Rongeurs

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés subissent une amputation de la première phalange pour génotypage, puis les animaux reçoivent des injections de tamoxifène et une injection de cardiotoxine qui détruit le muscle, dont on étudie ensuite la régénération sous glucocorticoïdes. Le porteur affirme que le recours à un "organisme entier" est nécessaire parce que cellules immunitaires et hormones interviennent dans la régénération, et indique n'attendre aucun effet secondaire majeur. Les bénéfices thérapeutiques évoqués restent une compréhension des mécanismes, sans application décrite à court terme.

Objectifs

Dans le cadre d’une blessure les glucocorticoïdes comme la cortisone peuvent être prescris pour leurs effets anti-inflammatoires efficaces mais dont la prise prolongée peut induire une perte de la masse musculaire. Les études sur les effets des glucocorticoïdes réalisées in vitro sur des cellules en culture montrent des résultats souvent contradictoires. Ainsi, malgré cette utilisation courante le mode d’action précis grâce auquel les glucocorticoïdes produisent leurs effets bénéfiques comme délétères sont encore mal connus. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la dégénérescence et la régénération musculaire via certain type de cellule immunitaire. Cette étude permettra aussi de mieux décrire, in vivo, le lien entre une partie du système immunitaire et les cellules souches du muscle. Enfin, grâce à ce projet nous espérons pouvoir identifier le meilleur moment pour administrer les traitements aux glucocorticoïdes en évitant les effets secondaires indésirables.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques de régénération musculaire. Ce projet permettra aussi de décrire les effets induits par des traitements aux glucocorticoïdes. Nous pourrons ainsi disséquer les conséquences d’un potentiel dysfonctionnement du système immunitaire sur les processus d’inflammation mais aussi les conséquences sur la réparation des fibres musculaires. En comprenant les cibles et le rôle précis des glucocorticoïdes des traitements pourront être développer pour cibler un type cellulaire en particulier et être administrés au moment adéquat.

Procédures

Les animaux issus des croisements sont identifiés par tatouage au doigt ou amputation de la première phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées. Tatouage et biopsie sont alors non douloureux. La phalangéctomie nous permettra de récupérer une biopsie des animaux afin de déterminer leurs génotypes. Les animaux vigiles, c’est-à-dire non anesthésiés, seront soumis principalement des injections de différents types ne nécessitant pas de contention de plus de 30 secondes. Une première vague d’injection de tamoxifène, permettant l’invalidation du récepteur des glucocorticoïdes, sera réalisée une fois par jour pendant 5 jours. Ensuite, l’induction de la lésion musculaire se fera sur des animaux endormis à l’aide d’un gaz à savoir l’isoflurane. Les animaux endormis recevront une injection unique de cardiotoxine dans chacun des tibias. Une fois l’animal endormi cette procédure dure environ 1,5 minute. Durant la régénération musculaire, les traitements par glucocorticoïdes seront réalisés grâce à une injection par jour sur une période allant de 1 à 7 jours maximum. L’injection unique d’une molécule, pour visualiser la prolifération cellulaire, sera réalisée par injection sur des animaux vigiles deux heures avant leur mise à mort. Le prélèvement de sang sera réalisé via l’artère temporo-mandibulaire sur des animaux vigiles juste avant leur mise à mort et représentera 25% de leur volume corporel. Enfin, pour l’anesthésie létale les animaux vigiles seront injectés avec un mélange de xylazine/kétamine afin de subir une chirurgie. Cette dernière consiste à réaliser une perfusion de paraformaldéhyde intracardiaque cœur afin que le système circulatoire permette au fixateur d’atteindre tous les organes. Cette technique permet de fixer et préserver les tissus de manière homogène.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. La phalangéctomie et le tatouage sont des techniques d'identification utilisées depuis plusieurs décénies dans le laboratoire et ne présentent pas d'effets secondaires majeurs. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant. En effet, 7 jours de traitement aux glucocorticoïdes ne provoquent normalement pas d’atrophie musculaire. Ainsi, nous n’attendons pas d’effets secondaires majeurs causés les molécules injectées. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).

