Rongeurs

180 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe qui induit une hypertension et une insuffisance cardiaque, puis une infection au SARS-CoV-2 par voie intranasale, avec échographies et prélèvements sanguins. Le porteur indique que les souris sont transférées vivantes à des partenaires avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Il présente ce modèle comme une future plateforme d'évaluation préclinique à proposer aux laboratoires académiques et industriels.

Objectifs

Les coronavirus constituent une grande famille de virus à l'origine de maladies allant du simple rhume à des maladies plus graves comme le MERS ou le SRAS. La pandémie du coronavirus 2019 (COVID-19), causée par le coronavirus 2 (SARS-CoV-2) a touché des millions de personnes dans le monde entier, déclenchant un effort sans précédent de la part de la communauté scientifique pour comprendre le fondement biologique de la physiopathologie du SARS-CoV-2. Au 2 février 2022, sur un total de plus de 376 millions d'infections liées au coronavirus (COVID-19) dans le monde, 5,6 millions sont décédées à ce jour, dont plus de 128 000 en France. 73% des victimes du coronavirus en France étaient âgées de 75 ans ou plus. Dans le contexte d'une infection au SARS-CoV-2, une association d'une maladie grave avec l'âge et/ou les comorbidités préexistantes comme l'hypertension, les maladies cardiaques mais aussi le diabète/obésité et les maladies respiratoires chroniques associée peut entraîner le décès. En outre, près d'un quart des personnes décédées du COVID-19 souffraient d'hypertension artérielle, et un tiers de maladies cardiovasculaires, parmi lesquelles l'insuffisance cardiaque était majoritaire. Dans ce contexte, l'objectif du projet est de profiter de la complémentarité des centres de recherches nationaux pour évaluer les effets des comorbidités liées aux maladies cardiovasculaires (MCV) sur la sévérité de l'infection par COVID-19 et l'efficacité des thérapies antivirales dans ces condition en utilisant un modèle préclinique de souris humanisé par le récepteur aux virus du COVID-19. Ce modèle animal de souris humanisés sera fourni par nos partenaires à Marseille et ils nous aidera à mieux comprendre l’évolution de cette pathologie et les facteurs influençant sa gravité du point de vue des réponses immunitaires innées et adaptatives suscitées par l'infection par le SARS-CoV-2 afin de connaitre les réponses conduisant à une amélioration des symptômes mais aussi celles susceptibles de contribuer à la maladie, la gravité et la mort.

Bénéfices attendus

Les modèles de souris fourniront non seulement des informations clés sur les mécanismes pathogènes de la maladie COVID-19 chez les malades atteints de maladies cardiovasculaires et d'hypertension, mais pourront également servir de plateformes d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. Ces modèles seront proposés aux laboratoires académiques et industriels comme modèle d’étude préclinique en vue de mise en place de prestation de service.

Procédures

Les animaux subiront 2 échographies de 10 à 15 minutes, une avant et une après challenge pharmacologique sous anesthésie gazeux pour étudier leurs fonctions cardiaques. Des prélèvements sanguins de 2 minutes seront réalisés à la veine temporale superficielle sur animaux vigiles après chaque echographie. Une implantation de mini pompe sera réalisée sous la peau lors d'un geste chirurgical pour diffuser le traitement pharmacologique, cette procédure peut prendre jusqu'à 20 minutes par animal. Celui-ci sera couplé à l'utilisation d'antalgiques avant, pendant et après l'incision pour éviter toute souffrance aux souris. Après l'envoie des animaux à Marseille, ils subiront une infection au SARS-CoV-2 par injection intra-nasal pour chaque animal, c'est une procédure qui peut prendre jusqu'à 30 min car elle sera couplé à l'utilisation de l'anesthésie et la manipulation dans la plateforme BSL3 dédié à l'utilisation des virus de ce type. A la fin du protocole, le sang et les organes des animaux seront perfusés et prélevés pour réaliser un immunophenotypage complet.

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections intrapéritonéales et des incisions sur la peau pour l'implantation de mini pompes en sous cutanée. Ce traitement induira de l'hypertension artérielle et une insuffisance cardiaque et peut causer des symptômes d'hyperthermie et de gêne respiratoire. Les souris subiront par la suite une infection avec le virus SarsCov2 et des symptômes de la maladie peuvent apparaitre. En fin d'expérimentation et selon les protocoles mis en place, elles peuvent subir une perfusion intracardiaque afin de récupérer des tissus sans globules rouges (poumons, cœur, cerveau) pour réaliser des immunomarquages et visualiser spécifiquement dans la cellule en microscopie optique.

