Rongeurs

4 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses ou des implantations chirurgicales de fragments de tumeurs humaines, puis des traitements répétés par voie orale, veineuse ou intrapéritonéale, avant un prélèvement terminal de la tumeur et des organes. L'objet est d'étudier le microenvironnement des tumeurs et d'y tester de nouveaux traitements anticancéreux. Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ou ex vivo ne reproduit la complexité de ce microenvironnement et évoque des modèles cellulaires en 3D destinés à réduire, à terme, le nombre d'animaux.

Objectifs

L’hypothèse de travail porte sur l’hétérogénéité tumorale qui corrèle avec l’agressivité́ des tumeurs, leur résistance aux traitements et leur capacité métastatique. Cette hétérogénéité est un paramètre biologique complexe qui inclue une hétérogénéité des cellules tumorales et de leur environnement et peut être impactée par les traitements utilisés. Le microenvironnement tumoral va créer un sanctuaire pour la mise des cellules cancéreuses dans un état de dormance qui deviennent résistantes aux drogues et sont alors responsables de la récurrence de la maladie plusieurs mois ou années après la rémission. Ce sanctuaire est une zone de tolérance immunitaire renforçant la survie et la croissance des cellules tumorales. Le projet portera sur le développement de nouvelles approches thérapeutiques et l’analyse de l’impact des traitements sur l’hétérogénéité tumorale et ses conséquences cliniques. Les approches thérapeutiques testées reposeront sur un ciblage des cellules tumorales (ex. chimiothérapie, inhibiteurs de kinases), un ciblage du microenvironnement tumoral (ex. ciblage des macrophages, inhibiteurs de points de contrôle du cycle cellulaire) en monothérapie ou en bithérapie. Ces approches seront testées in vivo dans des modèles murins xénogéniques (souris immunodéficients) ou syngéniques (souris immunocompétentes). Les pathologies tumorales étudiées seront des sarcomes (osseux ou tissus mous) ou de carcinomes (ex. prostate, colon, poumon). Ce projet a pour objectifs : - de caractériser sur un plan cellulaire et moléculaire le microenvironnement tumorale au cours de l’évolution naturelle de la maladie (impact sur la tumeur primaire et sur le développement métastatique), - de caractériser de manière cinétique l’évolution du microenvironnement tumoral et son impact sur la clonalité des cellules cancéreuses au cours des traitements, - d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, - de développer de nouvelles approches thérapeutiques reposant sur un ciblage du microenvironnement tumora

Bénéfices attendus

Le dialogue établi entre les cellules cancéreuses et leur environnement est considéré comme un point majeur dans la progression tumorale et dans le processus de résistance aux traitements. Cependant, quels que soient les traitements utilisés en oncologie, ceux-ci impactent la biologie des cellules tumorales et également les cellules « saines » du microenvironnement tumoral. Le projet présenté permettra de mieux comprendre les modifications du microenvironnement au décours des traitements, leur impact sur la progression tumorale et le développement de résistances aux drogues. Les bénéfices de ce projet sont multiples à court et long termes. A court terme une meilleure compréhension de l’évolution du microenvironnement permettra : - de cartographier l’impact des traitements sur les tissus, - de comprendre la contribution des éléments du microenvironnement dans le développement tumoral et la réponse aux traitements, - d’identifier et de valider de nouveaux biomarqueurs pronostiques, - d’identifier et de valider de nouvelles cibles thérapeutiques. A long terme, ce projet permettra d’analyser de manière cinétique l’évolution du microenvironnement tumoral, d’identifier de nouveaux biomarqueurs pronostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques en cancérologie. Les résultats obtenus permettront également la mise en place d’essais cliniques chez les êtres humains et les animaux (chiens, chats, etc) atteints de cancer.