Devenir

A l'issue de la procédure tous les animaux expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes et synthétiques (dexaméthasone) sur la régénération musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, lors de la régénération musculaire, les cellules du système immunitaire provenant de la circulation sanguine sont impliquées mais aussi d’autres facteurs comme les hormones. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un animal entier afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte (exemple : niveaux d’hormones circulantes). Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production d’un nombre assez important d’individu, contribuant à la production de résultats significatifs.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire sur la régénération musculaire ont mené à une bonne connaissance du modèle ainsi que des traitements à réalisés. Ainsi, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement et disposons de protocoles précis pour chaque expérimentation. Par ailleurs, les deux pattes des souris seront systématiquement utilisées afin de réduire de moitié le nombre d'animaux requis.

Raffinement

Dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Néanmoins, si l’un des animaux atteint un point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort par afin d'éviter toute souffrance inutile. Par ailleurs, après injection, les souris seront attentivement suivies. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …). De plus, le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’administration du composé induisant un dommage musculaire. Enfin, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement pouvant entrainer des effets secondaires délétères sur les animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront des mâles entre 10 et 15 semaines pour éviter les variations causées par la puberté. La régénération musculaire se faisant en plusieurs étapes, nous effectuerons une cinétique. Dans un premier temps, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la dégénérescence musculaire et l’inflammation en analysant les souris à 1, 3 et 5 jours après injection de la cardiotoxine. Puis, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la régénération musculaire et les mécanismes anti-inflammatoire en analysant les animaux à 7, 14, 28 et 60 jours après l’injection de la cardiotoxine. Un groupe d’animaux sera également analysé en l’absence de traitement à la cardiotoxine, constituant ainsi le jour 0. Pour la majorité des expérimentations nous utiliserons les souris de la lignée constitutive ne nécessitant pas d’injection au tamoxifène. Néanmoins, si nous observons des phénotypes sur ces souris, nous voudrions exclure une cause développementale c’est pour cela qu’il nous sera indispensable d’utiliser une seconde lignée inductible. Il est difficile à cette étape de prévoir à quel stade nous utiliserons ces souris car cela dépendra du phénotype des souris issues de la lignée constitutive.

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est irradié puis reçoit une injection intrafémorale décrite comme douloureuse, et une partie est transplantée avec des cellules souches hématopoïétiques humaines, avant euthanasie pour quantifier la prise de greffe. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne reproduit ce processus in vitro et que la transplantation chez l'animal est le "seul outil" disponible. Les retombées annoncées pour les patients greffés de moelle osseuse sont renvoyées au conditionnel et au long terme.

Objectifs

L’utilisation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) suscite un fort intérêt médical du fait de leur potentiel de régénération et de différenciation. Elles sont présentes dans la moelle osseuse et sont à l’origine des cellules sanguines. Elles sont utilisées au cours des transplantations hématopoïétiques dans le but de traiter les patients atteints de leucémies ou de maladies génétiques affectant les cellules du sang (leucocytes, globules rouges, plaquettes). L’une des limites de la greffe cependant, provient de la faible proportion de CSH capables de migrer vers les niches hématopoïétiques localisées dans la moelle osseuse et de s’y implanter. La grande majorité des CSHs est en réalité perdue ou détruite avant d’atteindre la moelle osseuse. Ainsi, une proportion importante des greffons, notamment ceux issus des sangs de cordons ombilicaux présentant de faibles quantités de CSHs, ne peut pas être utilisée pour la greffe. Une solution permettant d’augmenter le nombre de greffons disponibles consiste à augmenter la proportion des CSHs « utiles », c’est à dire capables de s’implanter dans la moelle osseuse. Cette amélioration permettrait en outre de limiter les risques d’échec de greffe chez les patients transplantés. Dans ce contexte l’objectif de notre projet est d’évaluer l’effet de l’injection de molécules impliquées dans le guidage des cellules vers les niches hématopoïétiques médullaires, en association ou non avec des complexes stabilisateurs, préalablement à l’injection des CSHs, sur l’efficacité de l’implantation des CSHs humaines dans la moelle osseuse. Les expériences de transplantations seront réalisées dans un modèle de souris n’ayant pas de système immunitaire, ne rejetant donc pas la greffe de cellules humaines.