Devenir

Toutes les souris seront transférées en vie à nos partenaires, les souris seront mises à mort après pour prélèvements d'organes et de tissus afin d'étudier le profil de leur système immunitaire.

Remplacement

Outre la production d'un modèle préclinique de souris pour le Sars-CoV-2, nous voulons tester l'impact de la comorbidité cardiovasculaire sur la gravité de la maladie après infection. Ce modèle murin donnera non seulement des informations clés sur la physiopathologie du COVID19 et l'impact de la comorbidité, mais servira également de plateforme d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un procès d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivie de la réponse immunitaire. Ces différents arguments soulignent la nécessité de réaliser notre étude in vivo avec des modèles animaux.

Réduction

Dans la mesure du possible les témoins infectés sans traitement seront utilisés pour plusieurs prestations. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux utilisés. Dans ce protocole, nous avons planifié d'utiliser 45 animaux par groupes expérimentaux. En effet, nos études précédentes nous ont montré que l'effectif idéal se situe entre 40 et 50 animaux par groupe expérimental selon la variabilité de la réponse au mélange pharmacologique observée. De ce fait, nous prévoyons un total de 180 animaux (90 souris hétérozygote K18-hACE2 et 90 WT) dans chaque groupe on aura 45 souris mâles et 45 souris femelles, recevant une mini pompe, pour obtenir des conclusions statistiques tout en anticipant une variabilité possible. Les données générées seront analysées par des tests paramétriques (analyse de variance et test de Student).

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupe de 5 pour éviter le stress de l’isolement et les cages seront systématiquement enrichies par l’ajout de plusieurs éléments : un dôme en carton pour leur procurer un abri, de la nourriture hydratée dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation durant leur hébergement. Comme notre objectif final est d'étudier la réponse immunitaire, aucun anti-inflammatoire ne pourra être administré aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats et masquer l’expression des marqueurs d’intérêt. Avant l'expérimentations les souris seront traités avec un morphinique antidouleur et les expérimentations seront réalisée sous anesthésie. Après la mise en place des mini pompes et tout au long de l'expérience, un antalgique sera mis dans l'eau de boisson et les animaux seront observées quotidiennement par le personnel formé et qualifié en charge de l’expérimentation et selon les recommandations vétérinaires. Chaque semaine, les souris seront pesées et évaluées pour constater leur état général et s'assurer qu'aucune dégradation de celui-ci n'est constatée. Si ce cas se présentait, un protocole spécifique et une grille de score serait mis en place avec une surveillance quotidienne approfondie. En cas de perte de poids supérieure à 10% sur une semaine, prostration avec vocalisation, lésion du site d'implantation, hypothermie, et/ou un score à partir de 12 sur la grille de score entrainera une mise à mort immédiate de l'animale.

Choix des espèces

Nous utilisons le modèle souris car il nous offre un accès à de nombreuses lignées génétiquement modifiées et que le système cardiaque peut être étudié et est suffisamment proche de l'humain pour offrir une valeur prédictive dans notre approche translationnelle. Les animaux seront âgés de 9 semaines, afin d'être dans des conditions similaires à notre étude précédente sur le même modèle

42 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses au flanc, puis des injections intraveineuses d'un complexe à base de fer, la croissance de la tumeur étant suivie au pied à coulisse quatre fois par semaine et limitée à 1 000 mm3. Le projet vise à évaluer l'effet de ce composé sur la réponse immunitaire face à un cancer du sein. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement ne permet d'étudier le microenvironnement tumoral et retient un modèle de souris à système immunitaire fonctionnel.

