté à atteindre les tissus cibles. En utilisant des lipides comme vecteurs de délivrance des composés géniques, nous sommes en mesure d'augmenter la stabilité, la solubilité et la spécificité de nos composés. De plus, notre technologie offre également la possibilité de co-délivrer sélectivement des agents diagnostiques ou thérapeutiques, ce qui ouvre de nouvelles perspectives pour la médecine personnalisée. En résumé, notre technologie représentent une avancée majeure dans la lutte contre les cancers de la prostate, en offrant une approche plus ciblée, efficace et personnalisée pour le traitement de cette maladie complexe.
Procédures
Les interventions sont les suivantes : a) Xénogreffe sous-cutanée : Les 1530 animaux de ce projet seront injectés sous-cutanément avec des cellules tumorales prostatiques sous anesthésie. Cette procédure dure environ 3 minutes par animal. b) Castration : Cette procédure concerne un groupe de 180 souris. Elle sera réalisée directement après la xénogreffe pour les animaux concernés, sous anesthésie. La durée maximale de la castration est de 30 minutes par souris. c) Suivi par imagerie : Cette procédure sera effectuée pour un groupe de 180 souris. La fréquence des imageries dépendra de la vitesse de croissance tumorale : une fois par semaine les deux premières semaines, puis une imagerie tous les 15 jours pendant 11 semaines de traitement. Le temps d'imagerie sera adapté à chaque modèle de tumeur. d) Traitement : L'administration des composés thérapeutiques se fera pendant 7 jours consécutifs pour les 450 souris dans la procédure d'évaluation de la spécificité des composés, et 3 fois par semaine pendant 11 semaines pour les 1080 souris dans la procédure d'évaluation de l'efficacité thérapeutique. Nous utiliserons l'injection intrapéritonéale, qui ne durera que quelques secondes par souris et ne nécessitera pas d'anesthésie. À la fin de l'étude, ainsi qu'en cours d'étude si nécessaire en fonction des critères limites, les souris seront euthanasiées et le sang ainsi que les tumeurs de tous les individus seront collectés.
Impact sur les animaux
L'injection de cellules tumorales chez les souris peut causer des effets indésirables tels que des douleurs, une faiblesse générale et une perte de poids. De même, l'injection d'oligonucléotides peut également provoquer des réactions indésirables telles que des inflammations et des douleurs au site d'injection. En outre, la castration peut également avoir des effets négatifs sur le comportement et la santé des souris, tels que des changements hormonaux et des modifications de l'activité locomotrice. Les modalités d'imagerie choisi n'entrainent pas d'algie chez l'animal. Cependant, l'induction anesthésique est une source de stress potentiel avant et pendant l'imagerie et l'acte chirurgical.
Devenir
À la fin de l'étude, les souris seront euthanasiées. Le sang et les tumeurs de tous les individus seront collectés pour des analyses post-mortem afin de contrôler la toxicité de nos composés et de valider la spécificité de chaque composé testé.
Remplacement
Afin de vérifier la pertinence des composés développés dans le laboratoire, le premier criblage sera effectué in vitro sur des modèles cellulaires en culture. Seules les composés positives démontrant leur efficacité in vitro seront utilisées dans les études in vivo du présent projet. Cependant, le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie. La souris immunodéficiente est un modèle de choix puisqu'elle permet le développement et le suivi de lignées tumorales humaines, de mimer la maladie observée en clinique. L'induction des tumeurs par xénogreffes chez la souris est une technique maîtrisée et documentée. Il n'existe actuellement aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l'expérimentation animale durant cette étape préclinique.
Réduction
Pour chacun des composés, nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux tout en restant une statistique fiable permettant de caractériser leur efficacité sur les modèles de xénogreffes de cellules tumorales de cancer de la prostate. Nos approches pour évaluer l'efficacité de chaque composé étudié comprendront des groupes témoins. Afin de réduire au minimum le nombre d'animaux et dès que cela sera possible, ces groupes témoins seront communs à plusieurs tests d'efficacité. Par ailleurs, nous réaliserons des études pilotes sur un petit nombre d'animaux par groupe afin de garantir une bonne tolérance aux molécules et d'adapter les doses à administrer avant de passer aux tests d'évaluation d'efficacité thérapeutique sur un nombre plus important d'animaux.
