Rongeurs
Travaux pratiques de physiologie : « Suivi d’une anesthésie générale chez le rat mâle et femelle »
- Enseignement supérieur
325 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés la semaine suivante dans une autre séance de travaux pratiques. Chaque étudiant reçoit un rat, lui administre une injection intrapéritonéale d'anesthésique et évalue la profondeur de l'anesthésie, le risque décrit étant une surdose provoquant un arrêt cardio-respiratoire. Le projet sert la formation d'étudiants au suivi d'une anesthésie, dans le cadre d'un programme pédagogique national. Le porteur indique que la réutilisation dépendra de l'état clinique des animaux et de l'avis du vétérinaire.
Objectifs
Dans le cadre du programme pédagogique national de notre formation, les étudiants doivent acquérir différentes compétences, notamment celle de « mener des études à l’échelle du vivant ». En première année, l’acquisition de cette compétence doit se faire notamment lors d’un ensemble d’enseignements destinés à apprendre aux étudiants comment « Organiser et mettre en place une procédure d’expérimentation animale dans le cadre de la règlementation en vigueur ». C’est dans le cadre de ces enseignements que ce TP a lieu. Lors de ce TP, les étudiants réalisent une anesthésie chimique chez le rat et doivent évaluer la profondeur de l’anesthésie de leur animal à intervalles réguliers. Les objectifs pédagogiques de ces travaux pratiques sont donc de plusieurs ordres : - D’un point de vue pharmacologique : apprendre à reconnaître les signes cliniques permettant d’évaluer le temps d’induction d’une anesthésie, sa profondeur et sa durée d’action chez le rat. - D’un point de vue éthique : sensibiliser les étudiants à l’importance de la surveillance d’un animal anesthésié, à la détection et à la prise en compte des signes cliniques de l’anesthésie (fréquence respiratoire, réflexes cutanés) chez l’animal. De plus, une réflexion est menée par les étudiants en amont du TP sur le respect des 3 R dans ce protocole - D’un point de vue expérimental chez l’animal : former les étudiants à la préhension / contention du rat vigile et à la réalisation d’une injection intrapéritonéale (IP) chez le rat ; apprendre à observer les animaux anesthésiés ; savoir recueillir des données expérimentales de façon exhaustive afin de répondre à l’objectif de l’étude (sensibilisation à la nécessité de préparer une étude afin d’en tirer les résultats attendus sans avoir besoin de les reproduire).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’apprendre aux étudiants de 1ère année du BUT Génie Biologique option Biologie Médicale et Biotechnologie à réaliser des expérimentations in vivo de physiologie et pharmacologie. En effet, ce diplôme est réglementé au niveau national et le contenu des enseignements est défini selon un programme pédagogique national. Dans le cadre de ce programme, les étudiants doivent acquérir différentes compétences, notamment celle de « mener des études à l’échelle du vivant ». En première année, l’acquisition de cette compétence doit se faire notamment lors d’un ensemble d’enseignements destinés à apprendre aux étudiants comment « Organiser et mettre en place une procédure d’expérimentation animale dans le cadre de la règlementation en vigueur ». Ainsi ce TP s’inscrit parfaitement dans ce cadre et les bénéfices attendus pour les étudiants sont les suivants : - apprentissage de la manipulation du rat vigile : pesée, identification, préhension, contention et injection IP - apprentissage du déroulé d’une étude en pharmacologie in vivo : recueil de données et traçabilité, choix des paramètres à étudier afin de réaliser un suivi exhaustif des animaux, analyse et interprétation des résultats - mise en pratique des éléments vus en cours théoriques sur l’éthique en expérimentation animale, notamment mise en évidence des règles de bien-être animal au cours du TP. L’enseignant s’assure tout au long du TP du respect de l’éthique et interroge régulièrement les étudiants sur les éléments indispensables au respect du bien-être animal dans ce protocole. Enfin, ce TP permettra de sensibiliser les étudiants à la différence de réponse des mâles et des femelles face à ce mélange anesthésique / analgésique et donc de la nécessité d'adapter les doses des molécules.
Procédures
Les animaux recevront une injection intrapéritonéale unique d'un mélange anesthésique / analgésique. La profondeur de l'anesthésie sera évaluée pendant toute la durée de celle-ci. A ces doses, une anesthésie d'environ 40 minutes est attendue chez les mâles et 60-70 min chez les femelles. Aucune autre intervention ne sera réalisée sur les animaux lors de cette séance de TP.
Impact sur les animaux
Tout d'abord, la contention et la manipulation des rats entrainent du stress chez les animaux, les injections par voie intrapéritonéale engendre une légère douleur au site d’injection. Un effet indésirable possible pour le rat est la surdose d'anesthésique, qui peut provoquer un arrêt cardio-respiratoire de l'animal dans les 5 minutes suivant l’administration des molécules.
Devenir
Tous les animaux seront réutilisés la semaine suivante dans un TP de pharmacologie (procédure légère). Les responsables du projet ont soumis cette possibilité préalablement auprès de la Structure en charge du Bien-Etre Animal, dont leur établissement dépend. Cette dernière leur a envoyé un avis de principe favorable au regard des procédures prévues dans les 2 protocoles, mais la réutilisation dépendra de l'état clinique des animaux au moment de la réutilisation et donc de l'avis du vétérinaire référent.
Remplacement
Dans le cadre de la formation de nos étudiants, le programme pédagogique national prévoit, dans la compétence « mener des études à l’échelle du vivant » que les étudiants apprennent à « Organiser et mettre en place une procédure d’expérimentation animale dans le cadre de la règlementation en vigueur ». C’est dans le cadre de ces enseignements que ce TP aura lieu. Ce TP doit permettre d’une part d’évaluer in vivo les effets des molécules étudiées (anesthésiques) et d’autre part l’apprentissage par nos étudiants de la technique d’administration IP chez l’animal vigile. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de remplacement permettant une formation appropriée de nos étudiants tant sur le plan technique (manipulation de l’animal vigile, administration des substances chez l’animal vigile…) que sur le plan pharmacologique (observation des effets induits par les substances étudiées, pratique des méthodes d'évaluation des effets). Toutefois, afin de favoriser l'apprentissage des étudiants et d'éviter d'intégrer des animaux d'entraînement, des vidéos présentant la réalisation des gestes techniques (préhension, contention, injection IP) leur seront présentées. De plus, les étudiants pourront au cours du TP s'entraîner à réaliser les injections en manipulant des seringues/aiguilles dédiées sur un support inerte (éponge).
Réduction
Les étudiants seront répartis par binôme, mais chaque étudiant aura la responsabilité du traitement et du suivi de son propre animal. Chaque promotion comporte au maximum 56 étudiants, avec 1 rat par étudiant. La promotion est répartie en groupes de 14 étudiants et les TP ont donc lieu sur 4 séances (1 séance par groupe d’étudiants). Chaque séance est encadrée par un enseignant et un rat de démonstration sera nécessaire pour chaque séance. Cinq rats supplémentaires seront également prévus chaque année en cas de soucis lors des TP (rat dont l’état de santé ne permet pas l’intégration au protocole expérimental par exemple). Ainsi 56+4+5=65 rats seront nécessaires pour un an pour 56 étudiants et 65*5= 325 rats sur 5 ans pour 280 étudiants. Ces chiffres seront évidemment revus à la baisse si le nombre d’étudiants est inférieur à 56 par promotion. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans notre établissement, ces rats seront également réutilisés la semaine suivante dans le cadre d'un autre TP, réalisé par les étudiants de 2ème année: cette réutilisation a été validée prélablement par la Structure chargée du Bien-Être Animal. Enfin, les animaux proviendront de notre propre élevage et afin d’éviter au maximum les animaux surnuméraires, des mâles et des femelles seront indifféremment utilisés pour ces TP, tout en respectant l’attribution d’animaux d’un même sexe par séance de TP. Afin de garantir un apprentissage de qualité à nos étudiants, il n’est pas possible de diminuer plus le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes socialement harmonieux et en présence d’un enrichissement comprenant 2 éléments (tunnel en plastique noir et bâtonnet en bois ou noix à ronger), dont une rotation sera réalisée au cours de l'hébergement. Tout animal stressé ou malade (poils hérissés, prostration…) ou qui n'aura pas pris de poids par rapport à la semaine précédente (comme attendu aux vues de l'âge des animaux) sera exclu du protocole. Les animaux anesthésiés seront réchauffés grâce à une lampe et leurs yeux seront protégés grâce à l’application d'un collyre lubrifiant et hydratant. Préalablement aux séances de TP, les animaux seront habitués à la préhension et à la contention dans le but de limiter leur stress lors de leur utilisation par les étudiants et seront récompensés après chaque acte en amont et pendant le protocole. De plus afin de limiter le stress des animaux, les étudiants seront sensibilisés au fait de rester calmes et de ne pas être bruyants lors des séances de TP impliquant l’utilisation des animaux. Pendant le protocole, les animaux seront soumis à une anesthésie/analgésie, la composante analgésique étant apportée par l'une des molécules présentes dans le mélange anesthésique. Pour limiter tout risque de surréaction chez les femelles, plus sensibles aux molécules anesthésiques/analgésiques que les mâles, celles-ci recevront une dose adaptée à leur sexe et seront utilisées lors des séances de TP ayant lieu l'après-midi, car les rats sont plus sensibles le matin à ces molécules. En cas de signes de détresse cardio-respiratoire, les enseignants effectueront un massage cardiaque et procéderont à la mise à mort de l'animal par injection de produit dédié si ce massage s'avère insuffisant. Cependant ceci ne devrait pas se produire aux doses utilisées de produits anesthésiques/analgésiques. Enfin, toujours pour diminuer le stress des rats après le protocole, la répartition des animaux dans leur cage d’hébergement initial sera conservée jusqu'au protocole suivant.
Choix des espèces
Le rat est une des principales espèces utilisées en recherche et notamment en physiologie et pharmacologie. Il est donc nécessaire que nos étudiants soient formés à la manipulation et à l’observation des rats. De plus, sa taille permet une surveillance aisée de l’animal lors de l’anesthésie, notamment pour différencier les respirations thoraciques et abdominales, ce qui fait du rat, un animal de choix d'autant plus pour une première formation à des étudiants. Les animaux utilisés auront entre 5 et 7 semaines. Etant donné qu’il s’agit du premier TP avec des rats in vivo réalisé par nos étudiants, utiliser des animaux relativement jeunes, de petite taille, permettra de diminuer leur appréhension et donc le stress ressenti par les animaux.