Objectifs

Les cancers du sein représentent la première cause de mortalité induite par cancer chez la femme (INCA, 2022). Malgré les progrès dans leur diagnostic et leur traitement, certains ont encore un pronostic défavorable notamment lié à l’apparition de résistances aux thérapies associées à une baisse de l’efficacité du système immunitaire antitumoral. Parmi les cellules immunitaires, les macrophages infiltrent rapidement la tumeur. A l’issue de leur activation, les macrophages peuvent acquérir soit des capacités antitumorales, soit propriétés pro- tumorales. Au sein d’une tumeur, le microenvironnement tumoral favorise les propriétés pro-tumorale des macrophages et ces derniers sont donc associés à un mauvais pronostic. C’est pourquoi, trouver de nouvelles pistes thérapeutiques favorisant les propriétés antitumorales de macrophages constitue un enjeu majeur en cancérologie. Dans ce contexte, nos travaux actuels sur de nouveaux complexes organométalliques à base de fer montrent une activité anticancéreuse intéressante. Parmi ces composés, un entraîne un arrêt de la prolifération cellulaire et favorise les capacités des macrophages à éliminer les cellules cancéreuses. C’est pourquoi, il est désormais fondamental de faire la preuve de concept de l’efficacité de ce composé sur organisme vivant (souris) afin d’évaluer son impact sur la réponse immunitaire antitumorale, notamment des macrophages, mais également des autres cellules du système immunitaire.

Bénéfices attendus

L’étude de l’impact de ce composé sur le système immunitaire et plus particulièrement sur les macrophages lors de la mise en place d’une réponse immunitaire antitumorale permettra, en parallèle, d’appréhender l’action de ce composé sur le microenvironnement tumoral, avec une potentialisation du système immunitaire, pouvant conduire à une résorption de la tumeur.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection unique de cellules cancéreuses au niveau du flanc pour développer le modèle. Une fois que les tumeurs auront atteint un volume d’environ 200 mm3, les souris recevront une injection unique (0,5 mg/kg) ou trois injections à 4 jours d’intervalle (0,15mg/kg) en intraveineuses de notre composé à base de fer. Les souris contrôles recevront trois injections intraveineuses, à 4 jours d’intervalle, de sérum physiologique. Cette expérience durera soit 14-17 jours à compter de l’injection des cellules cancéreuses (pour étudier les effets précoces du composé sur la réponse immunitaire antitumorale), soit 22-25 jours (pour étudier les effets plus tardifs du composé sur la réponse immunitaire antitumorale). Au cours de cette expérience, un suivi de la croissance tumoral sera réalisé à l’aide d’un pied à coulisse 4 fois par semaine. Donc, dans le cadre de cette expérience, les 42 souris utilisées seront utilisées pour une durée totale de 14-17 jours pour 21 souris et 22-25 jours pour 21 souris. Le temps de chaque intervention, injection des cellules cancéreuses, injection du composé et mesure de la taille des tumeurs se fera en moins de 5 minutes par souris (soit 4 interventions pour chaque souris concernant les injections, plus les mesures de la taille des tumeurs 4 fois par semaine).

Impact sur les animaux

Les injections (sous-cutanée et intraveineuses), ainsi que la contention des souris nécessaire pour réaliser ces injections, nécessaire pour l’ensemble de la procédure (développement tumoral et injections du composé) peuvent entrainer un état de stress chez ces dernières. C’est pourquoi nous avons choisi d’effectuer ces gestes sur souris anesthésiées. Un suivi quotidien des animaux (évaluation du comportement, alimentation, hydratation) et l’évaluation 4 fois par semaine de la courbe de poids ainsi que de la croissance tumorale (à l’aide d’un pied à coulisse sur animal vigile) ne provoquera pas de nuisance et permettra la surveillance d’apparition des points limites définis Le développement de la tumeur sur le flanc (qui sera limité à un volume maximal de 1000 mm3) pourrait provoquer une gêne légère de la souris – c’est pourquoi déplacements et activité seront particulièrement observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et les ganglions lymphatique drainant ou non le site tumoral

Remplacement

Aucune méthode alternative de remplacement ne permet de satisfaire l’objectif de Remplacement à notre connaissance. Afin d’étudier les régulations du système immunitaire en condition tumorale, nous avons besoin d’un modèle prenant en considération l’environnement des cellules immunitaires (à savoir les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire) ou encore le microenvironnement tumoral qui module de façon très spécifique la réponse immunitaire antitumorale. A ce jour, seules les expériences in vivo permettent de prendre en considération l’ensemble de ces paramètres.

