Rongeurs
Effet des endozépines sur l’anxiété et l’homéostasie glucidique et énergétique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
658 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 208 en gravité sévère. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique, des instillations intranasales une à deux fois par jour pendant quinze jours, des prélèvements sanguins répétés six fois en une heure, deux tests d'anxiété et un séjour en cage métabolique. Le porteur teste un peptide coupe-faim contre l'obésité, en vérifiant d'abord qu'il ne provoque pas d'effet anxiogène, avant un "éventuel transfert en clinique humaine". Il affirme qu'aucun modèle ne peut se substituer à l'animal pour cette étude.
Objectifs
L’obésité est un problème majeur de santé publique à forte prévalence dans les pays industrialisés. Les dernières données recueillies en France montrent en effet que 32% des adultes sont en surpoids et que 15% sont obèses. En marge des traitements diététiques et d’accompagnement de première intention et des solutions instrumentales ultimes comme la chirurgie bariatrique, l’arsenal thérapeutique actuel est d’autant plus réduit que des médicaments sont retirés du marché en raison de leurs effets secondaires marqués. Il est maintenant bien établi que certains neuropeptides jouent un rôle clé dans le contrôle de la prise de nourriture. Dans ce contexte, il a été démontré que l’administration intracérébroventriculaire d’une faible dose de l’octadécaneuropeptide ODN et intranasale d’un de ses analogues entraînent une forte diminution de la prise alimentaire, sans aucune autre manifestation comportementale, et qu’ils jouent donc un rôle clé dans la régulation centrale de l’homéostasie énergétique. Notre travail s’oriente vers la validation des effets d’une instillation intranasale unique ou répétée de peptide sur le comportement alimentaire chez la souris vigile normalement alimentées ou en régime hypercalorique, avant un éventuel transfert en clinique humaine. Au préalable, nous devons vérifier que l’administration d’une faible dose de peptide chez la souris n’entraine pas d’effet anxiogène comme attendu et rapporté dans la littérature. Aucun modèle ne peut se substituer à l’utilisation d’un animal dans cette étude. Le projet est constitué de 3 procédures et les données expérimentales seront recueillies chez les animaux vigiles à différents temps post-administration et une fois euthanasiés pour une quantification de gènes cibles.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude devraient permettre l’obtention d’avancées significatives dans la recherche fondamentale et translationnelle du système endozépinergique. Tout d’abord, cette étude clarifiera le rôle joué par le récepteur de l’ODN dans les effets anorexigènes du peptide. Elle délimitera aussi la fenêtre thérapeutique en termes de dose à administrée pour s’affranchir d’un effet anxiogène indésirable éventuel et enfin, elle confirmera que la voie intranasale est particulièrement bien adaptée pour traiter nos animaux.
Procédures
Au cours du projet, certains animaux seront soumis à : -une chirurgie stéréotaxique qui constitue l’acte de chirurgie expérimentale majeur (30 min). -une instillation intranasale sous contention 1 fois ou 2 fois par jour pendant 15 jours (2 min/instillation). -une injection intrapéritonéale unique (2 min). -un prélèvement sanguin caudale (3 min) répété 6 fois en 1 heure. -deux tests d’anxiété de 5 et 10 min espacés d’une semaine. -un hébergement en cage métabolique de vie normale (21 jours).
Impact sur les animaux
A priori, nous n’attendons pas de manifestations indésirables majeures chez les animaux utilisés dans l’ensemble de cette étude. Nous porterons néanmoins une attention particulière (surveillance accrue) à la douleur des animaux canulés ou prélevés (sang), et aux stress des groupes contrôle positif du contingent engagé dans les tests d’anxiété et ceux qui perdront du poids. Les traitements n’induiront ni douleur, ni inflammation, ni changement du comportement autre ceux anticipés, considérés et maitrisés qui pourraient nuire au bien-être des animaux. Les effets mesurés chez les animaux sont transitoires et les traitements aigus suffisamment espacés (1 semaine) pour permettre une récupération totale des animaux et s’affranchir d’effets indésirables cumulatifs.
Devenir
Tous les animaux reçoivent un traitement pharmacologique aigu ou chronique et peuvent difficilement être réaffectés à d’autres protocoles. De plus, les expérimentions se déroulant dans une zone dédiée, les animaux ne peuvent pas retourner dans la zone d’élevage et être utilisés comme animaux reproducteurs. Pour l’ensemble de ces raisons tous les animaux sont euthanasiés rapidement après la fin des procédures.
Remplacement
Le projet scientifique vise à étendre la compréhension de la régulation de l’homéostasie énergétique pour envisager de nouveaux traitements contre l'obésité et le diabète. Dans la mesure où aucun modèle de substitution permettant de mener à bien ces différents objectifs physiologiques et pharmacologiques n’est actuellement disponible et devant la complexité des mécanismes mis en jeu et leur interconnexion, l’ensemble de l’étude sera réalisé in vivo chez la souris. De plus, de nombreux modèles de souris ont déjà été développés afin de mieux appréhender l’origine des dérèglements centraux de l’homéostasie énergétique et proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques.
Réduction
En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d’animaux utilisés, les études sont conduites sur des lots de 10 souris par condition de traitement. Le dispositif de cages métaboliques étant paramétré autour de 8 cages de vie normale, l’effectif sera à ce titre diminué d’autant. Ces effectifs nous assurent d’obtenir des données statistiquement comparables. Les deux tests d’anxiété sont réalisés sur les mêmes animaux à une semaine d’intervalle et après randomisation des animaux. De même, le test de tolérance au glucose est mené sur les mêmes animaux randomisés que ceux ayant subis le test de sensibilité à l’insuline, une semaine plus tard afin de garantir la normalisation de la glycémie basale. Un certain nombre de groupes expérimentaux ont été prévus mais ne seront inclus dans l’étude qu’en cas de besoin.
Raffinement
Les souris sont élevées et maintenues en cage standard conformément à la réglementation avec un enrichissement du milieu de vie constitué de nids en copeau de peuplier. Les expériences sont menées dans une pièce adjacente de la zone d’hébergement. Par ailleurs, les animaux sont surveillés pendant et après toute la durée du protocole et leur score quotidien confronté à la grille de score préalablement détaillée incluant des points limites adaptés.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré (in vivo sur animal entier) peut nous permettre de comprendre, de façon globale, la contribution du système endozépinergique dans l’homéostasie énergétique et comment il peut être instrumentalisé pour rééquilibrer les dysfonctions liées aux pathologies associées. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie (taille et coûts d’entretien réduits, bonne performances reproductives). De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques de l’altération du comportement alimentaire car elle est relativement sensible à une modification de son régime alimentaire. Afin de mener à bien nos objectifs, nous effectuerons nos expériences sur des souris adultes âgées de 6 à 10 semaines. En effet, à cet âge les souris ont terminé leur croissance longitudinale et la prise de poids est minimale après cette période.
Rôle du facteur de croissance des nerfs dans l’inflammation associée à l’hypertension artérielle pulmonaire idiopathique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
280 rats vont être utilisé·es, tous tués à l'issue sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte de la monocrotaline pour déclencher une hypertension artérielle pulmonaire, puis un anticorps anti-NGF, avant des mesures échographiques et de pression cardiaque sous anesthésie. Le porteur veut confirmer que bloquer le facteur de croissance NGF freine la maladie, avec des retombées thérapeutiques annoncées à terme. Il soutient que la maladie induite reste peu douloureuse faute d'effort imposé aux rats, et affirme que ces interactions complexes ne peuvent être reproduites in vitro.
Objectifs
L’hypertension artérielle pulmonaire ou HTAP est une maladie grave qui touche les artères pulmonaires conduisant le sang du cœur vers les poumons pour y être réoxygéné. Dans cette maladie, la pression augmente de manière anormale dans ces artères, et le cœur doit alors travailler plus fort pour envoyer le sang dans ces artères. A force de travailler plus, il finit par fonctionner mal, entrainant le décès des patients. Aucun médicament actuellement sur le marché ne permet de guérir cette maladie, et il faut donc essayer de développer des nouveaux médicaments plus efficaces. Nous pensons que développer un médicament qui bloquerait le facteur de croissance des nerfs NGF pourrait avoir un grand intérêt dans cette maladie. En effet, nos expériences sur cultures de cellules humaines suggèrent que le NGF participe à l’inflammation présente dans l’HTAP. Le NGF pourrait notamment attirer des cellules inflammatoires à proximité des artères pulmonaires, et ces cellules inflammatoires libèreraient alors des substances qui contribuent aux altérations de ces artères pulmonaires qu’on observe dans la maladie. Nous souhaitons à présent valider cette hypothèse dans un modèle plus intégré d’HTAP, en utilisant le modèle monocrotaline (MCT). Ce modèle d’HTAP chez le rat est classiquement utilisé dans la littérature et déjà en place au laboratoire. L’utilisation de ce modèle est nécessaire car nous ne pouvons pas modéliser en culture les interactions complexes qui existent entre les cellules inflammatoires et les cellules des artères pulmonaires, afin de déterminer quel est le rôle du NGF dans ces interactions. Ainsi, ce projet va nous permettre de traiter les rats avec un anticorps qui bloque le NGF et voir si ce traitement empêche le développement de la maladie, en modifiant l’inflammation et ses conséquences sur les artères pulmonaires.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de déterminer les conséquences du blocage in vivo du NGF sur le développement de l’HTAP, et en particulier sur sa composante inflammatoire. Ainsi, l’effet d’un traitement à l’aide d’anticorps bloquants anti-NGF sera évalué sur l’élévation des pressions ventriculaires droites et de la pression artérielle pulmonaire, sur le débit cardiaque et sur l’hypertrophie ventriculaire droite pour apprécier les effets bénéfiques sur les paramètres qui définissent l’HTAP. Puis l’effet de ce traitement sera évalué ex vivo sur l’infiltration des monocytes et leur activation dans le poumon, sur la sécrétion de substances inflammatoires et leurs conséquences sur les artères pulmonaires. Les résultats obtenus dans ce modèle nous permettront ainsi de mieux comprendre le rôle physiopathologique du NGF dans l’inflammation associée à l’HTAP, et ainsi de contribuer à confirmer que le NGF est une nouvelle cible thérapeutique d’intérêt dans cette pathologie.
