Rongeurs

Soumises à des injections répétées de morphine, de cocaïne ou d'un mélange des deux, jusqu'à douze administrations par animal, 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le sevrage qui suit produit environ une semaine de symptômes physiques, avec une activité fortement réduite, puis quatre semaines de symptômes émotionnels. Cinq tests comportementaux s'échelonnent sur huit semaines, sans que le porteur précise lesquels. Toutes seront tuées pour des contrôles histologiques et le prélèvement de leur cerveau.

Objectifs

En Europe et en France la consommation de substances psychoactives illicites ne cesse de croitre. Notamment, la cocaïne, un psychostimulant, est la 2ème drogue illicite la plus consommé et est impliquée dans ~25% des accidents provoqués par les substances d’abus. De leur côté, les opioïdes sont moins consommés (~2% de la population française) mais sont impliqués dans ~70% des cas de décès par overdose. Enfin, une étude récente, analysant les résidus des seringues, a montré que le mélange de substance le plus souvent retrouvé est celui mettant en jeu psychostimulants et opioïdes. Ainsi, mieux comprendre les conséquences de l’usage, notamment le sevrage, de chacun de ces deux types de substance mais aussi les conséquences de leur usage simultané représente un enjeu de santé publique majeur. Dans ce cadre, ce projet vise à décrire avec précision les symptômes de sevrage physique et émotionnel faisant suite à la prise d’opioïdes, psychostimulants ou leur consommation conjointe et de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacents, notamment au niveau cérébral. Il est important de noter que des différences intersexuelles importantes existent dans les comportements associés à la consommation de substances. Ainsi, afin de mieux comprendre ces différences, ce projet cherchera également à décrire les conséquences des différents traitements chez des individus des deux sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de décrire le décours temporel des symptômes de sevrage provoqué par des opioïdes, psychostimulants ou un mélange de ces deux substances. De plus, l’analyse post mortem de différents organes permettra l’étude des conséquences physiologiques et notamment le recrutement neuronal, dans l'ensemble du cerveau, lors des phases de sevrage faisant suite à l’utilisation de ces différentes drogues d’abus. A long terme ce projet permettra de mieux comprendre les trajectoires de consommation et notamment les comportements observés chez les patients lors de phases de sevrage plus ou moins longues et ainsi améliorer l’aide aux patients lors de cette phase critique du trouble.

Procédures

Lors de ce projet les animaux subiront des administrations chroniques de morphine, cocaïne ou un mélange de ces deux drogues d’abus. Un animal recevra un maximum de 12 administrations, à raison de 2 administrations par jour maximum (espacées de 6h au mimimum). Ces administrations se feront sur animaux vigiles (durée de l'injection inférieure à 30 sec). Un maximum de 5 tests comportementaux (entre 5 et 30 min de test) sera effectué par chaque animal, à raison d'un test par jour espacé de minimum 24h, sur une total de 8 semaines.

Impact sur les animaux

Ce projet vise à étudier les symptômes de sevrage à la morphine, la cocaïne et leur usage simultanés. Ainsi, des souris recevront un traitement chronique puis subiront une période de sevrage. Ce sevrage étant spontané et non pas provoqué, il engendre des symptômes physiques transitoires, essentiellement visible par une réduction de l’activité de l’animal (durée : ~1 semaine). Suite à ces symptômes physiques, des symptômes émotionnels se développent sur une période plus longue (~4 semaines) avant de progressivement disparaitre. Les injections peuvent provoquer une douleur aigüe transitoire, une inflammation ou des hématomes. Leur répétition peut provoquer un stress et des indurations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les contrôles histologiques et prélèvements.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer les mécanismes neurobiologiques du sevrage, notamment les modifications de comportements sociaux des individus. Ainsi, l’animal entier, vivant et se comportant, est nécessaire et ne peut être remplacé par un autre modèle. La nécessité des prélèvements de cerveau oblige l'utilisation d'une espèce sur laquelle de tels prélèvements sont possibles et surtout chez laquelle des régions cérébrales homologues à celles des humains sont retrouvées. Ainsi, la souris apparait comme une espèce adaptée à notre étude.

