Rongeurs
Évaluation de la réponse inflammatoire de la pulpe dentaire à un nouvel hydrogel d’acide hyaluronique à base de nanoémulsion chargée en lipoxine A4 dans un modèle de pulpe inflammatoire chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une cavité est creusée dans leurs molaires puis laissée ouverte 24 heures pour déclencher une inflammation de la pulpe dentaire, avant l'application d'un hydrogel expérimental. Le porteur reconnaît une douleur buccale et une gêne pour s'alimenter, et prévoit l'euthanasie de groupes de six animaux à 24 et 72 heures pour récupérer les molaires. Il affirme que les expériences in vitro ne reproduisent pas les interactions cellulaires complexes de l'inflammation et que le recours au rongeur reste "nécessaire" pour valider le biomatériau.
Objectifs
La carie dentaire touche environ 98% de la population en Europe. La dent représente un environnement spécialisé où la pulpe dentaire est un tissu conjonctif mou entouré d'une barrière minérale dure faite de dentine et d'émail. Lors d’une carie, les micro-organismes pénètrent l’émail et la dentine et déclenchent ensuite une réponse inflammatoire/immunitaire dans la pulpe dentaire (pulpite). Cette pulpite peut entraîner des douleurs dentaires très aiguës (la forme la plus répandue de douleur orofaciales). Le traitement des dents en pulpite est encore controversé. Le traitement « classique » canalaire radiculaire présente un bon taux de succès (85%) : il consiste après mise en forme et désinfection à l’aide d’une solution d’hypochlorite de sodium 2,5% à obturer de manière tridimensionnelle l’intégralité de l’endodonte avec un ciment et de la gutta percha (polymère naturel). Cependant, les dents traitées sont plus cassantes que les dents non traitées ; il y a une perte des capacités de cicatrisation, et un risque de dissémination bactérienne dans l'organisme subsiste toujours après traitement radiculaire. Une approche alternative consiste à retirer uniquement la partie enflammée de la pulpe pour maintenir et préserver son potentiel de guérison. Les avantages de ces thérapeutiques sont : le maintien des mécanismes de défense, la perception de la douleur comme système d'alerte, la cicatrisation et la régénération des tissus, l'achèvement de la formation des racines chez les jeunes patients. Malgré ces avantages évidents, cette approche alternative est encore peu pratiquée notamment parce que le résultat est difficilement prévisible en raison de l'état inflammatoire du tissu pulpaire restant. En effet, l'inflammation pulpaire est souvent trop importante et entraîne une nécrose pulpaire. L'originalité de ce projet est de contrôler la réponse immunitaire qui est le principal facteur de succès.
Bénéfices attendus
Ce modèle nous permettra d’induire une inflammation dans un système global ce qui n’est malheureusement pas possible avec les expérimentations in vitro. Nous pourrons alors évaluer l’effet anti-inflammatoire de ces nouveaux hydrogels d'acide hyaluronique à base de nanoémulsion chargée en lipoxine A4 (LXA4). Les nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des LXA4, qui améliorent la résolution de l’inflammation pourraient avoir un meilleur rapport bénéfice/risque. A court terme ce protocole nous permettra de répondre à plusieurs questions. Tout d’abord, nous pourrons choisir une formulation d’hydrogel, la plus efficace pour favoriser la résolution de l’inflammation. Nous pourrons également valider l’effet de la LXA4 in vivo dans un système complexe et non seulement in vitro sur les macrophages. Notre proposition peut également être avantageuse par rapport à d'autres systèmes d'administration de médicaments qui ont des effets immunotoxiques indésirables potentiels. A plus long terme, ce protocole marquera une avancée dans l’élaboration d’un système complexe permettant de relarguer des molécules anti-inflammatoires telles que la LXA4 de manière contrôlée dans le temps. En clinique, l’objectif final sera d’apporter une alternative supérieure en termes de cicatrisation et de régénération des tissus concernés dans le cadre des pulpites (maintien des mécanismes de défense, perception de la douleur comme système d'alerte, cicatrisation et la régénération des tissus, l'achèvement de la formation des racines chez les jeunes patients). Bien que notre perspective se concentre sur le domaine de la dentisterie, l'utilisation de notre proposition thérapeutique pourrait être déployée afin de traiter de multiples maladies inflammatoires et/ou des défauts osseux.
Procédures
Le jour de la procédure, les rats seront anesthésiés. L’ouverture buccale sera maintenue par instrument dentaire. Pour induire l’inflammation, nous formerons une cavité à l'aide d'instruments dentaires sur les molaires, la cavité formée sera rincée au sérum physiologique avant d’être laissée à l’air libre durant 24h. Après 24h d’exposition, la cavité sera de nouveau rincée au sérum physiologique pour éliminer tous débris éventuels puis nous viendrons injecter dans la cavité la proposition thérapeutique (ou bien les solutions contrôles) à l’aide d’une seringue, le volume sera adapté à chaque cavité de manière à la remplir. La cavité sera ensuite refermée avec un biomatériau utilisé en dentisterie. Pour chaque groupe, 6 rats seront euthanasiés à 24h et 6 autres à 72h. Nous récupérerons les maxillaires de manière aseptique afin de procéder aux différentes analyses.
Impact sur les animaux
Ce modèle entraine une inflammation « contrôlée » et limitée du tissu pulpaire. Ce protocole de classe modérée pourrait conduire à : - Une douleur au niveau buccal après avoir exposé le tissu pulpaire à l’environnement oral - Une gêne pour s’alimenter (normalement pendant 24h) liée aux dents laissées ouvertes. Le design de l’étude permet de conserver un coté sans atteinte dentaire permettant une alimentation normale. Nous resterons bien évidemment très attentifs sur tout comportement anormal des animaux de manière à soulager leur douleur si celle-ci venait à apparaître.
Devenir
Les animaux doivent être mis à mort afin de pouvoir récupérer les molaires traitées et controlatérales (qui serviront de témoins).
Remplacement
Cette étude prend en compte la règle des 3R. Les expériences in vitro ne permettent malheureusement pas de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs cellulaires (macrophages, neutrophiles, monocytes…) et les différents systèmes (immunitaires, vasculaires…). Il est donc nécessaire de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors de la réponse inflammatoire. L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux chargés en termes de biocompatibilité, et bioactivité. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés.
Réduction
Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les formulations d’hydrogels ont été testées et sélectionnées en amont pour leur biocompatibilité et leur caractère anti-inflammatoire in vitro. Le nombre de 6 animaux par groupe est calculé à partir d’un test de puissance statistique pour une différence significative de 20%, un écart-type de 10% et un risque consenti de 5%.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse, les animaux seront manipulés plusieurs jours avant l’expérimentation dans un but d’habituation et leur environnement sera enrichi par alpha dri. Les rats seront hébergés à raison de 3 rats par cage. Nous raffinerons également en réduisant les douleurs via : - 1. Une anesthésie réalisée localement avant toute procédure sur la dent. - 2. Des antalgiques en post opératoire. Les rats seront observés et pesées quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérimentation. Par ailleurs, des points limites ont été identifiés et les procédures de raffinement à mettre en oeuvre lors de l’atteinte de ces points limites ont été décrites. De plus, pour faciliter la prise alimentaire, l’alimentation des rats sera posée sur le sol de manière à être plus accessible. Enfin, les analyses menées sur chaque animal seront complètes. Les molaires traitées et les molaires controlatérales seront prélevées pour effectuer des analyses complètes afin d'exploiter le tissu extrait dans sa totalité.
Choix des espèces
Notre choix se base donc sur l’étude de la bibliographie. Notre projet fondé sur une approche translationnelle est un préalable nécessaire à un développement préclinique sur d'autres espèces plus proches de l'Homme. Ce modèle est bien maitrisé dans notre laboratoire. Le modèle de carie induite sur la molaire de rat est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude des biomatériaux et/ou la réponse immunitaire de la pulpe dentaire tout particulièrement pour l’approche moléculaire, histologique et imagerie 3D. Nous avons choisi d’utiliser uniquement des mâles. Il existe des différences liées au sexe dans la prévalence des lésions carieuses chez l’Homme. Ces différences sont dépendantes d’un grand nombre de variables (milieu socio-économique, accès à l’éducation, accès aux soins). En revanche ces différences n’ont jamais été démontré dans des modèles animaux de caries dentaires. La réponse immunitaire est capitale dans la cicatrisation et il peut y avoir des différences de réponse entre mâles et femelles. Nous prévoyons d’utiliser que des mâles pour justement éliminer ce biais et cela correspond de plus à des publications qui nous ont servi de références pour l’élaboration du protocole. Les animaux reçus auront 7 semaines, ils auront une semaine d’acclimatation dans l’animalerie avant le début du protocole. Les rats auront donc 8 semaines au début du protocole et presque 9 semaines à la fin du protocole. Ce choix correspond à notre volonté de travailler sur de jeunes adultes afin d’éviter les effets liés à la sénescence, de plus cela correspond aux protocoles standards retrouvés dans la littérature concernant ce modèle d’inflammation de la pulpe dentaire.
Impact des polluants environnementaux sur le neurodéveloppement et la la pathologie autistique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les mères sont exposées à trois fongicides utilisés sur la vigne, aux doses autorisées dans l'eau potable, et leur descendance passe une batterie de tests de développement et de comportement, réflexe de sursaut, orientation olfactive, habileté sociale, stéréotypies et anxiété. Le porteur affirme n'avoir observé ni douleur ni perte de poids lors d'expositions antérieures et présente les tests comme non invasifs. Il conclut qu'aucun marqueur biologique n'existe pour l'autisme et que l'évaluation ne peut se faire qu'au niveau comportemental, les retombées annoncées visant une éventuelle révision de la réglementation.