Bénéfices attendus

Cette étude permettrait d’établir la preuve de concept que l’injection de molécules (sélectionnées sur la base de leur effet sur les CSHs) augmente la prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques (CSHs) lors d’expérience de transplantation. A terme, ces résultats concourront à l’optimisation des protocoles de transplantation de cellules hématopoïétiques chez l’humain, dans le but d’augmenter les chances de réussite thérapeutique et le nombre de patients pouvant bénéficier d’une greffe de moelle osseuse.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une irradiation, étape nécessaire à une bonne prise de greffe (entre 3min environs et 5 min environ selon la lignée de souris) et à l’injection intrafémorale d’une molécule sélectionnée sur la base de son activité sur les CSHs. Cette injection qui dure quelques minutes sera réalisée sous anesthésie (1h environ) avec une prise en charge analgésique. Certains animaux seront également transplantés avec des CSHs humaines par voie intra veineuse. L’injection de CSHs qui ne dure que quelques secondes est réalisée sous anesthésie et analgésie. Ces procédures permettront de tester 5 molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs

Impact sur les animaux

L’injection dans l’os est douloureuse. Elle sera effectuée sous anesthésie et sera accompagnée d’une prise en charge analgésique. Les animaux seront irradiés pour permettre la prise de greffe. L’irradiation non létale des souris n’est pas sensée provoquer de douleur ou d’altération majeur de leur santé. Une perte de poids peut être observée dans de rare cas mais elle est transitoire (une semaine environ). Seule une infection potentielle peut s’avérer dangereuse mais elle est limité au maximum grâce au maintien des animaux dans un environnement stérile et à un traitement antibiotique durant 1 mois dans l’eau de boisson.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de quantifier, dans la moelle et dans le sang, la concentration de la molécule étudiée pour les études de pharmacocinétique ainsi que la proportion de CSH humaines présente dans la moelle des souris pour les expériences de transplantation.

Remplacement

La prise de la greffe au cours des transplantations de CSH est un phénomène complexe et il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de mimer ce processus in vitro. Le passage par une expérience de transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des CSHs à se loger au niveau de la moelle osseuse et ainsi d’identifier des molécules capables d’améliorer cette étape.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, nous déterminerons sur un petit nombre de souris les conditions expérimentales optimales de transplantation en fonction de chaque molécule testée. L’effet de cinq molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs sera évalué. Notre expérience ainsi que la littérature dans le domaine nous montrent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe et par expérience est de 6 animaux afin que nous puissions rendre des résultats statistiquement significatifs sur le plan hématologique. Nos expériences préliminaires par étapes successives nous permettront d’optimiser les paramètres expérimentaux et de vérifier que ce nombre d’animaux est valide lorsque l’on combine injection intra-fémorale d’une molécule à tester et injection intra-veineuse de cellules hématopoïétiques.

Raffinement

Pour limiter au maximum l’impact sur le bien-être des animaux, toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale grâce à un mélange anesthésique/analgésique. Par ailleurs, une prise en charge analgésique sera effectuée si besoin au site de l’injection intra-fémorale. Enfin une surveillance accrue sera réalisée entre le moment de l’irradiation et l’euthanasie de l’animal afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'humain. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de l’hématopoïèse après transplantation de CSHs. Souris jeunes adultes (10-12 semaines) afin d’être dans des conditions dans lesquelles la prise de greffe est optimale.