Procédures
Dans la 1ère partie de la procédure, les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales. Ils en recevront au maximum 6 sur la durée totale du protocole (28 jours), réparties de la manière suivante : Jour 0 (Anticorps), Jour 1 (solvant ou monocrotaline), Jour 8 (Anticorps), Jour 15 (Anticorps) et Jour 22 (Anticorps). Les volumes injectés sont faibles à chaque injection (200 ou 500µl) et la durée d’injection est très courte (quelques secondes par animal). 240 animaux seront concernés par ces injections (groupes 3 à 14). Dans la 2ème partie de la procédure, les animaux seront soumis à des mesures in vivo, sous anesthésie gazeuse et analgésie complémentaire, afin de réaliser des mesures échographiques (durée : une dizaine de minutes par animal), puis des mesures de débit cardiaque et de pressions ventriculaires droites et artérielles pulmonaires (durée : une vingtaine de minutes par animal). L’ensemble des animaux seront concernés par ces mesures, soit 280 animaux.
Impact sur les animaux
L’injection intrapéritonéale est peu douloureuse lorsqu’elle est bien réalisée. Les injections de monocrotaline, de son solvant seul, des anticorps non pertinents ou des anticorps bloquants anti-NGF n’est pas décrite comme provoquant des douleurs post-injection dans la littérature. Toutefois, les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement pendant la suite du protocole. Concernant le développement de la maladie en elle-même, chez l’homme, l’HTAP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme légère dans ce type de protocole d’induction d’une maladie.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux, toujours sous anesthésie gazeuse, seront euthanasiés (sans réveil) et les expérimentations suivantes auront lieu sur tissus prélevés après euthanasie.
Remplacement
Ce projet a pour but d’identifier des mécanismes in vivo pour valider la pertinence des résultats obtenus in vitro. En effet, nous recherchons à identifier un lien entre NGF, monocytes, IL-1b et altérations des artères pulmonaires. Nous avons réalisé des expériences in vitro qui nous ont permis notamment de montrer que le NGF stimule la libération d’une substance inflammatoire qui induit in vitro différents effets sur les cellules artérielles pulmonaires humaines en culture. Pour montrer que le blocage du NGF et de ce mécanisme conduit à des effets bénéfiques sur le développement de l’HTAP, ce projet nécessite à présent l’utilisation d’animaux pour modéliser cette pathologie in vivo (pathologie impossible à modéliser in vitro de manière complète pour le moment) et pour valider l’utilisation d’anticorps bloquants anti-NGF comme traitement possible de l’HTAP.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux à utiliser est basée sur les analyses des études déjà menées au laboratoire sur ce même modèle compte-tenu de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche. De plus, cette estimation tient également compte des données de la bibliographie et du fournisseur qui décrivent un effet variable de la monocrotaline en fonction des lots commandés. Pour optimiser le nombre d’animaux utilisés : (1) le plan d’expériences a été optimisé afin de pouvoir réaliser les expériences in vivo et ex vivo sur les mêmes animaux et afin d’utiliser les deux poumons de chaque animal (utilisation par exemple du poumon gauche pour les expériences de contraction et utilisation du poumon droit pour l’étude de l’expression de différentes protéines d’intérêt) (2) parallèlement à ce protocole, des études continueront à être réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines en culture afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans les effets observés. Ainsi, nous optimiserons l’utilisation des animaux et les remplacerons par des cellules humaines autant que possible. Au final, cette démarche nous a conduit à un protocole utilisant 14 groupes comptant chacun 20 animaux, soit un total de 280 animaux (140 mâles et 140 femelles, puisque nous souhaitons également explorer les différences éventuelles des effets observés en fonction du sexe). Ce nombre sera réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs (ou résolument non significatifs) avant la fin de la totalité des séries prévues. Les expérimentations sont planifiées pour obtenir un maximum de résultats expérimentaux sur un nombre d’animaux le plus faible possible (mesures échographiques, de débit cardiaque et de pression artérielle pulmonaire puis expériences ex vivo ultérieures après euthanasie réalisées sur les mêmes animaux, une seule procédure).
Raffinement
À leur arrivée, les animaux sont hébergés en cages collectives, pourvues d’enrichissement du milieu (litière : copeaux de peuplier ; enrichissement : papier tressé, morceaux de bois, tunnels et maisons en carton). 2 à 3 animaux seront hébergés dans chaque cage. La nourriture et l’eau seront données à volonté, et le change effectué une fois par semaine (cage, litière, biberon). Un suivi quotidien (week-ends, vacances et jours fériés inclus) des animaux sera effectué par le personnel de l’animalerie pour prévenir tout inconfort, souffrance ou comportement anormal des animaux. Au moment de cette procédure expérimentale, les animaux seront observés et cette surveillance portera sur le suivi du poids des animaux, sur leur apparence, et sur des paramètres comportementaux (mobilité, interaction avec ses congénères, peur, agression, vocalisation, automutilation, activité diminuée ou augmentée, prostration). Une feuille de suivi des animaux, sur laquelle sont précisées les conduites à tenir en cas de problème de santé de l’animal, sera complétée. L’expérience des personnels de l’animalerie nous garantit un bon suivi des animaux. Si le suivi du poids fait apparaitre une perte de poids des animaux supérieure à 5% par rapport à leur poids initial, une mise à disposition de nourriture humidifiée posée directement au fond de la cage sera effectuée, jusqu’à ce qu’une amélioration de l’état de l’animal soit observée. Les animaux seront sacrifiés en cas de perte de 20% de poids par rapport à leur poids initial, ou si l’animal perd 10% de son poids par rapport à la dernière pesée. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée, et l’animal en souffrance sera alors surveillé toutes les demi-heures pendant deux heures. En cas de souffrance ou de détresse persistante au-delà de cette période malgré l’administration d’antalgique, une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre.
Choix des espèces
Le rat est une espèce classiquement utilisée pour le développement de modèles d’hypertension pulmonaire. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. Le modèle monocrotaline est le modèle que nous souhaitons utiliser dans cette DAP pour compléter des expériences déjà réalisées avec ce modèle. Le choix du rat est d’autant plus justifié par le fait que le modèle monocrotaline ne fonctionne pas chez la souris. En effet, pour être active et induire le développement d’une hypertension pulmonaire, la monocrotaline doit être métabolisée en un dérivé, appelé monocrotaline pyrrole, par des enzymes présentes dans le foie. Or ces enzymes nécessaires à cette réaction n’existent pas chez la souris. Ce modèle monocrotaline ne fonctionne donc pas chez la souris, et nécessite forcément l’utilisation du rat. Nous utiliserons des rats jeunes de 200g. Le protocole utilisé se déroule sur 4 semaines et les données de la littérature ainsi que les résultats précédents obtenus au laboratoire préconisent d’utiliser des rats de ce poids pour ce type de protocole. En effet, au-delà de 200g en début de protocole, l’injection de monocrotaline est décrite comme moins efficace pour entraîner le développement d’une hypertension artérielle pulmonaire.
Modélisation du syndrome neurodéveloppemental Okur-Chung et de son phénotype analogue à celui de l’autisme chez la souris-AMENDEMENT 2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 408 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un groupe de 384 subit une chirurgie stéréotaxique du cerveau, les autres reçoivent jusqu'à cinq médicaments et enchaînent jusqu'à cinq batteries de tests comportementaux, avant une perfusion transcardiaque. L'objectif est de valider un nouveau modèle murin d'un trouble neurodéveloppemental rangé dans le spectre de l'autisme, les pistes thérapeutiques étant renvoyées à de futures études. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne reproduit "la complexité du cerveau", ce qui rendrait le modèle animal "indispensable".
Objectifs
Récemment, plusieurs cas de mutations dans un gène codant pour une kinase ont été liés de manière causale a des troubles neurodéveloppementaux. Ces maladies sont caractérisées par un retard de développement, une déficience intellectuelle et d’autres anomalies comportementales qui font la font entrer dans les troubles du spectre autistique. Notre objectif est de valider un nouveau modèle expérimental d'un trouble neurodéveloppemental chez la souris. Nous rechercherons d’éventuelles anomalies comportementales s’apparentant aux symptômes de la pathologie. Des études biochimiques seront ensuite réalisées sur les tissus cérébraux de souris issus de ces souris pour tenter d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués. Ces études devraient permettre d’améliorer les connaissances sur cette pathologie dans le but de développer des thérapies pour aider les patients du spectre de l'autisme. Ce projet mettra en jeu des procédures d’administration de substances pharmacologiques avant évaluation des conséquences biochimique et comportementales (fonctions motrices, cognitives, émotionnelles et sociales), suivi par perfusion transcardiaque pour analyse du tissue. Cette étude qui nécessite une approche comportementale n’est possible qu’à l’échelle de l’organisme entier et ne peut être reproduite in vitro ni ex vivo. Ce projet s’effectuera dans le respect de la règle des 3R, en veillant au bien-être des animaux et en limitant leur douleur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Les animaux seront observés quotidiennement et évalués à l’aide de points limites bien définis. En conclusion, notre travail vise à identifier les déficits neurobiologiques et comportementaux qui sont présents dans un modèle murin d'un trouble neurodéveloppemental, permettant de futures études thérapeutiques de ce syndrome. Ce projet apportera des données anatomiques, biochimiques et fonctionnelles cruciales pour appréhender les mécanismes mis en jeu dans le spectre de l'autisme et pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
Bénéfices attendus
En conclusion, notre travail vise à identifier les déficits comportementaux dans un nouveau modèle expérimental d'un trouble neurodéveloppemental permettant de futures études thérapeutiques. Ce projet apportera des données anatomiques, biochimiques et fonctionnelles cruciales pour appréhender les mécanismes mis en jeu dans le spectre de l'autisme et pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
Procédures
Au total, 1408 animaux sur 3 ans seront utilisés et subiront une batterie de tests comportementaux. Parmi les 8 groupes expérimentaux différents, un groupe (384 animaux) subira une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie complète (durée de 20 minutes) et avec un traitement analgésique avant et jusqu'à 2 jours après la chirurgie. Aucun effet indésirable n'est attendu sur la base de notre expérience. Les autres animaux (1024) subiront des tests comportementaux jusqu'à 5 paradigmes différents, les tests étant espacés d'au moins une semaine entre chaque paradigme. Au total, 5 médicaments différents (dont 4 en aigue, par injection i.p, et un chroniquement pendant 3 semaines, administré dans l'eau à boire) seront administrés à des animaux éveillés. Aucun de ces médicaments n'ést préjudiciable au bien-être de l'animal. Une prise de sang sera effectuée au niveau de la veine caudal, à l'aide d'un tube capillaire, via une légère incision à l'extrémité de la queue, poirtant un faible risque d'hémorragie.