Procédures

Le projet prévoit l’induction de tumeurs chez la souris par l’injection de cellules cancéreuses (3440 animaux) ou de fragments tumoraux humains frais (1360 animaux). Fréquence : une seule injection/implantation par animal. L’induction des tumeurs par injection de cellules sera réalisée par injections de cellules en site sous cutanée et en site intramusculaire para-osseux sur animal vigile, ou en site intracardiaque sous anesthésie générale. Des implantations intra-osseux sont prévues sous anesthésie générale. L’induction des tumeurs par implantation de cellules cancéreuses en site intra-osseux, ou de fragments tumoraux en site sous cutanée ou intra-musculaire sera réalisée par une procédure chirurgicale sous anesthésie générale. Durée d’intervention : 10 minutes par souris (site sous cutanées ou intramusculaire), 20 minutes (site intra-osseux) Les traitements par injection en site intra-péritonéal, sous cutanée seront réalisés sur animal vigile. Les traitements par injection en site intra-veineux seront réalisés sur animal sous anesthésie gazeuse (durée de la manipulation: 10 minutes). Les traitements oraux seront réalisés sur animal vigile (durée de manipulation : courts moins de deux minutes/animal). La rythimicité des traitements est dépendante des agents thérapeutiques utilisés et de leur mode d’injection (Fréquences maximales des traitements par animal: intra-veineux (un par semaine), sous-cutanée (1 par jour), intra-péritoneal (1 par jour), gavage (1 par jour) ; Fréquences moyennes des traitements par animal selon l’expérience de l’équipe : intra-veineux (un par semaine), sous-cutanée (1 par jour deux fois par semaine), intra-péritoneal (1 par jour deux fois par semaine), gavage (1 par jour). Les volumes tumoraux seront suivis manuellement à l’aide d’un pied à coulisse deux fois par semaine sur animal vigile (durée de la manipulation : 2 minutes/animal). Les prélèvements de tissus (organes, os, tumeurs) seront réalisés en point final après euthanasie des animaux, et un prélèvement sanguin en site intracardiaque sera réalisé sur animal sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Les procédures présentées dans ce projet peuvent générer des douleurs chez les animaux comme l’injection de cellules ou l’implantation de fragments tumoraux. Une prise en charge de la douleur spécifique à chaque geste technique sera proposée et reposera sur une administration médicamenteuse adaptée et proportionnée à l’évaluation de la douleur. Cette prescription médicamenteuse sera maintenue pendant 24 heures (procédure dite légère) ou avec une fréquence toutes les 12 heures pouvant être accrue toutes les 8 heures (procédure jusqu’à récupération complète et disparition de la douleur liée à la procédure). La suite du protocole ne doit pas générer de douleur, néanmoins, s’il est constaté́ une douleur (mobilité réduite, comportement anormal type prostration, pelage hérissé, etc), la procédure légère de prise en charge de la douleur sera réitérée.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés selon la procédure précisée en vue de prélever la tumeur, les sites métastatiques, le sang et les organes afin d’analyser les caractéristiques du microenvironnement tumoral et d’analyser l’impact des molécules thérapeutiques sur celui-ci et leur effet sur les organes des animaux.

Remplacement

Le microenvironnement tumoral est un environnement très complexe composé de divers types cellulaires et de matrice extracellulaire produit par différentes cellules, et qui se développent de manière cinétique en trois dimensions. Toutes ces composantes interagissent entre elles pour établir pour assurer la mise en place d’un environnement propice à la croissance de la tumeur, au processus métastatique et au contrôle de la réponse aux médicaments par les cellules tumorales. Par ailleurs, cette niche tumorale peut être modifiée en fonction du temps par les thérapies utilisées. Ces caractéristiques font qu'il n'existe actuellement aucun système in vitro ou ex vivo permettant de récapituler tous les évènements et les modifications du microenvironnement associées que ce soit pour les sarcomes et les carcinomes. Cependant, parallèlement aux modèles animaux proposés, des essais in vitro "basés sur les tumeurs" (lignées cellulaires, cultures primaires de cellules humaines, modèles de culture 3D) ont débuté au sein de l’équipe pour développer une plateforme de criblage de composés prometteurs et ainsi réduire le nombre d'animaux requis. Ces futurs modèles associeront des systèmes microfluidiques, de la reconstruction en 3D de coupes histologiques humaines, des approches utilisant des données archéologiques (tissu osseux) et de la modélisation informatique.