2 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules tumorales pulmonaires puis une infection nasale par le virus Influenza sous anesthésie, avant des traitements de chimiothérapie ou d'immunothérapie, la croissance tumorale pouvant provoquer détresse respiratoire et perte de mobilité. Le porteur affirme qu'il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et justifie le choix de la souris parce que "toutes les études similaires sont menées chez cet animal". Les bénéfices avancés pour les patients atteints de cancer du poumon restent une meilleure connaissance des facteurs de résistance aux traitements.

Objectifs

Nous souhaitons caractériser l’impact d’un virus respiratoire sur la progression tumorale de cellules tumorales pulmonaires et comprendre les mécanismes mise en oeuvre lors de la reconnaissance virale. Pour ce faire, nous utiliserons des lignées cellulaires présentant ou non des adaptateurs moléculaires impliqués dans le processus de reconnaissance du virus respiratoire Influenza A. Nous nous interessons également à la réponse aux différents traitements.

Bénéfices attendus

Les traitements actuellement préconisées dans le cadre d'un cancer pulmonaire sont la radiothérapie ou la chimiothérapie et éventuellement en association avec l'immunothérapie ou thérapie ciblée. Cependant, il est nécessaire de poursuivre des recherches pour mieux connaître les facteurs pouvant impacter la progression tumorale et la résistance au traitements. C'est pourquoi, nous souhaiterions déterminer le rôle des adaptateurs ou récepteurs de la reconnaissance virale en combinaison avec de la chimiothérapie ou immunothérapie.

Procédures

Pour l'ensemble des procédures, la durée de l'expérience est de 1 mois. Les animaux recevront une injection de cellules tumorale (2250 animaux) par voie intraveineuse avec au préalable une anesthésie générale. La durée de l'acte est de quelques secondes à une minute. De plus, avant l'infection respiratoire, les souris sont anesthésiées à l'aide de cette même préparation puis l'infection par voie nasale (2250 animaux) peut avoir lieu. Le temps nécessaire une infection est de 20 minutes maximum. Nous testerons également la résistance aux médicaments et la voie d'administration du traitement (chimiothérapie ou anti-monoclonal) est une injection intra-veineuse (1800 animaux) et l'acte prend moins de 10 secondes. Les souris recevront une anesthesie gazause. Lors des traitements par chimiothérapie : deux à 5 injections sont prévues pour les sels de platine. Enfin, lors du traitement par immunothérapie, 5 injections d'anticorps seront réalisées. De plus, lors de l'imagerie du petit animal, nous utilisons un anesthesique gazeux pendant 10 min (2250 animaux).

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales par voie intra-veineuse peut causer une douleur ou un inconfort d’où l’utilisation d’une anesthésie injectable. Les souris peuvent souffrir de faim ou de soif lors d’une infection virale et lors d’une croissance rapide de la tumeur instillée, l’animal peut présenter des signes de souffrances, d’une détresse respiratoire et une diminution de la mobilité de l’animal. De plus, les effets indésirables liés à l’infection virale peuvent être multiples. Lorsque nous procédons à une infection virale par voie nasale, il est nécessaire d’endormir les souris à l’aide d’une anesthésie injectable pouvant entrainer une hypothermie. Enfin, l’administration de médicaments se fait par voie intra-veineuse Et, l’animal recevra une anesthésie gazeuse pour limiter toute souffrance, et ensuite, l’injection intra-veineuse peut être entrepris.

Devenir

Les souris sont euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les poumons dans le but d’analyser par des techniques multiparamétriques, l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral et la réponse virale.