Impact sur les animaux
La chirurgie stéréotaxique de la souris est réalisée sous anesthésie générale et, normalement, tous les animaux survivent à cette procédure sans nécessiter de soins analgésiques prolongés. Neanmoins, des protocoles de soins pré et post opératoires sont mis en place pour éviter la sensation de douleur. Certains des tests comportementaux ont un impact modérément stressant sur les souris, mais nous surveillons régulièrement le bien-être des souris, leur poids, leur toilettage et leur comportement social, et nous n'avons pas constaté d'effets néfastes durables dans les expériences réalisées précédemment.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Nous utiliserons le tissu cérébral pour des analyses biochimiques et d'imagerie
Remplacement
A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire la complexité du cerveau, ce qui rend l’utilisation d’un modèle animal indispensable à la réalisation de ce projet.
Réduction
La taille de chaque groupe sera de 16 animaux par condition expérimentale. Nous avons précédemment utilisé cette taille de cohorte pour des expériences comparables et avons atteint de différences significatives dans nos expériences (p
Raffinement
Pour éviter toute souffrance, les procédures de chirurgie se feront sous analgésie et anesthesie générale. Les souris seront observées régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques. Les souris seront logés à raison de 5 compagnons (frères, soeurs) par cage dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. De plus, les modèles transgéniques utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris. Animaux seront utilisés au stades infantiles (2 semaines), juvéniles (4 semaines) et adultes (12 semaines). Tous les animaux seront testés dans das tests comportementaux entre 3 et 6 mois, pour définir les phénotypes chez la souris adulte.
Evaluation de l’efficacité des ondes magnetiques sur l’ouverture de la barrière hématoencéphalique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
100 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs viraux couplée à une ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ondes magnétiques, puis sont tuées aussitôt ou une à quatre semaines plus tard pour prélèvements. Le porteur présente un procédé "confidentiel" relevant à la fois de la recherche et d'une "prestation de service" pour des entreprises, avec des applications cliniques renvoyées à des étapes ultérieures sur de plus grands animaux. Il indique qu'aucun modèle cellulaire n'existe pour cette étude et revendique le "besoin" d'un modèle animal.
Objectifs
Notre équipe est impliquée dans le developpement d’approches de thérapies géniques innovantes dans le domaine des maladies neurodégénératives avec à la fois de la recherche et du développement mais aussi de la prestation de service pour des entreprises. Ici nous voulons tester la capacité des vecteurs à permettre une expression significative dans les differentes zones du cerveau suite à un nouveau mode d’ouverture de barrière hématoencéphalique confidentiel afin d’etablir des voies d’administration de thérapie non invasives pour l’application en santé humaine. Au total le projet utilisera 100 souris sur les 5 prochaines années avec des groupes de 5 individus.
Bénéfices attendus
La barrière hématoencéphalique est une protection du système nerveux central (SNC) des pathogènes et virus mais est pour la même raison une limite à l’atteinte efficace du SNC par les composés injectés en intraveineux Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de la faisabilité de l’ouverture de la barrière hématoencéphalique par une nouvelle technologie chez la souris. Puis de coupler cette ouverture de barrière à l’injection en intraveineuse de nos vecteurs viraux thérapeutiques, afin d’amener nos vecteurs au niveau cérébral. Lorsque nous aurons validé ces étapes chez la souris nous pourrons mener les étapes translationnelles sur des modèles animaux plus grands et plus proches de l’Homme. Ces étapes sont impératives avant la mise en place des essais cliniques de phases I et II chez le patient
Procédures
- Les animaux seront utilisés pour une injection intraveineuse sous anesthésie générale (durée 5min) couplée à une ouverture de leur barrière hématoencéphalique là aussi sous anesthésie générale et analgésie (1h) Les animaux seront euthanasiés soit immédiatement après l’exposition aux ondes devant conduire à l’ouverture de cette barrière et entre 1 et 4 semaines après la procédure (ouverture de barrière avec injection de notre vecteur thérapeutique) pour évaluer l’efficacité.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : - Une injection intraveineuse sous anesthésie avec un risque de décompensation respiratoire et un risque de saignement - un risque respiratoire ou d’hypothermie à l’anesthésie - un risque hémorragique lors de l’ouverture de barriere hémato-encéphalqique Un risque de non récupération suite à l’anesthésie Tous ces actes peuvent conduire à un stress de l'animal et possiblement une malnutrition mais pas de douleur liée à la procédure.
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données de bio distribution et de tolérance.
Remplacement
À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle de culture ou de système cellulaire pour étudier l’efficacité de l’ouverture de la barrière hématoencéphalique, encore moins pour évaluer l’efficacité de l’expression de la protéine thérapeutique grâce au vecteur viral consécutive à l’ouverture de cette barrière. Notre étude dans l’espèce murine nous permet de vérifier la faisabilité de notre procédé couplant injection intraveineuse d’une thérapie génique (vecteur viral) et l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique. Une fois cette faisabilité vérifiée, les données de bio-distribution que nous récoltons nous permettent d’avoir une connaissance de la diffusion au niveau de la cible thérapeutique visée (cerveau) et également à l’ensemble de l’organisme (organes périphériques) pour vérifier la tolérance de ce nouveau procédé (effets secondaires, toxicité).
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe mais conservons un nombre suffisant de façon à obtenir des résultats fiables et robustes. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 5 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Nous commençons par une étude pilote sur 20 animaux et poursuivrons une fois cette étape validée par de groupes de 5 à 1 animaux en fonction des thérapies géniques à tester. Un nombre total maximal de 100 souris sera donc nécessaire pour ce projet.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, la procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress.. Les animaux seront hébergés en groupe dans des conditions sanitaires contrôlees Les animaux disposent de nourriture adaptée à leur stade physiologique (gestation/allaitement ou animaux de stock) et d’eau ad libitum. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne y compris le weekend en plus de la zootechnie si besoin (points limites) et de soins adaptés. Les animaux seront hébergés par 3 à 5 souris par cage ventilée au maximum, si nécessaire en cas d’agressivité les animaux seront séparés ou isolés. Un animal peut se retrouver seul lorsqu'il est le dernier animal de la cage et qu'aucun regroupement n'est possible (sexe, âge). Les procédures sont effectuées sous anesthésie avec la mise en place de moyens pour venir contrecarrer les risques liés à cette anesthésie (monitoring respiratoire et de la température, utilisation de tapis chauffant, de couverture à circulation d'eau chaude, chambre de réveil thermostatée, alimentation gélifiée mis à disposition lors du réveil, gel oculaire pour éviter la sécheresse cornéenne). Un antidouleur est prévu lors de notre phase pilote concernant l'ouverture de barrière hémato-encéphalique par ondes magnétiques, et en amont du moment de l'euthanasie. Les gestes techniques sont réalisés par du personnel compétent et des points limites suffisamment prédictifs sont établis afin de limiter tous stress, souffrance ou douleur.
Choix des espèces
Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la faisabilité de l’ouverture de barrière ainsi que pour connaître la biodistribution et l’expression des vecteurs adeno-associés recombinants suivant leur mode d’administration et ceci ne peut se faire que chez la souris contrôle comme petit animal qui nous permet de prédire le pattern d’expression et anticiper les études d’efficacité dans le modèle murin des pathologies concernées. Les souris sont utilisées à 8 semaines en rapport avec les étapes suivantes qui seront menées dans le modèle murin de la pathologie, afin d’utiliser des animaux d’âges comparables.
Rôle et mécanisme d’action de la chromogranine A dans la régulation de la sécrétion de neuropeptides hypothalamiques impliqués dans le contrôle de l’homéostasie glucidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
306 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 234 sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections intrapéritonéales, des prélèvements sanguins caudaux répétés six à dix fois, des mises à jeun de seize heures et des tests de tolérance au glucose, à l'insuline et au pyruvate, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur étudie le rôle de la chromogranine A dans la sécrétion de neuropeptides hypothalamiques réglant la glycémie. Les retombées contre l'obésité et le diabète, présentés comme la pandémie de "diabesity", restent lointaines, et il affirme qu'une telle approche "très intégrée" n'est possible que sur "l'animal entier".
Objectifs
Les systèmes neuropeptidergiques hypothalamiques sont récemment apparus comme des liens couplant l’équilibre énergétique et l'homéostasie du glucose. Un dysfonctionnement de l'un de ces systèmes pourrait ainsi jouer un rôle majeur dans le développement de pathologies telles que l'obésité et le diabète. En effet, l'obésité est fréquemment associée au diabète de type II, et leur progression significative et synchrone depuis 30 ans fait de la pandémie mondiale de "diabesity" un véritable enjeu de santé publique. Au sein de notre Unité, le système peptidergique 26RFa/GPR103 a été identifié et démontré comme étant impliqué dans le contrôle du comportement alimentaire de par son important effet orexigène. De plus l’expression du 26RFa est augmentée chez les animaux obèses, suggérant qu’il pourrait jouer un rôle dans le développement et le maintien de l'obésité. Le 26RFa possède par ailleurs un robuste effet anti-hyperglycémiant central, conséquence de sa capacité à relayer l’action centrale de l’insuline. Au sein de notre équipe, nous avons rapporté le rôle essentiel de la protéine chromogranine A (CgA) dans la formation des granules de sécrétion, organites permettant le stockage et la sécrétion des neuropeptides. De manière intéressante, les souris dont le gène exprimant la CgA a été invalidé de manière globale sont hypertendues et obèses. Par ailleurs, nous avons observé récemment que les neurones 26RFa expriment d'autres neuropeptides ainsi que la CgA. Sur la base de ces données, nous proposons dans le présent projet d’étudier le rôle de la CgA dans les mécanismes moléculaires de la sécrétion des neurones 26RFa en analysant l’impact de la modulation de l'expression de la CgA dans les neurones 26RFa sur la sécrétion du système peptidergique 26RFa, la régulation centrale de l’homéostasie du glucose et le déclenchement de l’obésité et du diabète.