Réduction

Grâce aux injections sous-cutanées de cellules tumorales dans un flanc de la souris, nous pouvons utiliser les ganglions lymphatiques qui ne drainent pas le site tumoral comme contrôle (cellules immunitaires non activées par les cellules cancéreuses), en comparaison avec les cellules immunitaires des organes lymphoïdes drainant le site tumoral (donc cellules activées). Cela permet de réduire le nombre de souris en évitant d’ajouter un groupe de souris « contrôle » (sans tumeur). L'effectif du nombre d'animaux requis par groupe expérimental a été calculé par une approche statistique, en nous basant sur des études similaires menées au sein de notre laboratoire. Ainsi, ce projetrequerra 7 souris / groupe expérimental (dont 3 groupes pour le temps précoce et 3 groupes pour le temps « tardif »), soit un total de 42 animaux.

Raffinement

Les souris femelles seront hébergées par 5 en cages filtrées, à une température de 22±2°C et une humidité relative de 50±20%. Les souris seront soumises à un cycle lumière-obscurité inversé de 12h. Elles auront accès ad libitum a eau et nourriture et disposeront d’un enrichissement adapté à leur besoin. Les expérimentations débuteront après une période d’acclimatation de 7 jours aux conditions de l’animalerie. Les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés afin de limiter le stress engendré par la contention. Des critères d'arrêt anticipé de l'experimentation en cas de survenue d'une complication ont été identifies. Dès qu’un des points limites est atteint la souris en question sera écartée du protocole et des anti-inflammatoires ou analgésiques seront administrés à l’animal si nécessaire.

Choix des espèces

Au cours de ce projet, il est indispensable de travailler avec des souris possédant un système immunitaire fonctionnel pour étudier la régulation de ce système. Le modele de souris Balb/c, est le modele animal le plus approprie pour éviter un rejet de greffe des cellules cancéreuses 7 semaines : adulte, poids d’environ 18-20 g. La veille bibliographique réalisée sur les études in vivo établies à partir de modèle de cancer mammaire démontrent l’utilisation de souris femelles Balb/c âgées de 6-8 semaines

800 animaux non-humains, 400 souris et 400 rats, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des immunisations par pistolet à gènes deux fois par semaine pendant jusqu'à 25 semaines, avec des prélèvements sanguins réguliers, les souris prélevées vigiles à la veine maxillaire et les rats sous anesthésie. Le porteur indique que le pistolet à gènes provoque une rétraction de la peau, une irritation et une douleur locale, et qu'aucun animal ne sera gardé en vie. Il affirme qu'un modèle in vitro ne reproduirait pas la complexité de la réponse immunitaire.

Objectifs

La préparation aux pandémies est un bien public mondial. Les menaces de maladies infectieuses ne connaissent pas de frontières. De même, des maladies telles que le cancer, les maladies auto-immunes et la résistance aux antibiotiques constituent un risque mondial. Des efforts sont donc en cours pour développer des vaccins plus efficaces et plus spécifiques. L'enjeu est de taille car les progrès scientifiques et la maîtrise des procédés de génie génétique ont permis de concevoir des molécules de plus en plus efficaces à des coûts avantageux. Les anticorps monoclonaux produits in vitro étaient coûteux et échouaient lors des essais cliniques. Ainsi, le développement des vaccins plus efficaces et plus spécifiques, tels que les vaccins à ADN sont donc mis en avant. Ces vaccins produisent, in vivo, une immunité spécifique à l'antigène et font l'objet d'intenses recherches. Alors que les vaccins traditionnels reposent sur la production d'anticorps par l'injection de virus atténués, de particules virales mortes ou de protéines recombinantes, les vaccins à ADN peuvent être construits pour fonctionner de manière fiable tout en conservant la spécificité du vaccin. Les vaccins à ADN sont non vivants, non réplicatifs et présentent un faible risque de réversion pour provoquer une forme de la maladie en question ou une infection secondaire. En outre, les vaccins à ADN sont très flexibles et peuvent coder de multiples gènes (virus, bactéries et protéines). L'objectif de cette étude est de comparer l'efficacité de différentes méthodologies d'immunisation chez le rat et la souris par la production d'anticorps neutralisants.

Bénéfices attendus

Le principal avantage de ce projet est le développement de vaccins plus efficaces et plus sûrs grâce à la validation de la méthode d'immunisation par le "gene gun".