Raffinement
Nos études in vivo seront réalisées de manière séquentielle pour déterminer l'action des drogues sur le développement tumoral. Des études pilotes seront menées sur un petit nombre d'animaux afin de vérifier leur tolérance aux molécules et d'ajuster les doses à administrer à notre souche de souris. De plus, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant des méthodes non invasives sur les animaux. Enfin, nous améliorerons les conditions d'hébergement des animaux en proposant de la litière enrichie (copeaux de bois compactés et/ou coton) et en maintenant les souris en groupe de 4 à 5 individus pour éviter le stress lié à l'isolement. Les souris seront hébergées dans des cages ventilées, dans une pièce avec des cycles de lumière obscurité de 12 heures, où la température et l'hygrométrie seront constamment contrôlées. Elles auront un accès libre à la nourriture et à l'eau. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d'intervenir rapidement dès le moindre signe de souffrance. Pour minimiser la souffrance et le stress des animaux, les manipulations pourront être effectuées sous anesthésie gazeuse pour un endormissement et un réveil rapides, et une analgésie sera administrée en cas de signes de douleur. Tout signe ou comportement anormal tels que des difficultés respiratoires, une souris prostrée ou en retrait, ou une perte de poids supérieure à 20% du poids initial des animaux entraînera la fin de l'expérimentation et leur euthanasie immédiate afin d'éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie (ici le cancer de la prostate). Sur cette base, en adéquation avec nos objectifs, le modèle murin apparaît le plus pertinent. La xénogreffe désigne la transplantation d'un greffon d'un individu ou d'une lignée d'une espèce donnée chez un individu hôte d'une espèce différente. L'accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de nos approches. En effet, un contexte immunitaire permissif est essentiel pour favoriser la prise tumorale et éviter la réaction de l'hôte vis-à-vis du greffon. Pour la réalisation de xénogreffes de lignées tumorales humaines, cette espèce constitue le modèle in vivo le plus adapté : la maîtrise zootechnique (élevage/confinement); la praticabilité chirurgicale (technicité, accessibilité du site sous-cutané ou orthotopique); les connaissances actuelles et la diffusion dans le domaine scientifique (littérature, collaborations). Les animaux utilisés dans ce projet sont des souris mâles âgées de 6 semaines qui ont atteint leur maturité sexuelle, afin de garantir la sécrétion d'hormones masculines qui ont une influence sur le développement du cancer de la prostate chez l'homme.
étude de la modulation de l’extinction de la memoire
- Formation professionnelle
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 90 opérées puis tuées sans réveil et 30 soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objet n'est pas de produire des connaissances mais de former des étudiants de master et de thèse à l'implantation de canules dans le cerveau et à un test d'extinction de la mémoire de peur liée à un contexte. Après une chirurgie d'une heure, les souris subissent plusieurs séances d'exposition puis une injection intracérébrale, avant l'euthanasie et le prélèvement du cerveau. Le porteur affirme que ces techniques, une fois maîtrisées par les stagiaires, réduiront le nombre d'animaux utilisés dans leurs propres laboratoires.
Objectifs
Nous proposons de former de nouveaux chercheur, des étudiants en master et des étudiants en thèse, sur les méthodes modernes de mesure d’activités neuronales impliquées dans la codification de la memoire. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront appris et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et de comportement leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et de comportement leur permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.
Procédures
Les animaux suivront une chirurgie (1 heure) qui permettra l’implantation de deux canules intracérébrales. Deux semaines plus tard, les animaux suivront un test comportemental qui permet d’évaluer la formation et la disparition de la mémoire de peur liée à un contexte spécifique. Ce test comprend : 4 jours d’habituation à la manipulation de l’expérimentateur. (Entre 3 et 5 minutes par jours). Test jour 1 : 1 fois 3 minutes. Test jour 2 : 1 fois 5 minutes. Test jour 3 : 6 fois 2 minutes (intervalle 1 heure) À la fin de la dernière exposition, les animaux recevront une injection dans la canule intracérébrale. 5minutes/hémisphère = 10minutes total. Test jour 4 : 1 fois 2 minutes. A la fin de la dernière séance, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé.