Remplacement

Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. En effet, les cellules en culture ne permettent pas d'appréhender le processus de progression tumorale et l’infiltrat immunitaire dans sa globalité

Réduction

Les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles. Nous avons établi 15 souris/groupe. Nous utiliserons un pied à coulisse pour mesurer le volume tumoral aux cours du temps et des techniques d'imagerie non invasive pour l’apparition des métastases. Le nombre d’animaux impliqué dans l’étude est de 2250. Nous utiliserons un test statistique permettant de comparer les moyennes des souris instillées par rapport aux contrôles.

Raffinement

Raffiner, la méthodologie utilisée, ce qui implique la notion de points limites, si des signes de souffrances sont visibles. De plus, les animaux auront un temps d'acclimatation de 8 jours avant d'être expérimentés. Les animaux seront observés de façon quotidienne et seront gardés en groupes de 5 et hébergés dans des cages appropriées offrant suffisamment d’espace vital. Un milieu enrichi adapté est prévu pour l’hébergement des souris. Notre stratégie d’observation consiste en une surveillance quotidienne par les animaliers d’une part et nous assurons en plus une surveillance suivi d’un contrôle 3 fois par semaine dès que les souris ont été infectée par injection intra-nasale avec recherche de signes d’altération de l’état général (souris recroquevillée, amaigrissement (3 pesées hebdomadaires) et de difficultés respiratoires. Lors des injections de cellules tumorales pulmonaires et au moment de l’infection intra-nasale, les animaux seront sous anesthesie générale. Afin d'éviter que les animaux ne soient en hypothermie, nous les plaçons sur un tapis à 37°C. En cas de signe de souffrance les souris seront euthanasiées. Nous utiliserons une anesthesie gazeuse afin d’observer l’apparition des tumeurs par une technique d’imagerie pour éviter d’euthanasier l’animale. Nous utiliserons également de l’anesthesie gazeuse lors des injections intra-veineuses.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour conduire nos expériences avec avant tout dans un souci d’intégration de nos recherches dans un contexte scientifique où toutes les études similaires sont menées chez cet animal. Il s’agit d’une espèce pour laquelle notre animalerie est parfaitement adaptée, qui se manipule facilement. Nous utilisons des souris C57Bl/6 albinos qui est une lignée de souris dont la mutation provient d’une mutation spontanée dans la lignée C57Bl/6. Cette lignée est couramment utilisée pour les expériences de bioluminescence. Les animaux commerciaux sont utilisés à l'âge de 7 à 9 semaines. Ce stade de développement a été choisi car les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature.

5 321 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de quelques jours reçoivent une injection de chimiothérapie, des mâles subissent une vasectomie et des femelles une réimplantation d'embryon, pour évaluer l'effet des traitements sur le sperme et l'embryon. Le porteur décrit des douleurs postopératoires, des infections de plaie et une perte de poids possibles, et prévoit l'euthanasie avant prélèvement du tissu testiculaire ou des ovocytes. Il affirme que la spermatogenèse in vitro complète n'est réalisable que chez la souris et présente comme "indispensable" la recherche d'épi-mutations transmissibles.

Objectifs

Ce projet permet d’évaluer, chez un modèle murin, l’impact des traitements de chimiothérapie sur l’intégrité du tissu testiculaire, sur la capacité des spermatogonies à se différencier in vitro et sur la qualité des gamètes produits. L’architecture de la chromatine ainsi que l’expression des transcrits dans les spermatozoïdes provenant de souris traitées par chimiothérapie sera évalué par une approche de sc-ATAC-seq et de sc-RNA-seq. Avant d’établir ce projet, une étude bibliographique a été réalisée au préalable. Aucune étude n’a évalué l’impact des agents de chimiothérapie sur (i) l’épigénome et la chromatine spermatique et (ii) le développement et l’épigénome de l’embryon précoce. Il apparait donc indispensable de rechercher la présence d’éventuelles épi-mutations dans le noyau des spermatozoïdes produits in vivo ou in vitro et d’évaluer les risques de transmission transgénérationnelle de ces altérations, qui pourraient être à l’origine de défauts du développement embryonnaire ou d’anomalies congénitales.