Réduction

La conception de nos protocoles expérimentaux repose sur notre expérience, les données quantitatives publiées antérieurement suite à différents traitements médicamenteux et les recommandations de notre cellule statistique. En prenant en compte tous ces éléments, le nombre d’animaux par groupe est fixé à 10. Si des différences importantes sont observées lors des premières expérimentations à venir (essai d’une nouvelle génération de molécules), une réduction du nombre d'animaux dans les expériences suivantes sera appliquée après une nouvelle estimation statistique. Toutes les expériences seront « randomisées » : les animaux sont inclus au hasard dans chaque groupe après induction des tumeurs, et groupés de manière à réduire le nombre d'animaux en utilisant, dans la mesure du possible (par exemple : un même groupe de contrôle peut être utilisé pour plusieurs molécules à tester). Des études pilotes reposant sur un nombre d’animaux réduits seront envisagés lorsque cela sera nécessaire (ex : nouvel échantillon de patient) pour définir un temps de croissance tumorale par exemple et ainsi réduire le nombre d’animaux par groupe ultérieurement. Un plan expérimental sera établi avant chaque expérimentation afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus.

Raffinement

Les modèles murins qui seront utilisés dans ce projet sont déjà établis et nous disposons déjà de données dans l'utilisation de ces modèles (ex. croissance tumorale, formation de métastases, réponse à certaines chimiothérapies). Nous avons déjà identifié la chronologie de la croissance de la tumeur primaire pour les modèles reposant sur l’injection de cellules tumorales issues de lignées cellulaires commerciales, de l'initiation des métastases pulmonaires (cas des ostéosarcomes) et de la détection des cellules tumorales circulantes. Ces informations nous permettent d'initier les procédures expérimentales à un moment approprié avec une reproductibilité accrue. Une attention particulière sera donnée sur le suivi des signes de souffrance des animaux. Une surveillance étroite des animaux par des techniciens animaliers et des chercheurs expérimentés sera mise en place et, le cas échéant, une analgésie sera utilisée pour soulager la douleur. Nous continuerons à affiner les études en termes de surveillance/imagerie des tissus et de collecte de données. Dans le cadre des bonnes pratiques de laboratoire, nous rédigerons un protocole [plan d'étude individuel (PIE)] pour chaque expérience, comprenant l'énoncé du ou des objectifs, une description de l'expérience, couvrant des questions telles que les traitements expérimentaux, les détails du matériel expérimental.

Choix des espèces

Nos procédures expérimentales prévoient l’utilisation de souris immunocompétentes et immunodéprimées selon l’origine des cellules ou des tissus tumoraux implantés. Des souris immunodéficientes seront utilisées pour l'injection de lignées cellulaires humaines et pour l'injection de cellules issues de cultures primaires ou d'échantillons de patients. L’utilisation de souris immunocompétentes permettra d’étudier les populations immunitaires associées au développement tumoral suite à l’implantation de cellules d’origine murine. Différentes souches de souris seront utilisées selon l'origine des cellules. La souris est préférentiellement choisie en raison de l’origine des lignées cellulaires disponibles et par le fait que ces animaux de petites tailles nécessitent des quantités de molécules thérapeutiques réduites. Pour les modèles de d’ostéosarcomes et de sarcomes d’Ewing, des souris jeunes seront utilisées afin de mimer au mieux les tumeurs chez les patients (enfant, l’adolescent et le jeune adulte). Réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 5 semaines). L’âge des souris est déterminé selon l’âge de diagnostic de la pathologie chez l’être humain. Pour les modèles de sarcomes des tissus mous, chondrosarcomes et de carcinomes, des souris âgées de 8 semaines seront utilisées. Réception de souris âgées de 7 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 8 semaines). L’âge des souris est déterminé selon l’âge de diagnostic de la pathologie chez l’être humain.

840 animaux non-humains, 480 rats et 360 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont soumis à un stress chronique destiné à provoquer anxiété et dépression, puis à une incision chirurgicale de la patte, et subissent des dizaines de tests de douleur et de tests anxio-dépressifs, avec un jeûne de 24 heures pour l'un d'eux. Le porteur indique que la douleur ne peut pas être soulagée parce que c'est l'objet même de l'étude, et que les animaux présenteront les signes attendus d'anxiété et de dépression. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer l'observation comportementale d'un animal vivant.