Thérapie ciblée des maladies chroniques du foie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
946 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose du foie est induite par chirurgie, puis les animaux reçoivent des injections de vecteurs de thérapie génique et des séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie, avant prélèvement terminal du foie entier. Le porteur affirme que le ciblage d'un organe par un vecteur injecté dans la circulation n'est pas modélisable in vitro. Les applications thérapeutiques chez l'humain restent annoncées comme précliniques et lointaines.
Objectifs
Les maladies du foie, de causes très variées (excès de gras, alcool, virus, médicaments, atteinte biliaire, génétique etc), sont un enjeu majeur de santé publique. Elles mènent à la cirrhose qui est la 14ème cause de mort dans le monde et au cancer du foie, 3ème cause mondiale de décès par cancer. Quelle que soit l’origine de la maladie, un tissu cicatriciel excessif responsable de la maladie est fabriqué par des cellules appelées « myofibroblastes ». En même temps, les cellules assurant les principales fonctions du foie appelées « hépatocytes » meurent. De nombreux traitement ont été proposés mais jusqu’à présent aucun ne s’est montré satisfaisant par manque d’efficacité de ciblage sécurisé d’un type cellulaire présent dans le foie et l’apparition d’effets secondaires indésirables (ex : l’élimination de cellules saines en même temps que les cellules pathogéniques). Ce projet vise à développer et tester l’efficacité préclinique d’un vecteur de thérapie génique permettant l’élimination spécifique des myofibroblastes rendant le foie malade quelle que soit l’origine de la maladie, et d’un vecteur de thérapie génique protégeant les hépatocytes de la mort au cours des maladies chroniques du foie.
Bénéfices attendus
Il n’existe aucun traitement curatif des maladies chroniques du foie. Ce projet comprend des études précliniques de validation de vecteurs de thérapie génique ciblée pour les maladies chroniques du foie chez les animaux en vue d’application clinique thérapeutique chez l’humain.
Procédures
Des souris auront une intervention chirurgicale unique et terminale, sous anesthésie générale et sous analgésique (10 min). Des souris subiront une opération chirurgicale d’environ 15min sous anesthésie générale et sous analgésique. 15 jours après ces souris auront une intervention chirurgicale terminale, sous anesthésie générale et sous analgésique (10 min). Des souris recevront une injection (5min). Une partie d’entre elles recevront une deuxième injection 1 à 3 semaines après (5 min). 1 fois par semaine, pendant 2 mois maximum, ces souris seront soumises, en même temps, à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie. Des souris seront opérées chirurgicalement (environ 15min) sous anesthésie et sous analgésique. Ces souris recevront deux injections à 1 semaine d’intervalle en 5min. 1 fois par semaine pendant 2 semaines, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie. Des souris seront nourries avec un régime particulier pendant 16 semaines maximum et recevront deux injections à 1 à 3 semaines d’intervalle (5min/acte). 1 fois par semaine pendant 8 semaines maximum, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie générale. Des souris seront injectées 2 à 3 fois par semaine pendant 12 semaines (5min). 1 fois par semaine pendant 6 semaines, sous anesthésie, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin.
Impact sur les animaux
Pour induire la fibrose du foie, un des modèles expérimentaux est chirurgical (15 minutes par intervention). Une perte de poids post-opératoire, des infections ou des ruptures de sutures pourraient survenir. Plusieurs actes seront pratiqués sous anesthésie (10 minutes environ par intervention) pouvant induire des nuisances comme le risque d’arrêt cardio-respiratoire, l’hypothermie et la perte de repère transitoire au moment du réveil. Des nuisances peuvent également être induites par les prélèvements sanguins et les injections comme un stress émotionnel de courte durée (5min maximum par acte) liés à la contention et la douleur de l’introduction de l’aiguille ou des saignements et irritations. Les régimes alimentaires ou le produit injectable utilisés pour induire une fibrose hépatique aux animaux entrainent une perte de poids pendant les 3 premières semaines qui se stabilise ensuite. Un des modèles de fibrose nécessite l’utilisation de souris transgéniques développant spontanément une fibrose hépatique qui reste asymptomatique jusqu’à l’âge de 12 mois. Dans ce projet ces souris seront maintenues jusqu’à l’âge de 4 mois maximum.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux de toutes les procédures est nécessaire pour pouvoir isoler les cellules du foie, évaluer la maladie du foie et pour valider le ciblage cellule spécifique des vecteurs de thérapie génique. Le prélèvement du foie entier ne permet pas la survie des animaux.
Remplacement
Les maladies du foie reposent sur de multiples interactions dans l’organisme entier entre les processus de régénération, d'inflammation, de vascularisation et de cicatrisation impliquant le support des autres organes du corps et n’est pas modélisable in vitro. Le ciblage spécifique d'un organe par rapport à un autre via l’injection d’un vecteur génique dans la circulation sanguine et l’étude de sa répartition corporelle n’est pas modélisable in vitro. De même, le ciblage spécifique d’un sous type cellulaire du foie par rapport aux autres cellules du foie nécessite d’étudier l’organe en entier. Aucun modèle 3D in vitro du foie ne reproduit actuellement la réelle complexité cellulaire du foie ni sa structure. Enfin, Il n’existe pas de lignées cellulaires proche de la physiologie réelle du foie. Pour étudier les signatures cellulaires saines ou malades dans l’organe entier, nous serons donc contraints d’utiliser des cellules primaires dont la survie est limitée en culture et qui ne peuvent être obtenues qu’à partir du foie des souris. Ainsi, pour développer cliniquement une thérapie génique ciblée, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire
Réduction
A cause des variabilités entre animaux et des risques d’échec des procédures, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Le nombre d’animaux utilisés pour le projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre notre objectif scientifique. Le nombre d’animaux a été évalué à 948 maximum. Les tests in vitro seront réalisés sur des cellules primaires mais qui ne peuvent être maintenues à long terme après isolement. Pour les types cellulaires qui le permettent, une amplification sera réalisée en culture. Afin de réduire le nombre d’animaux, un seul modèle de fibrose sera utilisé pour réaliser les expériences in vitro. Autant que faire se peut, nous nous efforcerons d’isoler plusieurs types cellulaires à partir des mêmes animaux. Le nombre de candidats vecteurs sera réduit progressivement de 10 vecteurs à 1 au cours des procédures réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Grâce aux prélèvements sanguins et au suivi du transgène fluorescent qui nous permettent d’observer dans le temps la pathologie et l’expression de notre vecteur au cours des expérimentations, 1 seul temps d’euthanasie est nécessaire. Ceci permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans cette étude.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats scientifiques dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les animaux seront anesthésiés pour chacune des procédures et un analgésique sera administré en per et/ou post opératoire pour éviter toute souffrance liée à l’intervention chirurgicale. Au cours des chirurgies, les souris seront placées sur une plaque chauffante pendant et après l’opération, jusqu’au réveil total, et leurs yeux seront protégés au cours de l’anesthésie. Au cours des expériences impliquant le produit médicamenteux induisant la fibrose, aucun analgésique ne sera administré en même temps aux souris afin d’éviter toute surdose et une insuffisance hépatique. Dans le cas des injections répétées, plusieurs sites d’injection seront alternés au cours des procédures pour éviter une irritation locale et diminuer le risque d’ascite. Des points limites ont été définis suivant une grille d'évaluation établie sur l’apparence physique, le poids et le comportement animal, adaptés à chaque procédure. Si l’animal atteint un point limite il sera soulagé par l’administration d’un analgésique et si les symptômes persistent où sont trop sévères, l'animal sera euthanasié. Les prélèvements sanguins et l’imagerie médicale réalisés au cours des procédures permettent également de surveiller précisément toutes déclarations de symptômes. Les souris seront prises en charge par du personnel qualifié et entrainé aux procédures, et examinées quotidiennement. Les animaux seront hébergés 7 jours avant le début des procédures jusqu’à l’euthanasie en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles dans un environnement enrichi favorisant les comportements exploratoires et réduisant ainsi le stress. Les animaux seront hébergés dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Au cours des 7 jours d’hébergement avant procédure, les souris s’adapteront à leur nouvel environnement et un contact sera mis en place afin de les habituer aux manipulations et ainsi réduire leur stress au cours des procédures. Les personnes non formées agiront en tant qu’observateurs et toujours accompagnés par un membre formé.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris, dans la littérature est la plus référencée pour les modèles de maladies hépatiques notamment pour leur grande reproductibilité et leur capacité à développer une pathologie très proche de l’homme. De plus la souris possède une vésicule biliaire tandis que le rat n’en possède pas. Or la vésicule biliaire possède un rôle dans la régénération du foie et son absence au cours des modèles biliaires pourrait biaiser les résultats. La fibrose hépatique est un processus insidieux et indolore pouvant mettre plusieurs années à se déclarer chez l’humain adulte. Chez la souris elle est également asymptomatique et peut prendre jusqu’à 3 mois pour s’installer en fonction des modèles. Dans ce projet, les souris utilisées seront donc de jeune adulte de 8 à 10 semaines afin de participer à des procédures pouvant durer plusieurs mois sans être affectées par un vieillissement avancé.
Rôle du facteur de transcription MAF dans la production d’anticorps chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal subit sous anesthésie des prélèvements de sang et des injections d'un agent immunisant, avant d'être tué pour prélever sang et tissus, afin d'étudier le rôle du facteur MAF dans la production d'anticorps par les lymphocytes B. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace l'animal pour valider ces observations in vivo. Les bénéfices évoqués, traitements des maladies auto-immunes ou amélioration de la vaccination, restent renvoyés au conditionnel.