Bénéfices attendus

Il est nécessaire d’évaluer l’impact des traitements de chimiothérapie sur l’intégrité du tissu testiculaire, sur la capacité des spermatogonies à se différencier in vitro et sur la qualité des gamètes produits avant d’envisager une application chez les patients guéris de LAL mais devenus stériles. Les échantillons humains étant rares et précieux, nous utiliserons du tissu testiculaire murin pour attendre les objectifs du projet.

Procédures

Injections de molécules de chimiothérapie (et sérum physiologique) en intra-péritonéales sur souricaux de 3,5 jpp. 1 injection d'1 seule dose par animal. Acte nécessitant 2 minutes maximum par souriceau. Procédure chirurgicale : vasectomie de souris mâles. 1 acte chirurgical par animal (avec vasectomie bilatérale ; permettant de générer des mâles castrés, utiles pour l'obtention de femelles pseudo-gestantes). Acte nécessitant une procédure de 10-15 minutes par souris. Procédure chirurgicale : réimplantation d’embryon chez des femelles pseudo-gestantes au niveau de l'infundibulum. 1 acte chirurgical par animal. Acte nécessitant une procédure de 20-25 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Stress lié à l’injection de molécules de chimiothérapie, nuisances liées à l'acte chirurgical et stress lié à la mise à mort. La chirurgie peut entrainer des nuisances telles qu’une infection au niveau de la plaie, notamment suite à une déhiscence (séparation de bords de la plaie) ; des saignements ; une douleur, souvent au niveau de la cicatrice ou un état de fatigue. Lors de la croissance de l’animal, le principal critère sera la perte de poids par rapport à la moyenne du groupe témoin. Ce paramètre intègre non seulement l’éventuelle perte de poids de l’animal, mais aussi le différentiel de gain de poids, pathologique pour les souriceaux et très jeunes souris. Peu après les injections, des diarrhées (spécialement si le signe est prolongé plusieurs jours) seront également considérés comme des points limites. Pour des animaux plus âgés, la perte de poids par rapport au poids initial ou au poids le plus élevé de l’animal sera considérée comme anormale. Enfin, des points critiques classiques tels qu’un poil hérissé, un dos rond, un abdomen distendu, une léthargie ou tout signe clinique jugé par un technicien expérimenté comme indiquant un état moribond sévère seront considérés comme des points limites. Afin de pouvoir suivre le poids des animaux dans le temps, les souriceaux de 3,5 jpp seront marqués avec un stylo chirurgicale en attendant qu'il soit assez grand pour qu'une pose de puces au transpondeur soit possible pour poursuivre le suivie des souris à l'âge adulte.

Devenir

Les animaux ne pouvant pas vivre après prélèvement chirurgical du tissu testiculaire sans traitement hormonal de substitution, ils seront euthanasiés en amont du prélèvement. Les femelles subissant un prélèvement de leurs ovocytes (post-stimulation ovarienne) seront euthanasiées en amont du prélèvement.

Remplacement

La technique de spermatogenèse in vitro complète permettant la génération de spermatozoïdes à partir de cellules souches germinales mâles (les spermatogonies) ne peut s'effectuer qu'à partir de tissus testiculaires vivants. La culture organotypique en interphase gaz-liquide d'explants testiculaires de souris permet d'obtenir des cellules haploïdes utilisables dans ce projet. Des techniques similaires se basant sur des organoïdes ou des cultures en 2D et 3D sont à l'étude mais (i) ces techniques ne sont pas encore au point et ne permettent pas d'obtenir des résultats similaires à ceux de la culture organotypique et (ii) elles utilisent des cellules issues de tissus testiculaire prépubères également.