Objectifs

La douleur chronique post-chirurgicale (DCPC) est une douleur qui perdure au moins 3 mois après une intervention chirurgicale. Elle n’a pas d'autre étiologie et n’est pas du a un problème préopératoire. Son incidence varie de 20 à 85 % et représente un fardeau clinique et économique. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent le développement de la DCPC. Parmi les facteurs de risques potentiels, les facteurs psychosociaux préopératoires, notamment l'anxiété et la dépression, joueraient un rôle clé dans le développement de celle-ci. Les modèles animaux ont fourni des informations essentielles sur l'interrelation et la neurobiologie qui sous-tendent l'association entre dépression et douleur chronique, mettant en évidence le cercle vicieux qui relie ces pathologies. Il a récemment été montré que la douleur post-chirurgicale est prolongée lorsque les animaux sont soumis à un stress conduisant à un état dépressif, ce qui confirme que cette observation clinique peut être reproduite dans des modèles animaux précliniques. L’objectif de ce projet sera d’étudier (1) les effets d’un stress répété et la réponse émotionnelle associée (anxiété, dépression) sur la DCPC puis nous déterminerons (2) les mécanismes neuro-immunitaires impliqués dans le développement, l'expression et le maintien de cette DCPC et des phénotypes anxio-dépressifs induits par le RRS. Ce projet s'efforcera d'examiner et de comparer les effets du stress sur la DCPC chez les mâles et les femelles et de déterminer si des dimorphismes sexuels existent en termes de comportement et de mécanismes neurobiologiques.

Bénéfices attendus

La douleur chronique post-chirurgicale est un résultat potentiellement dévastateur d'une intervention chirurgicale par ailleurs réussie, qui entraîne une augmentation des coûts médicaux directs par l'utilisation de ressources supplémentaires et des coûts indirects par l'absentéisme au travail et la perte de productivité. Elle a également un impact significatif sur les individus et leurs familles, affectant leur fonctionnement physique, leur état psychologique et leur qualité de vie. Ainsi, la compréhension des mécanismes qui sous-tendent le développement de la douleur chronique post-chirurgicale et l'identification de nouvelles stratégies de traitement contribueront grandement à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de cette affection et permettront d’éviter le développement à long terme de cette douleur post-chirurgicale. Cette recherche fournira un nouvel aperçu mécanistique de la façon dont le stress chronique est impliqué dans l'établissement et le maintien de la douleur chronique post-chirurgicale.

Procédures

Les animaux seront soumis à un stress chronique (temps à déterminer pour le rat via une étude pilote durée maximale envisagée de 6 heures et 1h par jour pendant 3 jour pour la souris) qui entraine le développement de troubles anxio-dépressifs ainsi qu’à une douleur de type post-chirurgicale qui perdure 15 jours environ. Ils subiront une chirurgie sous anesthésie gazeuse au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 minutes environ, 48h après la fin du stress chronique. Les animaux subiront 6 tests nociceptifs d’une durée de 20min environ avant la chirurgie, puis 4 tests pendant le stress chronique puis 30 tests après la chirurgie. Ils subiront également 5 tests anxio-dépressifs d’une durée de 5 à 20 min (avec 24h minimum entre chaque test). Pour un de ces tests les animaux seront mis à jeûn 24h avant la réalisation de ce test mais garde accès à la boisson.

Impact sur les animaux

Nous travaillons sur l’effet de l’anxiété chronique sur la douleur post-chirurgicale. Il y a une douleur qui ne peut donc être soulagée car c’est l’objectif de l’étude. De même les animaux présenteront des signes d’anxiété et de dépression car c’est ce qui est attendu. Pour les procédures de stress chronique d'une durée maximale de 6h pour certains groupes d'animaux, il peut y avoir des risques d’irritation de la peau entrainées par une production excessive d'urine. Concernant l’incision de la patte, l'infection de la plaie après l'opération (dans 2% des cas) peut être observée. Chez les rats, une difficulté dans les déplacements peut être présente les heures suivants l’incision mais cette dernière disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Pour l’un des tests comportementaux, les animaux réaliseront un jeûne préalable de 24h.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvements à la fin de l'étude.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse de l’effet d’un stress chronique dans un modèle de douleur post-chirurgicale nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 15 souris/rats mâles et 15 souris/rats femelles, le risque de variabilité lié à l’activité intrinsèque de ces réseaux cérébraux étant minime. Un calcul statistique a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides. Cela permet de calculer le nombre de sujets nécessaires pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables de notre étude. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés, les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus (souris) ou 2 ou 3 individus (rats) pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Les espèces et les souches utilisées sont représentatives de celles les plus couramment utilisées dans la recherche sur les neurosciences intégratives des systèmes entiers et correspondent à ce qui a été utilisé précédemment pour développer ce nouveau modèle. Les rats Sprague-Dawley sont utilisés couramment dans la recherche sur la douleur. Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font également de la souris un modèle pertinent. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g pour les souris et poids supérieur à 200g à la chirurgie pour les rats).