Objectifs
Les objectifs du projet de recherche sont d'étudier les effets de certains polluants fréquemment détectés dans notre environnement sur le neurodéveloppement et le vieillissement. Nous nous intéressons à différents polluants : les fongicides de la famille des anilinopyrimidines, le cyprodinil, le mépanipyrim, et le pyrimethanil. Ces 3 antifongiques sont très largement utilisés pour le traitement de la vigne et pour préserver les fruits de la moisissure grise après récolte. Nous avons récemment montré que l'exposition tout au long de la vie à un cocktail de ces 3 fongicides à la dose réglementaire autorisée dans l'eau potable (0.1 µg/L) conduit à un trouble du neurodéveloppement ainsi qu’à l’âge adulte, au développement d’un phénotype autistique. Nous souhaitons maintenant mettre en évidence les fenêtres de développement précoce critiques d’exposition aux fongicides afin de mieux comprendre leur rôle dans le développement des effets délétères pour ensuite examiner leur exposition ultérieure.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension de l’impact de l’exposition à des polluants environnementaux dans le développement des troubles neurodéveloppementaux et dans la mise en place de la pathologie autistique. Il aura des bénéfices pour la santé humaine car les expositions utilisées dans notre modèle correspondent aux doses règlementaires à ne pas dépasser dans l’eau potable et pourraient aboutir, à terme, à une modification de la réglementation actuelle.
Procédures
Les mères seront exposées à des fongicides à des doses réglementaires autorisées dans l'eau potable. La trajectoire du développement comporte l'ouverture des yeux (durée du test : 1 minute), l'examen du conduit auditif (durée du test : 1 minute), le réflexe de sursaut (durée du test : 1 minute), l'acquisition de la marche (durée du test : 1 minute), l'orientation olfactive (durée du test : 5 minutes) et l'activité motrice (durée du test : 10 minutes). À l'âge adulte, les animaux seront évalués pour leur habileté sociale, leur capacité à générer des stéréotypies motrices et cognitives ainsi que leur niveau d'anxiété. Chacun de ces tests durera entre 7 et 15 minutes et ne sera réalisé qu'une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
D’après les expériences réalisées chez nos collaborateurs, l’exposition à des fongicides aux doses réglementaires autorisées ne présente pas d’effets indésirables notoires. Dans les expériences d'exposition aux pesticides menées tout au long de la vie, nous n'avons pas observé de douleur, souffrance, perte de poids ou stress consécutifs au traitement. De plus, en limitant la fenêtre d'exposition, nous ne nous attendons pas à observer d’effets indésirables notoires. Par ailleurs, la dose de fongicide utilisée est la dose maximale réglementaire autorisée dans l'eau potable. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux éthologiques non invasifs
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés soit par exposition au CO2, soit par dislocation cervicale sous légère sédation dans le cas de prélèvements de tissus à des fins d'analyses ex-vivo
Remplacement
La compréhension des mécanismes causaux de l’autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du répertoire comportemental des animaux modèles permet de vérifier que ces modèles valident bien le critère d’aspect pour la pathologie autistique, et aussi d’évaluer le cas échéant l’efficacité d’une approche thérapeutique. L’évaluation des effets bénéfiques d’un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu’au niveau comportemental : en effet, il n’existe pas de marqueur biologique pour l’autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.
Réduction
Nous utilisons des outils statistiques adéquats pour calculer précisément le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser les expériences
Raffinement
Nous raffinerons nos expériences en soulageant l’inconfort ou le stress potentiel subi par les animaux tout au long du protocole expérimental. Nous logerons les souris par groupes sociaux de 2 à 4 individus, mettrons à leur disposition le matériel nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et les manipulerons quotidiennement par le même expérimentateur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons les animaux des deux sexes, les testerons dans différentes tâches et appliquerons les tests statistiques adéquats. Nous ne pouvons toutefois pas nous passer du modèle animal car l’autisme est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant tout son répertoire comportemental. Pendant les expériences, nous suivrons quotidiennement le bien-être de nos animaux, en particulier leur poids et leur posture. Nous mettrons en place des points limites afin d’éviter de faire souffrir inutilement les animaux.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux, chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Les déficits comportementaux détectés chez les souris modélisant l’autisme sont suffisamment importants et robustes pour tester la validité d’aspect du modèle et, le cas échéant, permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les déficits comportementaux fixés.
Enseignement pratique des techniques biologiques en Assistance Médicale à la Procréation
- Formation professionnelle
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent deux injections intrapéritonéales d'hormones de superovulation, puis tous les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale après sédation, pour prélever leurs gamètes. Ces animaux ne servent pas à la recherche mais à l'entraînement de médecins et de techniciens aux techniques de fécondation in vitro. Le porteur affirme que le modèle animal est "incontournable" car il n'existe selon lui aucun autre moyen de se procurer des gamètes que de tuer des animaux.
Objectifs
L'Assistance Médicale à la Procréation (AMP) fait appel à diverses techniques biologiques telles que la préparation de sperme en vue d'assistance médicale à la procréation, la fécondation in vitro, la congélation de gamètes et d'embryons, l'ICSI (Injection Intracytoplasmique de Spermatozoïde), la vitrification d'embryons, entre autres. Ces procédures demandent une haute technicité. Les différentes techniques et en particulier celles liées aux micro-manipulations sollicitent des compétences très spécifiques. Les thérapeutiques employées par les biologistes de la reproduction sont de hauts niveaux et nécessitent des habilitations pour une optimisation et une reproductibilité des résultats. C'est pour développer ces compétences pratiques et manuelles pour tendre vers une autonomie des professionnels de santé que cette formation est proposée. Elle se veut très pratique et elle permet notamment aux apprenants de manipuler des gamètes tout au long du cursus de professionnalisation sur des postes de micro-manipulations dédiés sous l’œil de praticiens aguerris.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de satisfaire les exigences de formation des médecins, pharmaciens, scientifiques et techniciens de laboratoire sur les méthodes de fécondation in vitro, avec ou sans micromanipulation.
Procédures
Chaque femelle recevra deux injections intrapéritonéales, espacées de 48 heures et d'une durée de 30 secondes chacune.
Impact sur les animaux
-Les pratiques de contention et de manipulation peuvent engendrer de stress pour les animaux. -Douleur suite à l’introduction des aiguilles dans les sites d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après une sédation profonde pour le prélèvement des gamètes
Remplacement
Le modèle animal est incontournable car La réalisation de fécondation in vitro nécessite des gamètes. Il n’existe pas d’autre moyen de se procurer des gamètes que de sacrifier des animaux.
Réduction
Aucune statistique n'est nécessaire dans ce projet qui a un but éducatif. L'utilisation des hormones de superovulation a pour but de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour prélever des gamètes, en permettant d'obtenir un plus grand nombre d'ovocytes par ovulation
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux en présence d'enrichissement (igloo et matériel de nidification), la nourriture et l'eau sont ad libitum. La température et l'hygrométrie des salles d'hébergement sont contrôlées et un cycle jour/nuit 12H est en place. L'injection intrapéritonéale sera pratiquée par des personnes habituées à ce geste technique après l’application d’une pommade anesthésiante sur le site d’injection. Un suivi quotidien sera réalisé pour évaluer l'état de santé des animaux, en prenant en compte les paramètres physiologiques, le comportement et l'apparence. Cette évaluation permettra de déterminer les points limites stricts et spécifiques du projet qui, s'ils sont atteints, nécessiteront l'arrêt de la procédure.
Choix des espèces
Les souris B6-CBA-F1 présentent une très bonne réponse à l’hyperstimulation ovarienne et une spermatogenèse de très bonne qualité, permettant des recueils de gamètes favorables à la réalisation de FIV et réduisant le nombre d’animaux nécessaires Les mâles seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines) car les animaux doivent être pubères pour produire des spermatozoïdes matures fécondants. Les femelles seront utilisées en période pré-pubère (6 à 8 semaines) car c’est l’âge où la super ovulation permet de recueillir les plus d’ovocytes matures.
Role des inhibiteurs ERAP dans un modèle de psoriasis chez des souris humanisées BRGSF-HIS
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
440 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Un psoriasis leur est induit par application d'imiquimod avec épilation, puis elles reçoivent par gavage ou injection des inhibiteurs candidats, avec des prélèvements sanguins répétés en rétro-orbitaire sous anesthésie. Le porteur décrit une contention et des gestes générateurs de stress, et prévoit l'euthanasie pour prélever rate et peau. Il revendique un "fort besoin médical" pour le psoriasis et affirme que les modèles plus simples, invertébrés, ne permettent pas de valider l'approche.
Objectifs
Les ERAPs sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour traiter les maladies auto-immunes et autoinflammatoires. Les ERAP 1 et 2 sont des amino-peptidases intracellulaires (métalloprotéases) chargées de la transformation finale des antigènes peptidiques pour présentation par les molécules du CMH de classe I. Ils régulent ainsi la réponse immunitaire adaptative par les lymphocytes T cytotoxiques (LcT) et affectent l'immunodominance en impactant le répertoire peptidique global présenté par le CMH-I. Les enzymes ERAP ont des rôles complémentaires et des fonctions importantes in vivo. Un certain nombre d'haplotypes ERAP sont liés au risque de souffrir de diverses maladies auto-immunes ou auto-inflammatoires, notamment le psoriasis. Un obstacle scientifique est la disponibilité de petites molécules inhibitrices d'ERAP efficaces, sélectives et biodisponibles. Aucun inhibiteur d'ERAP n'a été évalué in vivo jusqu'à présent et les rapports sur la modulation de l'immunopeptidome par les composés ERAP ne sont pas disponibles. L'objectif du projet est d'identifier des inhibiteurs pharmacologiques d’ERAP à travers méthodes intégrés de chimie médicinale (du criblage fonctionnel de la présentation de l'antigène combiné au profilage des immunopeptidomes dans les cellules des patients) et l’évaluation préclinique de leur efficacité thérapeutique dans un modèle de psoriasis chez des souris presentant a systeme immunitaire humain (souris BRGSF-HIS).