Réduction

Nous utiliserons des tests paramétriques permettant d’obtenir des résultats exploitables à partir d’un petit nombre d’animaux. Nous limiterons ainsi le nombre de réplicas à n=6 souris par expériences. Tous les souriceaux mâles de chaque portée seront utilisés, quelle que soit la taille de la portée. Les tissus qui ne sont pas exploités le jour du prélèvement seront cryopréservés pour une mise en culture ultérieure. Le nombre d’animaux estimé sera revu à la baisse si nous nous apercevons qu’une molécule de chimiothérapie est trop délétère pour l’animal.

Raffinement

Les souris seront obtenues via reproductions au sein de notre Service de Ressources Biologiques ; limitant le stress lié à d’éventuels transports. Les souriceaux seront conservés auprès de leur mère jusqu’au prélèvement tissulaires à 6,5 jpp afin de ne pas perturber leur développement. Les animaux utilisés comme contrôles ou in vivo seront sevrés au bout de quatre à cinq semaines afin de limiter le nombre de souris par cage. Les animaux qui subiront un acte chirurgical seront anesthésiés avec un système d'anesthésie gazeuse diffusant 5% d’isoflurane dans un mélange protoxyde d’azote/oxygène (70%/30%) puis maintenu sous anesthésie avec 2% d’isofluorane. Vingt minutes avant l’opération, une injection de buprénorphine sera réalisée (Buprécare® 0.5 mg/kg ; IP) afin d’atténuer/limiter les douleurs de l’animal. Deux minutes avant incision, de la lidocaïne en gel sera appliquée pour atténuer la douleur. Des « points limites » (ou critère d’arrêt anticipé) seront observés quotidiennement, notamment sur les animaux post-chirurgie. Enfin, les données obtenues lors de ces expérimentations seront exploitées au mieux afin de donner des résultats scientifiquement exploitables de par la bonne prise en charge des animaux.

Choix des espèces

Actuellement, la spermatogenèse in vitro complète par culture organotypique en interphase gaz-liquide n’est réalisable que chez la souris. Nous réaliserons les injections des différents traitements à 3,5 jpp. Nous travaillerons à partir de tissu testiculaire pré pubère issu de souris mâles de 6,5 jpp de façon à pouvoir mettre en culture le tissu avant le début de la première vague de spermatogenèse. Les souris âgées de 6,5 et 36,5 jpp seront utilisées comme contrôles in vivo pour permettre la comparaison avec les tissus testiculaires en culture in vitro d’âges correspondants (tissus prélevés à 6,5 jpp + 30 jours de culture). Les femelles donneuses d’ovocytes seront utilisées à l’âge de 5 à 9 semaines (période à laquelle les souris répondent le mieux aux traitements hormonales de stimulation ovarienne). Les mâles donneurs de spermatozoïdes testiculaires seront utilisés comme témoin à l’âge de 36,5 jpp (âge correspondant aux tissus testiculaires après 30 jours de cultures). Les mâles donneurs de tissus testiculaires seront utilisés à l’âge de 6,5 jpp, de façon à ce que les tissus testiculaires pré pubères soient mis en culture avant le début de la première vague de spermatogenèse qui commence à 8 jpp. Les mâles vasectomisés seront utilisés dès leur puberté (environ 5 semaines). Les femelles Black Swiss pseudo-gestantes seront utilisées dès leur puberté (environ 7 semaines). Nous utiliserons des femelles Black-Swiss afin de s’assurer que l’embryon obtenu est bien le résultat de l’ICSI réalisée au préalable. L’ICSI sera réalisée à partir d’un ovocyte d’un spermatozoïde de souris CD-1 (blanche) afin d’obtenir un embryon qui sera par la suite implanté dans une souris Black Swiss (noire). Lors de la césarienne, si le souriceau obtenu est blanc, cela nous permettra de valider notre ICSI.