Objectifs
La protéine sur laquelle nous travaillons possède la capacité de modifier l'expression des gènes, soit en les diminuant ou en les augmentant. Cette protéine joue un rôle important dans le développement et le bon fonctionnement de nombreux organes et tissus de notre corps. Elle participe à des processus comme la croissance cellulaire, la formation du système nerveux et la régulation du système immunitaire. Nous avons émis l'hypothèse que cette protéine pourrait contrôler la capacité des lymphocytes B (LB) à produire des anticorps qui sont indispensables pour une réponse immunitaire optimale. La production d’anticorps par les LB est en effet un des moyens essentiels pour le système immunitaire d’assurer son rôle de défense contre les pathogènes extérieurs (bactériens ou viraux) mais également d’assurer l’immuno-surveillance permettant d’éliminer les cellules cancéreuses. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer le rôle de cette protéine dans la réponse physiologique des LB et plus particulièrement sur leur capacité à produire des anticorps suite à différentes vaccinations. Pour ce faire nous utiliserons une lignée de souris transgénique pour laquelle le gène codant pour la protéine d'interêt a été spécifiquement supprimé des LB. Notre objectif est d'évaluer l'impact de l'absence de la protéine sur la capacité des animaux à développer des anticorps et donc une réponse immunitaire compétente, ceci par comparaison avec un groupe contrôle pour lequel la protéine n'a pas été enlevée. Ceci nous apportera des éléments de compréhension sur les mécanismes qui permettent au corps de produire des anticorps et donc de nous défendre contre les agents infectieux.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons mieux comprendre le développement des cellules B du système immunitaire qui produisent les anticorps afin de pouvoir produire de nouveaux traitements pour les patients. Deux bénéfices sont susceptibles d’en découler, soit éliminer les effets néfastes des anticorps produits dans les maladies auto-immunes pour lesquelles il n’existe pas de traitements curatifs et /ou améliorer la vaccination contre les infections virales et bactériennes comme face à la pandémie de COVID19. Ce projet s'inscrit dans un objectif d'augmenter les connaissances sur la production d'anticorps.
Procédures
Tous animaux seront soumis à des anesthésies pour toutes les interventions afin de diminuer le stress. Les animaux anesthésiés auront au maximum : deux prélèvements de sang de moins de 2 minutes espacés de 5 jours, deux injections d'agent immunisant, geste durant moins de 1 minute à 90 jours d'intervalle et certains pourront avoir une injection d'agent traceur, geste durant moins de 1 minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour les animaux sont : (1) du stress lors des anesthésies (2) au reveil de l'animal, les injections peuvent causer une légère douleur d'une durée de 1 à 3h, au point d’entrée de l’aiguille (3) les prélèvements sanguins réalisés peuvent entraîner une anémie et déshydratation transitoires d'une durée de 2 à 6 heures (4) une douleur légère et un gonflement transitoire peuvent être observés au point de prélèvement sanguin, persistant en moyenne moins d'une heure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever le sang et les tissus d'intérêt.
Remplacement
Les observations initiales réalisées sur des cellules humaines peuvent donner des informations précieuses, mais la validation in vivo de ces observations nécessite l'utilisation de modèles animaux. À l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode alternative qui puisse totalement remplacer l'utilisation d'animaux pour étudier comment les molécules agissent sur des processus complexes dans notre corps, comme la réponse immunitaire.
Réduction
Nos analyses seront basées sur des tests statistiques de comparaison des moyennes entre le groupe expérimental et le groupe contrôle, dans le cas d’échantillons indépendants. Un calcul des effectifs a été réalisé nous appuyant sur les données de la littérature. Pour un risque d’erreur de 5%, une puissance du test statistique de 90%, et compte tenu des différents écarts types estimés, les tailles d’échantillons calculées varient entre 40 et 60 individus au total par protocole expérimental (20 ou 30 animaux par groupe).
Raffinement
Nous avons optimisé nos procédures en définissant des points limites permettant d’identifier le moment à partir duquel la souffrance et /ou la détresse de l’animal doit être arrêtée. Un tableau de suivi de soin sera complété pour chaque individu inclut dans les procédures adaptant la réponse et les points limites au regard de la souffrance de l'animal. Le stress des procédures sera limité par l'utilisation d'anesthésie et d'analgésie lors des étapes de prélèvement de sang ainsi que lors des étapes d'injection.
Choix des espèces
Nous utilisons des modèles transgéniques pour lesquels certains gènes ont été modifiés et qui ne sont disponibles que chez cette espèce. Les animaux seront utilisés entre 6 et 14 semaines car c'est dans cette intervalle que les animaux sont à pleine maturité sexuelle et que leur réponse immunitaire est maximale.
EVALUATION DE L’ACTIVITE ANTI-TUMORALE D’UN COMPOSE CHEZ LA SOURIS IMMUNCOMPETENTE OU IMMUNODEPRIMEE PORTEUSE DE CELLULES CANCEREUSES IMPLANTEES PAR VOIE INTRAVEINEUSE
- Recherche appliquée
- Cancers
Une partie des souris est immunodéprimée et vit dans un secteur confiné, aux règles d'accès strictes, pour prévenir les infections, les autres étant immunocompétentes. 1 980 souris vont être utilisées, la déclaration en comptant 60 en souffrance légère et 1 920 en souffrance modérée. Les souris greffées reçoivent par la veine, éveillées, des cellules cancéreuses laissées se développer jusqu'à 120 jours, et des candidats médicaments jusqu'à deux fois par jour, par injection ou par la bouche, avec pour certaines un suivi en bioluminescence sous anesthésie deux à trois fois par semaine et jusqu'à six prises de sang en 24 heures. Cinq souris témoins non greffées par étude d'imagerie pourront être réutilisées dans un autre projet consacré à l'entraînement des expérimentateurs, la déclaration en comptant 60, et les autres seront tuées en fin d'étude ou à l'atteinte d'un point limite, pour vérifier l'envahissement tumoral dans leurs organes.
Objectifs
Le cancer est une maladie complexe qui peut prendre des formes extrêmement variées en fonction des organes et des tissus affectés. Les cellules cancéreuses sont initialement des cellules normales ayant acquis, au cours du temps, un certain nombre de caractéristiques faisant qu’elles ne répondent plus au système de régulation de l’organisme. Celles-ci prolifèrent indéfiniment soit en formant une tumeur maligne et/ou des métastases dans un organe, on parle de tumeurs solides, soit en circulant dans le sang ou la lymphe, on parle de tumeurs liquides tels que les cancers hématologiques (lymphome hodgkinien ou non hodgkinien, leucémie lymphoblastiques ou myéloblastiques…). Il est donc primordial de développer de nouvelles thérapies innovantes ciblant ces cellules cancéreuses et ces métastases tout en limitant les effets secondaires sur l’organisme. Les phases d'étude et de développement des nouveaux composés sont validées dans un premier temps par des tests in vitro sur des cellules en culture, mimant artificiellement la pathologie de l’homme. Grâce à ces tests in vitro, des molécules actives sont sélectionnées avant d’être testées, en seconde intention, dans des modèles in vivo de souris porteuses de tumeurs afin de démontrer leur activité et leur efficacité anti-tumorale. C’est en effet dans un organisme vivant complet que l’on peut mesurer les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris. En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique et ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. L’objectif de ce projet est de sélectionner le meilleur candidat médicament et de déterminer son indication thérapeutique, dans différents types de cancers « non solides » ou dans des métastases, en monothérapie ou en combinaison avec d’autres molécules pour son développement clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en oncologie. Les bénéfices attendus du projet sont de sélectionner le meilleur candidat médicament et de déterminer son indication thérapeutique, dans différents types de cancers « non solides » ou dans des métastases, en monothérapie ou en combinaison avec d’autres molécules pour son développement clinique.
Procédures
Injection en intraveineuse de cellules tumorales une seule fois sur animal vigile (contention d’une durée maximale de 30s) suivie d'une progression tumorale (maximum 120 jours sauf en cas de point limite). Traitement intra-péritonéal ou per-os ou intraveineuse ou sous cutanée de traitements candidats (entité biologique ou chimique), (contention d’une durée maximale de 15s quotidienne ou biquotidienne ) sur 120 jours maximum. Pour les groupes suivis par imagerie , injection de l'agent substrat nécéssaire aux mesures par bioluminescence, 2 à 3 fois par semaine (contention d’une durée maximale de 15s maximum 2 fois par semaine sur 120 jours maximum). En cours d'étude, des prélèvements sanguins (moins de 30 secondes) avec un maximum de 6 prélèvements de sang sur 24 h peuvent être réalisés sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Une potentielle source de stress ou de douleur peut provenir : •De la greffe de cellules tumorales par voie intraveineuse. La contention (d’une durée maximale de 30s) peut générer du stress ainsi qu’une douleur légère à l’injection (moins d’une minute). De la progression tumorale liée au modèle pathologique recherché : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress ainsi qu’une douleur légère à l’injection (moins de 10s)•De l’injection en intra-péritonéale de l'agent substrat nécessaire aux mesures d’imagerie par bioluminescence. •De l’administration des traitements candidats (entité biologique ou chimique) en intra-péritonéal ou Per-os, sous cutanée ou en intraveineuse : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress ainsi qu’une douleur légère à l’administration (max de 10 s) • Pour les prélèvements de sang, il est nécessaire de tondre les pattes arrière de l’animal. - Du prélèvement de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress. - De l’induction de l’anesthésie (gazeuse) pour la mesure d’imagerie. l’induction qui est rapide peut générer du stress
Devenir
Les 5 souris contrôle négatif de chaque étude mettant en eouvre de l'imagerie (correspondant à des souris non greffées non traitées par l’agent biologique ou chimique) pourront être réutilisées à l'issue de ce projet dans le cadre d'un autre projet autorisé dédié à l'entrainement des expérimentateurs. Les autres souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude et les organes et le sang pourront être prélevés afin de vérifier l’envahissement tumoral et/ou métastatique via des analyses qualitatives.
Remplacement
Aujourd’hui, de plus en plus de tests in silico et in vitro sont mis en place pour caractériser autant que possible les candidats médicaments, de façon à n’investiguer in vivo que les meilleurs candidats issus de ces sélections. Ce projet est mis en œuvre après la validation in vitro des différentes nouvelles entités biologiques et chimiques. L’absence d’efficacité in vitro ne permet pas de justifier l’utilisation d’un modèle animal par conséquent ce projet s’inscrit en dernier lieu dans le processus de recherche d’un candidat médicament. C’est seulement sur la base de ces données que les études d’efficacité antitumorale sont ensuite réalisées : uniquement les candidats les plus prometteurs vont être testés, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Cependant, cette étape chez l’animal reste aujourd’hui encore indispensable : en effet, même avec les limitations inévitablement liées à n’importe quel modèle, c’est dans un organisme vivant complet que l’on peut vraiment étudier les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Son comportement dans un système complexe est plus relevant d’un point de vue physiologique.