Réduction

Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 24 animaux/groupe pour le comportement. Les analyses statistiques du comportement seront essentiellement réalisées à l’aide d’analyse de la variance à un ou plusieurs facteurs, selon les comparaisons.

Raffinement

L’utilisation du dispositif "live mouse tracker" permet l’hébergement en groupes sociaux importants (8/système) et l’enregistrement continu des souris. De ce fait, l’enrichissement de l’environnement des animaux est important (groupe social, bâtonnets à ronger, cotons compressés pour faire des nids, dômes en polycarbonate). Les enregistrements continus permettront la surveillance quotidienne des animaux et d’ainsi s’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement afin que la prise en charge soit la plus efficace et rapide possible. Nous avons établi des points limites standards tels que des signes comportementaux d’inconfort, des signes cliniques qui seront recherchés quotidiennement par visionnage des cages et lors de la visite quotidienne de la pièce d’hébergement, par l’expérimentateur. En casde comportement aggréssif, une augmentation de l'enrichissement serait effectuée.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des souris pour ce projet car leur cerveau est suffisamment complexe pour nos études. En effet, nous retrouvons des régions cérébrales homolgues à celles présentes chez l'humain. De plus, leurs réponses comportementales aux différentes drogues utilisées dans le projet ressemblent à celles observées chez l’humain. Enfin, la consommation de substances comme la morphine et la cocaine concerne principalement les adultes, c’est pourquoi toutes les souris utilisées seront adultes (8 semaines) au moment des expériences.

268 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée quotidienne pendant un à quatre mois, passent une série de cinq tests comportementaux à trois mois puis à six mois, et subissent un électromyogramme sous anesthésie. La molécule évaluée est déjà commercialisée pour d'autres indications, et la lignée a été créée par l'équipe pour reproduire une maladie neuromusculaire humaine sans traitement curatif. Le porteur retient des femelles, dont les symptômes sont plus marqués que ceux des mâles, et les utilise entre 2 et 6 mois, avant l'âge de 15 mois où les homozygotes se dégradent.

Objectifs

Ce projet multisite déployé sur 3 établissements concerne le développement d’une thérapie pharmacologique pouvant constituer un traitement curatif pour une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle, il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie pharmacologique a pour but de prévenir l’avancée de la pathologie, retardant son développement, voire même de restaurer les fonctions sensorimotrices chez des individus traités en post- symptomatique. Précédemment, nous avons développé un modèle animal (souris) qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. L’objectif de cette étude multi-établissement est d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une molécule déjà sur le marché pour d’autres indications sur une durée de traitement de 1 à 4 mois en analysant les effets sur le comportement et l’organisme de nos souris (analyses tissulaires et moléculaires).

Bénéfices attendus

La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices d'une molécule chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique.

Procédures

Les souris recevront la molécule quotidiennement par injection sous cutanée (30 secondes) dans l’établissement utilisateur (EU) 2. Les souris réaliseront une fois (à 3 mois) ou deux fois (à 3 et 6 mois) la série de 5 tests comportementaux (durée : entre 30s et 15mn) au sein de l’EU2. A la suite de ces tests, un électromyogramme mesurant la latence et l’amplitude de la réponse musculaire (réalisé sous analgésie et anesthésie, durée : 15-20mn) sera également réalisé dans l’EU2, à 3 mois ou à 3 et 6 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique.

Impact sur les animaux

La manipulation répétée pour l’identification des géniteurs, leur mise en accouplements et la vérification des gestations causent un stress léger et court, qui s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Nuisances dues au phénotype : les individus homozygotes peuvent présenter une altération de l’état général à partir de 15 mois. Néanmoins, cet âge ne sera pas atteint car trop tardif pour la reproduction en vue de la création de la cohorte et ou de la fenêtre étudiée dans cette étude. L’injection quotidienne sous cutanée de la molécule (durée 1 mn) peut induire un léger stress dû à la manipulation qui s’atténue à mesure que les animaux s’habituent. L’administration de la molécule peut entrainer une douleur et des réactions cutanées. Les tests de comportements peuvent causer un stresse modéré. Aucun autre effet indésirable n’est attendu à l’issu de ces éléments.