Injectées dans le péritoine deux fois par semaine pendant dix semaines au plus, et anesthésiées pour un prélèvement de sang dans le cœur, 108 souris d'une lignée reproduisant la progéria vont toutes être tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chez les souris homozygotes de cette lignée, le porteur décrit un poids qui dépasse rarement 17 g chez les mâles et 15 g chez les femelles, des anomalies du squelette et de la peau, des troubles cardiaques et une survie moyenne de 117 jours. Elles reçoivent une molécule dérivée d'une première qui, testée chez la souris, "ne remplit pas tous les critères thérapeutiques", avec une inflammation légère des yeux possible après plus de huit semaines de traitement. Le porteur affirme que la souris est le "seul mammifère modèle de la maladie" utilisable pour des essais précliniques, puis ajoute aussitôt : "Il existe aussi un modèle de porc".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de tester l’efficacité in vivo d’un traitement sur un modèle murin de la Progéria (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS). Cette maladie génétique extrêmement rare se déclare dès l’enfance et conduit à l’apparition d’un vieillissement prématuré et à une mortalité précoce, vers l’âge de 13,5 ans, des suites d’infarctus du myocarde ou d’accidents vasculaires. Il existe donc un fort besoin médical pour ces patients. Cette pathologie est due à l’accumulation d’une protéine toxique dans le noyau des cellules de patients, appelée la progérine. La quantité de progérine présente chez les patients est directement corrélée avec la sévérité de la maladie. La réduction de la quantité de cette protéine toxique est donc une cible potentielle pour changer le cours de cette pathologie dévastatrice. Récemment une molécule avec un bon index thérapeutique sur un modèle d’étude in vitro a été sélectionnée pour poursuivre le développement. Cette molécule a été testée ensuite chez la souris. Le traitement hebdomadaire avec cette molécule a montré des signes d’efficacité mais ne remplit pas tous les critères thérapeutiques. Ainsi, dans ce nouveau projet nous testerons une nouvelle molécule dérivée de l’ancienne molécule. Le but sera ici d’évaluer : la diminution de la progérine en évaluant l’efficacité de cette nouvelle molécule, ainsi que sa pharmacocinétique, sa toxicité in-vivo et l’effet thérapeutique à long terme.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra : - de démontrer que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur les symptômes de la pathologie humaine ; - d’établir une relation pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule testée. Un des effets attendus de cette utilisation est une meilleure tolérance et efficacité. A plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir une preuve clinique de son efficacité chez l’homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de Progéria.

Procédures

Injections intrapéritonéales (2X/semaine, sur une durée maximale de 10 semaines). Les animaux seront injectés avec des anesthésiques (durée de l’injection moins d’une minute) avant que le sang soit prélevé par voie intracardiaque (durée 5 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle animal utilisé présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris homozygotes présentent des poids ne dépassant que très rarement 17g pour les mâles et 15g pour les femelles. La lignée est également caractérisée par une mortalité prématurée. En effet, la moyenne de survie basée sur l’ensemble des 7 publications utilisant ce modèle et présentant ce type d’étude est de 117 jours, soit 16,5 semaines environ. Des anomalies squelettiques sont également à noter ou des anomalies cutanées avec un pelage pouvant devenir épars. Enfin, des problèmes cardiaques importants sont souvent responsables de la mort prématurée de ces souris. Par ailleurs, nous nous attendons possiblement à la présence d’une inflammation légère au niveau des yeux sur les animaux traités avec la molécule pendant plus de 8 semaines.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses protéiques.