Procédures

Les animaux seront soumis aux protocoles d’immunisation avec l’utilisation du pistoler à gènes sous pression qui envoie des molécules d'ADN à travers la barrière épidermique et/ou muqueuse. Ce type d’immunisation est réalisé sous anesthésie. Lors de ce protocole, les animaux contrôles recevront les injections des éléments d’essais par une des voies dites classique, à savoir : sous-cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou orale. Afin que les résultats puissent être comparables, les animaux contrôles seront également anesthésiés. Les immunisations seront réalisées 2 fois/semaine. La durée maximale du protocole d’immunisation et des injections est 25 semaines. Des prélèvements sanguins sont prévus avant immunisation et toutes les 2 semaines pendant le protocole d’immunisation dont la durée maximale est de 25 semaines. Les rats seront prélevés en veine sublinguale sous l’anesthésie générale. Les souris seront prélevées en veine maxillaire en vigile. Les prélèvements de sang effectués en cours d'étude se feront en respectant les volumes circulants et à ne pas dépasser 15% du volume circulant. A la fin du protocole les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie pour le prélèvement d’organes.

Impact sur les animaux

L'anesthésie induit une baisse de la température corporelle. Le traitement par pistolet à gènes induit une rétraction temporaire du pis, une irritation temporaire de la peau et une douleur locale (légère et temporaire). Les voies d'immunisation conventionnelles, telles que les voies sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire, orale et intraveineuse, peuvent induire une irritation et une douleur cutanées (locales et temporaires). La prise de sang chez la souris par la veine mandibulaire est effectuée avec l'animal éveillé. La contention peut générer un stress momentané, contrôlé par les opérateurs. La douleur locale est minime et temporaire, et les animaux ne montrent généralement pas de signes de souffrance (ils recommencent rapidement à explorer la cage, à manger et à boire). La prise de sang chez le rat est réalisée sous anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude, des organes tels que la rate, la moelle osseuse et les lymphonodes peuvent être prélevés après sacrifice par dislocation cervicale sous anesthésie. Aucun animal ne sera gardé en vie à la fin du projet.

Remplacement

La vaccination permet de développer une réponse immunitaire de mémoire qui est à ce fin protectrice. La réponse immunitaire est complexe, mettant en jeux plusieurs types cellulaires : les cellules présentatrices d’antigènes, les cellules T, les cellules B, entre autres avec des activités biologiques différentes. Un modèle in vitro ne permettrait pas de reproduire ces mécanismes complexes, et ne permettrait pas de montrer le potentiel et la puissance du vaccin ainsi que les effets indésirables.

Réduction

Le nombre total d'animaux (800) utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre ses objectifs, c'est à dire avoir une production de anticorps neutralisants et protecteurs après le protocole d'immunisation. Le nombre d'animaux par groupe, un échantillon minimum de 10 animaux/groupe, a été choisi pour cet essai préclinique de vaccin sur la base d'études antérieures, en raison de l'efficacité accrue des vaccins ADN avec le protocole d'immunisation par pistolet à gènes.

Raffinement

Nous réalisons le protocole sur des animaux anesthésiés. Afin d'éviter tout impact négatif de l'anesthésie sur l'animal, la durée de la procédure n'excède pas 10 minutes, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Les concentrations anesthésiques sont adaptées à chaque espèce. Le personnel est formé à l'utilisation du pistolet à gènes, afin d'assurer un contrôle adéquat de la technique et de la procédure. Pour les voies d'immunisation conventionnelles, les volumes d'administration et le type d'aiguille ou de canule sont adaptés à l'espèce et au site d'injection ou d'administration. Toutes les voies d'administration conventionnelles chez les rats et les souris seront effectuées sous anesthésie générale afin de réduire le stress des animaux et de garantir des conditions égales entre les groupes. Les mesures de raffinement pour les prélèvements répétés concernent le respect du volume circulant total et une période de récupération de 2 semaines. Les prélèvements dans les veines sublinguales des rats sont réalisés sous anesthésie, avec une pression sur le site de prélèvement en fin de procédure pour prévenir le risque de saignement. Chez la souris, la veine maxillaire est choisie et les prélèvements sont effectués tous les quinze jours, de manière à ne pas anesthésier les animaux et à prélever un volume suffisant, en alternant les deux côtés pour permettre un temps de récupération. La surveillance quotidienne des animaux, le contrôle de leur poids et l'observation clinique permettront d'identifier le plus tôt possible tout signe de douleur, de souffrance ou de stress. Les animaux seront hébergés en groupes et des enrichissements spécifiques à l'espèce seront systématiquement fournis et/ou ajoutés si nécessaire (par exemple, en cas de comportement agressif). La nourriture sera placée au fond de la cage pour faciliter l'alimentation.