Devenir

La validation de ce protocole de thérapie pharmacologique sur les souris par des analyses comportementales et tissulaires, nécessite leur mise à mort afin d’étudier le phénotype tissulaire (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses).

Remplacement

Le projet a pour but de valider un premier protocole pharmacologique pour cette maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Le modèle poisson-zèbre a permis de mettre en évidence des effets au niveau physiologique et cellulaire de cette approche. Elle nécessite à présenter être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyser nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet. Le nombre d’individus inclus dans chaque procédure a été calculé à l’aide d’outils statistiques.

Raffinement

Le bien-être de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (6 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voir 2 jours entiers est prévue afin de limiter au minimum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les symptômes moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation pour valider notre approche pharmacologique. Notre projet sera réalisé sur des femelles, dont les symptômes sont plus marqués que chez les mâles, au stade adulte (2 à 6 mois). Notre modèle souris présente des défauts moteurs et sensoriels décelables uniquement par des tests comportementaux entre 1 et 3 mois ; il est donc nécessaire de débuter la stratégie à un stade précoce symptomatique. La validation du protocole et l’évaluation des bénéfices au niveau comportemental et histologique doivent être évaluées au stade adulte pour évaluer les effets de la thérapie.

2 400 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à 126 administrations de composés et subir jusqu'à 27 prélèvements sanguins sur animal vigile, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines subissent une trachéotomie sous anesthésie générale pour la mesure de leur capacité pulmonaire. Le porteur indique que l'exposition à l'ozone provoque une gêne respiratoire, une locomotion réduite et une perte de poids allant jusqu'à 15 %. Toutes seront tuées, leurs poumons ensuite lavés pour analyser la réponse immunitaire, et le porteur estime à douze le nombre de candidats médicaments testables sur la période.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier les mécanismes et le rôle des acteurs impliqués dans les réponses inflammatoires et immunitaires pulmonaires déclenchées par l'exposition à des polluants environnementaux tels que l’ozone ou les pesticides. L’exposition à des polluants environnementaux induit des lésions inflammatoires des voies aériennes pouvant conduire au développement de pathologies inflammatoires chroniques pulmonaires telles que la BPCO (BronchoPneumopathie Chronique Obstructive). La BPCO constitue un réel problème de santé publique car elle touche 7 millions de personnes en France avec un taux de mortalité de 9.2%. Il s’agit de la 3ème cause de mortalité en France. Cette pathologie se caractérise par une inflammation des bronches provoquant une réduction du diamètre de celles-ci. Les bronches s’épaississent et fabriquent davantage de mucus. Les alvéoles qui assurent les échanges gazeux sont détruites (emphysème) et l’élasticité du tissu pulmonaire est altérée. Il n’existe actuellement pas de thérapie. L’objectif de ce projet est donc de d’étudier le rôle des cellules immunitaires et des mécanismes impliqués dans la réponse de défense de l’organisme afin d’améliorer nos connaissances et proposer de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

La mise en place de ces modèles chez des souris spécialement modifiées permettra de mieux comprendre le rôle de certains mécanismes impliqués dans la maladie et de confirmer leur contribution au développement de l’inflammation. Une fois validées ces molécules représentent des cibles thérapeutiques potentielles dont la pertinence sera vérifiée par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques. Ce projet s’inscrit dans la continuité d’un précédent projet dont les résultats ont donné lieu à 2 publications scientifiques.

Procédures

Prélèvements de sang : maximum 27 prélèvements sur une étude (3 fois par semaine maximum, 30 secondes/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/souris). Administrations de composés : maximum 126 administrations/souris (2x/jour à 2x/semaine) selon la voie d’administration (30 secondes/souris). Une trachéotomie est réalisée sous anesthésie générale dans le cas d’une analyse de la capacité pulmonaire (20min/souris). Nous estimons à 12 le nombre de candidats médicaments qui pourront être testés sur cette période.