Bénéfices attendus
L’administration centrale de 26RFa a permis une première évaluation de l’effet du 26RFa central dans la régulation de l’homéostasie glucidique par le cerveau. Il a notamment été observé que le 26RFa exerce un puissant effet anti-hyperglycémiant lorsqu’il est administré en intra-cérébro-ventriculaire. Néanmoins, le rôle précis des différentes sous-population de neurones à 26RFa dans la régulation de la glycémie et les mécanismes d’action mis en jeu restent inconnus. De plus, l’interaction du système neuropeptidergique 26RFa/GPR103 avec d’autres systèmes neuropeptidergiques hypothalamiques reste également à l’étude. Nos données récentes montrant la colocalisation du 26RFa et des orexines dans les mêmes neurones de l’aire hypothalamique latérale suggèrent néanmoins que ces deux systèmes pourraient être impliqués ensemble et interagir au sein de l’hypothalamus latéral, pour réguler la glycémie. Ainsi, la caractérisation des différentes populations de granules de sécrétion, en terme de contenu en neuropeptides et granines, au sein des neurones 26RFa devrait permettre une meilleure compréhension de la capacité sécrétoire de ces neurones. Ces données, associées à l'invalidation de l'expression de la CgA au sein de cette population neuronale permettront de caractériser les rôles respectifs de ces neuropeptides dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique et des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant leur action.
Procédures
Les animaux seront soumis à divers types d'expérimentations et de prélèvements soit en condition vigile, soit sous anesthésie. Les injections intra-péritonéales durent 3sec, avec procédure globale : contention+injection ip 15-20 sec. La perfusion intra-cardiaque dure moins de 7 min ; l'anesthésie induite : 5 min, renouvelée si nécessaire. Les animaux subiront des prélèvements sanguins caudaux d'un volume total de l'ordre de 40 μL par expérimentation. Les expérimentations sont répétées 6 à 10 fois avec une semaine de repos minimum entre chacune d'entre elles. - mesure de glycémie : mise à jeun de 16h, puis prélèvements sanguins caudaux (2 prélèvements de 1 sec chacun et de 2µl, toutes les 15 min, 9 fois entre T0 et T120 min). - test de tolérance au glucose : prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 200µl de glucose à T0 (2g/kg poids corporel) - tolérance à l’insuline : mise à jeun de 6h, puis prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 225µl d’insuline à T0 (0,75UI/kg poids corporel). - test de tolérance au pyruvate : mise à jeun pendant 16h, puis prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 200µl de pyruvate à T0 (2g/kg poids corporel). - test de sécrétion d’insuline : mise à jeun pendant 16h, puis prélèvements sanguins caudaux de 10-15µl à T0, T15, T30 et T60 min après injection intra-péritonéale de 200µl de glucose à T0 (2g/kg poids corporel). L'hébergement en cage de calorimétrie indirecte permettra d'évaluer les paramètres métaboliques des animaux : 7 jours d’habituation en cage mimant la cage de calorimétrie indirecte, puis séjour de 7j en cage de calorimétrie indirecte avec 96h de mesures contrôles (prise alimentaire, hydrique, consommation d’O2, production de CO2, déplacements), puis 24h en condition de jeune puis 48h en condition de renutrition.
Impact sur les animaux
Les tests physiologiques auxquels seront soumis les animaux peuvent avoir un impact léger à modéré selon les procédures. Des signes de souffrance peuvent être observés : dégradation de l'état général de l’animal avec modifications de l’apparence physique externe (plaies, mauvais aspect du pelage, poil hérissé, dos voûté), et/ou changements du comportement (prostration, léthargie, agressivité inhabituelle lors des manipulations, vocalises), perte de poids importante.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux ne peuvent être réutilisés dans de nouvelles expérimentations sans compromettre les résultats et sont mis à mort.
Remplacement
Cette étude a l’avantage d’aborder, en parallèle, l’étude neuroanatomique de la chromogranine A (CgA) et de sa fonction régulatrice du système peptidergique 26RFa. Elle permettra la compréhension du rôle de la CgA dans la sécrétion de 26RFa, plus particulièrement par les neurones hypothalamiques, et ainsi la compréhension de la régulation centrale de l'homéostasie glucidique, en condition physiologique. Une telle approche, très intégrée, n’est rendue possible que par les études in vivo.
Réduction
Compte tenu de la variabilité inter-individuelle des processus physiologiques étudiés, nous utiliserons des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. De plus, une partie des tests physiologiques prévus pour évaluer l’homéostasie glucidique sera réalisée successivement sur une même souris et chaque souris sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d’une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précédent et de stabiliser leur poids corporel. Pour les groupes dédiés au prélèvement des explants hypothalamiques ou cérébraux, les groupes de souris pourront être réduits à 10 animaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux reproducteurs seront maintenus à trois par cage pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de matériel pour construire un nid + dôme en plastique rouge pour s'y réfugier). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par injection intra-péritonéale d'analgésiques, répétée après 4 heures si nécessaire.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre de façon globale, le rôle de la CgA dans la sécrétion des neuropeptides par les neurones 26RFa et la régulation hypothalamique de l’homéostasie glucidique. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coût d’entretien réduits, fortes performances reproductives. Il s’agit d’un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques et chémogénétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude, la physiologie adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.
Elevage avec Identification et génotypage invasifs
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 3000
72 000 souris et 3 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les animaux dont le génotype ne présente pas d'intérêt étant tués et les autres gardés en vie pour d'autres protocoles. Nouveau-nés ou adultes maintenus en contention, ils reçoivent un tatouage puis une biopsie de la queue ou de l'oreille pour identification et génotypage. Le porteur décrit une douleur légère et brève, avec dans de rares cas une hémorragie à la queue ou le rejet du nouveau-né par sa mère. Il affirme que les prélèvements non invasifs par écouvillon salivaire ou follicule pileux ne permettent pas un génotypage fiable avant sevrage, ce qui justifierait ces biopsies.
Objectifs
L'objectif de cette demande est d'identifier et de génotyper l'ensemble des animaux génétiquement altérés produits dans l'Etablissement Utilisateur(EU) pour répondre aux besoins des chercheurs des deux instituts de Neurosciences. Les 23 équipes emploient une centaine de lignées qui sont couvertes en expérimentation par actuellement 88 autorisations de projets. Pour ce faire, sur les nouveau-nés, deux gestes techniques invasifs sont réalisés succéssivement: un tatouage digital selon un code de numérotion enregistré dans les procédures de l'EU suivi d'une biopsie de queue et sur les animaux adultes seul le prélèvement de la biopsie d'oreille est réalisé. Ces procédures sont réalisées sur animal vigile agé de 6 à 12 jours pour les nouveau-nés et sur animal adulte. Cette identification et génotypage se justifient par la nécessité de: -sélectionner les animaux d'intérêt pour l'expérimentation (inclus dans d'autres demandes d'autorisation de projets si des procédures le justifient -sélectionner et vérifier le génotype des géniteurs permettant l'amplification et l'entretien des colonies -sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences et les prélèvements d'organes ou des tissus pour des études ex-vivo hors champ d'application. Les animaux dont le génotype n'est pas d'intérêt pour les expérimentations déclarées, les activités d'élevage, la formation ou les prélèvements seront mis à mort selon une méthode réglementaire.
Bénéfices attendus
La procédure d'identification et de génotypage est nécessaire pour la sélection des animaux d'intéret dans les projets de recherche. L'identification par tatouage permet: -d'identifier individuelement ou par lot les animaux -de manière permanente sur le long terme -de ne pas mutilier les animaux sur leurs pattes pour garder une motricité fine -d'éviter un recours à l'anesthésie. Le génotypage par biopsie de l'extrémité de la queue ou d'oreille permet: -l'obtention de resultats fiables grâce à une quantité et une qualité du matériel génétique obtenu pour réaction d'amplication d'ADN -de minimiser les risques de contaminations entre échantillons grâce aux procédures de prélèvement compatible avec les contraintes sanitaires nécessaire au maintien du statut EOOPS (Exempt d'opportunistes et d'organismes pathogènes spécifiques) ciblé -d'éviter le recours à l'anesthésie
Procédures
Tatouage et prélèvement de biopsie de queues sur animal nouveau-né vigile ou d'oreille sur animal adulte vigile: un seul prelevement /animal et la procédure dure de 2 à 3min/animal
Impact sur les animaux
Les gestes réalisés provoquent une douleur légère et de court durée. L'animal est maintenu en contention pendant les actes ce qui est une source de stress qui sera minimisé par l'expérience des expérimentateurs. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir: -une légère hémorragie à la queue -le rejet du nouveau-né par la mère
Devenir
Une mise à mort des animaux est réalisée si leur génotype n'est pas d'intérêt ou gardé en vie pour une utilisation continue couverte par les autorisations de projets.
Remplacement
A ce jour, les prélèvements non invasifs à base d'écouvillons salivaires ou de follicules pileux ne permettent pas de procéder au génotypage de façon fiable en prenant en compte les techniques de génotypage robotisées, des procédures de prélèvements en condition stérile et la nécessité d'obtenir des résultats avant sevrage pour la gestion des élevages et la production des animaux expérimentaux. Un doute sur les résultats de génotypage conduirait à la nécessité de procéder à un nouveau prélèvement sur des animaux plus âgés et donc plus sensibles à la douleur. Chaque erreur qui conduirait à l'accouplement d'animaux n'ayant pas les caractéristiques attendues engendrerait: -une augmentation du nombre d'animaux produits inutilement -la naissance d'animaux avec des phénotypes potentiellement délétères -l'utilisation d'animaux génétiquement sans interet dans des projets expérimentaux induisant des résultats érronés et non exploitables
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d'autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Les plans d'élevage mis en place en concertation avec le porteur de projet visent à réduire autant que possible le nombre d'animaux générés et donc d'animaux à identifier et génotyper. Dans la mesure du possible, nous favorisons l'utilisation des animaux au génotype non d'intéret dans d'autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d'animaux produits par l'EU. Nous pouvons également utiliser ces animaux comme congénère de compagnie pour éviter les animaux isolés.