Choix des espèces

Les rats et les souris peuvent bénéficier d'un protocole de vaccination destiné à stimuler largement le système immunitaire humoral. Une étude a montré que les anticorps naturels issus des sérums de rats immunisés ont produit une grande variété de production et une liaison totale supérieure à celle des anticorps naturels provenant des sérums de rats non immunisés. Cela indique que chez les rats de laboratoire, l'immunisation est associée à un plus grand répertoire d'anticorps naturels et à une liaison plus forte des anticorps. D'autres études plus récentes montrent chez la souris et le hamster et même chez l'humain le grand répertoire d'anticorps neutralisants produits par immunisation. Les animaux arrivent dans nos locaux à partir de 8 semaines d'âge. Après 1 ou 2 semaines d’acclimatation, en fonction de leur origine ils seront donc au stade adulte, et leur système immunitaire aura atteint sa pleine maturité.

800 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous la peau ou directement dans le foie sous échographie, un traitement par anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines et des échographies répétées sous anesthésie. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une ulcération cutanée ou des douleurs, et que tous les animaux sont tués pour prélever tumeurs et foies. Il décrit des travaux in vitro et ex vivo déjà menés mais conclut à la nécessité d'une validation sur "animal entier".

Objectifs

Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Une autre partie des animaux recevra une injection unique de cellules cancéreuses directement dans le foie grâce à un système échographique, réalisée sous anesthésie générale, sans subir de procédure chirurgicale. Cette procédure prend environ 15 minutes à être réaliser. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Certains animaux subiront une échographie de 20-30 minutes, sous anesthésie générale, 2 fois par semaine, afin de suivre la croissance tumorale dans le foie des animaux. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. Pour les souris injectées dans le foie, la tumeur peut entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une inflammation, une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement

1 320 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent dès la naissance des injections intraveineuses sur animal vigile et des prélèvements d'urine quotidiens, puis des prélèvements de sang à la veine maxillaire, pour tester une thérapie par ARNm contre la leucinose. Le porteur indique qu'un quart des souris, porteuses de la maladie, ont un risque de mort de 50 % dans les trois premiers jours et de 100 % avant deux semaines, et que toutes sont tuées pour analyse des tissus. Il affirme que la démonstration ne peut se faire complètement que dans un "organisme entier".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer des stratégies thérapeutiques pour traiter une maladie métabolique rare d’origine génétique, causée par la dysfonction d’une enzyme. La forme classique de cette maladie se caractérise par un coma en période néonatale pouvant conduire au décès en l’absence de traitement en urgence. Il existe également des formes moins sévères, chroniques, sans épisode aigu néonatal sévère et des formes se révélant par des troubles neurologiques lors d’épisodes aigus de stress métabolique (fièvre...). A ce jour, le principal traitement repose sur un régime alimentaire extrêmement strict, limité en protéines. Ce régime est très efficace mais il doit être poursuivi à vie et ne permet pas de prévenir le risque de complications graves, parfois mortelles. Un tel régime altère de façon significative la qualité de vie. Certains patients peuvent bénéficier d’une transplantation hépatique qui certes guérit la maladie, mais demeure associée à un risque propre de rejet et de décès. L’efficacité de la transplantation hépatique dans cette maladie nous a conduit à proposer le projet ici présenté. Notre objectif est de développer une stratégie de traitement de cette maladie métabolique par une approche de thérapie innovante basée sur l’utilisation d’ARN messagers, non-pathogènes, qui ont montré qu’ils pouvaient corriger de manière stable des maladies où d’autres protéines sont manquantes après une seule administration. La spécificité de cette étude est d’étudier l’efficacité à court terme de cette thérapie après injection unique dans des modèles murins de cette maladie métabolique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de faire la preuve de concept de l’efficacité de court terme de cette thérapie innovante chez la souris, ouvrant la voie du développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique chez l’homme.

Procédures

Tous les animaux de cette étude (N = 360 + 960 dans amendement) seront soumis à des injections par voie intraveineuse dans la veine temporale le jour de la naissance sur souris vigile et à des prélèvements d'urine quotidiens la première semaine de vie puis deux fois par semaine. Les animaux de l’étude de survie (N = 90 + 160 dans amendement) seront soumis à des prélèvements de sang au niveau de la veine maxillaire à partir d’une semaine de vie sur souris vigile. Les animaux de l’étude pharmacocinétique (N = 270 + 800 dans amendement) seront soumis à un prélèvement de sang unique au niveau de la veine maxillaire au moment de la mise à mort sur souris vigile. Ces différents actes seront le plus brefs possibles (1 min pour les injections néonatales, 1 min pour les prélèvements d’urine, 1 min pour les prélèvements de sang) et pratiqués par du personnel entrainé.

Impact sur les animaux

Les souris KO malades (25% des souris comptées dans le projet) présentent un phénotype grave : risque de 50% de décès au cours des 3 premiers jours et 100% au cours des 14 premiers jours. Les nuisances que subiront les souris seront : une douleur associée à une injection IV sur souris vigile (injection initiale unique sur souriceau), un stress lié à un prélèvement d’urine sur souris vigile réalisé quotidiennement la première semaine de vie puis deux fois par semaine et une douleur associée à un prélèvement sanguin sur souris vigile, à partir d’une semaine de vie, de façon hebdomadaire pour les souris de l’étude de survie ou au moment de la mise mort pour les souris de l’étude pharmacocinétique.

Devenir

Mise à mort pour analyse des tissus.

Remplacement

Afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux dans ce projet, nos collaborateurs ont déjà testé différentes formulations d’ARNm in vitro. sur des cellules de foie cultivées en laboratoire. Ceci leur a permis de sélectionner des traitements candidats. Cependant la capacité des nanoparticules à franchir les défenses immunitaires ne peut être démontrée complètement que dans un organisme physiologique "entier".

Réduction

Toutefois, la seule utilisation de la souche « malade » pose certains inconvénients : en sachant qu’un animal sur 4 est affecté par cette maladie à la naissance et compte-tenu du nombre de souris nécessaires pour notre projet, le nombre de souris en élevage serait trop important pour répondre à l’ensemble des questions posées. Aussi, dans l’optique de réduire au maximum l’utilisation de ces souris malades, les meilleures formulations sélectionnées in vitro ont été testées par nos collaborateurs dans un organisme physiologique entier, chez des souris saines, afin de sélectionner les plus efficaces et la plus apte à franchir les défenses immunitaires. Le nombre d'animaux nécessaire par lot a été déterminé grâce aux études publiées précédemment développant une approche similaire. Nous étudierons les réponses à nos traitements à la fois pour les mâles et les femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’accouplements et aussi le nombre de souris atteintes non utilisées. Afin de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires à la détection de l’effet de nos traitements, nous avons établi le paramètre le plus important (concentration plasmatique de leucine) et nous avons utilisé un test bilatéral standard de comparaison des moyennes (t-test) afin d’avoir 90% de chance de détecter une diminution des concentrations de leucine dans le plasma de souris traitées avec l’ARNm comparées aux contrôles, avec un risque d’erreur de 1%.

Raffinement

Nous allons utiliser des procédures de raffinement pour éviter la souffrance des souris lors de prélèvements sanguins et pendant l'injection du vecteur thérapeutique. Au moment de l’injection chez les nouveaux-nés ; la mère sera éloignée afin de minimiser son stress. Les souriceaux seront recouverts de sciure de la cage de la mère et replacés rapidement dans la cage. Au niveau expérimental, les quantités minimales de sang et d'urine seront prélevées par du personnel expérimenté en veillant à réaliser les prélèvements sur les zones les moins sensibles possibles. Une surveillance régulière sera mise en place et des points limites adaptés ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l'animal si nécessaire. Les souris seront gardées dans des portoirs ventilées dans lesquels nous ajouterons du coton, une maisonnette et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire la maladie humaine avec son phénotype clinique et biochimique sévère. Le modèle souris, facile à produire par comparaison aux autres modèles disponibles (bovins), permet d’étudier les différents organes, types cellulaires et mécanismes de défense immunitaire, pertinents pour notre étude et inaccessibles in vitro. Amendement : Deux modèles murins pertinents et complémentaires de la maladie seront utilisés. Nouveau-nés de 0 à 2 jours de vie car la maladie présente un phénotype très sévère entrainant un décès de la souris dans les 15 premiers jours de vie ; souriceaux et souris adultes jusqu’à 2 mois pour l’étude de survie.