Bénéfices attendus
Ce projet et les composés identifiés pourraient ouvrir la voie à des traitements personnalisés des maladies autoimmunes/auto-inflammatoires. A terme, nous souhaitons proposer de nouvelles options thérapeutiques pour la psoriasis qui est maladies à fort besoin médical.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins réalisés en rétro-orbitaire, à partir de J8 et chaque 2 jours après le début du protocole de traitement avec IMQ, jusqu'au sacrifice (J16). Ces prélèvements seront effectués sous anesthésie gazeuse à l'isofluorane 2%. Le volume maximal prélevé sera égal à 200μL. Pour chaque souris, le prélèvement sanguin durera au maximum 5 minutes, y compris la durée de l'anesthésie
Impact sur les animaux
Concernant les molécules candidates qui seront administrés, leur toxicité est préalablement testée par nos partenaires et leur administration tiendra compte des études de toxicité et de pharmacodynamique afin de ne pas avoir d'effets indésirables qui pourraient interférer avec les résultats de l'expérimentation. Cependant, les souris seront soumises à des procédures pouvant générer un stress, comme la contention, afin d'effectuer des traitements de gavage oral ou des ponctions intrapéritonéales ou un prélèvement sanguin sous anesthésie à l'isoflurane à 2 %.
Devenir
A l'issue de la procedure tous les animeaux seront euthanasiés sous anesthésie à l'isoflurane à 2% afin de prélever des échantillons de rate et de peau sur lesquels seront évalués tous les paramètres histologiques et biomoléculaires nécessaires pour définir l'efficacité ou non des composés testés.
Remplacement
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, le criblage d'une série d'inhibiteurs d'ERAP1/2 préalablement modélisés et synthétisés par l'équipe partenairesera réalisé sur des modèles cellulaires, par quantification LCMS-MS. De plus une évaluation de la sécurité sera exprimée sous la forme d'un rapport IC50 et CC50 (test cellulaire à haut contenu d'apoptose ou de nécrose (Caspase-3/7 activité Propidium iodure) et évalué la plateforme Equipex Imaginex. Les inhibiteurs candidats seront préalablement testés par des expériences de pharmacodynamiques afin de garantir une exposition et une voie optimale avant les tests chez les souris BRGSF-HIS
Réduction
Dans le respect des règles des 3R, le nombre minimum d'animaux sera utilisé pour garantir une analyse statistique correcte prenant également en compte la variabilité de l'expression des gènes d'interet et les differents paramètres mesurés. Le nombre d’animaux par groupe de n= 10 est calculé par une approche statistique qui integre la dispersion des valeurs individuelles et qui a été déterminé suite à des expériences pilotes ou sur la base des précédentes publications.
Raffinement
Afin de limiter la douleur, surtout pendant la phase d'épilation, toutes les souris seront traitées avec une injection sous cutanée de buprenorphine a la concentration de 0.05 mg/Kg. Les animaux sont observés et pesés d’une manière quotidienne pour une attention particulière aux points limites suivants: -une modification du comportement (prostration, poils hérissés, cris, blessure) - une perte de poids supérieur à 15%. Les souris montrat de signe de mal-être seront euthanasiées sous anesthésie gazeuse à l'isofluorane 2%.
Choix des espèces
La souris est une espèce modèle très bien documentée dans la littérature scientifique, offrant des outils optimisés pour l’étude des réponses immunitaires et des mécanismes physiologiques intégrés. Des modèles plus simples (invertébrés) ne permettent pas de valider les approches proposées. Le modèle expérimental murin de psoriasis que nous avons choisi d’utiliser est référencé et validé scientifiquement dans de nombreuses publications. Le modèle murin est donc le plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants tout en évitant au maximum la douleur et la souffrance chez l’animal. De plus, la souris BRGSF représente le modèle le plus immunodéficient généré à ce jour, avec un défaut des compartiments lymphoïde et myéloïde murin et représente donc un modèle animal fortement adapté pour la xénogreffe su systeme immunitaire humaine. La souris BRGSF représente le modèle immunodéficient plus efficace généré à ce jour, avec un défaut des compartiments lymphoïde et myéloïde murin, et représente donc un modèle animal fortement adapté pour la xénogreffe de tumeurs humaines et/ou du système immunitaire. L'inflammation cutanée de type psoriasis induite par l'Imiquimod (IMQ) semble liée à une production de cytokines, notamment d'IL23, par les cellules dendritiques. Dans le modèle BRGSF-HIS, nous proposons un boost de cellules dendritiques en utilisant hFlt3L. Comme les souris n'expriment pas ERAP2, l'utilisation d'une version humanisée semblerait être un solution pertinent pour tester les effets des nouvelles molécules basées sur l'inhibition des ERAPs dans la psoriasis. Le souris BRGSF-HIS seront utilisée a 12 semaine de vie, qui représentent le temps pour une reconstitution optimale d'un système immunitaire humain.
Etudes et traitements des maladies du nerf optique
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une atrophie du nerf optique menant à la cécité, elles subissent tatouage, biopsie de la queue, plusieurs anesthésies pour des examens oculaires et, pour une partie, une injection dans l'œil qui peut provoquer une inflammation. Le porteur affirme à plusieurs reprises que ce modèle est le "seul moyen" d'explorer la maladie et de tester des traitements, et que le recours à la souris est "nécessaire" pour la thérapie génique. Les animaux, modifiés ou infectés par des virus, ne peuvent être ni relâchés ni adoptés et sont tués pour prélèvement de tissus, le bénéfice pour les patients étant renvoyé au long terme.
Objectifs
Les objectifs du projet sont d’étudier les mécanismes qui sont responsables de la perte de vision dans les atteintes du nerf optique et d’identifier des traitements capables de protéger le nerf optique. Le projet porte sur une maladie qui entraine une perte de la vision progressive dû à une perte de la fonction du nerf optique qui permet de relier l’œil au cerveau. Il n’existe actuellement pas de traitement pour traiter cette maladie. Nous avons donc généré un modèle animal pour reproduire la maladie et tester des traitements. Ce modèle animal reproduit fidélement les atteintes retrouvées ches les patients. Il est important de noter que ce modèle représente le seul moyen d'explorer les mécanismes responsables de la maladie. Ce modèle est également le seul model qui puisse être utilisé pour tester des traitements sur la rétine. Nous développerons 2 approchent : 1) une étude sur les cellules de la rétine qui sont défectueuses que nous mettrons en culture afin d’étudier leur croissance en réponse à plusieurs traitements. 2) Un axe sur les animaux vivants auquels nous injecterons dans l’œil une protéine connue pour protéger la rétine. Nous mesurerons le bénéfice de cette thérapie sur la fonction visuelle des animaux au cours du temps.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence si notre traitement est capable de protéger la vision des animaux. A long terme ce projet permettra de proposer un traitement de thérapie génique chez les patients atteints de perte de fonction du nerf optique.
Procédures
600 animaux seront identifiés par tatouage pour leur identification et une biopsie de queue pour le génotypage (identification génétique des animaux). 180 de ces animaux seront anesthésiés pendant 30 minutes, 2 fois à une semaine d’intervalle à 3 mois et 5 mois (4 anesthésies en 5 mois) pour les expériences de fond d’œil (10 min par animal) et d’OCT (10 min par animal), ERG (10 min par animal). 120 d’entre eux auront une anéthesie supplémentaire de 20 min pour l’injection intravitréenne (5 minute par animal) à 3 mois (injection unique pour toute la durée du projet). 180 animaux seront anesthésiés pendant 30 minutes, 2 fois à une semaine d’intervalle à 3 mois, 5 mois et 11 mois (6 anesthésies en 11 mois) pour les expériences de fond d’œil et d’OCT, ERG. 120 d’entre eux auront une anéthesie supplémentaire de 20 min pour l’injection intravitréenne à 3 mois (injection unique pour toute la durée du projet). 240 animaux auront une injection intravitréenne, procédure durant 5 min maximum par animaux.
Impact sur les animaux
Les tests fonctionnels sont indolores et pratiqués couramment en ophtalmologie humaine. Les injections induisent une légère lésion au niveau de la sclère de l’œil et peuvent induire une inflammation. Une partie des tests se feront sous anésthésie générale. Après chaque exploration (test), les souris seront observées quotidiennement.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvement de tissus post-mortem. De plus, la plupart des animaux utilisés étants génétiquement modifiés et/ou infectés par des virus génétiquement modifiés eux aussi, il nous est impossible de replacer ou de faire adopter ces animaux. Ils seront donc euthanasiés à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Nous avons généré une souris reproduisant une maladie qui entraine une baisse progressive de l’acuité visuelle dû à la perte du nerf optique. Il n’y a pas de traitement. Il est important de noter que ce modèle représente le seul moyen d'explorer les mécanismes responsables de la maladie et de tester des traitements. Dans le cadre d'essais cliniques de thérapie génique, le recours à la souris est necessaire et permet d’apporter une indication de l’efficacité du traitement.
Réduction
Notre projet étudie toutes les souris qu’elles soient porteuses de mutation ou non. Nous avons également constaté une différence d’atteinte chez les mâles et les femelles, de ce fait notre étude prend en compte mâles et femelles. Les mêmes animaux seront étudiés à 3, 5 et 11 mois avant leur euthanasie.
Raffinement
Tous les tests comportementaux présents dans ce projet sont effectués sur animal éveillé ou sous anesthésie. Les animaux sont placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu'au réveil. Après toutes analyses, les souris seront observées quotidiennement. Si des animaux montrent des signes de douleurs ou de souffrances nous évaluerons cette souffrance et nous prendrons les décisions nécessaires afin de réduire la durée et l’intensité de la souffrance et y mettre fin.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris, car c’est le modèle mammifère de référence pour étudier l’impact d’une mutation d’un gène sur l’organisme. La souris modèle que nous avons générée porte la mutation la plus souvent retrouvée chez les malades (30% des cas) atteints d’atrophie optique dominante, une maladie dans laquelle le nerf optique disparait et qui rend aveugle. Ce modèle reproduit les caractéristiques cliniques de la maladie chez l’homme. Cette souris est donc un très bon modèle animal pour tester des traitements. Les animaux seront testés à 3 jours après la naissance pour faire des cultures de cellules rétiniennes. Ce stade est le stade utilisé pour avoir les meilleurs résultats. Des traitements seront testés sur ces cellules afin d’identifier des molécules protectrices des cellules ganglionnaires de la rétine. Les animaux génétiquement modifiés reproduisant la maladie seront traités par thérapie génique à l’âge de 3 mois et leur vision sera explorée au cours du temps (à 5 et 11 mois) afin d’évaluer le bénéfice thérapeutique de l’approche de thérapie génique. Des prélèvements de rétines seront réalisés sur les animaux de 5 et 11 mois après euthanasie afin d’évaluer l’effet du traitement sur la morphologie de la rétine.