Réduction
Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée tumorale à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié. Une collaboration avec le service bio-statistiques permet de consolider le design expérimental et l’effectif nécessaire par groupe, en intégrant de nombreux éléments comme l’influence environnementale, la répartition des points de cinétique, l’historique des données du modèle notamment sur les groupes véhicules des anciennes études, … Les doses de composé à administrer, définies au préalable dans un autre projet, sont non toxiques. La méthode de prélèvement sanguin par microsampling est privilégiée chaque fois que possible (puisqu’elle est extrêmement rapide, et réalisable plusieurs fois sur un même individu dans la limite des recommandations de la Structure du Bien Être Animal) L’imagerie optique est une technique non invasive de plus en plus utilisée en recherche qui permet d’évaluer la dissémination cancéreuse en temps réel sans nécessiter l’euthanasie de souris à chaque mesure.réduisant considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. Chaque souris est son propre témoin. A noter que si les méthodes de détection des cellules tumorales dans le sang prélevé par microsampling dans le cadre du projet préalable de mise au point des conditions de greffe tumorale sont validées et corrélées avec l’envahissement tumoral réel, alors cette méthode pourra permettre d’effectuer cette cinétique sur un même animal et réduira donc également considérablement le nombre d’animaux utilisés par rapport à celui théorique dans ce projet.
Raffinement
Les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. Les études de pharmacocinétique (PK) réalisées en amont de l’étude pharmacologique permettent d’optimiser la dose à utiliser pour pouvoir avoir la meilleur exposition dans le modèle pharmacologique vivo. Des prélèvements de sang microsampling à la veine saphène latérale peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant dans ce cas les études de pharmacocinétique dédiées) et pour exploiter au mieux les données d’activité antitumorale. Cette technique de prélèvement, peu invasive et rapide, permet de prélever plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémie physiologiques. Si des prélèvements répétés sont prévus, le volume maximal prélevé respectera les recommandations en termes de bien-etre animal et respect de sa physiologie. L’imagerie optique est une technique non invasive de plus en plus utilisée en recherche qui permet d’évaluer la dissémination cancéreuse en temps réel sans nécessiter l’euthanasie de souris à chaque mesure. La mesure du poids corporel et le suivi du développement tumoral en imagerie seront effectués 2 à 3 fois/semaine, sous anesthésie gazeuse, sur une surface plane et thermostatée. Une surveillance accrue sera réalisée si les souris présentent un fort signal de bioluminescence couplé à une perte de poids ou tout autre signe d’altération de l’état général et des points limites spécifiques seront mis en place. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants, et ce afin de prévenir tout risque d’infection et/ou contaminat ion. Les souris sont hébergées en groupes sociaux. Un enrichissement de milieu par des éléments de nidification adaptés vont également permettre de surveiller leur état général par l’observation de leur comportement vis-à-vis de ces éléments.
Choix des espèces
En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. Le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle le plus couramment utilisé pour ce type de recherche en immuno-oncologie. Le choix du modèle est dicté par le type d’anti-cancéreux étudiés (souris immunocompétentes et/ou immunodéprimées) et le choix de la souche par les études de dissémination tumorale qui permettent de définir les conditions optimales de greffe. Dans la mesure du possible, la souche est conservée pour l’ensemble des études in vivo pour un modèle tumoral donné (DMA/DMT, pharmacocinétique, pharmacodynamie, efficacité). En effet, il peut exister des différences importantes en termes de tolérance et d’exposition plasmatique d’un produit fonction de la souche murine considérée, pouvant impacter les résultats. Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines en début d’expérimentation. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement nous essayerons dans la mesure du possible de ne pas excéder 6 mois d’âge à la fin des études.
Évaluation des effets radio-protecteurs préventifs et thérapeutiques de médicaments candidats sur l’amélioration du syndrome d’irradiation aiguë survenant après une exposition à fortes doses de rayonnements ionisants.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 962 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la déclaration en comptant 201 en souffrance légère, 1 024 en souffrance modérée et 1 737 en souffrance sévère. Pour l'étude de la moelle osseuse, elles sont irradiées sur tout le corps, gavées jusqu'à quatre fois, pesées tous les un à deux jours et soumises à une prise de sang chaque semaine pendant 30 jours, jusqu'à 29 gestes par souris. Pour l'étude de l'intestin, l'irradiation vise l'abdomen, sous anesthésie gazeuse. Le porteur suit leur survie sur 30 jours et attend une perte de poids, une anémie, une prostration, une déshydratation ou une septicémie, pour tester des molécules à donner avant ou après une exposition à de fortes doses, lors d'un accident ou d'une attaque nucléaire. Il justifie le choix de ces rongeurs par un précédent : "Le modèle rongeur est pertinent car il a été utilisé dans de nombreuses études précliniques dans le cadre d'une irradiation."
Objectifs
Les individus exposés dans un laps de temps très court (quelques minutes) à une forte dose d’irradiation, provoquée par exemple par un accident dans une centrale nucléaire ou lors d’une attaque nucléaire dans un contexte conflictuel, vont souffrir d’un syndrome d’irradiation aiguë (SIA) avec pronostic vital engagé. A l’heure actuelle, les traitements curatifs sont très invasifs (greffes de moelle osseuse) ou inexistants. Certains médicaments peuvent néanmoins soulager les symptômes (traitement des diarrhées et vomissements) ou prévenir les éventuelles infections, mais le pronostic vital reste sombre. C’est dans ce contexte que nous proposons un projet d’étude pré-clinique chez la souris, dans le but de démontrer l’efficacité de plusieurs molécules dans le traitement du syndrome d’irradiation aiguë. Le SIA est le nom donné à une combinaison de trois syndromes : hématopoïétique (affectant la moelle osseuse), gastro-intestinal et neurovasculaire. Dans ce projet, nous nous intéresserons uniquement aux syndromes hématopoïétique et gastro-intestinal. L’effet protecteur ou curatif de ces molécules sera évalué sur la capacité de deux tissus très sensibles aux irradiations après exposition à se reconstituer plus ou moins rapidement : le tissu hématopoïétique (moelle osseuse) et l’intestin grêle. Ceux-ci se renouvellent constamment tout au long de la vie d’un individu et l’impact d’une irradiation sur leur fonctionnement est donc majeur pour la survie de chaque individu. En effet, la moelle osseuse contient les cellules souches hématopoïétiques responsables de la production et du renouvellement des cellules sanguines tout au long de la vie. De même, l’intestin grêle contient des cellules souches permettant le renouvellement tous les 4 à 5 jours des cellules intestinales qui constituent une barrière imperméable dont le rôle majeur est d’empêcher les bactéries du microbiote de passer dans la circulation sanguine. Il est donc primordial de préserver ces deux tissus des effets néfastes d’une irradiation. Nous nous attendons à ce que l’administration de ces molécules avant (effet préventif) ou après (effet curatif) une forte dose d’irradiation améliore l’état général, mais également la survie des animaux. Le modèle rongeur est pertinent car il a été utilisé dans de nombreuses études précliniques dans le cadre d’une irradiation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de révéler si le traitement des animaux avec les molécules d’intérêt, administrées avant ou après irradiation, (1) améliore leur survie, (2) diminue les effets indésirables associés à l’irradiation, (3) permet une récupération plus rapide de l’état général des souris grâce à une accélération de la régénération des tissus lésés (moelle osseuse et intestin grêle). Des bénéfices sur la population humaine sont susceptibles de découler de ce projet, comme : - une prise en charge immédiate des personnes ayant été exposées à de fortes doses d’irradiation ionisante avec l’administration rapide d’un traitement permettant un meilleur pronostic vital et une meilleure récupération hématopoïétique et intestinale (exemple : après un accident ou une attaque nucléaire). - la possibilité d’administrer préventivement une molécule qui protégerait les personnes susceptibles d’être exposées à de fortes doses d’irradiation (exemples : les militaires, la population civile avec risque d’exposition). Ce projet a donc un intérêt clinique majeur car les traitements curatifs actuels sont inexistants et/ou inapplicables à grande échelle. En effet, actuellement, -la prise en charge des patients souffrant d’une atteinte sévère du tissu hématopoïétique nécessite des traitements invasifs et coûteux, non généralisables à grande échelle (greffe de moelle osseuse) et présentant de nombreux inconvénients (recherche d’un donneur compatible, traitement immunosuppresseur à vie, risque de rejet). -la prise en charge des patients souffrant d’une atteinte gastro-intestinale sévère repose uniquement sur des traitements symptomatiques (antibiotiques, anti-diarrhéiques et antiémétiques). Il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif.
Procédures
Dans l’étude du syndrome hématopoïétique induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : -1 tatouage (1 minute) -1 irradiation corps entier (durée < 10 minutes) -gavages avec de l’eau ou avec la molécule à tester (4 maximum d’une durée de 2 minutes) -des pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (16 x 30 secondes) -prélèvements de sang 1 fois/semaine sur une durée de 30 jours (4 maximum de 3 minutes), puis un prélèvement de sang juste avant la mise à mort, sous anesthésie gazeuse avec analgésie (35 min en comptant l’effet de l’analgésie et de l’anesthésie). -1 à 2 injections sous-cutanées (2 maximum de 1 minute) -1 injection intra-péritonéale (1 minute) Les souris subiront au maximum 29 gestes techniques sur 30 jours. Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : -1 tatouage (1 minute) -1 irradiation locale au niveau abdominal, sous anesthésie gazeuse (durée < 10 minutes) -1 gavage avec de l’eau ou avec la molécule à tester (2 minutes) -des pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (16 x 30 secondes) -1 prélèvement de sang juste avant la mise à mort, sous anesthésie gazeuse avec analgésie (35 min en comptant l’effet de l’analgésie et de l’anesthésie). -2 injections sous-cutanées (2 x 1 minute). Les souris subiront au maximum 22 gestes techniques sur 30 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont une perte de poids, une anémie, une prostration, de la déshydratation, ou une septicémie. Un stress est envisagé lors des pesées et au moment du gavage. Des douleurs ponctuelles sont possibles lors des prélèvements et/ou des injections.
Devenir
L’étude de la survie des animaux se fera sur une durée de 30 jours. A terme, ils seront mis à mort. A différents temps après irradiation, les animaux traités ou non seront mis à mort afin de prélever les tissus et organes connus pour être très impactés par l’irradiation. Les analyses permettront d’évaluer l’efficacité du traitement sur ces tissus au cours du temps.
Remplacement
1)Pour l’étude de la survie des individus après irradiation, aucune alternative non animale ne peut être mise en place. 2)Dans l’analyse de la reconstitution hématopoïétique après irradiation, il n’est pas possible d’utiliser des alternatives comme par exemple des organoïdes ou des cultures cellulaires. En effet, les cellules souches de la moelle osseuse agissent de concert avec leur microenvironnement, constitué de plusieurs types cellulaires, pour permettre la reconstitution hématopoïétique après irradiation. L’étude sur l’animal corps entier est donc la seule approche possible pour une analyse physiologique des effets d’un traitement après irradiation depuis la cellule souche jusqu’aux cellules matures. 3)Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal aigu, les organoïdes peuvent être une alternative dans le cadre d’une analyse moléculaire ciblée. Nous ne ferons pas ce type d’analyse dans ce projet. Notre but est de mesurer des paramètres physiologiques impliqués dans la restauration de la barrière intestinale après irradiation, ce qui nécessite une étude sur l’animal corps entier.