Remplacement

Notre projet s’inscrit dans la continuité d’une étude in vitro menée sur des cellules de patients. Cependant, ce modèle cellulaire ne permet pas d’explorer l’intégralité des mécanismes qui peuvent avoir lieu dans un organisme. Le passage au modèle in vivo est donc une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Il nous est nécessaire de disposer d'un organisme entier pour pouvoir mieux comprendre la pathologie de la progéria. Le seul mammifère modèle de la maladie qui nous permet de réaliser des essais pré-cliniques en vue d’une mise en œuvre d’essais thérapeutiques chez l’Homme est la souris. Il existe aussi un modèle de porc, cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats interprétables. Dans ce sens la cohorte destinée à l’analyse de l’efficacité précoce comporte 6 animaux par groupe. L’estimation du nombre d’animaux par groupe nécessaire a été réalisée sur le critère principal suivant : comparaison du niveau moyen de progérine entre chaque groupe de traitement (comparaison de moyennes). La deuxième cohorte destinée à l’évaluation d’un possible espacement du traitement comporte 7 animaux par groupes et par temps d’analyse. Enfin la dernière cohorte destinée à l’observation plus tardive d’un phénotype clinique mesurable comporte 10 animaux par groupe. Pour l’ensemble des cohortes, le nombre d’animaux utilisés a ainsi été optimisé pour permettre d’observer un effet du traitement.

Raffinement

Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, l’apparence physique. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas d’inflammation des yeux, les animaux seront traités avec une crème ophtalmique 1 à 2 fois par jour pendant minimum 5 jours. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal blessé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés 2x/semaine et observés quotidiennement. Afin de maintenir un état nutritionnel correct, nous utiliserons, si nécessaire, une alimentation sous forme de gel, facile à ingérer par les souris afin d’éviter toute malnutrition.

Choix des espèces

Le modèle murin est le seul modèle envisageable pour tester des approches thérapeutiques dans le cadre de cette pathologie, puisqu’il s’agit d’une maladie génétique qui a été modélisée sur la souris. Le modèle que nous utilisons récapitule à la fois la mutation génétique de la maladie, ainsi que la majorité des caractéristiques cliniques et de l’évolution de la pathologie observée chez l’Homme. Une seule autre espèce génétiquement modifiée existe, il s’agit d’un modèle de porc. Cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée. Les animaux seront traités à partir de l’âge de 5 semaines, avant que la pathologie ne se développe et jusqu'à maximum 15 semaines pour étudier l'efficacité tardive.

1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, au plus tard à 24 mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Issues de croisements qui cumulent des mutations de gènes de l'anémie de Fanconi, elles sont suivies de la naissance à 24 mois pour guetter l'apparition de cancers, et piquées à la joue, éveillées, pour une prise de sang chaque mois de l'âge de six semaines à 24 mois. Le porteur indique que certaines peuvent développer des cancers ou une défaillance de la moelle osseuse, "source de douleur ressentie par l'animal", et renvoie les essais de traitements à une étape ultérieure. Sur le remplacement, il affirme avoir "besoin de l'organisme entier et vivant" pour mesurer l'effet de la perte d'un gène sur la production du sang.

Objectifs

L’anémie de Fanconi est une maladie héréditaire rare, caractérisée par des malformations dès la naissance, et un défaut de la production de cellules sanguines par la moelle osseuse, menant à une quantité réduite de globules rouges, globules blancs et plaquettes dans le sang. Par ailleurs tous les patients ont une tendance très importante à développer des cancers du sang et des cancers solides tels que ceux de la tête et du cou. Cette maladie est causée par des mutations des gènes participant à la réparation de l’ADN en cas d’altération. À ce jour, 23 gènes participant à la voie de signalisation Fanconi sont connus dans cette pathologie. La mutation d’un de ces 23 gènes de la voie Fanconi provoque les symptômes de la maladie anémie de Fanconi. Il est important de travailler avec différentes mutations de la voie Fanconi afin de mieux comprendre la maladie et l’évolution vers des cancers du sang. Pour ce projet nous utiliserons des modèles de souris associant plusieurs gènes impliqués dans la maladie et retrouvés mutés chez les patients Fanconi, notamment dans les cas les plus graves. Ces modèles de souris nous permettront également de mimer des états précédant l’apparition des cancers du sang. L’objectif de ce projet est de créer et caractériser des lignées de souris transgéniques reproduisant les altérations retrouvées chez les patients Fanconi.

Bénéfices attendus

Les gènes associés à l’anémie de Fanconi sont similaires entre la souris et l’homme. Nous pouvons ainsi modéliser les mutations de ces gènes retrouvés chez les patients chez la souris. À court terme, ce projet nous permettra de créer des modèles de souris de l’anémie de Fanconi et d’étudier l’évolution naturelle de la maladie. Dans un second temps, nous utiliserons ces nouvelles lignées génétiquement modifiées pour tester des thérapies ciblant l’anémie de Fanconi.