Raffinement
Les actes d'identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maitrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l'inconfort et le stress ressentis par l'animal. Ces identifications et prélèvements de biopsies sont réalisés avec du matériel et des instruments stériles et appropriés permettant un geste rapide et précis dans le respect des conditions d'aseptie établies dans l'EU. La procédure est réalisée sous PSM et est limitée dans le temps (2-3min/animal) pour limiter le temps de séparation des nouveaux-nés de leur mère et la contention des animaux. Une mise à mort est décidée si la queue de l'animal présente un saignement non maitrisé dans l'heure suivant la réalisation de la biopsie sinon il est réalisé à reception des résultats de génotypage ou à P14 si les animaux nés ne seront pas utilisés.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme ce qui permet une extrapolation des résultats à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire ou comportementale. Le rat est lui couramment utilisée dans des études de comportement et de neurogénèse adulte ce qui a permis de constituer des bases de données importantes pour guider la conception des protocoles expérimentaux et d'obtenir une bonne réplicabilité des expériences. Que soit la souris ou le rat, ces espèces de rongeurs sont des espèces qui permettent une obtention aisée de modèles génétiquement altérés par différentes méthodes et donc créer des modèles murins de pathologies neurologiques bien caractérisés. Pour la grande majorité, les animaux sont identifiés entre 6 et 12 jours post natal. A cet age les animaux sont aisément manipulable, le cartilage est souple et les groupes sociaux sont stables. Toutes fois, certaines procedures exigent un génotypage précoce entre la naissance et 5 jours : ces stades de développement sont ceux où les cellules expriment le mieux leur potentiel de différenciation et de survie en culture; cultures primaires de neurones hippocampiques et cultures organotypiques de tranches de cerveaux sur nouveaux nés. Pour les animaux adultes qui sont les géniteurs lors de l'introduction d'une lignée ou bien des vérifications sur animal adulte demandées par le chercheur, c'est un autre prélèvement qui est utilisé pour le génotypage: biopsie d'oreille.
Analyse comparée des protocoles d’administration de la FENM et de la Mémantine sur les paramètres comportementaux, biochimiques et physiologiques dans différents modèles murins de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
636 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans un ventricule cérébral sous anesthésie, des injections répétées et une pompe implantée sous la peau, puis passent des tests de mémoire dont un évitement passif où un stimulus électrique est appliqué sur les pattes. Le porteur présente les injections comme peu douloureuses et évoque un léger stress lors des tests. Il affirme que les modèles murins transgéniques développant progressivement la maladie d'Alzheimer sont les plus performants pour analyser les propriétés d'une molécule.
Objectifs
Ce projet de thèse a pour but de documenter de façon exhaustive la stratégie clinique qui sera sélectionnée pour le développement de la FENM dans la MA
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de préciser les effets pharmacologiques in vivo d'un candidat médicament et apporter des informations importantes avant le développement clinique de cette molécule de nouvelle génération potentiellement efficace pour modifier de façon durable le décours de la maladie, car neuroprotectrice.
Procédures
Une injection intracérébroventriculaire sera réalisée sous anesthésié gazeuse (durée 3 min). Injections intrapéritonéales pendant 7 jours (moins d'une minute). Les souris auront sous anesthésie une incision cutanée pour la pose de la pompe qui délivre le composé en continu (durée 5 min). Les capacités de mémorisation sont analysés avec des tests de comportement qui dure 8 min pour l'alternance spontanée, deux fois 10 min pour la reconnaissance d'objets, 90 et 60 secondes pour la mémoire spatiale et 2 fois 3 secondes pour le test d'évitement passif.
Impact sur les animaux
les procédures d’injections seront peu douloureuses avec une administration par voie intra péritonéale et par diffusion sous cutanée grâce au pompe Alzet. L'injection dans le ventricule se fait sous anesthésie gazeuse. Un léger stress est présent lors des tests de mémoire . un stimulus aversif sera administré au niveau des pattes de la souris. Les animaux ont la possibilité de remonter sur la plate-forme pour échapper au stimulus.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin du projet pour prélèvement et analyse des effets du traitement sur le cerveau
Remplacement
Les modèles précliniques d’étude des mécanismes complexes de neurodégénération dans la maladie d’Alzheimer les plus performants sont des modèles murins et plus particulièrement des modèles murins transgéniques développant la pathologie progressivement après plusieurs mois de vie. Les propriétés neuroprotectrices de la FENM seront analysées en administration chronique sur un modèle transgénique de la maladie d’Alzheimer, les souris APPSwe/PS1dE9 ainsi qu'un modèle pharmacologique d'injection de peptide amyloïde‐ß[25‐35] oligomérisé.
Réduction
Les molécules sont administrées dans une gamme de doses réduite (généralement 0.003 - 0.3 - 1 - 3 mg/Kg en fonction des résultats antérieurs). Les animaux sont testés sur des tests comportementaux adaptés au paramètre à mesurer. Les analyses statistiques sont optimisées aux données générées de façon à limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe a été déterminé de façon empirique mais a été depuis confirmé en analysant nos données antérieures à l'aide de logiciel statistiques.
Raffinement
Les animaux seront reçus une semaine avant le début de l'expérimentation et gardés en groupe de 8-10 individus par grande cage. Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Les traitements pharmacologiques envisagés ont déjà été utilisés et ne sont pas à l’origine de douleur visible ou de détresse. Mais un examen quotidien sera fait. Les animaux seront retirés de l'étude si les points limite sont atteints.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6 mâles seront utilisées pour différencier l'effet des deux modes d'administrations (bolus VS infusion). Ces souris témoins sont le fond génétique des souris transgéniques APPPS1 utilisées pour la suite de l'étude, il est donc important de travailler avec le même fond génétique pour ce projet. Les souris APPPS1 seront par la suite utilisées pour tester l'efficacité des composés aux doses efficaces en bolus VS infusion. Cette lignée développe la pathologie progressivement avec des altérations comportementales dès 9 mois et qui sont très marquées à 12 mois d'âge. Les dépôts amyloïdes, la neuroinflammation, la gliose et le stress oxydant apparaissent même plus tôt, dès 6 mois, c'est donc un très bon modèle expérimental pour refléter les symptômes de la maladie d'Alzheimer. Les souris C57/BL6 seront utilisées à l'âge de 3 mois qui correspond à l'âge adulte, puis à l'âge de 10 mois pour faire une comparaison avec nos souris transgénique traitées. les souris APPS1 à l'âge de 3 mois afin de visualiser si la FENM a un effet neuroprotecteur avant l'apparition des premiers signes de la pathologie, 6 mois afin de visualiser un effet neuroprotecteur sur le comportement de ces souris, puis 10 mois afin de vérifier un potentiel effet curratif de la FENM, lorsque les lésions histpathologiques de la MA sont iréversibles.
Exploration de la dysfonction endothéliale et de ses complications vasculaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
5 274 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie opérée sans réveil. Sur les unes, les expérimentateurs prélèvent des vaisseaux sous anesthésie profonde, sur d'autres ils pratiquent des chirurgies de la patte avec pose de cathéter pour perfuser des composés et mesurer la réponse des vaisseaux. Le porteur signale peur, stress, hypothermie et douleur liés aux manipulations et aux actes chirurgicaux. Il reconnaît qu'aucun modèle in vitro ne remplace complètement un organisme vivant et annonce des études sur cellules humaines pour limiter le nombre d'animaux.
Objectifs
Ce projet vise à déterminer l'impact de l'activité de certains récepteurs situés sur l'endothélium des vaisseaux qui pourraient être une cible thérapeutique pour la prise en charge des pathologies cardiovasculaires. Nous resoumettons le projet au regard des résultats obtenus. La mise à jour porte sur l'ajout des nouvelles lignées de souris ainsi que le besoin de réaliser de nouvelles procédures expérimentales. Ces ajouts tiennent compte de la règle des 3R. Le projet scientifique avait été antérieurement évalué positivement par l'ANR (Agence Nationale de la Recherche). Ce projet permettra de nouvelles avancées dans la compréhension des mécanismes de la dysfonction endothéliale qui contribuent au développement des anomalies de l'arbre vasculaire et en particulier de l'athérome. Il fournira de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de la recherche fondamentale, ce projet permet de caractériser au niveau de l'endothélium des vaisseaux, le rôle de certains récepteurs ou cibles dans le bon fonctionnement du vaisseau (état contractile nécessaire au déplacement du sang). Il permet aussi d'évaluer la contribution de ces cibles dans les modifications observées de la paroi des vaisseaux (remodelage vasculaire) au cours des variations de débit sanguin et de pression de perfusion. Sur ce terrain, il sera aussi étudié leur contribution dans le développement des lésions d'athérome au cours d'un régime gras déséquilibré. Des travaux publiés sur des cellules endothéliales en culture, montrent que l'activation de ces récepteurs favorise la production de composés/médiateurs par la cellule jouant un rôle protecteur contre les mécanismes pro-inflammatoires et pro-athérogènes. Sur ces avancées, il est attendu d'observer une amélioration des paramètres vasculaires (amélioration de la réponse vasodilatatrice, diminution des lesions sur les parois) et métaboliques (diminution de l'inflammation, amélioration du diabète,et de la lipidémie) chez les animaux recevant des composés à l'étude capables d'activer ces récepteurs. Il est aussi attendu l'absence d'amélioration voire une aggravation de la maladie (développement de lésions d'athérome, diminution de la lumière du vaisseau par développement de la paroi) chez les animaux transgéniques invalidés pour les récepteurs ou cibles moléculaires d'intérêt. Ce projet permet aussi dans le cadre de la recherche translationnelle de pré-établir des données expérimentales de sécurité et aussi d'étude des effets potentiels dans l'organisme pour la mise au point de futurs médicaments.
Procédures
Nous avons estimé un besoin de 5274 animaux dans le projet de recherche. Afin d’étudier les propriétés vasodilatatrices de nouvelles molécules synthétisées ainsi que, leurs effets sur les cellules constitutives de la paroi du vaisseau, des vaisseaux seront prélevés sur les animaux au cours d’une anesthésie profonde induite par l’administration dans l’abdomen (une piqûre) d’un mélange anesthésique (durée : quelques secondes). La durée du prélèvement est estimée à 10 minutes (1664 animaux sont concernés). D’autres animaux subiront des actes de chirurgie (décrits ci-dessous) sous anesthésie profonde réalisés par l’administration dans l’abdomen (une piqûre) d’un mélange anesthésique (durée: quelques secondes). Ils recevront aussi un analgésique puissant par voie sous – cutané (une piqûre) afin de réduire la douleur en pré-ou post-opératoire. Parmi, les chirurgies, des animaux subiront une chirurgie sur la patte arrière de durée estimée à 45 minutes, afin d’étudier, par la suite, chez l’animal vigile, la réponse vasodilatatrice du vaisseau au cours de la perfusion de composés administrés par le biais du cathéter préimplanté dans la patte arrière (640 animaux). D’autres subiront un acte chirurgical au niveau du cou d’une durée estimée de 10 minutes, au cours duquel une lésion vasculaire (brûlure) sera opérée en surface du vaisseau (1408 animaux) afin d’étudier par la suite chez l’animal vigile, la cicatrisation/régénération du vaisseau. D’autres animaux subiront une chirurgie du cou afin de réaliser une ligature sur des vaisseaux du cou pour d’étudier sur ces modèles vigiles, les effets protecteurs des composés sur la paroi du vaisseau. Le temps mis pour effectuer une ligature sur des vaisseaux du cou est estimé à 15 minutes sous anesthésie profonde (1472 animaux). Enfin, un étude de pharmacocinétique sera effectuée sur les composés à l’étude afin de connaître l’évolution des concentrations circulantes dans le temps. Les composés seront administrés à l’animal vigile à la suite d’une injection dans l’abdomen (une piqûre, durée de l’administration, de quelques secondes) et le devenir ou la concentration circulante de ces composés, sera établie au cours du temps dans le sang de l’animal. Le sang sera prélevé 5 fois à la queue et la durée du prélèvement à chaque fois (ou temps) est estimée à 1minute (90 souris vigiles).
Impact sur les animaux
Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, leur isolement dans certaines procédures, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant un acte chirurgical. Une nuisance de l'anesthésie est d'induire une hypothermie, une sensation de fatigue en période de réveil, une petite douleur au point d'injection. D'autres nuisances possibles, sont la sensation de fatigue, la douleur ou de la fièvre qui peuvent être observées au cours des actes chirurgicaux où l'expérimentateur pose à demeurre une cathéter intraveineux ou une sonde à ultrasons de mesure du débit sanguin. Les actes chirurgicaux portés sur les vaisseaux du cou (carotides) peuvent induire au réveil, une douleur locale gênant les mouvements de la tête en particulier pour la prise alimentaire. L'animal peut aussi ressentir au réveil, de la fatigue et développer une fièvre.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés. Ceci est nécessaire afin de prélever les tissus et organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses. Ces examens donnent des informations complémentaires aux données mesurées sur l'animal vivant. Ils permettent de comprendre les mécanismes biologiques mis en jeu dans un tissu ou organe, le développement des lésions au cours du temps, et, les cellules impliquées. Ces prélèvements permettent aussi de réduire le nombre d'animaux dans les expérimentations.
Remplacement
Bien qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer complètement un organisme vivant, des études in vitro sur des lignées de cellules endothéliales humaines sont prévues pour comprendre les réactions biochmiques immédiates à l'échelle de la cellule et limiter dans la mesure du possible l'utilisation des animaux à cette fin (réduire). Les animaux sont prévus dans ce projet, pour explorer dans le temps, et dans un organisme vivant, les effets biologiques des molécules administrées sur les paramètres cardiovasculaires et métaboliques. C'est pourquoi, ils ne peuvent être substitués par d'autres modèles d'étude.
Réduction
1/Plusieurs données peuvent être obtenues avec un même animal : tests de tolérance au glucose, prélèvements de tissus, prélèvement de plasma pour étude des lipoprotéines (profils) prélèvement de foie ,... 2/ Une réflexion biostatique est réalisée en amont de la procédure/expérience, pour limiter le nombre d'animaux. Cette réflexion implique la recherche bibliographique et l'examen de travaux similaires avec le nombre d'animaux nécessaires pour démontrer une différence statistiquement significative. Elle implique aussi l'utilisation d'un logiciel de statistique pour estimer sur la base de précédents travaux effectués ou en cours de réalisation, le nombre d'animaux nécessaires pour chaque expérimentation à venir. 3/La formation et l'encadrement des expérimentateurs dans les procédures permet d'optimiser l'obtention de mesures/données fiables et interprétables sur un faible nombre d'animaux. 4/ Les animaux seront utilisés dans les expériences/procédures jugées indispensables en fonction de l'avancée du projet.
Raffinement
Pour optimiser l'expérimentation, la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire, voire supprimer la douleur, le stress et améliorer le bien-être des animaux seront mises en place : - les animaux seront élevés et hébergés dans une animalerie agréée - les moyens pour limiter le stress aux animaux sont appliqués: enrichissement des cages, animaux invités à coopérer dans les actes non invasifs et non douloureux (exemple: test de tolérance au glucose), expériences réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur - en cas de transport de l'animal, un transporteur agrée pour transport d'animaux sera réquisitionné - des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après l’opération (des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés pour réduire /supprimer la douleur) - la réduction de la durée de certaines études (surtout toxicologiques) - la mise en place de procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
Nous souhaitons d'utiliser la souris pour plusieurs raisons: Nous disposons d'une grande expertise de l'utilisation de cet animal (manipulation, procédures chirugicales, expérimentations spécifiques). Nous disposons aussi d'outils d'exploration des effets vasculaires des molécules étudiées appliqués aux vaisseaux de souris. Dans la littérature, les effets vasculaires de l'apoA-I sont pour beaucoup décrits avec les souris (sauvages et transgéniques) ce qui constitue une base pour notre recherche. Des souris transgéniques, porteuses de mutations sur des gènes qui nous interessent, sont disponibles, et, nous permettent de réaliser le projet.Les souris sont utilisées à partir de 8 semaine de vie. A cet âge, elles pourront débuter le régime gras, ce qui est classique dans les études explorant la mise en place de l'athérome au cours du développement de l'animal. Le régime gras sera maintenu sur 30 à 40 semaines maximum. Les différentes explorations sont prévues sur des animaux âgés de 8 semaines à 50 semaines maximum.
Développement d’un traitement innovant de la drépanocytose
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
486 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une drépanocytose, elles reçoivent des injections sous anesthésie et, pour une partie, sont placées trois heures dans une atmosphère appauvrie en oxygène afin de déclencher des crises d'occlusion des vaisseaux, avant une mise à mort sans réveil. Le porteur reconnaît que ces crises provoquent douleur, perte de poids et baisse de mobilité, atténuées par un antidouleur puissant. Il affirme que la complexité des crises vaso-occlusives ne peut être reproduite in vitro et que seule cette souris génétiquement modifiée reproduit fidèlement la maladie.
Objectifs
L’un des projets de recherche de notre unité de recherche consiste à développer un nouveau traitement contre la drépanocytose, une maladie génétique du sang qui touche les globules rouges et qui est associée à des complications récurrentes, graves et parfois mortelles. De plus, l’espérance de vie des patients drépanocytaires est réduite. Actuellement, cette maladie ne peut pas être guérie et elle se traite très difficilement. Ceci souligne le besoin pour les patients de pouvoir bénéficier de nouveaux traitements plus efficaces, ou qui pourraient être utilisés en combinaison avec les médicaments déjà existants, pour augmenter leur efficacité. Dans ce projet, nous nous proposons de démontrer l’efficacité de plusieurs médicaments que nous avons avons développés au laboratoire. Nous souhaitons également déterminer comment, et à quelle dose, devront être pris ces potentiels médicaments, lors de futures études cliniques chez les patients drépanocytaires. La drépanocytose étant une maladie particulièrement complexe, nous devrons tester nos molécules chez des souris drépanocytaires, qui sont les seuls animaux disponibles qui reproduisent fidèlement la maladie chez l'Homme. Si les résultats obtenus chez la souris sont convaincants, nous poursuivrons ensuite les tests de ce médicament potentiel, chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Si nos résultats sont positifs, ce projet pourrait clairement avoir un bénéfice pour la qualité de vie et l'espérance des patients drépanocytaires. Nous avons, d'ailleurs, obtenu un financement par une entreprise pharmaceutique qui est intéressée pour développer nos médicaments et les tester chez les patients.
Procédures
Une partie des souris utilisées (drépanocytaires ou non) seront injectées (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, puis au maximum 2 prélèvements de sang (durée de 30 s chacun) seront réalisés sous anesthésie générale. Les souris seront immédiatement mises à mort, sans retour à la conscience, après le dernier prélèvement de sang. Pour une des interventions cherchant à déclencher des occlusions des vaisseaux chez les souris drépanocytaires, celles-ci seront injectées 2 fois (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, puis seront placées, ou non, dans des conditions dans lesquelles l'oxygène de l'air sera diminué (de 21 à 8%), pendant 3 h, et enfin replacées à l'air ambiant pendant 1 h. Toutes les souris seront ensuite immédiatement anesthésiées (anesthésie générale), le sang sera prélevé (durée d’1 minute), et les souris euthanasiées. Finalement, les organes (foie, reins, cœur, poumons, rate) seront prélevés. Pour l’autre intervention cherchant à déclencher des occlusions des vaisseaux chez les souris drépanocytaires, celles-ci seront injectées 3 fois (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, et 3 h après la dernière injection, toutes les souris seront immédiatement anesthésiées (anesthésie générale), et le sang sera prélevé (durée d’1 minute). Les souris seront finalement euthanasiées et les organes (foie, reins, cœur, poumons, rate) seront prélevés.
Impact sur les animaux
Les souris drépanocytaires développent une maladie similaire à la drépanocytose humaine, avec en particulier une anémie chronique, mais sans effet majeur chez des souris jeunes (< 10 semaines), qui ont été choisies pour notre projet. Au cours de leur 10 semaines de vie, les souris drépanocytaires pourront développer des "crises vaso-occlusives" (comme les patients), engendrant pendant quelques jours une douleur, une perte de poids, une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Ces crises sont transitoires, mais seront soulagées avec l'administration d'un anti-douleurs puissant. De même, quand nous induirons les crises vaso-occlusives chez les souris drépanocytaires, ceci engendrera une douleur d'une durée au maximum égale à la durée de l'intervention (3-4 h), ainsi qu'une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Cette douleur sera prise en charge par administration préventive d'un anti-douleur puissant, avant le déclenchement de la crise. Dans ce projet, d'autres nuisances sont attendues pour les souris drépanocytaires ou non drépanocytaires, et sont liées à la préhension/contention des animaux, aux injections (introduction d'une aiguille sous anesthésie), ainsi qu’au prélèvement final de sang, à la perfusion intracardiaque, au prélèvement d’organes, et au sacrifice (tous sous anesthésie).