Evaluation par microscopie intravitale des effets de la Photobiomodulation sur l’inflammation chronique et aiguë suivant un traumatisme de la moelle épinière
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Toutes reçoivent l'implantation d'une fenêtre vitrée dans la colonne vertébrale, et 420 d'entre elles une section partielle de la moelle épinière qui provoque une paralysie postérieure temporaire, avec difficultés à s'alimenter et à vider la vessie. Le porteur teste ensuite un traitement par lumière et compare la récupération à celle de 300 souris non lésées, avec des prélèvements sanguins deux fois par semaine et une mise à mort par perfusion intracardiaque. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ou in silico ne rend compte de la complexité du traumatisme médullaire, les bénéfices annoncés restant formulés au conditionnel.
Objectifs
Ce projet mettra en place un modèle murin de traumatisme médullaire permettant de clarifier les mécanismes neuroinflammatoires régulés par ce traitement, en vue d'accélérer et maximiser la récupération fonctionnelle. Il s'agit donc non seulement d'un enjeu de recherche fondamentale mais aussi de recherche cliniquement applicable.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’évaluer le traitement par photobiomodulation en fonction d’une application précoce, tardive ou combinée et de comparer l’évolution des densités cellulaires et de la récupération sensori-motrice post-traumatique avec celles observées pour des animaux lésés mais non traités. Ainsi nous pensons pouvoir mettre en évidence un effet anti-inflammtoire et neuroprotecteur de la PBM appliquée en phase aiguë immédiatement après le traumatisme et pendant 5 jours consécutifs. Nous pensons également pouvoir mettre en évidence un effet neurotrophique et neuro-régénératif de la PBM dans les phases chroniques grâce à une action directe sur la microglie après exposition brève pendant 5 jours à compter de la 5ème semaine post-traumatique. Si tel est le cas, la combinaison de ces deux protocoles thérapeutiques permettra d’amplifier les effets positifs de la lumière et d’accélérer, sinon de maximiser, la récupération fonctionnelle post-traumatique.
Procédures
Sur cinq ans, la totalité des 720 animaux seront soumis à une chirurgie pour implanter une fenêtre vitrée spinale permettant de réaliser des expériences de microscopie intravitale longitudinale sous anesthésie. L’implantation d’une fenêtre vitrée n’induit pas de nuisance majeure pour la locomotion et le comportement de l’animal non lésé. 420 souris seront de plus soumises à une transection partielle de moelle épinière thoracique (hémisection) de laquelle elles récupèrent spontanément au bout de 6 à 7 semaines en l’absence de traitement. 92% de ces animaux traumatisés recevront un traitement de 6 min de photobiomodulation quotidienne appliquée pour 5 jours consécutifs soit immédiatement au moment du traumatisme, soit un mois après, soit combiné (immédiat et un mois après). La durée des expériences sera limitée à 60 jours post-trauma. La réponse au traitement de ces animaux sera comparée à celle de 300 animaux non lésés. Les sessions d’imagerie intravitale ne sont pas douloureuses, ni destructives. Sur tous les animaux, la réponse musculaire réflexe sera évaluée 2 fois par semaine sous anesthésie volatile légère grâce à des enregistrements électromyographiques de la contraction musculaire induite par stimulation du nerf tibial. Sous anesthésie gazeuse également, des prélèvements sanguins seront réalisés 2 fois par semaine à raison de 50 µl par prélèvement sans dépasser un volume maximum équivalent à 7,5% de la volémie totale de nos animaux chaque semaine. Ces prélèvements n'auront lieu qu'après reprise du poids initial de l'animal. Tous les animaux seront mis à mort dans les 60 jours suivant le traumatisme initial et soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/CSF nécessaires aux études et caractérisations post-mortem.
Impact sur les animaux
Les différentes techniques d'exploration utilisées dans ce projet sont suceptibles d'engendrer les nuisances suivantes : anesthesie, implantation de fenetre vitrée spinale, lésion de moelle épinière, gêne locomotrice : paralysie temporaire unilaterale postérieure pouvant occasionner une difficulté à la prise alimentaire, risque éventuel de difficulté de la vidange de la vessie peut-être observé dans les premiers jours, traitement quotidien par photobiomodulation non invasive, l'hébergement en cage individuelle, stress et/ou douleur, prélèvements sanguins. Des électrodes adhésives sont proposées en lieu et place d’électrodes implantées. Prelevement LCR par citerne et perfusion intracardiaque.
Devenir
Tous les animaux (720) seront euthanasiés dans les 60 jours suivant le traumatisme initial et soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/LCR nécessaires aux études et caractérisations post-mortem.
Remplacement
Les pathologies neurodégénératives et traumatismes médullaires sont des processus complexes impliquant l’interaction entre de très nombreux organes et systèmes physiologiques (nerveux, immunitaire, endocrinien, cardiovaculaire… ) qu’il est nécessaire d’analyser et de comprendre. Aucun modèle cellulaire ou aucun modèle in silico ne sont aujourd’hui en mesure de rendre compte de cette complexité. L'importance de l'interaction entre les axones, la myeline, les vaisseaux sanguins et les autres types cellulaires (microglie et astrocyte) rend la mise en place d'un système in vitro reproduisant toutes les composantes trop complexe et n'est pas envisageable. Le modèle d’hémisection est nécessaire pour permettre de tirer des conclusions sur les mécanismes de récupération fonctionnelle. La procédure de thérapie par photobiomodulation dans notre modèle est une étude pré-clinique visant à ouvrir la voie à des essais cliniques pour des applications dans le traitement du traumatisme de moelle sachant que celle-ci est dors et déjà appliquée sur l'humain dans le cadre d'études cliniques pour le traitement de la maladie d'Alzheimer et des contusions cérébrales chez les sportifs. Dans notre cas, un des critères principaux de l'effet du traitement est l'évolution des capacités motrices, avec et sans traitement, au cours du temps. Cette étude ne pourrait donc pas etre réalisée autre que in-vivo.
Réduction
Sur la base de nos travaux passés, les lots d’animaux sont dimensionnés au minimum pour s’assurer de la significativité statistique des quantifications in vivo et sur tranches en utilisant le test statisitque dédié aux petits échantillons. Ce test nous a permis de définir le nombre d'animaux requis pour l'étude. Ainsi il est nécessaire de réaliser la quantification in vivo pour 8 animaux par groupe à J60. Compte tenu d’une probabilité d’environ 70% d’obtenir une fenêtre claire sur deux mois post-traumatiques suivant l’expertise des expérimentateurs chirurgiens, il est prévu d’utiliser 12 animaux par groupe pour les expériences intravitales. Les expériences d’imagerie sur coupes histologiques sont moins bruitées et permettent de moyenner l’analyse sur un plus grand volume de tissus pour obtenir des résultats moins variables. Le nombre d’animaux nécessaires à chaque temps est donc de 3 au lieu de 8 in vivo. Afin de couvrir les 6 temps d’intérêts, 18 animaux seront nécessaires par groupe pour réaliser les expériences d’immunohistochimie. Le nombre de 720 animaux a donc été établi afin d'avoir un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe permettant d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences avec significativité statistique. Le modèle souris est choisi en raison de sa très bonne récupération spontanée suite à un traumatisme de moelle, récupération que nous souhaitons accélérer par une prise en charge thérapeutique de type clinique tout en étudiant dans le même temps l’implication du système immunitaire. Les mêmes animaux et les mêmes données servent ainsi à la recherche fondamentale ET à la recherche applicative.
Raffinement
Reception et adaptation de 7 jours. Après induction à l'isoflurane, injection de buprénorphine, les animaux sont anesthésiés avec injection intrapéritonéale d'une solution de kétamine et xylazine; ces doses sont augmentées de 50% avant la perfusion intracardiaque pour anesthésie profonde pré-opératoire et mis sur un tapis chauffant. Les yeux sont oints de gel hydratant, une infiltration de lidocaine est appliquée avant toute incision. Après laminectomie, Une injection sous-cutanée d'une solution d'anti-inflammatoires, dexamethasone et rimadyl, est réalisée le jour de la chirurgie puis tous les deux jours pendant 10 jours. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles respectant la surface minimale requise, avec objet d’enrichissement de l’environnement (dômes en carton ou en plexiglas ou encore coton). un accès non limité à la nourriture et l’eau, un cycle de 12h jour et 12 nuit, une température et une humidité contrôlées. Les animaux sont visités tous les jours par des personnes compétentes dans le domaine de l’expérimentation et du bien-être animal comme attesté par les autorités référentes. Pour s'assurer de la bonne vidange de la vessie le bas du ventre de chaque animal est palpé 2 fois par jours. Dans le cas éventuel où la vessie ne se viderait pas, nous appliquons des massages jusqu'a vidange de celle ci. Du gel sucré énergétique est mis à disposition au fond de la cage pendant la procédure afin de s’assurer que l’animal a les apports énergétiques dont il a besoin. Le recours à l’anesthésie a lieu aussi souvent que nécessaire pour limiter le stress ou la douleur inhérentes aux manipulations requises pour les prélèvements ou les sessions d’imagerie. Les animaux sont pesés quotidiennement les 5 premiers jours avec pour poids de référence le poids avant la procédure chirurgicale. Une variation de plus de 20% pendant plus de 3 jours, malgré la supplémentation sous-cutanée en solution sucrée, sera considérée comme un point limite. Les procédures choisies s seront accompagnées d'un suivi rigoureux des signes cliniques (score de douleur: Grimace scal Langford et al). La mise a mort de l'animal sera effectuée s'il atteint son point d'arrêt.