Impact sur les animaux
- Nuisances liées à la procédure chirurgicale : douleurs post opératoires, perte de poids, risque mineur d’infection de la cicatrice, risque mineur de détérioration de la canule. - Nuisances liées au test comportemental : stress, douleur, agressivité vers les congénères. - Nuisances liées à la connexion des animaux au niveau de la canule : stress de la contrainte de la contention auquel l’animal doit s’habituer. - Nuisances liées aux injections intracérébrales: stress, risque mineur d’infection.
Devenir
Les animaux ayant suivi la chirurgie et le test comportemental, seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques. Les animaux ayant suivi que la procédure chirurgicale (sans réveil) seront euthanasie par dislocation cervicale.
Remplacement
Pour comprendre l'activité des circuits neuronaux dans le cerveau, il est nécessaire de générer des données biologiques pertinentes. L'utilisation d'animaux est inévitable car aucun modèle in vitro ne permet l’étude des circuits neuronaux impliqués dans la modulation de la mémoire de la peur. Les souris sont les modèles animaux de prédilection pour les recherches dans ce domaine en raison de la structure anatomique et de la fonction bien définies de différents cortex corticaux
Réduction
L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Par an, 20 étudiants et 10 instructeurs suivront les projets décrits dans cette DAP. Dans ce context, lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs.
Raffinement
Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirurgicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil ainsi que pendant les jours suivant. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, l'état du pelage, la mobilité de l'animal et les signes de douleur. Afin de palier le stress lie à la manipulation, un programme d’habituation est mis en place.
Choix des espèces
La souris est la espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système central est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle cellulaire et aussi au niveau des circuits neuronaux. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des procédures chirurgicaux.
Évaluation d’un système de prélèvements sanguins chez le rat et le hamster
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
Hamsters dorés : 24
48 rats et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Présenté comme un projet de raffinement destiné à améliorer le bien-être des animaux non-humains lors des prélèvements, il compare la ponction sous contention à un dispositif implanté chirurgicalement, le "Vascular Access Button", en imposant gavages, tests de tolérance au glucose et prélèvements sanguins hebdomadaires jusqu'à obturation du dispositif. Le porteur indique n'attendre "normalement" aucun effet indésirable tout en anticipant la perte de quelques animaux par complication chirurgicale, une nécropsie clôturant l'étude. L'amélioration annoncée du confort des animaux sert d'abord à valider un outil pour les futurs projets de recherche de la société.
Objectifs
La règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) est un des piliers majeurs du bien-être animal et il est aujourd’hui encore impossible de se passer totalement du modèle in-vivo pour certains projets de recherche. Quand cela est possible, l’utilisation d’animaux peut être remplacée, par des modèles in vitro (culture cellulaire, enzymologie …), des modèles non régi par l’expérimentation animale (drosophile, c elegan …) ou encore en ayant recours à de la modélisation informatique (in silico). Nos projets de recherche en développement nécessitent d’avoir recours à des prélèvements répétés de sang chez les rongeurs vigiles. Ces prélèvements en plus d’être chronophages, peuvent induire un stress aigu notamment à cause de la contention de l’animal ce qui peut participer à la variabilité des résultats. Pour répondre à cette problématique et dans un contexte de raffinement, l’objectif de ce projet de comparer deux techniques de prélèvement sanguin chez le rat et le hamster vigile. La première méthode est une des méthodes de référence pour obtenir un échantillonnage de sang via une contention de l’animal et une ponction au niveau de la veine gingivale (hamster) et de la veine caudale (rat). La seconde méthode de prélèvement nécessite d’avoir recours à une légère chirurgie pour permettre l’implantation du système « Vascular Access Button ». Ce bouton transcutané comporte un port externe avec un septum pour un accès rapide, propre et répété au cathéter implanté sur l’animal. Les applications incluent le dosage bolus ou continu, le prélèvement sanguin et l’auto-administration IV. Pour un accès intermittent, il est possible d’utiliser une seringue équipée d'un injecteur PinPort™ sans aiguille ; et pour un accès continu depuis l'extérieur de la cage, il est possible d’utiliser une attache d'accouplement. Ce système permettrait : - D’améliorer les prélèvements en contrôlant mieux le volume, la zone et la « propreté » du prélèvement (raffiner). - De diminuer le stress des animaux au moment du prélèvement (aucune contention n’est nécessaire) - D’améliorer le confort manipulateur
Bénéfices attendus
Si les résultats de ce projet sont concluants, le VAB pourra être utilisé sur hamsters ou rats sur notre plateforme de recherche. Le système de prélèvement VAB permettrait de pouvoir réaliser des échantillonnages sanguins sans avoir recours à la contention de l’animal ou sans introduction multiples d’aiguilles, notamment dans le cadre de cinétiques sanguines (type OGTT, PK).