Impact sur les animaux

L'exposition à l'ozone ou aux pesticides provoque une gêne respiratoire réversible et une inflammation pulmonaire chez les souris. D’après notre expérience, la première exposition à l’ozone cause un stress transitoire avec locomotion réduite, réversible dans l’heure suivant l’exposition. Elle cause également une perte de poids transitoire (jusqu’à 15%), avec un retour progressif au poids de départ dès la deuxième semaine d’exposition des études chroniques. Pour les traitements : un stress et une gêne respiratoire transitoire ; un risque très faible de lésion trachéale et des perturbations respiratoires transitoires pourront être observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. A l'issue de la mise à mort, un lavage bronchoalvéolaire et des prélèvements seront effectués pour étudier la réponse immunitaire dans les différents compartiments.

Remplacement

Aucun modèle expérimental in vitro n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la réponse et les interrelations entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses immunitaires innées et acquises. Après la caractérisation in vitro sur différentes populations cellulaires (lignées de macrophages, de cellules épithéliales, des modèles biologiques en 3D reproduisant certaines caractéristiques d’un organe) des voies activées par les polluants, l’objectif du projet est d’étudier la réponse inflammatoire pulmonaire à l’ozone, les microplastiques ou les pesticides. L’étude in vivo est indispensable pour ce projet puisqu’il nécessite plusieurs niveaux d’interactions entre les réponses inflammatoires et pulmonaires complexes qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 2 variables.

Raffinement

Les principaux signes cliniques observés dans ces modèles de pathologie font partie des critères d’évaluation à savoir la prostration, amaigrissement et difficultés respiratoires. Si le poids ou la mobilité des souris sont affectés, de l’hydrogel sera déposé au fond de la cage pour limiter la perte de poids et la déshydratation. Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l'état clinique des souris utilisées sera assurée grâce à une grille d’évaluation scorée qui permettra la mise en place d’une surveillance renforcée les cas échéants et l’éventuel déplacement des lieux de dépôt de la nourriture et de la boisson. Les administrations seront réalisées sous anesthésie afin de réduire à un strict minimum le stress et la souffrance de l'animal. Les animaux sont observés en continu pendant les expositions et lors des anesthésies jusqu’à leur réveil complet. Des points limites précoces ont été déterminés pour une prise en charge rapides et des critères d’arrêt mis en place pour éviter tout stress ou souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie scientifiquement : -La souris est un mammifère qui présente une architecture anatomique et fonctionnelle comparable à l’espèce humaine. -La souris est l’un des seuls modèles de mammifères permettant de telles modifications génétiques de précision cellulaire. -La souris reste l’animal modèle de référence dans la communauté scientifique pour étudier expérimentalement les mécanismes immunitaires pulmonaires. Les animaux sont utilisés au stade adulte (7 semaines minimum) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature.

Un tiers des 144 rats de ce projet sera hébergé seul en cage, précisément pour mesurer ce que l'isolement social leur fait. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger à modéré, avec deux prélèvements sanguins sous anesthésie et huit tests comportementaux répartis sur sept semaines, censés objectiver l'anxiété, la dépression, les capacités de réflexion et la sensibilité à la récompense, sans qu'aucun soit nommé. 96 rats seront tués pour prélèvement de tissus, les 48 autres proposés pour servir dans des formations à l'expérimentation animale. Le porteur présente ce travail comme une contribution au bien-être des animaux non-humains de laboratoire, et souligne que des rats moins craintifs seront aussi plus coopératifs lors des procédures scientifiques.