Choix des espèces
Nous utilisons la microscopie de fluorescence intravitale. Il est donc nécessaire d’étudier des animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents. Nous disposons d’une lignée unique, établie et caractérisée depuis plusieurs années par notre équipe et dans laquelle les populations cellulaires d’intérêt sont génétiquement marquées de différentes couleurs. Le phénotype de ces cellules est aujourd’hui très bien caractérisé par nos travaux précédents. Ceci évite de perdre des animaux en mise au point de protocole. Dans le cadre du traumatisme de moelle, la souris démontre une très bonne récupération spontanée tout en impliquant des processus physiologiques fortement similaires à ceux rencontrés chez l’humain : neurodégénération et repousse de colatérales d’axones, angiogénèse et recrutement de cellules inflammatoires, gliose réactionnelle… Les observations sont donc facilement transférables au contexte clinique. Les vastes connaissances actuelles sur l’organisation de la moelle épinière chez la souris et sur son comportement en font un modèle pré-clinique de choix dans lequel les signes de douleur ou souffrance sont aisément détectables et interprétables. Tous les animaux seront de animaux adultes de plus de 10 semaines sans limitation d’age pour rendre compte de la diversité des âges observée chez les patients traumatisés médullaire. Seront néanmoins exclus les animaux de moins de 10 semaines pour s’affranchir des phénomènes inhérents au développement, tant pour des raisons méthodologiques de pose de fenêtre vitrée que pour des raisons physiologiques liée à la plasticité des jeunes animaux. Les deux sexes seront utilisés pour rendre compte de la diversité des cas observés chez les patients lésés médullaires.
Chirurgie expérimentale : formation réglementaire destinée aux personnes concevant ou réalisant des procédures expérimentales chirurgicales sur des animaux
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 480
930 souris et rats vont être utilisés pour une formation réglementaire à la chirurgie, la plupart tués sous anesthésie sans réveil, certains réveillés puis suivis quatre heures avec une douleur postopératoire possible. Chaque animal sert à une intervention abdominale ou thoracique réalisée par un stagiaire après démonstration, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des personnels. Le porteur indique que les stagiaires s'exercent d'abord sur des supports inertes, cuisses de poulet et rats en plastique, et affirme qu'aucun modèle inerte ne reproduit les signes d'anesthésie profonde et de réveil. Il justifie l'ensemble par le caractère obligatoire de la formation et le "besoin" d'acquérir les bases chirurgicales.
Objectifs
Le projet consiste à réaliser des travaux pratiques sur Rongeurs (rats et souris) au cours des sessions du « module spécialisé en procédures chirurgicales » de la formation spécifique en expérimentation animale, destiné aux concepteurs de projets intégrant des interventions chirurgicales et aux personnels réalisant ces procédures chirurgicales. Cette formation réglementaire est obligatoire pour être autorisé à pratiquer des actes chirurgicaux sur l’animal. L’objectif est d’enseigner aux stagiaires les bases en chirurgie : rappels d’anesthésie, monitoring, gestion de la douleur pré-/per-/post-opératoire, sutures, cicatrisation, asepsie et d’acquérir des bases pour la réalisation de gestes chirurgicaux. Les stagiaires s’entrainent sur des supports inanimés (cuisses de poulets pour les sutures, rat MD-PVC pour les microsutures) avant de passer sur l’animal anesthésié. Plusieurs types d’interventions chirurgicales sont réalisées afin d’avoir une approche pluridisciplinaire (chirurgie abdominale, thoracique). Chaque stagiaire dispose d’un animal pour réaliser chaque intervention après démonstration de la technique par vidéo puis mise en œuvre par un intervenant compétent. Il y a donc une progression dans la compréhension de la technique avant sa mise en œuvre par le stagiaire. Chaque intervenant supervise au maximum 5 stagiaires afin d’assurer un encadrement de qualité. Pour réaliser ces travaux pratiques 15 souris et 16 rats maximum sont utilisés à chaque session soit sur 5 ans et pour 6 sessions de formation par an un total maximal de 480 rats et 450 souris.
Bénéfices attendus
Les formations réglementaires en chirurgie sur l’animal sont obligatoires et ont pour objectif de former les personnels impliqués dans ces procédures afin de minimiser les contraintes imposées aux animaux. Il leur est nécessaire d’acquérir les bases en chirurgie afin de garantir la mise en oeuvre de bonnes pratiques vétérinaires, tant éthiques que techniques. A l’issue de la formation, les stagiaires connaissent les points-clés indispensables à cette mise en œuvre éthique et responsable des protocoles de chirurgie.
Procédures
les animaux sont soumis à des procédures chirurgicales effectuées sous analgésie et anesthésie (1 procédure par animal). Chaque procédure chirurgicale est d’abord montrée par un intervenant qualifié et elle dure de l’ordre de 30 à 45 minutes. Lorsque les procédures sont mises en œuvre par les stagiaires, elles durent entre 1h et 1h30.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés pour la formation subissent une chirurgie qui peut avoir des effets indésirables : mauvaise mise en place de l’analgésie/anesthésie, détresse respiratoire, chute de température centrale. Les souris peuvent subir une lègère douleur au point de piqure lors de l’adminsitration de l’anesthésique par voie intrapéritonéale. La plupart des souris ne sont pas réveillées après le geste chirurgical. Celles dont le réveil est suivi pendant 4 heures peuvent ressentir une douleur post-opératoire. L’anesthésie des rats est induite par de l’isoflurane : ils peuvent subir un stress au moment de les placer dans la cage d’induction. Ils ne sont pas réveillés.
Devenir
Ces procédures sont mises en oeuvre dans le cadre d'un stage de formation aux bonnes pratiques chirurgicales. Les animaux sont euthanasiés à l'issue de la mise en oeuvre du geste technique(1 procédure par animal). Chaque procédure chirurgicale est d’abord montrée par un intervenant qualifié et elle dure de l’ordre de 30 à 45 minutes. Lorsque les procédures sont mises en œuvre par les stagiaires, elles durent entre 1h et 1h30.
Remplacement
Il s’agit de former aux bons gestes chirurgicaux. Les stagiaires commencent par pratiquer sur des supports inertes (cuisses de poulet, rats plastiques) puis ils mettent en œuvre 2 gestes chirurgicaux (procédures 1 et 2) après démonstration et sous supervision des enseignants. Il n’existe actuellement pas de modèle inerte permettant l’observation des signes d’anesthésie profonde et de réveil et un abord le plus précis et le moins invasif possible d’un organe. Quand cela est possible pour un bon apprentissage des gestes, les modèles plastiques sont utilisés. C’est le cas d’une des procédures qui est réalisée uniquement en démonstration par les enseignants : 1 seul animal est concerné par groupe de TP et par séance, les stagiaires reproduisant les gestes sur des modèles de vaisseaux en silicone.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste : 1 animal par démonstration de procédure et 1 animal par stagiaire pour les 2 premiers gestes (pas d’animal pour les stagiaires pour le 3e geste), auxquels on ajoute 2 rats et 4 souris supplémentaires par stage pour tenir compte des aléas chirurgicaux. Il y a 10 stagiaires par session, 6 sessions par an et la demande est faite pour 5 ans. Au total pour 5 ans, 930 Rongeurs : 450 souris et 480 rats.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des locaux conformes à la réglementation. Il s’agit d’animaux surnuméraires issus du pôle élevage de l’animalerie, ou ils sont exceptionnellement achetés chez un éleveur agréé lorsqu’il est nécessaire de compléter les lots. Ils sont habitués aux locaux de stabulation et à la manipulation pendant une semaine minimum avant les expérimentations. Les cages sont enrichies en nid végétal pour les souris et en buchettes à ronger pour les rats. Lors des chirurgies, une analgésie pré-opératoire est mise en place et, pour les rats, une sédation est d’abord induite avant d’installer l’anesthésie. En cas de besoin, une demi-dose du mélange anesthésique est administrée et/ou un relais est fait par de l’anesthésique local. Tout au long de l'hébergement et des procédures, la surveillance quotidienne permet de vérifier l'état de santé des animaux et des points limites précoces et adaptés sont mis en place.
Choix des espèces
Pour apprendre à gérer le stress inhérent à toute chirurgie, il est nécessaire en plus de l’apprentissage des gestes techniques sur des supports inertes de se placer dans les conditions réelles et donc de manipuler l’animal. La formation est essentiellement axée sur les Rongeurs (rat et souris) qui représentent plus de 80 % des animaux utilisés dans le cadre des procédures expérimentales. La formation est effectuée sur des animaux adultes car ils sont de gabarit adapté d'un point de vue pédagogique
Mécanismes des récepteurs du glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement chez la souris 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles subissent une ou deux chirurgies du cerveau, implantation d'électrodes de deux à six heures et injection de virus, suivies d'enregistrements de l'activité neuronale et de tests de mesure de l'anxiété et de la peur. Le porteur décrit une recherche fondamentale sur des récepteurs au glutamate et affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour préserver un réseau neuronal intact chez le rongeur. Les applications thérapeutiques pour les troubles anxieux sont annoncées à long terme, l'euthanasie servant à des analyses histologiques post-mortem.