Réduction
Les modèles de souris que nous utiliserons sont des lignées consanguines montrant moins de variabilité phénotypique intra-souche. Ainsi, il sera possible d’obtenir des résultats significatifs en utilisant la puissance statistique moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. Ceci permet de réduire le nombre de souris. Nous avons également utilisé un logiciel permettant de déterminer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant par groupe d’étude pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Avec le traitement proposé dans ce projet, nous avons évaluer un bénéfice d’environ 20%. Nous devons donc inclure 8 souris par groupe irradié avec ou sans traitement. Pour les souris non irradiées, aucun effet n’est attendu. Nous inclurons donc 3 souris par groupe.
Raffinement
Les souris seront régulièrement pesées et observées (posture, comportement, niveau d’activité, déshydratation). Nous utiliserons une grille de score pour évaluer leur état général et avons établi des points limites. Pour éviter une infection due à une diminution du système immunitaire, les cages seront placées, soit en portoirs ventilés, soit en portoir classique avec un couvercle filtrant. Les souris seront hébergées en groupe, avec enrichissement (coton, tunnels en carton). L'utilsation d'anesthésie et d'analgesie sera mise en place lors des procédures.
Choix des espèces
Les souris consanguines utilisées sont les mieux caractérisées en biomédecine et sont largement utilisées pour étudier le rôle d’un gène spécifique dans un organisme. Elles font l’objet d’un grand nombre d’étude pour analyser les effets biologiques des rayonnements ionisants et leur consanguinité réduit les effectifs utilisés car elles montrent moins de variabilité phénotypique. Ainsi, la puissance statistique est obtenue avec moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. De plus, les syndromes d’irradiation que nous souhaitons étudier sont bien caractérisés chez ces souris . Tout ceci présente des avantages scientifiques et éthiques. Nous utiliserons des souris adultes de 9 à 16 semaines (une souris est considérée comme étant adulte à l’âge de 7 semaines). Une souris prépubère (moins de 7 semaines) a un environnement médullaire (nécessaire à la production des cellules sanguines et à la préservation des cellules souches) qui n’est pas définitif. Une souris de plus de 7 mois est considérée comme âgée d’un point de vue hématopoïétique. Ceci restreint notre choix à l’utilisation de jeunes souris adultes. Pour des raisons de reproductibilité des expériences, le poids et la taille des souris doivent être identiques entre les groupes, ce qui est le cas chez les jeunes adultes à l’âge choisi.
Rôle des neutrophiles et des auto-anticorps dans le développement de l’arthrite induit par le collagène II
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont immunisées au collagène avec un adjuvant par deux injections intramusculaires dans les cuisses, ce qui déclenche une arthrite auto-immune, avec prises de sang et mesure des chevilles au pied à coulisse deux fois par semaine. Le porteur affirme que les processus de l'arthrite ne peuvent être reproduits in vitro et écarte le modèle d'arthrite spontanée jugé trop aléatoire. Le projet vise à comprendre le rôle des neutrophiles dans le déclenchement de la maladie.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer un modèle murin d’arthrite qui permettra d’étudier les mécanismes d’induction de l’auto-immunité impliqués dans cette pathologie, notamment le rôle des neutrophiles ainsi que leur diversité dans le déclenchement de cette pathologie. Pour cela, il est indispensable d’avoir un évènement déclencheur (ici le début de l’immunisation) à partir duquel les processus pathologiques amenant à la maladie se développent afin de pouvoir comparer des groupes de souris et établir une cinétique d’étapes clés. Un modèle d’arthrite spontanée ne se prête pas à notre recherche, car le début d’arthrite est trop aléatoire. Un modèle d’arthrite active (induite par une immunisation) a été décrit (collagen-induced arthritis (CIA)), mais ce modèle nécessite l’injection répétée de collagène II en présence d’un adjuvant fort, qui induit des inflammations tissulaires importantes. Pour éviter l’usage de cet adjuvant, nous proposons donc d’administrer du collagène II associé à une protéine porteuse en présence d’un adjuvant alternatif pour induire une arthrite chez la souris. Cet adjuvant est une huile naturelle qui est également utilisée dans certains vaccins humains. Pour établir les meilleures conditions expérimentales, nous réaliserons dans un premier temps, une mise au point du modèle sur des souris sauvages. Ensuite nous appliquerons les conditions établies dans cette première partie à des lignées de souris chez lesquelles l’activité des neutrophiles est altérée et dans un modèle de souris pour lequel les gènes codants pour les différentes classes d’anticorps, pour leurs récepteurs et le complément sont humanisés afin d’étudier les mécanismes impliqués dans la dérégulation de l’immunité, la perte de tolérance contre le soi et le développement de l’auto-immunité. Nous étudierons les cellules sanguines ce qui nécessitera des prises de sang régulières. A la fin de l’expérimentation, les souris seront mises à mort puis autopsiées pour étudier les réponses des neutrophiles et les anticorps dans les articulations, la rate et les ganglions drainants.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’étudier les mécanismes d’auto-immunité et la perte de tolérance au soi impliqués dans l'arthrite, notamment le rôle des neutrophiles ainsi que leur diversité dans le déclenchement de cette pathologie.
Procédures
Les animaux seront immunisés avec du collagène II complexé en présence d’un adjuvant par voie intramusculaire (50 uL) dans les deux cuisses arrière, par 2 injections espacées d’au minimum 1 semaine. Des prises de sang rétromandibulaires de moins de 100uL seront effectuées à trois occasions espacées d’au moins 1 semaine. Les deux types d’interventions ne prendront que quelques secondes. A partir de la première immunisation les articulations seront évaluées deux fois par semaine et l’épaisseur des chevilles mesurée à l’aide d’un pied à coulisse (caliper) (l’évaluation complète dure moins de 5 minutes/souris).
Impact sur les animaux
Les animaux seront immunisés avec du collagène II complexé en présence d’un adjuvant par voie intramusculaire (50 uL) dans les deux cuisses arrière, par 2 injections espacées d’au minimum 1 semaine. L’injection intramusculaire dure quelques secondes et provoquera un léger œdème dans le muscle associé à une douleur modérée de courte durée. Des prises de sang rétromandibulaires de moins de 7,5% de leur poids (100uL) seront effectuées à trois occasions espacées d’au moins 1 semaine. La prise de sang dure quelques secondes et causera une douleur légère de très courte durée. L’immunisation induira une réaction immunitaire contre le soi, qui se traduira par le développement d’une arthrite au niveau des articulations des membres. Cette inflammation débutera avec une rougeur au niveau d’une jonction articulaire, accompagnée d’un recrutement localisé de cellules inflammatoires, qui progressivement s’étendra à d’autres articulations du membre et s’accompagnera d’un gonflement. L’inflammation des articulations se traduira par une douleur progressive, qui n’entrainera pas pour autant une réduction de la mobilité des souris. A partir de la première immunisation les articulations seront évaluées deux fois par semaine et l’épaisseur des chevilles mesurée à l’aide d’un pied à coulisse (caliper) (l’évaluation complète dure moins de 5 minutes/souris).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Une autopsie sera réalisée sur tous les animaux afin de prélever différents organes et tissues dont la rate, les ganglions drainants, et les articulations pour étudier les réponses des neutrophiles dans ces différents compartiments.
Remplacement
L’arthrite met en œuvre des processus complexes reposant sur les singularités du système circulatoire et des tissus cibles, processus qui ne peuvent pas être reproduits in vitro.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé avec l’objectif de réduire ce nombre autant que possible tout en minimisant le « bruit de fond » inhérent à la recherche biologique in vivo. Ce nombre inclut le nombre nécessaire de contrôles et la nécessité de reproduire les résultats. De plus, le recours à des lignées consanguines de souris permettra de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les monitorings effectués (qui selon leurs scores déclenchent des actions à prendre) sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Nous respecterons les conditions d’élevage et de maintien établies par nos vétérinaires. Les animaliers ont la charge de la surveillance du bien-être des animaux, et inspectent les cages régulièrement, en plus de nos visites et de la visite hebdomadaire du vétérinaire. Dès la première immunisation les animaux seront observés au moins 1 fois par semaine et « scorés » selon une grille d’évaluation, prenant en compte l’arthrite, l’apparence de l’animal, les fonctions du corps et leur comportement. Des points limites ont été définis : - Pour l’arthrite : pour chaque patte un score de 4, et un score global (prenant en compte les quatre pattes) de 9. - Une perte de poids supérieur à 20% - Une immobilité persistante pendant plus que 24h - Un score clinique composite plus important que 20 Nous avons également mis en place des actions à prendre en fonction du score clinique composite : Pour un score de : - 0-3 : monitoring classique avec augmentation de la fréquence de surveillance (2 fois par semaine) - 4-7 : nourriture / gel humidifié dans la cage - 8-12 : nourriture / gel humidifié dans la cage et augmentation de la fréquence de surveillance (3 fois par semaine) - 13-20 : nourriture / gel humidifié dans la cage et augmentation de la fréquence de surveillance (tous les jours) et discussion de la conduite à tenir avec un membre de la structure du bien-être animal.
Choix des espèces
L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte » : entre 6 et 12 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs.
Régulation des réponses immunitaires innées par l’intégrine beta8 chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une injection unique d'un stimulant du système immunitaire, puis est mis à mort pour prélever les organes et évaluer le rôle de l'intégrine beta8 dans les réponses immunitaires innées. Le porteur affirme que la complexité du réseau de cellules immunitaires ne peut être reproduite in vitro. Les bénéfices annoncés se limitent à une meilleure compréhension des mécanismes, sans application décrite.
Objectifs
Le système immunitaire défend l’organisme contre les agents pathogènes notamment infectieux. Cependant toute réponse immunitaire doit être contrôlée : une réponse trop faible serait inefficace, et une réponse trop forte contre nos propres tissus peut mener à des maladies auto-immunes. L’intégrine beta8 (abrégé b8) a été impliquée dans la régulation des réponses immunitaires adaptatives. L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle de b8 dans la régulation des réponses immunitaires innées à l’échelle de l’organisme chez la souris. Dans ce projet, seront utilisés des animaux génétiquement modifiés permettant (1) de suivre l’expression de b8 ou (2) d’entrainer la perte de l’expression de cette protéine dans certaines cellules de l’immunité innée (les cellules dendritiques). Pour voir l’impact de b8 sur l’immunité innée, un stimulant des réponses immunitaires sera injecté à ces animaux et le suivi des réponses sera réalisée 24h après.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à étudier le rôle d’une protéine b8 dans la régulation des réponses immunitaires innées. De manière générale, ce projet permettra d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les réponses immunitaires innées sont régulées par b8. Ces résultats seront non seulement essentiels pour l’expansion des connaissances fondamentales sur les réponses dépendantes de b8 mais mettrons aussi en exergue des pistes potentielles pour l’amélioration les réponses vaccinales et antitumorales.