390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau pour une infection virale, avec ou sans implantation de fibres optiques, puis un isolement de quatre à cinq semaines et un test de peur conditionnée. Le porteur décrit un stress lié à l'isolement social et à la contention, et prévoit l'euthanasie pour des analyses d'électrophysiologie et d'histologie. Il affirme qu'aucune approche in silico ou en culture cellulaire ne peut se substituer à l'animal entier pour étudier la mémoire chez les mammifères.

Objectifs

La mémorisation des évènements passés nous permet de mieux réagir aux situations présentes. Elle permet notamment d’éviter les dangers et d’assurer la survie des individus, mais est également au cœur des phénomènes d’apprentissages. Sans surprise, les mécanismes fondamentaux de la mémoire sont théorisés et étudiés depuis plusieurs décennies par les neuroscientifiques, mais c’est seulement récemment que la démonstration expérimentale des conséquences physiologiques de l’expérience vécue et de sa rétention - la mémoire - sur le cerveau a été rendue possible par des approches optogénétiques. Il a notamment été montré que des groupes de neurones – les cellules constituant le cerveau et briques élémentaires de la cognition – dispersés dans diverses régions cérébrales étaient nécessaires et suffisants pour permettre l’encodage et le rappel de la mémoire. Ces groupes de neurones constituent l’engramme. L’objectif global de notre projet et de comprendre les processus d'encodage et de stockage de la mémoire, chez les mammifères en utilisant des outils de dernière génération permettant d’identifier et de manipuler les cellules de l’engramme. Nous voulons étudier les mécanismes cellulaires et synaptiques de la formation des cellules de l'engramme dans le cortex préfrontal du cerveau, une structure corticale impliquée dans les fonctions cognitives supérieures. Dans ce projet, Nous souhaitons valider les conditions d’utilisation de deux nouveaux outils moléculaires CaMPARI2 et Cal-light, afin de les utiliser pour cibler et manipuler les cellules de l'engramme dans le cortex préfrontal afin de pouvoir déchiffrer les mécanismes de la mémoire.

Bénéfices attendus

Notre objectif est la compréhension des mécanismes fondamentaux de la mémoire. Néanmoins, leur bonne connaissance nous permettra à terme de mieux comprendre les pathologies qui sont associées à des troubles de la mémoire, comme les maladies neurodégénératives - Alzheimer, Parkinson – ainsi que les pathologies génétiques liées aux déficits cognitifs.

Procédures

L’ensemble des animaux subiront une chirurgie pour infection virale (30min) avec ou sans implantation de fibres optiques (1h30). La pose d’implant et le test comportemental nécessite que les animaux soient placés en hébergement individuel pour une durée de 4-5 semaines suite à la chirurgie pour éviter le risque de perte d’implant dû à l’interaction avec ses congénères.

Impact sur les animaux

Les étapes de la chirurgie entrainant des effets indésirables sur les animaux :stress,douleurs post-opératoires. L’animal subit également un stress lié a la restriction de comportement social suite à l'isolement des animaux après la chirugie et le stress physique lié à des contentions et à la tache comportementale de peur conditionnée.

Devenir

L'ensemble des animaux est euthanasié à la fin de chaque procédure afin de réaliser des expériences d'électrophysiologie in vitro ou des études histologiques.

Remplacement

En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. L’utilisation de tests statistiques pour ces expériences nous permet d’estimer un nombre minimal de souris nécessaires pour satisfaire les conditions statistiques de significativité.

Raffinement

Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée (2/jours) dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux.Des critères de bien être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraine la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures de chirurgie sera décrit dans les procédures. La chirurgie est réalisée sous anesthésie .Un contrôle de la respiration et de l’absence de reflexe est vérifié faite par pression de pâte arrière afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal. sera effectué tout le long de la chirurgie. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable en sous cutané d’un anesthésique local. L’injection en sous cutané des analgésiques en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une seconde injection d'analgésique est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture analgésique pendant les 4-6 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous cutanée une injection quotidienne d’un anti inflammatoire non stéroïdien, jusqu’à disparition des signes de mal être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 à 16 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.