Devenir
Toutes les souris utilisées dans ce projet seront systématiquement euthanasiées en fin d'expériences. En effet, des analyses post-mortem sur des organes seront nécessaires pour certaines expériences. Pour le reste des expériences, les souris drépanocytaires (génétiquement modifiées), ou non drépanocytaires, ne pourront être ré-utilisées ou replacées car elles auront été injectées avec des molécules expérimentales dont les effets à long terme ne sont pas connus.
Remplacement
Les crises vaso-occlusives (CVOs) chez les patients drépanocytaires sont très complexes. Les cellules constituant les vaisseaux sanguins, mais également de nombreux types de cellules sanguines différentes, sont impliquées dans les mécanismes qui déclenchent ces crises. Ce système complexe ne peut à l'heure actuelle être remplacé par des systèmes in vitro, étant données les interactions multiples qui existent entre toutes ces cellules. L'évaluation de l'efficacité de nouveaux traitements dans la drépanocytose nécessite donc le recours à un modèle animal de cette maladie, et la souris est le seul modèle animal de drépanocytose actuellement disponible.
Réduction
Le but de notre projet est de déterminer si nos molécules pourraient être utilisées chez les patients drépanocytaires, avec des injections les moins fréquentes possibles, et si oui, à quelle dose. Dans un premier temps, nous partirons d'un dose classiquement utilisée en thérapeutique pour d'autres maladies, et nous évaluerons quelles molécules restent détectables dans le sang 96 h après l'injection, à cette dose. Seules les molécules respectant ce critère seront étudiées plus en détail dans ce projet, ce qui permettra de limiter le nombre de molécules testées, et donc le nombre de souris utilisées. Ces molécules seront ensuite testées pour savoir si elles sont efficaces pour limiter l’ampleur des crises vaso-occlusives chez des souris drépanocytaires. Pour répondre à cette question, le nombre de souris à utiliser pour obtenir des résultats robustes a été déterminé en nous basant sur des expériences similaires qui nous ont ensuite permis d’utiliser des logiciels de statistiques spécifiques pour estimer ce nombre. Au total, 360 souris devront ainsi être utilisées, mais uniquement si toutes les molécules répondent à nos critères initiaux. De plus, le maximum d’organes seront prélevés pour ne pas avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris. Il est aussi prévu, en fin de nos expériences, de prélever une quantité de sang suffisante pour pouvoir répéter les analyses sur le sang, sans avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, un enrichissement est prévu dans les cages. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées aux rongeurs, avec un nombre d’individus par cage compris entre 3 et 5 (pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une population trop importante). Toute injection ou tout prélèvement sera effectué sous anesthésie générale. Lors des modèles d'induction des crises vaso-occlusives (CVOs) chez les souris drépanocytaires, qui sont douloureuses, les animaux resteront sous la surveillance continuelle de l'expérimentateur, et tout changement de comportement et d’apparence physique, ainsi que des signes de douleur, seront recherchés. Si ces changements et ces signes sont trop importants, l’animal sera euthanasié et l’expérience sera interrompue pour cet animal. Surtout, un médicament anti-douleur très puissant sera administré aux souris, en prévention, avant de déclencher la CVO. Il est également possible que les souris drépanocytaires élevées dans notre animalerie développent spontanément une CVO douloureuse, en raison de leur maladie. C’est pourquoi ces souris drépanocytaires seront quotidiennement surveillées, y compris pendant leur hérbergement, et elles seront traitées par un anti-douleur très puissant quand des signes évoquant des COVs seront constatés.
Choix des espèces
Seule cette espèce possède un modèle génétiquement modifié mimant la drépanocytose, et qui reproduit de façon fidèle les manifestations cliniques de la maladie. Des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines maximum seront utilisées, car les souris drépanocytaires développent ensuite des atteintes d’organes sévères au cours du vieillissement.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements pour le syndrome de détresse respiratoire aigüe à l’aide de modèles de sepsis chez le rongeur (souris et rats)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Rats : 3900
5 070 souris et 3 900 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs déclenchent un sepsis par injection de toxine LPS ou par ligature du caecum, provoquant septicémie, inflammation, perte de poids, atteintes pulmonaires et choc septique, pour tester de nouveaux traitements du syndrome de détresse respiratoire aiguë. Le porteur n'attend pas de nuisance liée aux traitements eux-mêmes, qu'il présente comme non toxiques. Il affirme que le rat et la souris reproduisent au mieux la maladie humaine et que les essais in vitro ne suffisent pas.
Objectifs
Le Syndrome de Détresse Respiratoire Aigüe (SDRA) est un syndrome clinique d'inflammation et d'œdème pulmonaire diffus qui provoque généralement une insuffisance respiratoire aiguë. Le SDRA peut être causé par des déclencheurs infectieux ou non infectieux qui impliquent l'activation et la dérégulation de multiples voies de lésion, d'inflammation et de coagulation qui se chevauchent et interagissent dans les poumons et dans le système. Le plus souvent, le SDRA peut se développer dans le cadre d'une pneumonie, d'une septicémie (39% des cas), d'une aspiration du contenu gastrique ou d'un traumatisme grave. Le SDRA représente 10 % de tous les patients dans les unités de soins intensifs dans le monde entier, avec un taux de mortalité élevé (30-40 %). Le SDRA se caractérise par une mauvaise oxygénation et des poumons non conformes ou "rigides", c'est pourquoi la ventilation mécanique et les thérapies de soutien sont les piliers du traitement de la maladie. Cependant, le taux de mortalité est toujours très élevé, il est donc nécessaire de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques visant à découvrir ou repositionner des molécules et comprendre les mécanismes qui jouent un rôle dans la survenue et l’évolution de la pathologie. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte du SDRA avec la mise en place de modèle animaux reproduisant ces pathologies chez la souris ou le rat. L’objectif est de trouver des molécules pouvant retarder la progression de la maladie et améliorer la qualité de vie des patients atteints par cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans la septicémie et le SDRA. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui ralentiraient la progression de la maladie évaluée par des analyses sanguines (marqueurs inflammatoires, de toxicité, de NEToses (formation de pièges extracellulaires des neutrophiles) et de fibrose) ou par analyse histologique (recrutement des fibrocytes, fibrose, NEToses, toxicité).
Procédures
Tous les animaux des groupes 2 à 7 subiront soit une injection unique en intra-péritonéale de LPS, soit une administration unique en intra-nasale de LPS, soit une administration unique en intra-trachéale de LPS, soit une ligation du caecum par méthode chirurgicale pour induire la pathologie. L’injection intra-péritonéale se fera sur animaux vigiles tandis que pour l’administration intranasale et intratrachéale ainsi que pour la méthode chirurgicale, l’induction se fera sur animaux anesthésiés. Les animaux du groupe 1 quant à eux recevront du sérum physiologique, du PBS ou seront opérés à blanc. Les injections intra-péritonéales dureront moins d’une minute par animal. Les administrations intra-nasales et intra-trachéales dureront environ 5 minutes par animal et la méthode chirurgicale durera environ 20 minutes par animal. Les traitements pourront être administrés en préventif (jusqu'à 1 mois avant l'induction du modèle) et/ou en curatif (jusqu'à 4 semaines après l'induction du modèle). Selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra- péritonéale, sous-cutanée, par voie orale, par voie topique sur animal vigile ou par système de mini-pompe osmotique qui sera la voie préférentielle. Tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. Cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques. Les animaux seront pris en contention pour être anesthésiés avec un mélange de kétamine /xylazine, qui sera administré par injection intra-péritonéale ou par inhalation d’isoflurane. Lors des prélèvements de sang intermédiaires par voie rétro-orbitale ou lorsque qu’un animal présentera un score total compris entre 5 et 7, toutes catégories confondues dans le tableau des points limites, les souris et les rats seront traités avec de la buprénorphine. Le prélèvement sanguin durera environ 5 minutes par animal. A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort selon les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Du fait de l'induction des modèles, les animaux vont développer une septicémie associée à une élévation des marqueurs inflammatoires, une perte de poids et des complications aux longs termes telle que des dommages dans les poumons et un choc septique. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).
Devenir
Euthanasie : le poumon sera prélevé pour analyse histologique et prélèvement de sang.
Remplacement
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation, le recrutement des neutrophiles et la fibrose implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie du sepsis et du SDRA. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur l’inflammation et les dommages pulmonaires pouvant mener à la fibrose, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en modèle cellulaire.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux grâce à une approche statistique, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude donc une analyse statistique appropriée sera réalisée.
Raffinement
Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, prélèvement de sang) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque) ou par injection de kétamine/xylazine en intra-péritonéale. Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Pour les modèles d’induction par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique qui sera administré en phase pré- et post-opératoire ainsi qu’un analgésique local appliqué lors de la procédure chirurgicale. En dehors de la phase de chirurgie, l’utilisation d’antibiotiques peut être nécessaire afin de retarder le choc septique. Toutefois, en cas de douleur ou de souffrance importante, un analgésique pourra être employé. Nos études étant basées sur des modèles inflammatoires, les anti-inflammatoires ne sont pas applicables. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 5 premiers jours qui suivent l’induction puis trois fois par semaine pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est compris entre 5 et 7, l’animal recevra une injection de buprénorphine ou de meloxicam. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >7 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, étant donné leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour ces modèles en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de rat Sprague Dawley (SD) est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Chez la souris, les souches C57Bl/6 et Balb/c représentent les souches de choix. Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier du modèle utilisé, des objectifs et des besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés d’au moins 8 semaines au début de l’étude, en accord avec la littérature existante pour effectuer ces différents modèles. De plus, à cet âge, le système immunitaire de ces animaux est totalement développé.
Etude de la formation de la cardiomyopathie atrial associée à la réponse immuno-inflammatoire dans le modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 70
Nourries quatre mois d'un régime enrichi en graisse, des souris sont prélevées d'une goutte de sang à la queue huit fois en deux heures, éveillées et chacune isolée dans une cage, puis examinées sous anesthésie par échocardiographie. D'autres souris et des rats subissent une chirurgie cardiaque destinée à installer une insuffisance cardiaque, et d'autres souris encore sont irradiées puis reçoivent le lendemain des cellules de moelle osseuse de souris donneuses. Au total, 1 370 souris et 70 rats, soit 1 440 rongeurs, vont être utilisés, la déclaration en comptant 1 100 en souffrance modérée et 340 en souffrance sévère. Le porteur cite comme effets possibles des difficultés à se déplacer et à s'alimenter, des douleurs après l'opération, des arrêts cardiaques et un affaiblissement après l'irradiation. Tous seront tués à la fin des actes, pour les prélèvements et les analyses.