Objectifs

Très peu d’études ont porté sur les effets de l’hébergement en cages individuelles réalisé à partir de l’âge adulte chez le rat, générant des données contradictoires. Ces études, encore plus rares chez la femelle, ne précisent que très rarement si les rats ont été ou non manipulés de façon quotidienne au cours de l'hébergement individuel. Nous nous proposons donc d’étudier, dans deux souches différentes de rats mâles et femelles adultes, l'effet de l'isolement social avec ou sans manipulation quotidienne sur le comportement du rat adulte. A noter que nos conditions expérimentales en cages ouvertes placées les unes à côté des autres en animalerie, permettent aux animaux de maintenir un certain nombre d’interactions sociales par le son et l’odorat, ce qui limite toutes nuisances associées à un isolement strict pouvant conduire à un inconfort de l’animal. Cette étude permettra de formuler des recommandations claires concernant la limitation des effets de l'hébergement individuel, ouvrant ainsi des perspectives de mise en œuvre de méthodes d'amélioration facilement transposables à d'autres structures de recherche, visant à réduire les nuisances chez les animaux de laboratoire, améliorant ainsi le bien-être animal.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de notre projet sont l'amélioration des conditions d'hébergement des animaux de laboratoire afin d'atténuer l’impact comportemental de l’hébergement en cages individuelles sur l’humeur et le bien-être animal. Nos données, obtenues grâce à une évaluation comportementale, permettront d'identifier les différentes composantes de ces symptômes et d'établir clairement s'ils affectent non seulement les rats mâles, mais aussi les femelles de différentes souches. Ce projet contribuera à l'élaboration de recommandations précises concernant les précautions à prendre lors de l'isolement d'animaux sociaux, ouvrant ainsi la voie à la mise en œuvre de méthodes d'amélioration, telles que différentes manipulations quotidiennes, pour optimiser le bien-être des rats. Ces méthodes pourront être facilement transposées dans différents établissements animaliers. Les rongeurs seront ainsi moins craintifs envers les humains et plus coopératifs lors des procédures scientifiques, ce qui aura un impact positif tant sur les animaux que sur les expérimentateurs. Outre l'acclimatation et la manipulation quotidienne pendant la semaine suivant l'arrivée à l'animalerie, ces soins quotidiens tout au long du protocole expérimental devraient être considérés comme une composante standard d'un programme d'enrichissement du milieu de vie des rats (tel que le fait d’ajouter dans les cages des tunnels en cartons où se cacher, des bâtons en bois que les rats peuvent ronger, ou encore des bouts de papiers avec lesquels les animaux peuvent se construire un nid, ou tout autre type d’enrichissement permettant à l’animal d’exprimer les différents aspects de son comportement naturel). Garantir le bon déroulement des protocoles expérimentaux en réduisant les contraintes imposées à l'animal et en renforçant les interactions entre l'animal et l'expérimentateur tout au long des protocoles sera bénéfique pour l'ensemble de la communauté scientifique. Une telle approche est en effet une garantie de qualité et de reproductibilité des résultats, permet un gain de temps (en évitant les contraintes liées à la manipulation d'un animal trop fortement affecté par son isolement) et assure un environnement de travail de qualité. Ce projet présente également l'avantage de répondre aux attentes et aux préoccupations du public concernant la souffrance animale

Procédures

Des prélèvements sanguins seront effectués à deux reprises, à 2 mois d’intervalle, sur les animaux. Ces prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale et dureront 1 à 2 minutes. Les animaux seront amenés à réaliser différents tests comportementaux qui s’échelonneront sur une durée de 7 semaines au maximum et seront réalisés dans un ordre précis afin de minimiser leur impact potentiel les uns sur les autres. 4 tests, à raison de 1 par jour, chacun d’une durée de 10 à 20 minutes, permettront d’objectiver des comportements de type anxieux et/ou dépressifs sur une semaine. La semaine suivante, 2 tests, à raison de 1 par jour, chacun d’une durée de 10 à 20 minutes permettront d’évaluer les capacités de réflexion des animaux. Et enfin, une semaine plus tard, 2 tests, chacun d’une durée de 10 à 20 minutes et dont les sessions sont quotidiennement répétées sur une à trois semaines au maximum, permettront d’objectiver l’état motivationnel des animaux et leur sensibilité à la récompense.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux - et étant à considérer comme ayant un impact d’ordre modéré - sont les effets du stress lié à leur hébergement individuel et qui pourront concerner un tiers des animaux de cette étude (pouvant s’exprimer par un comportement de type anxieux et dépressif mais n’induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque). Bien que maintenus en cages individuelles placées les unes à côté des autres, celles-ci seront ouvertes, proches les unes des autres, permettant le maintien d’un certain nombre d’interactions sociales entre les animaux (sons, odeurs,…). Une souffrance légère pourra être liée aux 2 prélèvements de sang réalisés à deux mois d’intervalle sur animal anesthésié, pouvant induire du stress chez l’animal. Enfin, l’ensemble des tests comportementaux pourra induire une nuisance légère à modérée.