Objectifs
Le projet, qui se déroulera dans deux établissements, a pour but d’étudier des récepteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le système nerveux central des vertébrés. Ces récepteurs jouent un rôle central dans la communication et le fonctionnement de nos neurones, ainsi que dans les mécanismes associés à l’apprentissage et la mémoire. Ces récepteurs au glutamate étant également impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), ils constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’un des récepteurs au glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement, dans un cadre physiologique et pathologique. Il s’agira notamment de comprendre l’importance de ces récepteurs dans la formation et la stabilisation des souvenirs associant un contexte à une émotion donnée et leur implication dans les comportements liés à l'anxiété. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à la réactivation et la coordination de plusieurs structures cérébrales pendant l'exécution et la consolidation des souvenirs aversifs dépendante du sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements in vivo chez des souris libres de leurs mouvements et endormies. L'identification des processus de formation de souvenirs émotionnels est essentielle pour comprendre comment ces processus sont affectés dans la maladie. Ce projet devrait permettre des avancées scientifiques sur les mécanismes et la diversité des récepteurs du glutamate, sur la régulation des signalisations neuronales et des fonctions cérébrales et comportementales associées. Notre travail ouvrira de nombreuses perspectives tant avec des implications importantes sur notre compréhension de la neurotransmission et le développement de nouveaux agents protecteurs contre les troubles neurologiques et psychiatriques. Ainsi des retombées sont attendues tant dans le domaine fondamental qu’appliqué (développement de nouvelles stratégies thérapeutiques).
Bénéfices attendus
Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ces troubles touchent environ 15 à 20 % de la population à un moment ou un autre de leur vie. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.
Procédures
Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr) avec ou sans comportement (1h maxi / jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) comportement (mesure de l’anxiété ou de la peur), 2) injection de virus + comportement, 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones + comportement. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui, selon les besoins, pourra permettre des prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes (hors enregistrement de l’activité neuronale et comportement) est réalisés sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement nécessaire à la préservation des électrodes implantées (stress modéré) ; comportement (stress modéré).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem).
Remplacement
Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.
Réduction
Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 2104 animaux.
Raffinement
Après leur réception, les animaux sont habitués aux expérimentateurs par une manipulation bienveillante pendant 5jrs (5min) de manière à réduire le stress lors des procédures. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes ou individuellement et disposeront d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur, les animaux seront exclus du protocole. Les procédures comportementales sont modérément aversives et brèves et n'induisent pas d'angoisse sur le long-terme.
Choix des espèces
Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Sa robustesse et ses capacités d'apprentissage la qualifient comme un modèle idéal d'étude de la mémoire chez les mammifères. Nous utiliserons des souris non génétiquement modifiées et des souris génétiquement modifiées dans le cadre de ce projet. Ces souris se développent normalement et ont un comportement général sans anomalies évidentes. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.
Intérêt de l’administration intra-articulaire de nouveaux Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens dans le traitement de l’arthrose.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une injection de monoiodoacétate dans l'articulation leur provoque une arthrose douloureuse et durable, avec boiterie et difficultés d'appui, avant l'essai de nouveaux anti-inflammatoires par la même voie. Le porteur reconnaît que le modèle, non résorbable, interdit toute réutilisation des animaux. Sur le remplacement, il affirme que la culture cellulaire ne rend pas compte de la composante inflammatoire et conclut que le passage par la souris est "inévitable", alors que les retombées pour les patients arthrosiques restent renvoyées au conditionnel et au long terme.
Objectifs
L’arthrose est une pathologie qui touche principalement les personnes âgées et dont la prévalence est en constante augmentation. Pour autant, à l’exception de la mise en place de prothèse, il n’existe aucun traitement de fond efficace. En effet, actuellement, aucune thérapeutique anti-arthrosique capable de réparer ou prévenir la dégradation du cartilage n’est disponible. Les traitements préconisés sont essentiellement symptomatiques et visent à soulager les douleurs et la gêne fonctionnelle. Parmi eux, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) constituent la première ligne de traitement pour la prise en charge de l’arthrose. Cependant, ils ne sont pas dénués d’effets secondaires (toxicités digestives et cardiaques), ce qui limite leur utilisation chronique par voie orale chez les personnes âgées ou souffrant de comorbidités. Lorsque la prise en charge de la douleur n’est plus maitrisée, la prothèse est envisagée. Malheureusement certains patients sont non éligibles à cette technique chirurgicale et l’arsenal thérapeutique pour les « soulager » demeure insuffisant, malgré la visco-supplémentation ou les infiltrations de corticoïdes dont l’efficacité est temporaire (environ 3 mois) et qui de plus conduiraient à long terme à un effet délétère sur le cartilage. C’est sur la base de ce constat que repose notre projet soutenu par la Société Française de Rhumatologie (SFR). Nous proposons en effet d’améliorer l’efficacité des AINS tout en diminuant les effets indésirables de la voie orale en choisissant une administration d’AINS par voie intra-articulaire. Pour autant, les AINS étant rapidement éliminés de l’espace articulaire suite au renouvellement constant du liquide synovial, nous souhaitons augmenter le temps de résidence de l’AINS au niveau articulaire en fonctionnalisant les molécules par une structure de type ammonium quaternaire présentant une forte affinité pour les charges négatives des protéoglycanes du cartilage.
Bénéfices attendus
Les données recueillies à la suite de ce projet nous permettront d’évaluer l’intérêt de nouveaux anti-inflammatoires non stéroidiens pour des administrations i.a. en termes d’optimisation de l’effet antalgique, de diminution de l’inflammation et d’impact sur la dégénérescence articulaire. Si la preuve de concept est validée, cette stratégie pourrait permettre à plus long terme d’améliorer la prise en charge symptomatique des 10 % de patients arthrosiques pour lesquels l’indication de prothèse n’est pas retenue ou contre-indiquée, et pour lesquels la prise en charge de la douleur reste encore sans réelle solution.
Procédures
Tous les animaux subiront dans un premier temps une injection en intra-articulaire de MIA ou de NaCl sous anesthésie (intervention de 1 à 2 minutes). Les traitements seront réalisés par injection en intraarticulaire sous anesthésie (intervention de 1 à 2 minutes) Les examens d'imagerie seront réalisés sous anesthésie. La durée de l'anesthésie dépendra de l'examenet variera entre 10 minutes et 1h30.
Impact sur les animaux
Le modèle MIA est un modèle qui induit une douleur arthrosique qui se met en place progressivement. L’injection de MIA en intra-articulaire entraine une augmentation de la sensibilité nerveuse. Les effets indésirables sont donc de la douleur ainsi que des problèmes de locomotion (boiterie, difficultés d’appuis, …). Une légère perte de poids peut être observée les premiers jours post induction. Concernant, les injections intra-articulaires des traitements, les effets sont comparables à l’administration de sérum physiologique en intra-articulaire et ne génèrent ni douleur, ni effets indésirables.
Devenir
Tous les animaux devront être euthanasiés en fin d'expérimentation pour différentes analyses réalisées sur les pattes. De plus, ce modèle générant une arthrose douloureuse non résorbable, les animaux ne peuvent pas être réutilisés.
Remplacement
La culture cellulaire ne représente pas la complexité du vivant et notamment sa composante inflammatoire. Les études sur cellules nous permettent de réaliser une première sélection des molécules mais doivent être complétées par des études chez l’animal, d’autant plus lorsqu’il s’agit de vectorisation, comme c’est le cas ici. Le passage sur un modèle animal est donc inévitable pour juger de façon optimale notre stratégie thérapeutique.
Réduction
Pour la réalisation des études préliminaires, nous avons constitué des groupes de 10 souris ce qui correspond au nombre de souris minimal nécessaire à la réalisation des analyses de caractérisation souhaitées avec une bonne significativité. Dans le cas où lors de cette phase, l’une des molécules se révèlait nettement moins intéressante que les deux autres, elle serait abandonnée. L'étude relative à l'évaluation des molécules selon un protocole d'administration répétée comprenant deux stades de sacrifices pour des analyses histologiques, nous avons constitué des groupes de 30 souris. Ce nombre correspond au nombre minimal de souris qui nous permettra d’obtenir les données suffisantes attendues et de façon significative pour pouvoir réaliser l’ensemble des analyses et obtenir une réponse définitive sur l’efficacité du traitement sans avoir besoin de recommencer le protocole.
Raffinement
Le modèle animal MIA étant un modèle de douleur, une surveillance accrue sera mise en place notamment par le suivi du score clinique. Une attention particulière sera effectuée quant à la locomotion et un suivi du poids tous les deux jours sera réalisé. En effet, un problème de locomotion pourrait gêner les déplacements et l’accès à la nourriture située en hauteur. Dans ce cas-là des dispositions seront prises telles que la nourriture directement dans la cage.
Choix des espèces
Le modèle d’inflammation MIA que nous avons choisi dans ce projet est très couramment utilisé et caractérisé chez le rongeur (rats ou souris). Nous avons choisi ici le modèle souris. Les souris seront utilisées à 8 semaines, un stade pour lequel leur articulation est suffisamment développée pour l’injection en intra-articulaire.
Etude de la dangerosité cutanée de substance chimique, agrochimique ou pharmaceutique sur la santé humaine par l’utilisation d’un modèle de cobaye.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
2820 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré modéré. Des substances chimiques, agrochimiques ou pharmaceutiques sont appliquées sur leur peau rasée et injectées dans le derme pour vérifier si elles provoquent une allergie, selon deux tests réglementaires (Magnusson-Kligman et Buehler). Le porteur décrit des effets locaux pouvant aller jusqu'à la nécrose du derme, des escarres, des croûtes et une destruction de l'épiderme, ce qui contraste avec la gravité seulement "modérée" retenue. Il affirme que les modèles in vitro ne sont pas encore assez élaborés et que ces tests restent imposés par la réglementation européenne.
Objectifs
Le but du projet est d’évaluer la toxicité des produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques pour définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Un des paramètres étudiés pour évaluer la toxicité d’un produit chimique est de savoir s’il peut induire une réation allergique par contact cutané. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaires européennes. Pour répondre aux obligations règlementaires avant mise sur le marché de produit chimique, agrochimiques et pharmaceutiques nous réaliserons des tests de sensibilisation cutanée sur le modèle du cobaye (SMK : test de sensibilisation cutanée sur cobaye selon Magnusson et Kligman ou SMB : test de sensibilisation cutanée sur cobaye selon Buehler). Pour cela, le produit à tester est appliqué sur la peau rasée du cobaye afin de vérifier, par l’observation d’érythème, si une réaction allergique se produit.