Objectifs
La fibrillation atriale est l’arythmie la plus fréquente en pratique clinique. Sa prévalence augmente avec le vieillissement de la population faisant craindre une épidémie dans les 50 prochaines années. La cardiomyopathie atriale définie une déformation du myocarde atrial, un remodelage du tissu et une désorganisation de la hiérarchie du tissu. A l’échelle fonctionnelle, les conductions électriques sont anormales et favorisent les troubles du rythme (arythmie). Récemment, il a été décrit une accumulation de tissu gras à l'épicarde de l'oreillette. Les maladies métaboliques comme l’obésité sont des facteurs de risques de la fibrillation atriale, dans lesquels ce tissu gras épicardique semble dégénérer et libérer des facteurs qui diffusent librement dans le myocarde. Une infiltration de cellules immunes est observée, perturbant l’environnement homéostasique. Quiescent dans le cœur sain, l’épicarde atrial est réactivé en réponse à un stress, et devient une source de progéniteurs capables de se différencier en myofibroblastes et en adipocytes. Un stress de l'environnement réactive les progéniteurs et induit une transformation de ces cellules en adipocytes qui composent le tissu gras. Aujourd'hui, rien n’est connu sur les échanges et l'impact des cellules inflammatoires avec les progéniteurs. Les objectifs sont d'identifier les cellules immunitaires infiltrées et de comprendre leur rôle.
Bénéfices attendus
Les projets portant sur la compréhension du changement de structure et de fonction de l'oreillette dans le contexte de l'obésité et de l'insuffisance cardiaque permettront de cibler le rôle de l'inflammation et ses conséquences dans le développement précoce des troubles du rythme atrial.
Procédures
Procédure souris obèses : les souris seront mises sous régime enrichie en graisse pendant 4 mois. Elles seront soumises à une prise d'une goutte de sang répétée 8 fois en 2 heures pour tester l'évolution de syndromes métaboliques. Pour cela, les animaux sont vigiles, isolés les uns des autres dans 1 cage. Lors du prélèvement à la queue, chaque souris est posée tranquillement sur la grille, sans contention et le prélèvement d’une goutte de sang est effectuée en quelques secondes. Des mesures cardiaques seront effectuées par un monitoring adapté (échocardiographie) qui dure 5 minutes par animal et des tests de troubles de rythme qui dure 5 minutes par animal seront aussi réalisés. Durant toute la procédure, les animaux seront anesthésiés. Procédure, insuffisance cardiaque : les souris et les rats subiront une chirurgie cardiaque, sous anesthésie avec un anesthésiant et une injection de combiné de deux analgésiques pour respecter le bien-être animal. La durée de l'intervention est de 10-15 minutes. Puis, des mesures échocardiographies sous anesthésie seront réalisées, la durée est de 5minutes par animal. Procédure irradiation : les souris receveuses, seront irradiées, la durée est de 5 minutes par animal. Le lendemain elles sont transplantées avec des cellules issues de la moelle osseuse de souris donneuses.
Impact sur les animaux
L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage mais également à une obésité, un diabète. L'insuffisance cardiaque engendre des difficultés de déplacement et d'alimentation les 1ers jours et des arrêts cardiaques. La chirurgie peut conduire à des risques anesthésiques (détresse respiratoire, hypothermie, arrêt cardio-respiratoire) mais aussi à des douleurs post-opératoires ou encore à un risque infectieux. L’irradiation peut également induire un affaiblissement général en plus du risque infectieux accru.
Devenir
La totalité des animaux seront euthanasiés à la fin des actes pour réalisation des prélèvements et analyses.
Remplacement
Les projets ont pour but de comprendre l’influence du métabolisme et de l'immunité sur l’activité cardiaque et le remodelage atrial. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, des biopsies de tissu provenant d'études antérieures seront utilisées pour ne pas reproduire les expériences. Des lignées de cellules seront aussi utilisées.
Réduction
La taille des effectifs est établie avec un calcul de puissance en amont et par la suite des analyses seront effectuées en plus du nombre d'animaux. Les lots d'animaux d'expérimentation sont 1370 souris + 70 rats = 1440 animaux
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux sont en cage par 5 avec du matériel d'enrichissement. Les souris rendues obèses seront surveillée quotidiennement, des tests de glycémie seront réalisés pour surveiller l'obésité et le diabète. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Les points limites sont évalués par un personnel compétent, notamment sur l'aspect du pelage, le comportement et la mobilité. Dans le projet de l’insuffisance cardiaque, les animaux sont en cage par 5. Le jour de la chirurgie, ils sont anesthésiés puis rasés sur le thorax et désinfectés avec un antiseptique dermique. Une dose d'analgésique sera injectée en sous cutané chez l’animal 30 minutes avant la procédure chirurgicale et 30 minutes avant la fin de la procédure. La 1ère semaine, les animaux seront nourris avec de la bouillie et l'apport d'eau sera facilité. Les souris seront surveillées quotidiennement et la prise de poids sera évaluée de manière hebdomadaire. Les points limites seront évalués quotidiennement par un personnel compétent et formé. Le comportement, la mobilité, la prise de poids, l'aspect du visage, l'aspect de la cicatrice seront des critères évalués quotidiennement par un scoring. Dans le projet de l’irradiation, les souris seront surveillées quotidiennement, une attention particulière sera effectuée sur la consommation de l’eau dans lequel un antibiotique sera ajouté pour contrôler la fragilité à l’infection. Une alimentation directement dans la cage pour faciliter l’hydratation en post-irradiation avec de la nourriture molle sera employée.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus approprié pour nos études concernant la réponse systémique dans le développement des arythmies cardiaques. Il s'agit du seul modèle dans lequel ont été générées des lignées déficientes pour l’expression de gènes d'intérêt. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. La souris est l'espèce pour laquelle la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie. Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études concernant l'isolement de cellules progénitrices de l"épicarde. Le modèle d'insuffisance cardiaque permet d'augmentere le nombre de cellules progénitrices in situ, de les isoler et de travailler par la suite in vitro. Souris et rats adultes de 8 semaines à 12 semaines d’âge. Ce stade de développement corrobore avec le début de l’âge adulte, un stade qui correspond au début du développement des maladies cardiovasculaires chez l’homme.
Exposition chronique aux additifs et contaminants alimentaires inorganiques de la vie in utero à l’âge adulte: impact d’un challenge LPS sur la réponse du système immunitaire intestinal et systémique et l’homéostasie de la barrière intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées dès la vie intra-utérine à des additifs alimentaires ou à des pesticides contenant des nanoparticules, elles reçoivent ensuite une injection de toxine bactérienne qui peut perturber leur état général. Le porteur signale un stress lié aux manipulations, à la contention et à l'injection. Il affirme que le recours à l'animal est "nécessaire" pour obtenir cette exposition chronique dès l'utérus et qu'aucun modèle alternatif ne reproduit les interactions entre microbiote, intestin et réponse immunitaire.
Objectifs
Ce projet fait suite à un projet précédant qui a permis de montrer une perturbation du fonctionnement du système immunitaire intestinal et extra-intestinal lors d'une exposition à des nanoparticules (TiO2 et SiO2) avec notamment une altération des réponses fonctionnelles des cellules immunitaires. Pour déterminer si cela pourrait conduire à une perturbation de la réponse immunitaire à un challenge infectieux in vivo, nous étudierons la réponse de souris soumises à une infection à une toxine bactérienne lipopolysaccharidique (appelée LPS) après qu'elles aient été exposées de façon chronique à des additifs alimentaires ou à des contaminants de type pesticide contenant des nanoparticules.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mettre en évidence l’impact d'additifs et de contaminants de type pesticide sur les défenses immunitaires dirigées contre une infection de type bactérien. Il apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale dans l'utilisation de ces additifs et contaminants. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin de réguler l'exposition humaine aux nanoparticules inorganiques.
Procédures
Les animaux seront exposés aux additifs alimentaires ou aux contaminants de type pesticide contenant des nanoparticules à des doses encandrant l'exposition humaine. Puis, ils seront exposés au maximum 6 h à une toxine bactérienne délivrée par injection unique nécessitant une contention de quelques secondes des animaux.
Impact sur les animaux
La mise en oeuvre de nos procédures pourra générer du stress. Il sera atténué par l'habituation des animaux aux manipulations hebdomadaires (suivi de poids, observations). Ensuite, la contention et l'injection de toxine peut engendrer un court stress. La toxine peut perturber l'état général des animaux qui seront sous surveillance constante jusqu'à la fin de l'expérimentation.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer des prélèvements permettant d'étudier la réponse immunitaire contre la toxine bactérienne.
Remplacement
Le projet étudie les effets des nanomatériaux alimentaires contenus dans des contaminants de type pesticide sur la réponse à une infection après une période d’exposition périnatale et jusqu'à l'âge adulte,. L’utilisation du modèle animal est nécessaire afin d’avoir cette exposition chronique dès la vie in utero. De plus, l’étude portera sur les interactions microbiote-intestin et intestin-réponse immunitaire et aucun modèle alternatif ne permet de recréer toutes ces interactions. Du fait de ces 2 raisons majeures, le recours à l'animal est donc nécessaire.
Réduction
Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en collectifs (5 ou 3 par cages selon l'expérimentation) dans des cages contenant des abris et les femelles gestantes seront isolées (1 par cage) avec un enrichissement des cages (dispositifs de nidification en papier absorbant) afin d'améliorer leur bien-être. Les individus présentant une détérioration de l'état général (poil piqué, dos vouté, difficulté de mobilité, agressivité extrême) et/ou une perte de poids significative seront écartés de l'étude et des soins adaptés leur seront donnés. L'exposition à la toxine bactérienne peut perturber l'état général des animaux qui seront observés en continu jusqu'à leur euthanasie
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote et l’intestin. Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6J car nous avons déjà des résultats préliminaires concernant l’exposition des adultes aux additifs alimentaires. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte pour mimer une exposition périnatale et chronique à long terme.