Devenir

A l’issue des procédures des 96 animaux pour lesquels une analyse comportementale fine est recherchée, tous seront euthanasiés et des prélèvements de tissus biologiques seront réalisés pour analyses. Les 48 autres animaux naïfs inclus dans cette étude et qui seront utilisés uniquement pour mettre en évidence des comportements d’interaction sociale avec les autres animaux, seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettront l’évaluation des différents comportements étudiés.

Réduction

Grâce à notre expertise en matière de tests comportementaux et dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous prévoyons de n’inclure que 6 rats par lot, de 2 sexes et de 2 souches différentes par lot et dans 4 conditions d’hébergement (soit 96 animaux). 6 animaux sont suffisants étant donné que nous avons deux souches et que les réponses comportementales peuvent être similaires entre elles. La puissance des tests statistiques devrait donc être suffisante pour détecter tout effet potentiel lié au sexe. Nous choisissons également de limiter le nombre de rats naïfs supplémentaires pour l’un des tests comportementaux à 48, considérant que chacun permettra de tester un rat de la même souche et de même sexe hébergé individuellement et un des deux rats hébergés par 2. Ces rats naïfs seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement. Le projet nécessitera donc un nombre total de 144 animaux.

Raffinement

Les rats seront habitués à la manipulation (préhension, présence de l’expérimentateur) tout au long de la semaine d’acclimatation précédent les expériences pour limiter l’angoisse liée à leur nouvel environnement, aux contentions et aux manipulations. Nous serons obligés de maintenir un tiers des animaux de cette étude en cages individuelles, mais en cages ouvertes, ce qui limitera toutes nuisances associées à un isolement plus strict. Les animaux seront pesés toutes les semaines afin de prévenir toute perte de poids. Les tests comportementaux seront réalisés de manière successive de façon à générer le moins de stress possible sur les animaux tout en minimisant leur potentiel impact les uns sur les autres. Les 2 prélèvements de sang seront réalisés à deux mois de distance, après désinfection locale et sous anesthésie générale et les possibles hémorragies induites seront prévenues par compression et l’intégrité du processus cicatriciel après prélèvement sera renforcé par une nouvelle application de désinfectant local. Le suivi quotidien associé à la définition de points limites adaptés et les pesées hebdomadaires des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce adéquate car la question posée par notre étude concerne cette espèce. De plus il existe dans cette espèce un haut degré de similitude avec le cerveau humain et les registres comportementaux que nous cherchons à étudier sont facilement appréhendables dans cette espèce. Dès le début de l’étude, les rats seront des adultes de 3 mois, issus de fratries hébergées ensemble, ce qui permettra de travailler sur des animaux matures ayant développé un registre comportemental et social de base.

Gavées chaque jour pendant sept semaines, des souris femelles transmettent l'exposition au fongicide à leurs petits, soumis ensuite à une série de tests : anxiété, coordination motrice, force musculaire, mémoire, 32 heures d'enregistrement de l'activité circadienne, 50 minutes d'observation des interactions sociales. 252 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour collecter leurs tissus. 72 d'entre elles reçoivent en plus une puce sous la peau, posée par chirurgie. Le porteur présente ce travail comme un moyen d'améliorer les tests de sécurité avant commercialisation de fongicides déjà répandus dans les champs.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre comment l’exposition à des fongicides (utilisés dans le milieu agricole) pendant la grossesse pourrait affecter le développement du cerveau des descendants et les différents organes des mères. Pour cela, nous utiliserons des femelles gestantes et leurs descendants et nous étudierons leur comportement, leur motricité et leurs capacités cognitives, tout en analysant les modifications biologiques observées dans les zones du cerveau concernées.