Bénéfices attendus
Le projet permet d’évaluer la dangerosité sur la santé humaine liée à une àune substance chimique, agrochimique ou pharmaceutique. Ces études de toxicité permettront de définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Sur un plan plus large, ces évaluations basées sur des normes reglementaires très strictes permettent d’évaluer l’inocuité de médicaments ou denrées alimentaires à usage humain ou vétérinaire.
Procédures
- SMK : sur 15 animaux vigiles, 6 injections intradermiques, une application locales occlusive pendant 48h et une application locale pendant 24h. 3 pesées, observations locales. Injection intrapéritonéale pour la mise à mort - SMB : sur 30 animaux vigiles, 3 à 9 applications occlusives locales de 24 heures, 3 pesées, observations cliniques quotidiennes. Injection intrapéritonéale pour la mise à mort.
Impact sur les animaux
Un phénomène de sensibilisation peut apparaître. Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Les effets locaux peuvent rester jusqu’à la fin de l’étude, soit 35 jours. Selon l’intensité des effets observés, s’il y a atteinte des points limites alors l’animal peut être euthanasié pour raison éthique avant la fin de l’étude. Il peut y avoir, assez rarement, des effets de toxicité systémique. - test SMK : À la suite des injections intradermiques, il peut y avoir de l’érythème allant jusqu’à la nécrose du derme. À la suite des applications locales, peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une desctruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée. - test SMB : peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une desctruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée.
Devenir
SMK et SMB : Les animaux ayant reçu des traitements sur différentes parties de leur corps ceux-ci ne peuvent donc pas être réutilisés pour une procédure différente ultérieurement. Ils sont donc mis à mort en fin d’essai.
Remplacement
Les relations quantitatives structure-activité et les modèles in vitro ne sont pas encore suffisamment élaborés à l’heure actuelle pour jouer un rôle significatif dans l’évaluation du potentiel de sensibilisation cutanée des substances chimiques à tester. On doit donc continuer à déterminer ce potentiel sur des modèles in-vivo. L’évaluation du potentiel sensibilisant des produits chimiques est de plus imposée par la règlementation européenne pour leur mise sur le marché. Conformément à la réglementation des produits chimiques, deux tests in vitro sont réalisés sur les produits et doivent être négatifs avant de passer chez l'animal pour étudier le pouvoir sensibilisant du produit d'essai.
Réduction
Des essais préliminaires sont réalisés afin de déterminer pour l’essai principal les doses non irritantes par application topique, non nécrosantes par injection intradermique et ne présentant pas de toxicité systémique et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les normes demandent de réaliser des groupes témoins positifs à chaques tests. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ces tests, nous réalisons un test témoin positif tous les six mois et non à chaque essai.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages communes par 2 ou 3, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles contiennent de la litière constituée de particules de bois résineux déshydratée puis tamisée et un tunnel en carton comme enrichissement. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et la litière souillée est remplacée par de la litière propre 3 fois par semaine. En cous d’étude (pendant une phase de repos) les animaux sont passés en cages plus grandes, par 5, toujours dans un souci de respect des règles de bien être animal (surface au sol). Des essais préliminaires sont réalisés afin de déterminer pour l’essai principal les doses non irritantes par application topique, non nécrosantes par injection intradermique et ne présentant pas de toxicité systémique et donc de limiter toute souffrance animale inutile. Des points limites sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux.
Choix des espèces
Le cobaye reste le modèle de choix utilisé pour les tests de sensibilisation cutanée, comme le décrit la ligne directrice de la norme que nous suivont qui a été révisée en 2022. De plus la capacité de sensibilisation du cobaye est assez voisine de celle de I'homme. L’espèce et le stade de développement des animaux est imposé par les normes correspondantes. Cobayes jeunes adultes de 3 à 6 semaines pesant au moins 300g au début d’étude et arrivant à environ 800g à 1kg en fin d’étude. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.
Développement sur modèle murin de nouveaux vecteurs thérapeutiques pour le traitement des hémoglobinopathies Beta
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Les souris de ce projet portent des altérations génétiques qui provoquent une immunodéficience sévère et les rendent vulnérables aux infections microbiennes, et elles reçoivent entre cinq et sept semaines d'âge une greffe de cellules souches humaines. 2 058 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole énumère des anesthésies, un conditionnement chimiothérapeutique injecté dans le péritoine, sept injections sous la peau, une injection de cellules souches dans la veine, des prises de sang, une séance d'imagerie intravitale et la pose chirurgicale d'une pompe osmotique. Pour tester des vecteurs censés traiter la bêta-thalassémie et la drépanocytose en modifiant les cellules souches directement dans le corps, le porteur écrit que la nature du projet "nous oblige naturellement à nous tourner vers un modèle animal proche de l'homme".
Objectifs
La β-thalassémie et la drépanocytose sont les maladies héréditaires génétiques les plus fréquentes au monde. Elles sont dues à des mutations génétiques causant de nombreux symptômes ainsi qu’une réduction de l’espérance de vie (40 ans). Des thérapies géniques sont développées depuis des années afin de guérir ces maladies. Cependant, ces traitements nécessitent la manipulation des cellules souches hors du corps de chaque patient avant leur transplantation. Ce genre de manipulation est complexe et présente plusieurs limitations techniques. De plus, les traitements actuels nécessitent que les patients subissent une chimiothérapie dont les conséquences sont lourdes pour l’organisme. Nous proposons dans ce projet de contourner toutes ces limitations et d’améliorer l'efficacité de ces thérapies en testant une nouvelle génération de vecteurs thérapeutiques ciblant directement les cellules souches à l’intérieur du corps du patient.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet apporteront une preuve de concept de l’application de nos stratégies de modification du génome par administration directe dans la circulation sanguine. Ces nouveaux traitements permettront d’augmenter l’efficacité des thérapies actuelles et de réduire à la fois leur coût et la souffrance des patients.
Procédures
Anesthésie gazeuse (2X), 30s à 15min. Anesthésie profonde (1X), 1min. Injection intra péritonéale (3X), 30s par intervention. Injection en intraveineuse (1X), 1 min par intervention. Prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (2X) et sous anesthésie profonde (1X), 2 min par intervention. Injection en sous-cutanée (7X), 10s par intervention. Imagerie intravitale (1X), 10min par intervention. Pose de pompe osmotique (X1) : incision, 15min par intervention.
Impact sur les animaux
Les altérations génétiques des animaux utilisés dans ce projet provoquent une immunodéficience sévère qui les rend vulnérables aux infections microbiennes. Le traitement myéloablatif léger appliqué aux souris peut provoquer une douleur transitoire durant les heures qui suivent l’injection intrapéritonéale. L’anesthésie gazeuse ou par injection intrapéritonéale peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. L’administration par injection sous-cutanée ou intrapéritonéale peut provoquer une douleur légère et un stress. La pose de pompe osmotique par chirurgie sous-cutanée peut provoquer une douleur légère durant plusieurs jours après l’opération. L’injection de cellules souches en intraveineuse et sous anesthésie peut provoquer un stress transitoire. L’imagerie intravitale peut provoquer chez les animaux un stress et une baisse de la température corporelle liée à l’anesthésie gazeuse prolongée nécessaire à sa mise en œuvre. Les prélèvements de sangs réalisés sous anesthésie gazeuse peuvent provoquer une douleur.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de cette procédure car nous avons besoin de prélever leurs organes afin de réaliser plusieurs analyses moléculaires et biochimiques.
Remplacement
Le développement des vecteurs de ce projet a été réalisé en laboratoire, sans l’usage d’animaux, dans les conditions qui se rapprochent des celles observées dans le corps humain. La nature de ce projet, qui se focalise sur la capacité de ces nouveaux vecteurs à fonctionner dans la circulation sanguine, nous oblige naturellement à nous tourner vers un modèle animal proche de l’homme.
Réduction
La lignée de souris utilisée dans ce projet a été choisie dans le but de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats significatifs. Pour le traitement statistique de nos données, nous aurons recours à plusieurs tests statistiques destinés à réduire les lots du projet de manière optimale. Par ailleurs, nos élevages de souris seront synchronisés en amont de chaque expérience de manière à utiliser au maximum les animaux de chaque portée.
Raffinement
La lignée de souris utilisée dans ce projet a été choisie dans le but de raffiner nos protocoles en diminuant la souffrance engendrée par le conditionnement chimiothérapeutique. Chaque procédure douloureuse sera précédée d’une anesthésie gazeuse ou une anesthésie par injection. Lors des prélèvements de sang, un anesthésique local sera appliqué à l’œil afin de diminuer la douleur qui suit la manipulation. Les animaux seront pesés au cours du conditionnement afin de surveiller toute perte de poids anormale. Une surveillance quotidienne sera réalisée par le personnel compétent de l’animalerie ainsi qu’une surveillance hebdomadaire par les responsables du projet. Les animaux seront hébergés sur portoir ventilé, avec un accès à la nourriture et à la boisson ad libitum. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnel translucide rouge destiné à diminuer le stress et stimuler l’activité, des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification et un bâtonnet en bois pour répondre aux besoins naturels des rongeurs. Enfin, la souffrance des animaux sera surveillée régulièrement et la décision de leur mise à mort encadrée par une grille de score spécifique.
Choix des espèces
Les seuls modèles animaux aujourd'hui disponibles pour l'étude des cellules souches humaines ont été développés chez la souris. Cette espèce est facile à élever en animalerie et présente une homogénéité génotypique importante. Les membres de notre laboratoire disposent d'une expertise sur cette espèce, ce qui facilite la réalisation d'un tel projet. Les animaux subiront une greffe de cellules souches à l'âge de 5 à 7 semaines car il s'agit de l'âge optimal pour obtenir les meilleures chances de succès de greffe de cellules souches humaines.