Procédures
Une injection sur animaux vigiles d'un stimulant du système immunitaire (durée 10 sec).
Impact sur les animaux
L’animal peut ressentir un stress lié à l’injection. Le produit injecté permet de mimer une infection en stimulant le système immunitaire mais n’induit pas d’inflammation excessive. Aucune douleur n'est attendue dans les 24h que dure le protocole, mais il est possible que l’animal ressente un léger inconfort du fait de la légère inflammation induite.
Devenir
Les animaux seront mises à mort avec une méthode reglementaire en fin de procédure pour collecter ensuite les organes, ce qui permettre d'évaluer l'impact de la délétion ciblée de la protéine b8 sur les réponses immunitaires étudiées.
Remplacement
Le but de cette étude est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels la réponse immunitaire et la mise en place de réponses extrêmement régulées sont maintenues dans l’organisme. Comme la complexité de l’environnement tissulaire, le réseau complexe de cellules immunitaires impliquées dans la régulation des réponses immunitaires étudiées dans ce projet ne peuvent être reproduits in vitro, cette étude nécessite la réalisation d’expériences à l’échelle de l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux (12 par groupe expérimental) dans chaque procédure expérimentale a été calculé à minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Le sexe n’ayant pas d’effet sur le phénotype observé, les souris mâles et femelles seront utilisées indistinctement. Cela permet d’utiliser l’ensemble des souris générées lors des croisements et donc de diminuer le nombre total de souris nécessaires à la réalisation du projet.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement. La procédure sera réalisée après un temps d’acclimatation d’une semaine minimum pour toutes les souris après sortie de l’elevage. Il s’agit ici de procédures courtes sur 24h et ne générant normalement pas de douleur. Pour le bien-être des animaux, ils seront surveillés dans l'heure suivant l'injection du stimulant. En cas exceptionnel de détérioration de l’apparence de l’animal et/ou de son comportement, l'animal sera mis à mort (point limite).
Choix des espèces
Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude des réponses immunitaires. La sélection de la souris permet également de bénéficier d’un nombre important d’animaux transgéniques développés précédemment (comme c'est le cas ici) et facilite donc le raffinement du plan expérimental. Nous utiliserons ici 2 lignées d'animaux transgéniques ne présentant aucun phénotype dommageable. Des souris adultes entre 8 et 25 semaines seront utilisées dans ce projet. Cette fenêtre a été choisi car à cet âge les souris ont un système immunitaire mature et non vieillissant.
Prélèvements biologiques chez le rongeur et le lapin
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 800
Lapins : 350
1 950 souris, rats et lapins vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie ou impliquant un niveau de souffrance léger, une partie euthanasiée pour prélever organes et tissus, d'autres réutilisés, gardés en élevage ou adoptés. Ils subissent des prélèvements de sang par différentes voies, dont la ponction du sinus rétro-orbital sous anesthésie et la ponction intracardiaque terminale, pour fournir sang, sérum, urine et organes à la communauté scientifique. Le porteur affirme que ces produits biologiques ne peuvent pas être obtenus par des méthodes de remplacement. Le projet a pour objet de prélever sur ces animaux la matière biologique utilisée dans d'autres recherches.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de fournir à la communauté scientifique des produits biologiques provenant de l’espèce lapin ou de différentes espèces de rongeurs génétiquement altérés ou non génétiquement altérés (rat, souris,). Ces produits biologiques, essentiels pour l’avancement de la recherche biomedicale, le développement des therapies innovantes et la conduite des tests in vitro ou ex-vivo, sont du sang, plasma, sérum, des fèces, de l’urine, du liquide cérébrospinal et divers tissus (moelle osseuse, organes, … ) Les prélèvements biologiques provenant du lapin ou de rongeurs sont utilisés par exemple comme : -outil de diagnostic/ réactif pour des tests biologiques -matrice pour des essais ex vivo et/ ou la mise au point/ validation de méthodes analytiques indispensables pour des futures études in vivo dans le cadre de l’évaluation de la sécurité de futurs médicaments ou produits biologiques -pour obtenir des contrôles analytiques ou des données références sur une souche animale qui seront ensuite utilisés dans le cadre de l’évaluation de la sécurité de futurs médicaments ou produits biologiques.
Bénéfices attendus
Les prélèvements biologiques provenant du lapin ou de rongeurs sont utilisés par exemple comme : -outil de diagnostic/ réactif pour des tests biologiques -matrice pour des essais ex vivo et/ ou la mise au point/ validation de méthodes analytiques indispensables pour des futures études in vivo -pour obtenir des contrôles analytiques ou des données références sur une souche animale. Ce projet a pour but de mettre à la disposition de la communauté scientifique ou de l’industrie divers produits biologiques (sang et ses dérivés, urines, fèces, liquide cérébrospinal, …) en provenance du lapin, du rat et de la souris. A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode in vitro permettant de synthétiser ces produits biologiques.
Procédures
Les méthodes générant le moins de stress pour l’animal (temps de contention réduit, pas de nécessité de vasodilatation) et les moins traumatisantes pour l’animal seront privilégiées : veine jugulaire ou saphène par exemple. Dans le cas où ces sites ne peuvent pas être utilisés ou les volumes demandés sont trop importants, la veine sublinguale ou en dernier recours le sinus rétro-orbital seront utilisés et l’animal sera préalablement anesthésié par voie gazeuse (ex : Isoflurane). Le prélèvement en intracardiaque (ou aorte ou veine cave caudale) sera réservé aux grands volumes de sang ne pouvant être prélevés par d’autres voies et sera terminal sur animal préalablement anesthésié. Les prélèvements auront une durée de l’ordre de la minute. Fréquence pour les procédures où ce ne sera pas un prélèvement unique : Rat (sublinguale) 2 sur 7 jours Rat (Sinus retro-orbital) alternance site G/D : 2 sur 7 jours Rat (caudale) : 6 sur 24h, et 10 sur 7 jours Rat (jugulaire) : 6 sur 24h, et 10 sur 7 jours Rat (saphène externe) : 4 sur 7 jours: Rat (submentale) : 2 sur 7 jours Rat (submandibulaire) : 2 sur 7 jours Souris (submentale) : 2 sur 7 jours Souris (submandibulaire) : 2 sur 7 jours Souris (caudale) : 3 sur 7 jours Souris (saphène) alternance site G/D : 2 sur 7 jours Lapin (oreille) : 8 sur 24h, et 12 sur 7 jours Pour les prélèvements de diurèse, une mise à jeun éventuelle sera appliquée (maximum de 16h avec mise à jeun).
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes de prélèvement de sang ou fluides corporels Des points limites identifiés dans les procédures internes seront apppliqués. En cas d’atteinte de ces points limites, des mesures seront rapidement prises pour limiter la souffrance (mise en place d’un traitement analgésique, suspension de la procédure ou euthanasie)
Devenir
En accord avec le plan d’étude utilisé les animaux pourrons être 1) euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques, microscopiques et/ou squelettiques); 2) gardés en vie si pas de besoin de prélèvement; 3) adoptés en accord avec la structure en charge du bien-être animal et les vétérinaires ; 4) hébergés en attente d’inclusion en étude, conditionnée par un examen vétérinaire favorable.
Remplacement
L’objectif du projet étant de fournir aux scientifiques des produits biologiques provenant de lapins ou de rongeurs et ceux-ci ne peuvent pas être produits par des méthodes alternatives.
Réduction
Le nombre d’animaux est déterminé en fonction de la quantité de sang ou de tissus ou d’autres prélèvements biologiques nécessaire, de manière à respecter les recommandations éthiques en vigueur sur les volumes prélevés et les temps de récupération. Les animaux pourront être réutilisés pour certains prélèvements biologiques à condition de respecter les procédures de réutilisation des animaux et sur avis du vétérinaire.
Raffinement
Les rongeurs hébergés sur site seront hébergés dans des cages sur fond plastique et sur de la litière avec un enrichissement adapté (par exemple : papier kraft, tunnel, …). Les rats (mâles et femelles) et souris femelles seront hébergés en groupes sociaux. Les lapins seront hébergés en cage sur fond plastique munie d’une plateforme de repos, avec contact visuel et olfactif avec les congénères. De la musique sera diffusée pendant la période 6h-18h. Un enrichissement adapté sera fourni : par exemple mousquetons/rondelles métalliques, rondins végétaux et bâtonnet de bois à ronger. Tous les animaux (rongeurs, lapins) sont observés au moins 1 fois par jour afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas de signes cliniques, ayant des répercussions sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures seront rapidement prises pour limiter la souffrance de l’animal (traitement analgésique, suspension de la procédure ou euthanasie).
Choix des espèces
Les espèces utilisées dépendent des espèces sélectionnées pour les études précliniques in vivo (analogie du récepteur entre l’homme et l’animal, similitude du profil des métabolites, données de pharmacocinétique/ pharmacodynamie, …) et des tests biologiques à faire. De la naissance à adulte mature qui a terminé sa croissance. L’âge de l’animal dépend des besoins du scientifique, de la classe d’âge visée dans l’utilisation clinique du produit (mise au point /validation de méthodes analytiques).
Association de l’ocytocine à la corticothérapie dans la myopathie de Duchenne
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
652 souris du modèle mdx de la myopathie de Duchenne vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'ocytocine ou de prednisolone trois jours par semaine pendant cinq semaines à cinq mois, puis passent une batterie de tests comportementaux nommés, labyrinthe en croix surélevé, test clair-obscur, open-field, interaction sociale et contention. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable des injections et justifie le recours à l'animal par l'interaction entre plusieurs organes. L'ocytocine étant déjà approuvée par la FDA, le porteur présente son passage en clinique comme facilité, au conditionnel.