Procédures
Évaluation de la composition corporelle : 1 fois en début d'étude et 1 fois au moment du test de tolérance au glucose. Cet examen implique une légère contention inférieure à 1 min par animal. Test de tolérance au glucose : 1 fois (composé d'un gavage d'une solution sucrée puis de 5 prélèvements sanguins). Ce test dure 2h et inclus 1 gavage durant moins de 30 secondes et 4 contentions durant chacune moins de 1 min. Mise à jeun de 5h : 1 fois avant l'OGTT. Prélèvements de sang hors OGTT : 1 fois par semaine jusqu'à obturation du dispositif (fin de la procédure). Nécessite une contention inférieure à 1 min. Chirurgie d'implantation d'un système de prélèvement sanguin : 1 fois. L’anesthésie, la chirurgie et le réveil de l’animal sont réalisés entre 30 et 45 min par animal. Chacun de ces actes sont réalisés par des personnes formées et expérimentées.
Impact sur les animaux
L’objectif étant de mettre en place un système de prélèvement permettant d'améliorer le bien-être animal lors de prélèvements répétés, aucun effet indésirable sur les animaux n'est normalement attendu. S’agissant cependant d’un projet de mise au point passant par la pose d’un VAB par technique chirurgicale, des complications liées à cette pose se traduisant par perte d’un nombre restreint d’animaux dans le temps chirurgicale pourrait apparaitre en début de projet.
Devenir
Une nécropsie de fin d'étude sera nécessaire pour évaluer le site d'implantation des dispositifs. Les animaux ne pourront pas être réutilisés ou replacés.
Remplacement
Le prélèvement sanguin est un acte in vivo par définition. L’utilisation d’animaux est donc indispensable. D’autres techniques de prélèvement sur animaux vigiles sans recours à la chirurgie préalable existent, mais ils sont moins adaptés que la pose d’un cathéter lorsqu’il s’agit de recourir à des prélèvements répétés.
Réduction
La taille des groupes est choisie de manière à obtenir une puissance statistique minimale, mais suffisante pour les paramètres clés (évaluation de la perméabilité des capteurs dans le temps et glycémie lors de la cinétique OGTT). Les valeurs seront présentées comme la moyenne ± SEM. Les différences seront considérées comme statistiquement significatives à p
Raffinement
Tous les animaux de ce projet suivront une période d’habituation d’au moins une semaine avant de commencer les procédures, ils seront hébergés dans un environnement contrôlé et adapté (cages ventilées, 22°C, 30-70% d’humidité, cycle J/N 12 :12). Les cages seront enrichies à l’aide de matériel de nidification et d’un tube rouge permettant aux animaux de se cacher et aux techniciens de les manipuler. Un contrôle quotidien sera réalisé pour permettre de relever et documenter l’apparition de signes cliniques. Un traitement analgésique sera mis en place en péri-opératoire. La chirurgie sera réalisée sur animaux anesthésiés sous isoflurane 2.5% durant la procédure. Un traitement analgésique sera mis en place en péri-opératoire. Enfin des points limites sont déterminés et appliqués pour chaque procédure.
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans ces projets correspondent aux espèces et souches utilisées dans nos différents projets de recherche et developpement. Il est nécessaire de valider le dispositif dans les conditions expérimentales de son utilisation ultérieure. Les animaux utilisés pour ce projet seront âgés de 8 semaines à la réception et suivront une chirurgie à 10 semaines. À cet âge un poids de 100/110g pour le hamster et de 300/350g pour le rat est attendu et correspond à un stade de développement de jeune adulte. Cet âge et ce poids sont compatibles avec l’acte chirurgical à réaliser et correspondent à l’âge et au poids d’utilisation des animaux dans les différents projets de développement de la société.