Développement et maintien de la lignée Eo-Cre Rac pour comprendre le rôle de Rac1 dans les éosinophiles au cours de l’asthme sévère chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
3663 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet crée et entretient une lignée transgénique, avec puçage et biopsie de la queue sous anesthésie, puis induit un asthme dit sévère par des sensibilisations et des challenges répétés, une partie des souris subissant une trachéotomie sous curarisation. Les reproducteurs sont tués vers huit à dix mois et les génotypes intermédiaires éliminés. Le porteur affirme n'avoir jamais observé de gêne respiratoire ni d'altération du bien-être malgré l'asthme induit, et juge "indispensable" le modèle transgénique in vivo pour étudier le rôle d'une protéine dans les éosinophiles.
Objectifs
L'asthme est l'une des maladies chroniques les plus courantes dont la prévalence augmente dans le monde. Les cas les plus graves sont résistants aux traitements actuels. Il est urgent d'améliorer la prise en charge de ces patients asthmatiques sévères et de pouvoir proposer de nouveaux traitements prévenant les crises d'asthme mortelles. L'identification de nouvelles cibles pharmacologiques et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques devraient permettre de relever ce défi dans lequel s'inscrit notre projet. Récemment, nous avons identifié le rôle majeur d’une protéine (Rac1) qui régule la contraction et la prolifération du muscle des voies respiratoires. Nous avons démontré que la suppression spécifique du gène Rac1 dans le muscle bronchique empêche l'hyperréactivité et le remodelage des bronches chez les souris asthmatiques. Grâce à notre modèle expérimental d'asthme sévère, nous avons également identifié la population de cellules inflammatoires présentant une sur-activité de Rac1 : les globules blancs (éosinophiles). Notre objectif est maintenant d’identifier le rôle de Rac dans cette population cellulaire au cours de l’asthme sévère. Ainsi, nous devons générer une lignée murine n’exprimant pas spécifiquement la protéine Rac1 dans les éosinophiles . Ce travail permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique d’inhiber Rac1 chez les patients asthmatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de générer une lignée murine unique permettant l’analyse du rôle de Rac1 spécifiquement dans les éosinophiles. Grâce à notre protocole expérimental d’asthme, nous pourrons également déterminer le rôle de Rac1 dans les éosinophiles au cours de l’asthme. La réalisation de cette étude déterminera si la protéine Rac1 est une nouvelle cible thérapeutique pour cette pathologie.
Procédures
Trois semaines après leur naissance, les souriceaux seront sevrés. De ce fait, ils seront anesthésiés afin d’être pucés ou bagués pour identification ; au même moment, un prélèvement d’un bout de queue sera fait afin de les génotyper. Pour l’élevage, les animaux en reproduction seront gardés jusqu’à l’âge de 8-10 mois pour effectuer cette fonction après quoi ils seront mis à mort. Dans le cadre du protocole d’asthme, les animaux seront soumis au protocole de sensibilisation à 4 reprises, avec 7 jours de repos entre chaque sensibilisation. Chaque sensibilisation dure quelques minutes par souris au maximum (hors anesthésie). Par la suite, les animaux seront soumis au protocole de challenge à 6 reprises. La fréquence de 1 challenge par jour pendant 3 jours (répété 1 fois avec 1 semaine de repros entre les « deux groupes » de challenge) est nécessaire pour induire le phénotype recherché.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de la procédure d’élevage, il n’y a pas de nuisance prévue. Néanmoins, il est possible d’observer des cas de cannibalisme des parents sur leurs petits ou agressivité dans le couple. Dans ce cas, les animaux seront exclus de l’aspect reproduction et mis à mort. De plus, des cas de dystocies peuvent être observées chez les femelles qui seront alors mises à mort. Dans le cadre de la procédure visant à induire l’asthme sévère : les souris seront anesthésiées durant les étapes de challenge et de sensibilisations, ce qui limitera le stress ressenti. Lors de l'exploration des fonctions respiratoires, un stress pourra être ressenti par les animaux en raison de la restriction d’espace dans la chambre. Pour prévenir ce stress, les souris seront habituées environ 3 jours avant l’expérimentation, en les laissant quelques minutes dans la chambre. De plus, lors de l’expérimentation, avant d’entamer les nébulisations, les souris seront laissées quelques minutes dans la chambre pour faciliter encore leur acclimatation. L’analyse des résistances pulmonaires, plus invasive, s’effectue sur des souris anesthésiées et curarisées. Une trachéotomie est donc réalisée. Pour limiter la douleur une injection d'analgésique est réalisée 20 minutes avant la trachéotomie. Nous souhaitons ajouter que bien que l’objectif soit d’induire un asthme sévère, le mot sévère indique seulement un phénotype équivalent aux patients résistants aux traitements corticoïdes. De plus, nous pratiquons ce protocole depuis plusieurs années et il n’a jamais été observé de gêne respiratoire en raison de l’induction de l’asthme. En effet, on observe même que des souris laissées 1 mois dans leur cage après le dernier challenge retrouvent un état symptomatique et inflammatoire équivalent à celui des souris n’ayant pas subi le protocole d’asthme. Il n’est donc pas attendu de phénotype délétère dans ce nouveau modèle expérimental ni d’impact sur le bien-être animal. Cette supposition s’appuie sur le fait que les corticoïdes sont les traitements classiques des asthmatiques sévères qui visent notamment les éosinophiles. Les patients, comme les modèles animaux, traités aux corticoïdes n’ont pas d’altération du bien-être.
Devenir
Pour l’élevage : les animaux nécessaires au maintien de la lignée sont gardés en vie. Les génotypes intermédiaires seront mis à mort. Protocole asthme : animaux mis à mort en fin de procédure
Remplacement
L’objectif de ce projet est l’étude du rôle de la protéine Rac1 dans le polynucléaire éosinophile au cours de l’asthme sévère. Pour répondre à notre problématique scientifique, nous avons établi un modèle d’étude in vitro sur des progéniteurs hématopoïétiques qui ont été différenciés en éosinophiles matures. Bien que nos résultats démontrent un rôle majeur de Rac1 dans la physiologie de l’éosinophile, notamment dans sa fonction de dégranulation, il nous manque la composante pathologique de l’asthme pour approfondir notre recherche. C’est pourquoi un modèle in vivo est indispensable à la poursuite de ce projet. De plus, notre objectif étant d’identifier les rôles de Rac1 spécifiquement dans l’éosinophile, un modèle transgénique où l’expression de la protéine est déplétée spécifiquement dans ces cellules inflammatoires est la méthode la plus précise et rigoureuse que nous pouvons mettre en place. Ainsi, pour valider ou non nos hypothèses scientifiques et répondre à nos problématiques de projet, l’étude in vivo sur une lignée transgénique est indispensable.
Réduction
Pour l'élevage, les croisements ont été optimisés pour obtenir le plus rapidement possible nos animaux d’intérêt. Pour notre projet asthme, des groupes de 12 souris seront nécessaires pour réaliser une analyse statistique robuste pour les différentes approches mises en œuvre. Ne connaissant pas l’impact du sexe sur les paramètres observés, mâles et femelles seront étudiés. Si nous n’observons pas d’effet sexe, le nombre de souris sera alors divisé de moitié. Enfin, les manipulations seront réalisées en duplicat afin de prévenir un effet observé dû au groupe d’étude. Cependant, pour réduire au maximum le nombre d’animaux, les analyses seront regroupées au maximum.
Raffinement
Dans le cadre de la procédure élevage, lors de la mise en accouplement, l’alimentation des mères est enrichie. Pour enrichir le nid, du coton est ajouté en plus des frisottis. Afin de ne pas perturber les relations parents-petits, le change est décalé à minimum J+3 après la mise bas ; une étiquette est apposée pour signaler ce report. De plus, pour limiter le stress, le nid parental est conservé pendant le change. Afin de faciliter l’accès à la nourriture aux petits lors des sevrages, des croquettes sont mises directement dans la cage. Les gestes invasifs tel que le bagage et le prélèvement de biopsie sont réalisés sous anesthésie générale. Dans le cadre des procédures expérimentales, les animaux anesthésiés et curarisés seront placés sur un tapis chauffant afin d’éviter une hypothermie. De plus, l’utilisation d'un analgésique adapté permettra d’atténuer la douleur lors de la trachéotomie. Du fait d’une durée longue de l’anesthésie, une injection sous-cutanée d’un bolus réchauffé de solution saline injectable sera réalisée pour éviter toute hypotension de l'animal. Pour l'exploration des fonctions respiratoires, et pour limiter le stress des souris, une acclimatation sera mise en œuvre en laissant les souris seules quelques minutes dans la chambre quelques jours avant et durant l’expérimentation.
Choix des espèces
Dans notre modèle murin d’asthme, nous retrouvons l’endotype éosinophilique de l’asthme allergique décrit chez les patients asthmatiques sévères. En effet, un fort infiltrat éosinophile est observé au niveau pulmonaire, contrairement à d’autres espèces animales. De plus, on observe chez la souris les mêmes composantes physiopathologiques de l’asthme que chez les patients : une inflammation exacerbée, une hyper réactivité bronchique et un remodelage des voies aériennes. Les autres modèles animaux pouvant reproduire un asthme sévère sont essentiellement le cheval, le chat et le cochon-dinde. Or, nous ne disposons pas de modèles transgéniques exprimant la CRE recombinase sur le promoteur de l’éosinophile peroxydase, ni les séquences lox autour du gène Rac1 chez ces animaux. Les animaux seront utilisés à un âge entre 8 et 10 semaines pour effectuer les reproductions, afin que les animaux soient matures sexuellement. Cependant, pour la procédure visant à rendre les animaux asthmatiques, les animaux utilisés seront âgés d’environ 7 semaines afin d’avoir un système immunitaire optimal permettant une bonne mise en place du phénotype pathologique. De plus, certains prélèvements comme la récupération de moelle osseuse doivent être réalisés sur des animaux qui ne sont pas trop âgés afin que les progéniteurs hématopoïétiques soient suffisamment nombreux pour obtenir une culture d’éosinophile, et pas trop jeunes afin d’avoir une maturité du système immunitaire suffisante. Pour toutes ces raisons les prélèvements seront effectués sur des animaux à 13 semaines.