Procédures

Pour mener à bien ce projet, nous générerons de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées par croisement. Les animaux ainsi obtenus seront suivis de la naissance jusqu'à l'âge de 24 mois afin de détecter tout effet sur l'apparition de cancer. Nous mesurerons également plusieurs paramètres sanguins à partir de prélèvements de sang obtenus au niveau de la joue (sur souris éveillée, d'une durée de 30 secondes environ). Ces prélèvements seront mensuels à partir de l’âge de 6 semaines et jusqu’à l’âge de 24 mois.

Impact sur les animaux

Une douleur liée au prélèvement de sang réalisé au niveau de la veine de la joue peut être constatée. Certaines souris peuvent développer des cancers ou un défaut de la production des cellules sanguines par la moelle osseuse ce qui peut être une source de douleur ressentie par l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés au plus tard à 24 mois pour l’analyse des organes post-mortem.

Remplacement

Notre projet a pour but de décrire les caractéristiques des souris avec des mutations de gènes associés à l’anémie de Fanconi, notamment les valeurs de référence pour les paramètres sanguins (hémoglobine, globules rouges, globules blancs, plaquettes) et leur évolution en fonction du vieillissement des souris, en cherchant une réduction progressive des paramètres sanguins avec le temps. Le modèle souris ne peut pas être remplacé par un modèle cellulaire car nous avons besoin de l’organisme entier et vivant pour évaluer l’impact de la perte d’un gène Fanconi sur la production des cellules du sang par la moelle osseuse.

Réduction

Afin de caractériser les nouveaux modèles de souris que nous allons créer, nous avons besoin d’un nombre minimal d’animaux de chaque groupe, défini à l’aide d’une analyse statistique. Nous prévoyons une analyse intermédiaire ce qui permettra de déterminer si les animaux créés présenteront une altération de leur bien-être. Si l’analyse intermédiaire permet de détecter une différence significative entre les groupes génétiquement altérés, l’expérience sera arrêtée.

Raffinement

Une surveillance quotidienne sera réalisée par l’expérimentateur ou l’animalier. Nous serons attentifs en veillant à ce que tous les animaux soient maintenus autant que possible en groupe et que l’enrichissement du milieu soit adapté, notamment pour les animaux qui se retrouveraient isolés en cours d’expérience. Toutes les cages auront un enrichissement (papier kraft, tunnel, buchette de bois). Une surveillance clinique hebdomadaire de l’apparence (poids, pelage, sécrétions, présence de masse tumorale) et du comportement (interactions sociales, posture, mobilité, respiration) sera effectuée dès la naissance et jusqu’à la fin de la procédure (18 ou 24 mois). Le suivi se fera en suivant une grille de points limites définis, suffisamment précoces et prédictifs. Pour les nouveaux nés jusqu’au sevrage, nous surveillerons également la présence de malformations et de retard de développement éventuel. La surveillance biologique mensuelle par numération des comptes globulaires sanguins à partir de 6 semaines de vie nous permettra également de détecter des anomalies très précoces de la numération sanguine. Si des animaux présentent des signes d’inconfort, ils bénéficieront d'une analgésie. Toute souris présentant des signes de souffrance pendant la durée de l’expérience (poil hérissé, prostration, perte de poids, tumeur palpable) sera euthanasiée sans attendre et analysée.

Choix des espèces

Les gènes Fanconi sont similaires entre la souris et l’homme. Nous pouvons ainsi modéliser les mutations de ces gènes retrouvées chez les patients Fanconi chez la souris. L’utilisation du modèle souris permet à la fois de modéliser le défaut de réparation de l’ADN de l’anémie de Fanconi et d’analyser l’évolution naturelle de cette pathologie. Pour la caractérisation des modèles, les souris seront suivies dès la naissance afin de détecter l’apparition d’une tumeur. Le premier prélèvement sanguin aura lieu à l’âge de 6 semaines, afin de ne pas manquer des anomalies très précoces de la numération sanguine et jusqu’à l’âge de 24 mois, afin d’évaluer le vieillissement des souris et son retentissement sur les paramètres sanguins, ainsi que le développement de possibles cancers. Cette surveillance est basée sur la littérature scientifique existante.