Bénéfices attendus

L'objectif est de comprendre comment l'exposition à ces fongicides peut causer des problèmes de comportement, de motricité et de cognition, dans un modèle murin qui reproduit/mime fidèlement les effets potentiels chez l'Homme. Ces résultats pourraient permettre d'améliorer les tests de sécurité avant que ces fongicides ne soient commercialisés.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises à des gavages pendant 7 semaines (30 secondes par gavage 1 fois par jour). 72 animaux seront soumis à une chirurgie mini-invasive à l’âge de 7 semaines pour l'insertion d’une puce radio-fréquence sous la peau (5 min sous anesthésie gazeuse avec un anti-douleur local). Ces animaux seront également soumis à des tests comportementaux permettant d’évaluer l’anxiété (5 minutes, deux fois par animal), les fonctions sensori-motrices (30 minutes, deux fois par animal), la coordination motrice (deux tests de 5 minutes chacun, deux fois par animal), l’apprentissage et la mémoire (un test de 30 minutes, une fois par animal, ainsi qu’un test de moins d’une heure par jour pendant deux semaines), la force musculaire (5 minutes, une fois par animal), l’activité circadienne (32 heures, une fois par animal) et les interactions sociales (50 minutes, une fois par animal). MODIFICATION 2 : Dans le cadre de cette procédure, un ou deux prélèvements de sang, selon le groupe d’animaux, seront réalisés sur certains animaux au plus tôt à 7 semaines d'âges et jusqu’à 18 semaines. Ce geste dure environ une minute. MODIFICATION 3: Chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil : Réalisée une seule fois en fin de protocole sur une partie des animaux. Durée totale de la procédure de l'injection d'anesthésique au prélèvement des tissus : environ 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Le gavage par contention peut entrainer un léger stress et une irritation de l'oesophage. La chirurgie mini-invasive entrainera une légère douleur. L'accumulation des tests de comportement pourrait induire un stress léger. MODIFICATION 2 : Le prélèvement sanguin sera réalisé sur un animal vigile, ce qui pourrait induire un stress. MODIFICATION 3: L'anesthésie générale réalisée en vue de la chirurgie terminale sans réveil peut induire un stress passager et une hypothermie de courte durée avant la perte de conscience. À l'issue de l'étude une partie des animaux sont mis à mort par chirurgie terminale sous anesthésie profonde.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Le projet vise à évaluer l'impact d'une exposition périnatale à un fongicide sur le développement embryonnaire et neurodéveloppemental. Ceci n'est modélisable que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques de régulations. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Bien que des études aient été réalisées au préalable dans d’autres modèles animaux (poisson zèbre, xénope, ver C. elegans), le modèle murin est idéal pour étudier l’impact d’un fongicide sur le neurodéveloppement chez les mammifères en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 12 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques. Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seule cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique.

Raffinement

Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe), ce qui permettra de réduire le stress et de limiter au maximum la souffrance animale. Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée quotidienne lors du gavage et hebdomadaire pour les animaux expérimentaux ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Des points limites adaptés ainsi qu'un arbre décisionnel d'arrêt des souffrances a été mis en place. Lors de la pose de puce radiofréquence nécessaire au suivi des animaux, une anesthésie et une analgésie seront mises en place pour prévenir tout stress et douleur. MODIFICATION : De plus, nous avons ajouté une étude pilote (PE3) dans le but de vérifier que le gavage pendant la gestation et la lactation n'affecte pas la gestation ni la survie des portées, et que l'administration du fongicide permet une gestation normale ainsi qu'une bonne survie des portées. Si nous devions constater un impact important sur cette étude pilote, le projet serait suspendu afin d’adapter la suite des procédures expérimentales (PE1 et PE2). MODIFICATION 2 : Dans la cadre d’un prélèvement de sang, les dispositions suivantes seront prises pour améliorer la récupération : un temps de récupération sur plaque chauffante, une injection de NaCl 0,9% (sérum physiologique) chauffé à la température de 37°C du volume équivalent au volume de sang prélevé sera réalisée.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle idéal pour étudier l’impact d’un fongicide sur le neurodéveloppement en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide. Leur homogénéité génétique permet des résultats fiables, et leur utilisation facilite le contrôle des expositions à différentes phases critiques. De plus, elles offrent des réponses physiologiques et comportementales pertinentes pour évaluer la toxicité. Une partie des animaux seront traités lors de la gestation et de la lactation et seront utilisés à 8 semaines. Les souris issues de cette gestation seront analysés à partir de 3 semaines d'âge jusqu'a 18 semaines.