Objectifs
En l'absence de traitement, la corticothérapie est le seul traitement palliatif actuellement utilisé pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Le corticothérapie (prédnisolone) présente des avantages modestes sur le maintien de la force musculaire et présente également des effets secondaires indésirables comme le développement de l'anxiété, de la dépression et paradoxalement d'une faiblesse musculaire, sur le long terme. L'ocytocine (OT) est connue pour ses effets bénéfiques sur la fonction cardiaque, la régénération musculaire et dans le comportement social. En utilisant le modèle murin mdx, modèle classique de la maladie de Duchenne, le projet évaluera si la combinaison de l'OT avec la corticothérapie peut améliorer la fonction musculaire squelettique, cardiaque ainsi que le comportement social.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont que l'OT seule ou en combinaison avec la prédisone/prédnisolone pourrait constituer un traitement dans la maladie de Duchenne. En effet, les résultats obtenus fourniront des indications sur l'intérêt de combiner les 2 traitements, notamment sur le niveau d'OT des souris traitées dans les différentes conditions. Étant donné que l'OT est un médicament approuvé par la U.S. Food and Drug Administration (FDA), la faisabilité d'une application clinique rapide est forte.
Procédures
Les animaux seront injectés 3 jours par semaine avec de l'OT ou de la prédnisolone. Le traitement durera soit 5 semaines soit 5 mois selon les groupes. Des évaluations fonctionnelles non invasives de la force musculaire (newtonmètre), de la fonction cardiaque (échocardiographie) et respiratoire (plésthysmographie) seront réalisées. Une série de tests comportementaux sera réalisée une fois après 5 semaines de traitement et après 6 mois de traitement. Les tests sont les suivants : Les délais entre tests sont de 24h, avec la succession suivante : 1. Plus maze (durée 5 min) 2. Clair/obscur (durée 5 min) 3. Open-field (durée 15 min) 4. Interaction sociale (durée 5 min) 5. Réponse à un stress léger par contention (durée 5-6 min)
Impact sur les animaux
Il n'y a pas de nuisance ou d'effet indésirable attendus suite à l'injection d'ocytocine ou de prednisolone. Néanmoins, les animaux seront surveillés pour évaluer une possible réaction inflammatoire au site d'injection. Le stress, dû à des contentions répétées des animaux, sera également surveillé. Les animaux impliqués dans les tests d'évaluations musculaire fonctionnelles et comportementales(tests d'anxiété et d' interaction sociales) sont dans des situations soit non anxiogènes ou très peu, n’impliquant pas de stress ou inconfort majeur, cependant, les animaux seront surveillés quotidiennement.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour le prélevement des tissus (muscles, coeur et cerveau) pour des analyses biochimiques et histologiques post-mortem.
Remplacement
Le but du projet est d'explorer le rôle de l'OT thérapeutique dans la maladie de Duchenne. Dans ce contexte, afin de déceler les processus physio-pathologiques impliqués, il est nécessaire d'utiliser des animaux car les mécanismes de dégénérescence musculaire impliquent l'intéraction entre plusieurs types cellulaires et organes différents. Effectuer cette étude sur un système in vitro aboutirait à une étude de processus non-physiopathologiques et ne serait donc pas pertinent pour la mise au point d'un traitement thérapeutique.
Réduction
Pour réduire autant que possible le nombre d'animaux nécessaires, nous avons calculé la taille de chaque groupe d'échantillon nécessaire pour une analyse statistique.
Raffinement
Les animaux d'une même fratrie sont regroupés dans une cage. Les cages sont enrichies avec un tunnel et une maison en carton. Nous utilisons une grille de suivie et des points limites ont été déterminés en fonction des paramètres observés pour évaluer la souffrance, la détresse et l’inconfort des animaux. Selon les procédures la surveillance est effectuée par les animaliers et/ou par deux chercheurs statutaires ayant suivi la formation Expérimentation Animale. Les animaux sont observés et pesés trois fois par semaine avant chaque injection. S'il apparait que les animaux ont des difficultés pour se nourrir une supplémentation avec du dietgel , nourriture et eau au sol sera envisagé.
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère dont le système nerveux central présente de nombreuses analogies avec les mammifères supérieurs (dont l'humain). La grande maitrise des méthodes d'élevages, des conditions de bien-être animal et la haute standardisation des lignées en fait un organisme de choix pour une étude physiopathologique. De plus, la souris mdx est le modèle le plus reconnu pour étudier la maladie de Duchenne. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 6 semaines, âge où la dégénérescence musculaire reste très faible et permet ainsi d'évaluer le potentiel thérapeutique de molécules sur une période de traitement allant de 6 semaines à 5-6 mois, période où la dégénérescence musculaire cardiaque apparaît.
Rôle du facteur de transcription PLZF dans l’inflammation et le vieillissement du système hématopoiétique
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Une partie est irradiée puis greffée de moelle osseuse et reçoit des injections de molécules pro-inflammatoires, tandis que les reproducteurs sont mis à mort après six mois d'accouplement et les animaux au génotype non recherché également éliminés. Le projet étudie le rôle du facteur PLZF dans le vieillissement du système sanguin, ou "inflammaging". Le porteur affirme que le dialogue entre cellules souches et microenvironnement ne peut être reproduit et rend le "modèle murin" impossible à remplacer.
Objectifs
La moelle osseuse, qui est la source de toutes les cellules sanguines (dans un processus appelé hématopoïèse) subit au cours du vieillissement des défauts fonctionnels qui peuvent être associés au développement d'hémopathies. Dans le cadre d’un précédent projet, nous avons montré que le facteur de transcription PLZF est impliqué dans la régulation du vieillissement du système sanguin. PLZF participe à la régulation du compartiment des cellules souches hématopoiétiques (qui sont à l'origine de toutes les cellules du sang) et est associé à l'augmentation de certaines sous-populations que nous avons identifiées comme des cellules préactivées dans des voies de signalisation impliquées dans l'inflammation. Ces résultats suggèrent que PLZF pourrait être un acteur clé dans le vieillissement du système sanguin lié à l'inflammation chronique. Notre projet propose d'élucider le rôle de PLZF dans la physiologie du vieillissement des cellules sanguines soumises à des processus inflammatoires. Nous souhaitons donc étudier en détail les effets d’une inflammation chronique sur les différents types de cellules hématopoïétiques (notamment les cellules souches et les progéniteurs) ainsi que leurs altérations moléculaires et fonctionnelles dans des modèles murins où l'expression de PLZF est altérée.
Bénéfices attendus
La moelle osseuse, qui est la source de toutes les cellules sanguines, subit au cours du vieillissement des défauts fonctionnels qui peuvent être associés au développement d'hémopathies. Le vieillissement du système sanguin est notamment lié aux inflammations subies tout au long de la vie de l'individu, processus connu sous le nom d'"inflammaging" qui favorise l'émergence d'hémopathies malignes. Nous souhaitons élucider certains mécanismes responsables de ce processus, pour mieux comprendre les causes du développement des hémopathies et cibler les acteurs clés de ce phénomène.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse. L'anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles le prélèvement, effectué en 10 à 20 secondes, est réalisé. Les animaux receveurs de greffe subiront une irradiation réalisée via une exposition des animaux aux rayons X d'environ 6-7 minutes. La greffe de cellules de moelle osseuse qui s'ensuit est réalisée sous anesthésie gazeuse d’une durée de 3 à 4 minutes. Les animaux seront soumis à des injections de molécules pro-inflammatoires (durée 1 à 4 semaines, injection 3 fois par semaine) nécessitant chacune quelques secondes d'intervention sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse. Les animaux recevront des traitements par des molécules inflammatoires. Les animaux receveurs de greffe seront soumis à une irradiation suivie d’une transplantation de moelle osseuse sous anesthésie gazeuse. L'irradiation est réalisée au sein d'un appareillage bruyant, ce qui peut être source de stress. Lors de ces transferts adoptifs, l'irradiation et le délai de reconstitution entraînent une période de fragilité immunitaire des animaux récipients, que nous compenserons par l'administration d'une antibiothérapie maintenue sur une durée de deux semaines à 1 mois après la greffe. Les animaux seront soumis à des observations et pesées quotidiennes, qui peuvent être source de stress.
Devenir
Ce projet nécessitera 456 souris. Les animaux reproducteurs sont mis à mort à l’issue de la période de 6 mois d’accouplement qui permet de générer les animaux de génotype d'intérêt. Les animaux ne présentant pas les génotypes d’intérêt sont également mis à mort. Les animaux d'intérêt utilisés dans ce projet sont mis à mort à l'issue des procédures à des fins d'analyse.
Remplacement
Le but du projet est de mieux comprendre le vieillissement des cellules souches hématopoïétiques, lequel implique des mécanismes largement dépendants d'une communication cellulaire avec des facteurs microenvironnementaux (cytokines, molécules d’adhésion). Ce dialogue permanent entre la cellule souche hématopoïétique et son microenvironnement nécessite d’avoir recours aux modèles murins qu’il n’est donc pas possible de remplacer actuellement.
Réduction
Nous limiterons au maximum le nombre d'animaux grâce à l’utilisation des techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique (largement optimisées et maîtrisées au sein du laboratoire) afin de pallier la problématique de l’hétérogénéité tumorale, et réduire ainsi le nombre d’animaux pour résoudre cette hétérogénéité. Notre expérience passée nous a permis d'estimer le nombre d'animaux nécessaires à l'obtention d'un nombre suffisant de cellules souches et progéniteurs (populations rares) pour les analyses pré-citées, et nous permet d'avoir un échantillonnage statistiquement interprétable.
Raffinement
Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 3 à 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique. En fonction des scores obtenus, nous faciliterons l’accès à la nourriture en positionnant les croquettes dans le fond de la cage et en mettant à disposition de la nourriture humide. Tous les gestes techniques sont réalisés par du personnel compétent et expérimenté, le cas échéant sous anesthésie gazeuse (injections et prélèvements sanguins).
Choix des espèces
L’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers, parmi lesquels le poisson zèbre et la souris sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique et la disponibilité des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, et notre expertise dans les outils développés chez cette espèce conduisent logiquement à l'utilisation de la souris comme le modèle le plus pertinent pour les expérimentations proposées. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes, à partir de 6-7 semaines, âge où le système hématopoïétique et son microenvironnement sont définitivement matures. Les greffes par transfert adoptif s'effectuent sur des animaux receveurs C57BL6/J Ly5.1 âgés de 7 à 8 semaines, qui correspond à une fenêtre optimale de prise de greffe .
Production in vivo d’un anticorps monoclonal dirigé contre un marqueur de l’hémostase destiné à l’industrie du diagnostic in vitro
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
34 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de pristane puis d'hybridomes qui déclenchent une tumeur et une accumulation de liquide d'ascite dans l'abdomen, décrite comme source de détresse, avant un prélèvement terminal. Le projet produit in vivo un anticorps monoclonal destiné à des kits de diagnostic industriels, le porteur affirmant que la production in vitro n'a pas été validée et concluant à une "nécessité incontournable". Le recours à 34 000 souris pour produire un anticorps par la méthode d'ascite ressort comme l'élément marquant de ce projet.
Objectifs
L’objectif du projet est de produire in vivo chez la souris un anticorps monoclonal (Mab) ultra-spécifique d’un produit terminal de la dégradation de la fibrine. Ce Mab entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs IVD exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique et la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif.
Bénéfices attendus
L’obtention in vivo de cet anticorps monoclonal permettra le maintien de la production de kits de diagnostic essentiels à la définition d’un statut clinique. Cet anticorps entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs de diagnostic in vitro (IVD) exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique avec la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. Il est à noter que ces kits, ont joué un rôle clé dans la crise sanitaire liée à la maladie à coronavirus (COVID-19). Les instances scientifiques ont permis de définir un lien entre le taux du produit de dégradation de la fibrine dosé par les kits dépendant de cet anticorps et la gravité de la maladie COVID-19 (mauvais pronostic pour le patient).
Procédures
Mise en quarantaine des souris dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation Après respect d'une semaine de quarantaine, à J1 les souris reçoivent une injection d’un agent d’amorçage. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de cet agent est précédée 30 minutes avant par l’injection en sous-cutanée d’un antalgique. A J22, après expansion clonale, les hybridomes sont injectés en IP unique à raison de 4.106 cellules/souris. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. Suivi quotidien des animaux. Les animaux présentant des signes d’inconfort sont euthanasiés et ponctionnés de manière éthique. Récupération unique et terminale d’ascite par paracentèse dès apparition. Injection IP ou SC, durée de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Chez l'animal, une douleur et une détresse peuvent résulter de l'injection intrapéritonéale (IP) de l'amorce (pristane), de l'inoculation IP des cellules tumorales, et de la croissance des cellules tumorales dans la cavité abdominale (effets primaires) sous forme de plaques péritonéales qui s'infiltrent dans la paroi abdominale ou les organes abdominaux. Plus précisément, il semble que l'injection par voie IP produit un niveau de détresse modéré; on décrit que la production d'ascite et la croissance de tumeurs causent de la souffrance chez les patients humains. De plus, les changements pathophysiologiques et pathologiques complexes peuvent provoquer une détresse chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont concernés, les souris sont toutes euthanasiées en fin de protocole. L’ensemble des animaux inclus dans un cycle de production sont euthanasiés avant paracentèse.
Remplacement
L’alternative la plus logique pour la production de cet anticorps serait une production in vitro. Malheureusement, à ce jour, l’anticorps n’a pu être caractérisé techniquement et validé cliniquement que sur des lots issus de production en condition in vivo. L’ensemble des résultats concernant la capacité de certains clones à produire in vitro les mêmes anticorps selon le même cahier des charges requis pour les dispositifs IVD concernés, démontre la nécessité incontournable de poursuivre la production de ce Mab en condition in vivo (incapacité des hybridomes à tolérer un transfert en extension d’échelles notamment de rendement de production et ou de qualité fonctionnelles des anticorps obtenus). Les besoins de santé publique de ces dispositifs IVD exploitant cet anticorps, et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. La société nous demandant de réaliser des productions d'anticorps in vivo, est consciente de l’aspect éthique de l’expérimentation animale et s'engage à ne recourir à la production in vivo que dans des cas de stricte nécessité. En parallèle, de ce protocole, les essais de passage en in vitro se poursuivront notamment via la mise en œuvre d’essai de tris des clones présentant les taux de sécrétion d’immunoglobulines les plus élevés. Il est également à noter que pour les nouvelles versions de cette gamme de produit, les anticorps utilisés seront fabriqués avec des anticorps produits uniquement avec un process « in-vitro » (développement en cours)
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire. Nous pourrons nous baser sur l’expérience acquise sur les anciens protocoles réalisés sur ces clones. L’utilisation de souris anciennes reproductrices permet également de ne pas utiliser d’animaux jeunes spécifiques au projet, mais d'utiliser des souris qui étaient vouées à être euthanasiées. Les expériences de sélection des clones possédant les meilleures capacités de sécrétion, devraient permettre à minima de réduire le nombre d’animaux engagés par protocole. La dernière demande d’autorisation concernait 21000 souris par an, la nouvelle demande impliquerait 17000 individus annuellement, soit une diminution d’environ 19%. A ce jour 1 souris permet la réalisation de 1400 tests.
Raffinement
Les recommandations (issue de CNREEA et parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris seront appliquées. L’unique paracentèse sera réalisée après euthanasie de l’animal, afin de limiter les manipulations de l’animal toujours sources de stress. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de l’agent d’amorçage est précédée 30 minutes avant par l’injection d’un antalgique. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 2 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion…) et signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 3 niveaux : normal, souffrance légère mise en œuvre d’antalgies à envisager, souffrance sévère arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les animaux bénéficient d'un hébergement, d’un environnement, d'une certaine liberté de mouvement, de nourriture, d'eau et de soins appropriés à leur santé et à leur bien-être. Afin de faciliter la sociabilité des souris, elles ne sont pas isolées dans une cage et des objets d'enrichissement sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont euthanasiés et prélevés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore.
Choix des espèces
Les hybridomes concernés ont été obtenus par fusion de splénocytes de souris et de myélome de souris, selon la méthode de Milstein et al (1975). Les clones obtenus n’ont jamais pu être produits autrement que chez la souris. Le Mab obtenu et validé dans les dispositifs IVD concernés, est un Mab obtenu et produit chez la souris. Les souris doivent être de même souche (syngéniques) à la fois pour l'immunisation en vue de la création du clone d'hybridome et pour la production subséquente de Mab, de sorte que les tissus utilisés soient histocompatibles. Les souris Balb/c représentent le meilleur choix puisque les cellules myélomateuses parentales employées dans le processus de fusion proviennent de cette souche. Les souris utilisées préalablement pour la reproduction présentent l’avantage pour la production de l'ascite parce que leur musculature abdominale a déjà été étirée (Falkenburg, 1998). Les animaux utilisés sont de préférence des femelles adultes Balb/C (anciennes reproductrices), car elles présentent une prédisposition physiologique favorisant une dilatation de leur paroi abdominale en diminuant le risque de compression d‘organe (respect des 3R).
Preuve de concept de l’efficacité de nos produits d’intérêt myorelaxant, après application topique, dans le traitement des maladies de la contraction musculaire.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
516 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est rasé, reçoit le produit sur la peau ou par injection intramusculaire, puis subit une dizaine de mesures électriques du muscle sous anesthésie et une trentaine de mesures de l'écartement des doigts de la patte. Le projet compare des produits commerciaux, désignés comme "nos produits", aux traitements de référence de la dystonie et de la spasticité. Le porteur indique que la réutilisation des animaux a été tentée sans succès et affirme que les modèles cellulaires restent débattus.
Objectifs
Cette étude a pour objectif de démontrer l’efficacité et les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisés en clinique. Dans cette étude, le produit sera administré localement aux rats, sur la peau d’un membre postérieur (application topique au niveau du tibialis cranialis). Nos produits seront comparés au traitement actuel de référence.
Bénéfices attendus
Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entraîner des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead (FTP-501) quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide, et d’autres offrent un effet durable par exemple (le cas du premier Lead FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Nous visons ainsi le développement de plusieurs produits, car nous envisageons la possibilité de positionner chacun des produits finaux pour le traitement de différentes maladies neuromusculaires.
Procédures
Rasage : 1 fois : 30 sec/animal Administration composée : 1 fois : 1min / animal et maintient avec un pansement pendant 2h ; Mesure CMAP (avec anesthesie) : environ 10 fois : 15 min / animal = 150 min /animal (1h30) Mesure DAS : environ 30 fois : 10 sec / animal = 300 sec / animal (5 min)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues ici sont : Partie administration des composés : Stress dû au rasage de la patte des animaux, administration des composés par voie sous-cutanée ou intra-musculaire, légère gêne suite au pansement occlusif sur la patte. Partie observation : Stress dû aux lectures DAS (Digit Abduction Score = score de l'écartement des doigts de la patte) et au différentes anesthésies pour les mesures de CMAP (Coumpound Measurement Activity Potentiel = mesure de l'activité élétrique du muscle).
Devenir
Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, il n’est malheureusement pas possible de les réutiliser dans une nouvelle série d’expériences. Nous avons testé cette possibilité lors du premier projet, malheureusement sans succès. Il est possible que les animaux ayant subi une série d’expériences (suivi d’une période de repos) se soient accoutumés au test DAS, et répondent différemment des animaux naïfs ; le poids plus important des animaux ré-utilisés peut également impacter négativement la réponse au test DAS.
Remplacement
Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de co-culture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Les test DAS et CMAP nous permettent au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.
Réduction
Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs ; Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 6 animaux par groupe.
Raffinement
Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle DAS chez le rat : l’administration des composés (ici topique et intra-musculaire.) est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, et les mesures de DAS sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. Les administrations de nos composés en topique sous pansement occlusif ne seront réalisées qu’une seule fois sur un temps assez restreint (2h). Pour toutes les mesures de CMAP, les animaux seront anesthésiés environ 10 fois pour chaque animal (aux temps 2h, 4h, 8h, 24h, 48h, J7, 14J, 21J, 28J (et tous les 7 jours jusqu’au retour du signal au signal de départ)
Choix des espèces
La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Les tests DAS et CMAP chez le rongeur, déjà éprouvés lors de notre étude princeps, sont au contraire des tests reconnus pour leurs pertinence pour étudier les myorelaxants. Rats femelles Sprague Dawley femelles (Bien que faciles à manipuler, nous avons remarqué au cours de l’étude princeps que la prise de poids des animaux ne facilitait pas la stimulation et la lecture du DAS (animal difficile à stimuler, et peu enclin à exhiber un réflexe). Or il est largement admis que les mâles prennent plus de poids que les femelles. De plus, nos molécules ont été administrés en i.m (pour tester leurs efficacités dans notre étude princeps) et que nous n’avons remarqué aucune différence (entre mâles et femelles) de réponse pharmacologique. De plus, pour les molécules testées ici leur pharmacocinétique est connue (soit dans la littérature, soit testé dans notre laboratoire), et aucune différence significative n’est observée entre les deux sexes. Afin de diminuer notre variabilité de mesure, nous sommes donc contraints de nous limiter aux animaux femelles) âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g). Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests DAS. Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler