Rongeurs
Toxicité aiguë – Méthode par classe de toxicité aiguë (OCDE 423)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 360
480 animaux non-humains, 120 souris et 360 rats, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une administration unique d'une substance par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée ou endotrachéale, dans le cadre d'un test réglementaire de toxicité aiguë suivant la ligne directrice OCDE 423. Le porteur indique que les animaux montrant des signes cliniques intenses ou perdant plus de 20 % de leur poids sont mis à mort, et observe tremblements, convulsions, salivation, diarrhée, léthargie et coma. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode in vitro capable de générer ces données et présente l'étude comme obligatoire pour compléter les dossiers de mise sur le marché.
Objectifs
Des études in vivo chez le rat ou la souris sont réalisées dans le cadre de l’évaluation du risque toxicologique des substances. Il s'agit d'études reglementaires suivant les recommandation des lignes directrices de l'OCDE. Les résultats sont destinés à compléter les dossiers de demande d’autorisation à fournir aux autorités compétentes pour leur mise sur le marché.
Bénéfices attendus
Ces études réglementaires sont réalisées dans le cadre de l’évaluation du risque toxicologique des substances. Elles permettent de fournir des résultats destinés à compléter les dossiers de demande d’autorisation de mise sur le marché à fournir aux autorités compétentes .
Procédures
Les animaux subissent une administration unique d'une substance par voie orale dans des limites appropriées à la taille et à l’espèce de l’animal. Cependant pour le besoin de certaines molécules (pour lesquelles la voie orale ne convient pas), le protocole est adapté pour une administration par voies intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée ou endotrachéale. Le temps d'intervention sur chaque animal est de 5 minutes. Il n'y a qu'une intervention par animal.
Impact sur les animaux
Les observations portent sur les modifications de la peau, des poils, des yeux et des muqueuses, l'appareil respiratoire, le système circulatoire, le système nerveux central et autonome, l'activité somato-motrice et le comportement. Puis des observations sont faites sur diverses manifestations de tremblement, convulsion, salivation, diarrhée, léthargie, sommeil et coma. Tout animal montrant des signes cliniques modérés et/ou intenses, ou une perte de poids importante (>20% ) sont msis à mort.
Devenir
Les animaux ont été traités par des substances. En fin de procédure ils sont donc mis à mort. En effet, ces traitements pourraient avoir une incidence sur l'effet d'autres substances testées ultérieurement.
Remplacement
Ces protocoles sont des études réglementaires qui permettent de générer des données sur un produit à étudier avant d’entreprendre des études de toxicologie (plus longues et nécessitant plus d’animaux). Elles sont obligatoires d'un point de vue réglementaire et permettent de générer des résultats pour l'établissement des dossiers de demande d’autorisation de mise sur le marché à fournir aux autorités d’enregistrement. Il n'existe pas de méthode in vitro permettant de générer de telles données.
Réduction
Les études sont faites de façon séquentielle : on observe les effets sur les animaux avant de décider d'administrer une nouvelle dose ou un autre niveau de dose (inférieur ou supérieur). Chaque étape n'utilise que 3 animaux.
Raffinement
Les animaux sont acclimatés et manipulés dans le calme, à distance des autres animaux (y compris lors de la mise à mort). Les animaux sont placés en cages sur portoirs ventilés : chaque cage est composée d’un bac (en polysulfone) fixé à un couvercle (en polyéthérimide) doté d’un plénum connecté au plénum d’air d’extraction du portoir. Le bac est équipé d’un couvercle en acier inoxydable muni d’une mangeoire et de poche d'eau. Nourriture et eau sont fournies ad libitum. Les cages sont dépression par rapport à l’animalerie elle-même ventilée. La ventilation dans le portoir renouvelle l'air environ 100 fois par heure et l’air dans l’animalerie est renouvelé 20 fois par heure. Une minuterie permet d'éclairage 12 heures par jour (8 heures-20 heures). La température est de 22 ± 3 °C et l'humidité de 55 ± 15%, selon les recommendations. Les animaux sont placés dans les cages par groupes de 3 maximum. chaque cage contrient une litière composée de granulés de résineux irradiés. Les cages contiennent un enrichissement. Les volumes administrés sont dans des limites appropriées à la taille et à l’espèce de l’animal. Une fois traités, les animaux sont observés fréquemment: pendant les 30 premières minutes après administration et régulièrement pendant les premières 24 heures, particulièrement au cours des 4 premières heures. il y a ensuite des observations quotidiennes pendant 14 jours. La durée totale d'observation est variable en fonction des réactions de toxicité, du moment où elles apparaissent et de la durée de la période de récupération. Elle peut donc être prolongée à 21 ou 28 jours. Les observations portent sur les modifications de la peau, des poils, des yeux et des muqueuses, l'appareil respiratoire, le système circulatoire, le système nerveux central et autonome, l'activité somato-motrice et le comportement. Puis observation des diverses manifestations de tremblement, convulsion, salivation, diarrhée, léthargie, sommeil et coma. Tout animal montrant des signes cliniques modérés et/ou intenses, ou une perte de poids importante (>20% ) fait l'objet d'une mise à mort.
Choix des espèces
L’étude est réalisée selon les recommandations de la ligne directrice de l’OCDE spécifique à ce test qui stipulent qu'elle doit être menée sur des rongeurs. RAT Par étude : 3 animaux par groupe, maximum 8 groupes = 24 animaux maximum. 3 études par an. Soit 72 animaux par an Donc 360 animaux sur les 5 années d’autorisation de projet. 8 à 12 semaines (soit 200 à 250 g environ) selon les recommandations de la ligne directrice. SOURIS Par étude : 3 animaux par groupe, maximum 8 groupes = 24 animaux maximum. 1 études par an. Soit 24 animaux par an Donc 120 animaux sur les 5 années d’autorisation de projet. 8 à 12 semaines (soit 25 à 35 g pour la souris) selon les recommandations de la ligne directrice.
Etude d’efficacité d’agents anti-cancéreux sur trois modèles de cancers gastriques humains greffés en sous cutané chez la souris immunodéprimée
- Recherche appliquée
- Cancers
720 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent en sous-cutané une greffe de trois cancers gastriques humains, puis neuf injections intrapéritonéales ou vingt-huit gavages, avec suivi de la tumeur au pied à coulisse jusqu'à un volume limite. L'objectif est de tester quatre molécules et une technologie brevetée de ciblage tumoral, avant d'éventuels essais cliniques. Le porteur affirme qu'après des tests sur cellules, la validation exige de travailler sur "un organisme entier et complexe".
Objectifs
Ce projet vise à tester l’efficacité anti-cancéreuse de quatre molécules novatrices dans trois modèles de cancer de l’estomac. Le diagnostic des cancers gastriques est souvent tardif, où le cancer de l'estomac est foudroyant. Malgré l’arrivée de nouveaux traitements, le besoin médical non couvert demeure très important. Le but des candidats médicaments testés est d'apporter un nouveau traitement novateur qui pourrait également en combinaison améliorer les chimiothérapies actuelles en diminuant leurs effets secondaires indésirables et en boostant leur efficacité. Afin de soigner les patients atteints de cancers de l’estomac qui résistent aux traitements actuels, une technologie brevetée permettant de cibler spécifiquement la tumeur, sans toucher les autres organes, et, ce faisant, de réduire la toxicité des traitements anticancéreux et augmenter leur efficacité, a été mise au point et sera testée ici.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont la démonstration que de nouvelles molécules thérapeutiques sont actives dans le traitement du cancer de l’estomac. Cette approche thérapeutique permettra au mieux de guérir les patients atteints de cancers gastriques, sinon de ralentir la progression tumorale. Ces résultats sont nécessaires afin de procéder à l’évaluation ultérieure de ces molécules dans le cadre d’études cliniques précoces chez l’Homme.
Procédures
Suite à l’implantation sous cutanée des cellules cancéreuses (injection de quelques secondes maximum), les souris seront observées et palpées 3 fois/semaine. Dès que les tumeurs seront palpables, le suivi des animaux sera fait comme suit : mesure de la taille des tumeurs au pied à coulisse 3 fois/semaine et pesée des souris 3 fois/semaine (geste de quelque secondes maximum). L’observation des animaux sera réalisée 3 fois /semaine par le(s) expérimentateur(s) en même temps que la palpation et la pesée. Les souris vont subir 9 injections intrapéritonéales (3x/semaine pendant 3 semaines) ou 28 gavages au total (2x/jour pendant 2 semaines). Les injections et gavages durent 10 secondes maximum.
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir des injections sous cutanée qui vont générer du stress à la contention ainsi qu’une douleur de courte durée à l’injection. La pousse tumorale peut engendrer une perte de poids et des douleurs au niveau de la tumeur. Les injections intrapéritonéales et les gavages peuvent générer une douleur lors de l’injection. Les chimiothérapies peuvent entrainer des effets néfastes sur l’état général des souris, mais les drogues utilisées ici ont été testée précédemment et n'ont présenté aucun effet secondaire délétère. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress lors de la contention et éventuellement de la douleur au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour cause d'atteinte du volume tumoral maximal tel que défini dans les points limites et pour prélèvement des tumeurs pour analyse.
Remplacement
Des tests in vitro ont été effectués au préalable et ont permis d'affiner le design de l'étude, mais la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anti-cancéreux est fortement dépendante du microenvironnement tumoral. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur et au sein de l’organisme nécessite de travailler sur un organisme entier et complexe. Pour cette raison nous devons effectuer ces études d’efficacité chez la souris.
Réduction
Les études seront faites séquentiellement et une évaluation de l’efficacité des 4 composés sera effectuée après la réalisation des expériences sur le premier modèle, ce qui donnera lieu à une décision d’arrêter ou de continuer les expériences pour les modèles suivants. Cette décision sera prise par le comité scientifique. Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'un outil statistique et les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. Les études sur les différents modèles tumoraux seront réalisées en séquentiel, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés. En conséquence, les études statistiques nous ont permis de déterminer qu'il nous faudra 720 animaux au total pour cette étude.
Raffinement
Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures, les animaux seront habitués à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort au plus tard 56 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux). Pour les composés administrés en gavage, des sondes de gavage flexibles et à usage unique seront utilisées. Les animaux seront observés de manière qualitative par les zootechniciennes de l'animalerie qui remplissent tous les jours une grille de suivi, basée sur des scores de critères comportementaux. Les animaux ainsi repérés sont inspectés le jour même par un membre de l’équipe de recherche qui procédera à l’évaluation des points limites selon une grille de scoring. Cette procédure sous forme d'arbre décisionnel ainsi que la définition de points limites adaptés à l'étude permettent une évaluation objective des critères d'arrêt des souffrances.
Choix des espèces
L'objectif est de travailler sur des animaux présentant des tumeurs et éviter le phénomène de rejet. L'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter ce phénomène. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif est un modèle qui permet une prise tumorale avec de nombreuses lignées humaines. En effet cette souris immunodéprimée est une souche reconnue pour l’implantation de tumeurs humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.
Analyse des conséquences de mutations dans des gènes impliqués dans la stabilité du génome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
404 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour des défauts de réparation de l'ADN, elles reçoivent des injections d'un agent myéloablatif, le 5-fluoro-uracile, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le projet étudie les conséquences de ces mutations sur l'instabilité du génome et le développement de cancers, avec des pistes annoncées pour les téloméropathies. Le porteur indique réaliser une partie des analyses sur fibroblastes prélevés, et affirme que le reste ne peut s'étudier qu'in vivo sur "le mammifère in toto".
Objectifs
L’information génétique nécessaire au bon fonctionnement des organismes vivants est contenue dans les molécules d’ADN qui forment les chromosomes. Les télomères représentent des structures particulières situées aux extrémités des chromosomes qui protègent ces derniers de la dégradation et de la fusion, source d'instabilité génomique. De nombreux facteurs participent à la protection des télomères. Par ailleurs l’ADN fait constamment l’objet de dommages introduits soit secondairement à des fonctions physiologiques telles que la réplication, soit à la suite d’exposition à des agents génotoxiques de l’environnement tels que les rayonnements. Ces dommages sont très efficacement réparés pour éviter l’altération de l’intégrité du génome. Les défauts de réparation de l’ADN et de protection des télomères, notamment dans certaines maladies génétiques, conduisent à diverses pathologies telles que les déficits immunitaires, les téloméropathies ou les cancers. Nous générons des modèles murins d’altération des processus de protection des télomères et de réparation de l’ADN afin d’apprécier les conséquences du défaut de ces processus dans certaines maladies génétiques et dans le développement des cancers afin d’entrevoir de nouvelles solutions thérapeutiques pour ces maladies.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter de nombreuses informations originales et fondamentales sur les conséquences fonctionnelles de certaines de ces mutations dans la stabilité des télomères, l'intégrité du génome, et leurs implications dans les téloméropathies. Les résultats obtenus devraient permettre d'ouvrir des pistes à des approches thérapeutiques chez les patients atteints de téloméropathies causées par ces mutations.
Procédures
Des injections intrapéritonéales contenant du 5 fluoro-uracile (5FU), un produit myéolablatif, seront effectuées. A la dose utilisée de 5FU, il n'y a pas d'effet indésirable globale de cette drogue. Une létalité embryonnaire peut exister lors de la gestation des animaux homozygotes.
Impact sur les animaux
Les animaux, du fait d'un défaut potentiel de la stabilité du génome peuvent présenter un défaut immunohématologique. Cependant leur maintien dans une zone EOPS devrait les préserver d'infections opportunistes. Par ailleurs l'injection de l'agent myéloablatif génère une légère douleur lors de l'injection intrapéritonéale et provoque un stress et réduit le nombre de cellules souches hématopoiétiques.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques
Remplacement
Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des organes prélevés sur des souris. Il s’agit ici d’études sur le développement du système hématopoïétique qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère in toto. En effet, le développement du système hématopoiétique des mammifères et son fonctionnement ultérieur sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part. Les organoïdes permettant d'étudier l'hématopoïèse et en particulier la lymphopoïèse ne sont pas actuellement disponibles. De même les approches in silico ne permettent pas d'étudier m'impact de mutations sur l'hématopoïèse et la lymphopoïèse. En revanche l'analyse de la réparation de l'ADN et de la stabilité des télomères sera en grande partie réalisée dans des fibroblastes embryonnaires des différentes lignées murines ce qui permettra d'utiliser un nombre limité d'animaux.
Réduction
En se basant sur des test statistiques, nous réduiront au maximum le nombre d'animaux utilisés pour obtenir les résultats escomptés. Les tests statistiques faits a priori utiliserons le calcul de puissance. Les tests statistiques faits a posterori seront réalisés à l'aide d'un test non-paramétrique . Par ailleurs, de nombreux tests seront réalisés sur des fibroblastes obtenus de souris, permettant une étude in vitro de nombreux paramètres et ainsi réduisant le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront observés de façon hebdomadaire par le personnel compétent de l'animalerie. Les cages disposent par ailleurs de matériel d'enrichissement (bouts de coton, tunnels colorés). Le maintien des animaux dans une zone EOPS devrait les préserver d'infections opportunistes. La mise à mort de l'animal sera réalisée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites. Le scoring hebdomadaire est réalisé en plus de l'observatin quotitidenne règlementaire des animaux. Les injections intrapéritonélaes sont peu douloureuses et ne nécessitent pas d'analgésie.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement du système immunohématopoiëtique, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement de ce système entre les rongeurs et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation de ce projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. Le phénotype dommageable affectant la survie (embryonnaire et postnatale) sera réalisé au moment du sevrage (3 semaines), le phénotype du système immunitaires sera réalisé à 8-10 semaines (période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel), l'apparition de tumeur sera évaluée à 3 mois (les tumeurs surviennent généralement vers 6 mois, puisque nous voulons savoir s'il y a une accélération de l'apparition des tumeurs dans les modèles de souris double mutantes par un effet de synergie nous analyserons ces souris à 3 mois).
Entretien d’une lignée de souris dont le gène de la chromogranine A est floxé (ChgA-loxP); Génération et entretien d’une lignée de souris dont le gène ChgA est éliminé sous le contrôle du promoteur du gène du 26Rfa (26RFa-iCre/+)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce projet se limite à produire et entretenir des lignées génétiquement modifiées, avec biopsie de la queue sous anesthésie pour génotypage et pose d'une puce sous-cutanée. Les souris de génotype "inadéquat" sont tuées après génotypage, et les couples reproducteurs le sont quand ils cessent de donner des portées. Le porteur relie cet élevage à l'étude d'une protéine liée à l'obésité et au diabète, présentés comme la pandémie de "diabesity".
Objectifs
L'obésité et le diabète de type II connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans qui fait de la pandémie mondiale de "diabesity" un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que des neuropeptides connus pour jouer un rôle crucial dans le contrôle hypothalamique du comportement alimentaire sont aussi exprimés dans les îlots pancréatiques, suggérant que les neuropeptides hypothalamiques pourraient servir de lien entre l’homéostasie énergétique et glucidique. C’est le cas du 26RFa, neuropeptide hypothalamique identifié au sein de l'Unité comme le ligand endogène d’un récepteur humain orphelin, le GPR103. Des études récentes menées au sein du laboratoire révèlent que le 26RFa est un nouvel acteur de la régulation de la glycémie. Au sein de notre équipe, nous avons rapporté le rôle essentiel d'une protéine de la famille des chromogranines, la chromogranine A (CgA), dans la formation des granules de sécrétion, organites permettant le stockage et la sécrétion des neuropeptides. De manière intéressante, les souris dont le gène exprimant la CgA a été invalidé de manière globale sont hypertendues et obèses. Or la CgA est exprimée par de nombreuses populations de cellules nerveuses, et de récentes études préliminaires nous ont permis d'observer que les neurones 26RFa expriment également la CgA. Ainsi, la compréhension du rôle de cette chromogranine dans les mécanismes moléculaires de la sécrétion des neuropeptides tels que le 26RFa pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du diabète de type II. Dans ce contexte, nous souhaitons héberger et reproduire des souris CgA-loxP obtenues de "GemPharmatech". L'entretien de cette lignée nous permettra d'invalider de manière ciblée le gène exprimant la CgA en la croisant avec la lignée 26RFa-iCRE/+ pour invalider la CgA dans les cellules exprimant le 26RFa. Ce croisement devrait nous permettre de caractériser l'impact de l'altération de la sécrétion de neuropeptides sur la régulation de l'homéostasie du glucose dans l'organisme.
Bénéfices attendus
L'expression de la CgA étant ubiquiste, l'invalidation globale du gène exprimant la CgA ne nous permet pas de discriminer le rôle central des rôles périphériques de la CgA quant au contrôle de l'homéostasie glucidique. Par ailleurs, la caractérisation du phénotype des souris issues des croisements (prise alimentaire, poids, glycémie, morphologie et capacité sécrétoire des neurones hypothalamiques) concourra à la compréhension du rôle de la CgA dans la sécrétion du 26RFa et son rôle dans l’homéostasie glucidique.
Procédures
Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale (prélèvement d'un bout de queue de 3 mm destiné au génotypage des animaux) sous anesthésie : un seul prélèvement, 5 minutes d'anesthésie. L’induction de l'anesthésie profonde se fait par voie aérienne dans une cage dite "à induction". Lors de cette anesthésie, les animaux seront identifiés à l'aide de puces stériles dédiées. La puce est placée en sous-cutané entre les omoplates de façon tangentielle à la courbe du dos et à l'aide de l'injecteur stérile à usage unique fourni avec la puce.
Impact sur les animaux
Les modèles de souris dont le gène ChgA a été invalidé de manière globale sont viables, mais présentent une hypertension et une obésité. L'invalidation ciblée du gène ChgA ne devrait pas induire de nuisance ou d’effet indésirable accentués chez les animaux. Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale sous anesthésie par voie aérienne dans une cage dite "à induction" (isoflurane). Lors de cette anesthésie, les animaux seront identifiés à l'aide d'une puce placée en sous-cutané. L’élevage et la reproduction devraient induire peu de stress et de souffrance.
Devenir
Une partie des animaux générés dans ce projet sera destinée à la reproduction et à l'entretien de la lignée CgA-loxP, et une autre partie des animaux sera destinée à la génération et à l'entretien d'une lignée dont le gène ChgA est éliminé sous le contrôle du promoteur du gène du 26RFa. Les animaux de génotype adéquat seront placés en accouplement tant que les couples donneront naissance à des portées à un rythme régulier et dans des conditions assurant le bien-être des animaux. Les couples âgés ne produisant plus de portées seront mis à mort selon les procédures précedemment décrites. Les animaux de génotype inadéquat donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d'animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation.
Remplacement
L’étude de l'impact de l'invalidation ciblée du gène ChgA sur l'homéostasie glucidique n’est possible que dans un système intégré et nécessite donc l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
La stratégie de reproduction choisie dans le cadre de ce projet vise à réduire le nombre d'animaux générés en choisissant de travailler sur les animaux homozygotes pour la construction CgA-loxP, plutôt qu'hétérozygotes. En effet, les règles de la génétique mendélienne indiquent que la probabilité d'obtenir des animaux de génotype adéquat est de 1/4 dans le cas de croisements d'animaux double hétérozygotes CgA-loxP. Le nombre d'animaux de génotype non adéquat, générés dans la descendance des croisements est ainsi divisé par deux.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à cinq par cage (deux femelles et un mâle par cage pour les accouplements) pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de boules de coton pour construire un nid + dôme en plastique rouge sous lequel se réfugier). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement, y compris week-ends et jours fériés, pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. C’est le cas lors du prélèvement de biopsies caudales nécessaires au génotypage des animaux. Dans le cadre de la reproduction de lignées de souris, la mise bas peut s’avérer être une étape critique nécessitant une surveillance particulière. Pour réduire une éventuelle souffrance liée à la mise bas, les femelles seront suivies quotidiennement, y compris week-ends et jours fériés, pour déceler tout signe de gestation puis, lorsque la gestation sera avérée et le terme estimé sera proche, le suivi sera renforcé afin de détecter les signes de mise bas. La mise-bas en elle-même sera étroitement surveillée afin de vérifier que la naissance des petits se produit dans un délai normal (le processus de mise-bas dure en moyenne 2 heures chez la souris) et l’aide nécessaire sera apportée aux femelles en cas de difficultés au cours de la mise bas (temps de mise bas allongé au-delà de 4h, mise-bas non évolutive, premiers petits mort-nés ou mère présentant des signes de détresse…).
Choix des espèces
La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études de physiologie permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. La souris est également un modèle permettant des approches génétiques complexes, ce qui n'est pas le cas d’autres modèles mammifères. Ainsi, des souris de la lignée C57Bl/6J ont été utilisées afin de générer les animaux portant la construction transgénique CgA-floxP provenant de GemPharmatech (B6/JGpt-Chgaem1Cflox/Gpt). Cette dernière lignée (utilisation de souris à partir de 8 semaines de vie, âge de maturité sexuelle) sera alors croisée avec une lignée transgénique 26RFa-iCRE (même stade de développement et également obtenue à partir de souris de la lignée C57Bl/6J), détenue au sein de l'animalerie, soumise à un « Material Transfert Agreement » convenu entre le laboratoire d’origine et l’Inserm U1239.
Etude de la cinétique de la dégénérescence rétinienne d’un modèle murin du syndrome de Bardet-Biedl : Bbs10 KO
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
56 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle du syndrome de Bardet-Biedl qui les rend progressivement aveugles et obèses, elles subissent un prélèvement de queue pour génotypage puis un électrorétinogramme sous anesthésie, avant mise à mort pour prélever les yeux. Le porteur signale que l'examen peut lui-même provoquer une cataracte. L'objectif est de dater le début de la dégénérescence rétinienne pour cibler une fenêtre thérapeutique dans d'autres projets.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de déterminer si, dans un modèle murin du syndrome de Bardet-Biedl, une maladie génétique rare qui mène à la cécité, la dégénérescence rétinienne caractéristique de ce syndrome est déjà présente dès l'âge de 14 jours et comment elle évolue jusqu’à l’âge de 3 mois. Pour cela, nous effectuerons des enregistrements de l’activité électrique de la rétine, qui traduit la fonctionnalité des cellules rétiniennes suite à une exposition à de la lumière, à différents âges et nous étudierons l'état de l'avancement de la dégénérescence de la rétine au niveau moléculaire.
Bénéfices attendus
Nous espérons mieux cerner le moment du début de la dégénérescence rétinienne afin de pouvoir cibler la fenêtre thérapeutique idéale dans d’autres projets que nous menons et qui visent à préserver la fonction visuelle chez ce modèle murin et à terme chez les patients.
Procédures
Lorsque les animaux seront âgés de 7 jours, un petit bout de queue sera prélevé pour le génotypage. Les animaux seront soumis, une seule fois et sous anesthésie générale, à l'enregistrement d'un ERG (électrorétinogramme), une méthode non invasive et non douloureuse qui dure au maximum 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les souris atteintes du syndrome de Bardet-Biedl que nous allons étudier deviennent progressivement aveugles. Elles naissent plus petites que les souris saines et deviennent plus tard obèses. De plus, l’ERG peut parfois entraîner l’apparition d’une cataracte.
Devenir
Tous les animaux utilisés pour ce projet seront mis à mort après l'enregistrement de l'ERG pour prélever les globes oculaires et étudier l'état d'avancement de la pathologie au niveau moléculaire.
Remplacement
L’animal permet des études fonctionnelles et offre un contexte physiologique qui ne sont à l’heure actuelle pas possibles avec les modèles cellulaires et in silico.
Réduction
Un total de 56 souris sera nécessaire pour ce projet, un effectif déterminé d’après la littérature pour obtenir des résultats fiables et robustes.
Raffinement
Les souris seront maintenues en portoir ventilé et en cycle d’éclairement de 12h de jour / 12h d'obscurité. Elles évolueront en groupes sociaux dans un milieu enrichi en matériaux de nidification (bâtons de coton), dôme et bâtons de bois. Elles auront accès à l’eau et la nourriture à volonté. Elles seront surveillées de manière quotidienne pas le personnel zootechnique. Un suivi hebdomadaire plus approfondi avec scoring permettra de détecter, soulager et éventuellement mettre à mort un animal présentant des signes de souffrance ou de détresse. Suite à l’enregistrement de l’ERG, des animaux dont un œil ne s’ouvrirait pas correctement ou qui présenteraient des écoulements suite à l’ERG seraient mis à mort. De l’ocrygel pourra être appliqué pour prévenir/résorber une éventuelle cataracte.
Choix des espèces
De nombreux modèles murins du syndrome de Bardet-Biedl ont été générés et caractérisés dans le cadre d’études précédentes, dont le modèle que nous allons utiliser dans ce projet, qui récapitule le phénotype des patients et qui permet donc d’obtenir des informations essentielles sur l’évolution de la pathologie, et en particulier sur les stades précoces auxquels il est difficile d’avoir accès chez les patients. Les outils qui permettent d’évaluer la fonction visuelle (ERG) et de caractériser la rétine au niveau moléculaire sont disponibles et bien standardisés chez la souris. Nous comparerons des souris saines et malades âgées de 14 jours (âge de l’ouverture des yeux à partir duquel la rétine est fonctionnelle), 1 mois, 2 mois et 3 mois.
Dymorphisme sexuel associé à la maladie des petits vaisseaux et à l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection preservée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
2 650 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. En surpoids ou diabétiques, elles subissent des injections intrapéritonéales répétées, une à deux chirurgies pour les castrer ou leur implanter une pompe, un test d'effort et une échocardiographie sous anesthésie. Le projet étudie le rôle des hormones sexuelles dans une insuffisance cardiaque touchant surtout les femmes ménopausées, avec des cibles thérapeutiques annoncées à long terme. Le porteur affirme que cette pathologie complexe ne peut s'étudier in vitro et requiert "un organisme vivant proche de l'homme".
Objectifs
L’insuffisance cardiaque dite « à fraction d’éjection préservée » représente la moitié des insuffisances cardiaques et sa prévalence est en constante augmentation compte tenu du vieillissement de la population et de l’explosion des facteurs de risques cardiovasculaires. Il s’agit d’une pathologie associée à une mortalité élevée et pour laquelle il n’existe pas de traitement efficace. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie ce qui est primordial pour identifier des cibles thérapeutiques. Plus précisément nous nous attacherons à mieux comprendre, d’une part le rôle de la maladie des petits vaisseaux qui est souvent associée à cette maladie et d’autre part le dimorphisme sexuel associé à cette maladie. En effet cette maladie touche surtout les femmes ménopausées suggérant un rôle des hormones sexuelles.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment les hormones sexuelles interagissent avec les facteurs de risque cardiovasculaire pour protéger ou altérer le phénotype des petits vaisseaux et la fonction cardiaque. A plus long terme, il devrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques personnalisées pour les patients atteints d’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. En effet, l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée est une maladie hétérogène possiblement induite par des mécanismes multiples.
Procédures
Les souris subiront 1 à 2 séries de 4 à 5 injections intrapéritonéales (chaque injection incluant la contention ne dure que quelques secondes), une à deux chirurgies de 10 minutes visant à les castrer ou à implanter une micro-pompe en sous cutané et un prélèvement sanguin inférieur à 50 µL dans la veine caudale. Finalement ces souris seront soumises à un test d'effort (12 minutes par jours pendant 3 jours habituation) puis 5 à 30 minutes pour le test à proprepemnt dit) et une anesthésie de 15 minutes pour subir une échocardiographie.
Impact sur les animaux
Ce projet utilisera des souris en surpoids ou diabétiques dont les nuisances sont comme chez l'homme, un surpoids, une polyurie et une polydipsie. D'autre part les animaux ressentiront des douleurs post-chirurgicales et un stress occasionné par des administrations intrapéritonéales répétées.
Devenir
Toutes les souris seront sacrifiées pour pouvoir faire des prélévements d'organes. Les géniteurs seront sacrifiés lorsque le nombre d'animaux nécessaires aux expérimentations aura été produit.
Remplacement
L‘insuffisance cardiaque est une pathologie complexe mettant en jeu des interactions de divers mécanismes, dont beaucoup restent inconnus, entre de nombreux types cellulaires locaux (cardiomyocytes, cellules endothéliales, péricytes notamment) et circulants (cellules hématopoïétiques diverses). Etudier l’ensemble de ces acteurs et plus encore leurs interactions ne peut pas à l'heure actuelle être réalisé uniquement par des tests in vitro. Le recours à un organisme vivant proche de l’homme est donc necessaire.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'un logiciel informatique: Pour avoir 90% de chance de mettre en évidence des différences significatives entre 2 groupes (concernant, la pression télédiastolique du ventricule gauche notamment), le nombre de souris par groupe et par analyse doit être 10. Il faut noter cependant que nous ne pourrons pas faire toutes les analyses sur une seule souris, il nous faudra donc 2 souris. Le nombre de souris par groupe sera donc 20. Ce chiffre est conforté par notre propre expérience et à celle de la communauté scientifique s'intéressant aux pathologies cardiovasculaires, 10 animaux par lot sont nécessaires pour obtenir des résultats exploitables statistiquement aussi bien pour les mesures de la fonction cardiaque et les analyses histologiques. Pour réduire le nombre d'animaux, aucune expérience déjà publiée ne sera reproduite. Les manipulations seront réalisées par du personnel technique entrainé de façon à réduire la variabilité des résultats donc le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux des groupes "contrôles", traités de façon identiques, mais inclus dans différentes procédures seront dès que possible utilisé dans plusieurs "expériences ou procédure". Le nombre de souris nécessaires à la réalisation de ce projet sera ainsi réduit.
Raffinement
L’hébergement des animaux sera réalisé dans des conditions qui limiteront le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement enrichi avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). La souffrance des animaux sera réduite par l'usage d'anesthésiques et d'antalgiques adaptés pour la réalisation des gestes douloureux et la mise en place de points limites. D'autre part, les animaux seront surveillés quotidiennement par le zootechnicien, le responsable du bien-être animal ou l'expérimentateur. Dès le début des expérimentations, une fiche de suivi « bien-être » sera créée. Le bien-être des animaux sera alors gradé ce qui permettra d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire a de forte ressemblance avec celui de l'homme. Par ailleurs, il existe dans cette espèce des individus présentant des mutations spontanées prédisposant au diabète de type 2 (facteur de risque cardiovasculaire). Des souris adultes âgées d'au moins 6 semaines seront utilisées, En effet, notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques.
Effet de la consommation de farines produites à partir de graines de protéagineux et d’oléoprotéagineux enrichies en acides gras polyinsaturés sur le métabolisme lipidique et protéique musculaire du rat jeune
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
90 rats vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Hébergés seuls pour contrôler leur alimentation, ce qui leur impose un stress chronique, ils sont nourris de farines d'oléoprotéagineux enrichies en oméga 3, pesés trois fois par semaine et placés quatre jours en cage métabolique, avant mise à mort pour prélever muscles et sang. L'objectif est nutritionnel et commercial, évaluer la digestibilité de protéines végétales pour développer des "ingrédients" destinés à l'alimentation humaine. Le porteur affirme que ces mesures ne peuvent être obtenues ni in vitro ni directement chez l'homme.
Objectifs
La croissance démographique mondiale pose la question de la disponibilité des ressources alimentaires et notamment des protéines. Une des solutions est d’augmenter les protéines végétales et de réduire les protéines animales dans la ration alimentaire. Toutefois, l'essor des protéines végétales nécessite une meilleure connaissance de leur valeur nutritionnelle, de leur cinétique de digestion et de leur biodisponibilité (capacité des protéines à fournir réellement tous les acides aminés nécessaires pour les synthèses protéiques corporelles). En effet, il est important d’étudier les qualités nutritionnelles des protéines végétales avant de pouvoir recommander leur consommation comme source protéique de substitution aux protéines animales. Et cela s’applique particulièrement aux protéines issues des oléo-protéagineux car elles sont encore peu étudiées pour l’alimentation humaine, malgré leur grand intérêt nutritionnel. En effet, ces sources alimentaires végétales, qui sont à la fois riches en acides gras indispensables (oméga 3) et en protéines (15 à 35 % de protéines dans le Colza et tournesol), pourraient être une option intéressante pour la définition de nouveaux aliments végétaux. Les farines, concentrats et isolats d’oléoprotéagineux disponibles commercialement proviennent des coproduits obtenus après extraction de l’huile (touteaux). Pour tester l’effet combiné de leurs protéines et de leurs acides gras oméga 3, il faudra rajouter des acides gras polyinsaturés aux matières protéiques végétales issues de tourteaux. Dans ce contexte, le projet vise à étudier la digestibilité de régimes riches en protéines végétales d’oléo-protéagineux enrichies avec des acides gras oméga 3, en comparaison avec un régime riche en protéines et étudier leur impact sur la digestibilité et la fonction et le métabolisme lipidiques et protéiques musculaires dans un modèle de rats jeunes.
Bénéfices attendus
L’une des solutions pour répondre au besoin accru en ressources alimentaires et notamment en protéines, est d’augmenter les protéines végétales et de réduire les protéines animales dans la ration alimentaire. Pourtant, il manque encore des preuves scientifiques qui permettent de considérer les protéines végétales comme source protéique de substitution aux protéines animales. Les études décrites dans la littérature portent majoritairement sur les protéines issues de graines de légumineuses (pois, lentilles), ou issues du soja mais peu s'intéressent à la valeur nutritionnelle des protéines provenant d’oléoprotéagineux tels que le colza ou le tournesol. De plus, aucune d'entre elles n’envisage un éventuel effet synergique des lipides et des protéines issues des oléoprotéagineux tant sur leur digestibilité que sur leurs effets santé. Les plantes oléoprotéagineuses offrent un double intérêt nutritionnel car elles apportent des protéines mais également des lipides, notamment des acides gras polyinsaturés qualifiés d'acides gras indispensables car le métabolisme de l'Homme et des animaux est inapte à les synthétiser. Seule l'alimentation est capable de fournir à l'organisme, ces acides gras indispensables à un certain nombre de fonctions physiologiques. Du fait de leur forte teneur en lipides, les plantes oléoprotéagineuses sont principalement cultivées pour la production d’huiles végétales. Les procédés d'obtention de l'huile conduisent à un coproduit appelé tourteau. A partir de ces tourteaux, des produits de transformations appelés farines, concentrats et isolats, sont disponibles lorsque certains procédés de transformation sont appliqués. Ces derniers contiennent des teneurs en matières grasses résiduelles et sont concentrés en d'autres nutriments, notamment en protéines. Le présent projet fournira des données scientifiques nouvelles qui permettront d'apprécier l'intérêt de sources végétales comme les oléoprotéagineux qui combinent les protéines et les lipides tant sur la valeur nutritionnelle des protéines que sur leur éventuels bénéfices santé, résultant d'une synergie entre le métabolisme des lipides et des protéines. Ce projet pourrait donc à terme permettre de développer à partir de ces matrices protéiques végétales issues d’oléo-protéagineux, des "ingrédients" riches en protéines végétales et enrichis ou non avec des acides gras polyinsaturés oméga 3, qui pourraient présenter un intérêt pour la santé et la nutrition humaine.
Procédures
L'ensemble des interventions décrites ci-après concernent l'ensemble des 90 rats. Les rats seront hébergés en cage individuelle pour contrôler précisément leur consommation alimentaire pendant toute la durée du protocole depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à leur mise à mort soit 4 semaines plus 10 jours d'acclimation. Les 90 rats subiront peu d’interventions durant le protocole. La première consiste à les peser, 3 fois par semaine pendant toute la durée du protocole. Les pesées des pesées est de quelques secondes. La deuxième consiste à récupérer la totalité des fèces et de l’urine produits par les animaux afin de mesurer la digestibilité des protéines (=azote ingéré – azote excrété/azote ingéré). Les rats seront alors hébergés dans une cage métabolique conçue pour permettre cette récupération. La durée du passage sera réduite à son maximum (4 jours au total) sans compromettre les résultats du projet.
Impact sur les animaux
A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront âgés de 4 semaines. A la fin du protocole expérimental, ils seront mis à mort à l’âge de 2 mois. Aucun effet indésirable particulier n’est attendu en lien avec les différents régimes et la mesure du poids réalisée de façon non invasive. Afin de mesurer précisément leur consommation alimentaire pendant toute la durée du protocole expérimental, les rats seront hébergés en cage individuelle. Cet hébergement individuel affectera le bien-être de ces animaux sociaux en induisant un stress chronique que nous chercherons à réduire en favorisant les contacts acoustiques, olfactifs et optiques avec leurs congénères et en fournissant un enrichissement adapté dans la cage. De plus, l’ensemble des rats sera soumis à un stress supplémentaire avec leur hébergement dans une cage métabolique au cours des 4 derniers jours du protocole.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses sur les différents tissus prélevés qui permettront de répondre aux objectifs du projet. En effet, le prélèvement des muscles squelettiques est nécessaire pour mesurer le niveau de synthèse protéique au sein de ce tissu. De même, l'ensemble du sang des animaux doit être prélevé pour pouvoir mesurer le statut inflammatoire des rats et réaliser leur bilan sanguin.
Remplacement
L'utilisation d'animaux dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacée par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 ou 3 dimensions car ils ne présentent pas à ce jour les mêmes caractéristiques que celles observées chez le rat et l’homme. En effet, les cellules intestinales disponibles ne présentent pas les caractéristiques indispensables dans les phénomènes d’absorption des lipides par la muqueuse intestinale. De plus, ces systèmes ne permettent pas de mesurer simultanément la digestibilité des différentes sources de protéines (protéagineux ou oléoprotéagineux) enrichies avec des acides gras polyinsaturés oméga 3, le métabolisme protéique, lipidique et musculaire et le statut inflammatoire circulant. En l’état, ce projet ne peut pas non plus être mené directement chez l’Homme. En effet, actuellement, les tourteaux et farines issues de tourteaux de colza ou de tournesol disponibles commercialement ne sont destinés qu’à l’alimentation animale et ne peuvent pas être utilisés pour la consommation humaine. Il est à noter qu’avant de réaliser les régimes fournis ensuite aux rats les farines, concentrats ou isolats protéiques seront analysés d’un point de vue nutritionnel et microbiologique garantissant leur innocuité.
Réduction
Les résultats d’études antérieures menées sur des rats nourris avec des farines produites à partir d'autres végétaux (céréales) ont permis de réduire le nombre d’animaux utilisés à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre total de rats nécessaires à la réalisation de ce projet est 90. Pour comparer les résultats des différents paramètres mesurés, nous utiliserons des tests statistiques.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les rats seront hébergés individuellement dans des cages adaptée à l'espèce. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 2 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.
Choix des espèces
Le modèle rat est le modèle le plus utilisé dans les études de digestion et d’absorption et de métabolisme des lipides et des protéines, en vue d’une extrapolation chez l’homme. Ce modèle a l'avantage de posséder les mêmes systèmes digestif et enzymatiques que ceux observés chez l'Homme. D'autre part depuis près de 30 ans nous avons cumulés des données obtenues à partir de ce modèle, ce qui nous permet de poursuivre nos investigations sur la base de précédentes études mais aussi de mettre en regard nos données à celles d'autres travaux de recherche à l'international.
Evaluation de l’efficacité d’un traitement anticancéreux sur un modèle de tumeur mammaire humaine développée chez la souris immunodéprimée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
720 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dont 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Immunodéprimées, elles reçoivent par chirurgie une greffe de tumeur mammaire humaine, puis jusqu'à dix-huit injections d'une molécule inhibitrice sur six semaines, avec suivi de la tumeur et prélèvements sanguins. L'objectif est de confirmer l'efficacité de ces molécules contre le cancer du sein triple négatif, avec un bénéfice pour les patientes annoncé à long terme. Le porteur affirme qu'après des tests sur cellules, la validation sur "organisme entier" est nécessaire.
Objectifs
Ce projet concerne l'inhibition d'une enzyme qui intervient dans le mécanisme de détoxification des cellules. Cette voie de détoxification est particulièrement utilisée par les cellules des tumeurs. L’augmentation de l’expression de cet enzyme a été reportée dans de nombreux cancers et est associée à la résistance aux traitements habituelles lors de rechutes. Le pourcentage du cancer du sein représente 33.5% de l’ensemble des nouveaux cas de cancer chez la femme. La grande diversité retrouvée dans le cancer du sein rend les traitements plus difficiles que sur d’autres formes de cancer du sein. Il constitue un problème clinique en raison de son pronostic relativement mauvais, de son comportement agressif, de sa capacité à métastaser et de l'absence de thérapies ciblées. Un nouveau traitement anticancéreux contre les cancers a été développé. Une première molécule a montré son efficacité sur la leucémie , le mélanome, le cancer du poumon ainsi que le cancer du sein. L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité des molécules sur des souris greffées avec des cellules tumorales humaines au niveau des glandes mammaires afin de reproduire un modèle de cancer du sein in vivo.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet à court terme sont de confirmer l’efficacité de nos molécules inhibitrices sur la progression d’une tumeur de cancer du sein implantée chez la souris. Les bénéfices attendus, à long terme, sur la santé humaine sont d’améliorer la prise en charge des patientes et d’améliorer le pronostic lors de rechutes. Ce traitement, permettra d’envisager une thérapie ciblée plus efficace que les thérapies conventionnelles actuellement utilisées contre le cancer du sein triple négatif.
Procédures
injection de cellules tumorales dans la glande mammaire de la souris par chirurgie courte sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes) Traitement des souris des molécules inhibitrices (3 fois par semaine pendant 6 semaines maximum / 18 injections maximum / 5 secondes par injection) Contention des souris lors de la mesure des tumeurs (2 fois par semaine). Un prélèvement de sang en cours d'étude dans la veine mandibulaire de la souris (1 fois). Un prélèvement final de sang réalisé sous anesthésie (1 fois).
Impact sur les animaux
Douleur liée à la chirurgie. Développement de la tumeurs. Gène liée à la tumeur .Douleur légère liée à l'injection. Douleur liée à la prise de sang (piqure d'aiguille). Stress lors de la contention. Douleur liée à l'apparition de métastase.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements dans le but de la analyser.
Remplacement
Avant de réaliser des études sur la souris, l’efficacité des molécules a été démontrée sur les cultures cellulaire de tumeur séléctionnées pour ce projet. Il est dorénavant nécessaire de confirmer ces résultats sur une tumeur développée dans un mammifère. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement de son environnement. Par ailleurs, plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du traitement dans la tumeur nécessitent de travailler sur un organisme entier. Pour toutes ces raisons, nous devons effectuer les études d’efficacité chez la souris.
Réduction
La prise tumorale ayant un taux de réussite de 80%, nous avons réduit le nombre d'animaux à implanter en prenant en compte ce paramètre. L’étude pilote sera réalisée avec le minimum nous permettant d’apprécier la croissance tumorale. Pour les procédure où le traitement sera administré aux souris, la comparaison entre les différents groupes sera réalisée par un test statistique. le nombre d'animaux par groupe a été déterminé car il nous permet un compromis entre une puissance statistique suffisante et l’éthique animale. Une réduction du nombre d’animaux sera possible en fonction des résultats obtenus lors des premières études : - Suppression des doses non tolérées dans les études suivantes pour chacune des souches de souris. - Suppression des témoins négatif s’ils ne démontrent pas d’activité dans les premières études.
Raffinement
Après leur réception, les souris disposeront d’une période d’acclimatation de 7 jours. Lors de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés maximum 70 jours (10 semaines) après leur réception si aucun point limite n’a été atteint. Ce délai correspond à la durée maximale possible des études (1 semaine d’acclimatation + 3 semaines de prise de greffe + 6 semaines de traitement). Lors de la chirurgie, des antidouleurs sont donnés avant l'opération. l'animal a une anesthésie générale et locales. Un antidouleur est apporté dans l'eau de boisson pendant les 3 jours qui suivent l'opération. Les animaux étant identifiés, toute anomalie observée permettra de faire un suivi individuel. Ils seront pesés le jour de la première intervention (J7) puis au moins une fois par semaine (3 fois lors des traitements). En cas de perte de poids >10%, de la nourriture humide sera ajouté dans la cage. En cas de tumeur invalidante, de l'eau gélifiée et des croquettes seront ajoutées dans la cage pour faciliter l'accès à l'eau et à la nourriture. Les animaux seront répartis à raison de 5 ou 6 par cage (dépendant de la prise de la tumeur) afin de maintenir la sociabilité de l’animal. Une observation, 3 fois par semaine lors des traitements, permettra de détecter une souffrance ou l’atteinte d’un point limite.
Choix des espèces
La souris est l'un des seuls modèles d'animaux adaptés pour la réalisation de greffe de tumeur d'origine humaine. C'est un modèle reconnu dans la recherche contre le cancer. Les animaux seront utilisés à partir de 6 à 10 semaines jusqu’à 15-20 semaines. Ce choix est basé sur la bibliographie afin de favoriser la prise tumorale.
SIGNAL: INFECTION AU SARS-COV-2 DES NEURONES A GNRH, NEUROINFLAMMATION,VEILLISSEMENT ET CONSEQUENCES A LONG-TERME
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
348 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur humain, elles sont infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale, avec implantation de mini-pompes et prélèvements sanguins répétés, certaines lignées n'ayant qu'une espérance de vie de sept à douze jours après infection. Le projet étudie l'infection des neurones à GnRH et ses effets à long terme sur la reproduction et la cognition, y compris chez des femelles gestantes et leur descendance. Le porteur affirme que cette étude requiert "l'organisme entier" et juge ces souris "indispensables".
Objectifs
Depuis le début de la pandémie de COVID-19, les efforts collaboratifs des 5 équipes de recherche ont montré que le SARS-CoV-2 infecte et tue les neurones produisant l'hormone de libération des gonadotrophines (GnRH) dans le cerveau des patients adultes atteints de COVID-19. Ce phénomène entraîne une réduction spectaculaire de l'expression de la GnRH dans l'hypothalamus chez une proportion significative de patients. Ces neurones, connus pour être les maîtres régulateurs de la fonction de reproduction, pourraient également jouer des rôles clés dans le développement des fonctions cognitives et sensorielles, du métabolisme et du vieillissement cérébral et systémique. En outre, les neurones à GnRH foetaux, qui proviennent du nez, expriment plusieurs protéines qui leur confèrent une sensibilité à l'infection par le SARS-CoV-2. Ceci suggère qu'ils pourraient être vulnérables en cas de transmission materno-foetale/néonatale, et fait planer le risque d'une double pandémie d'infertilité et de déclin cognitif prématuré. Nous émettons l'hypothèse que l'infection des neurones à GnRH et d'autres populations de cellules cérébrales par le SARS-CoV-2 module l'expression des gènes de l'hôte, perturbe le neurodéveloppement et aggrave les changements liés à l'âge par des altérations inflammatoires et épigénétiques persistantes dans les cellules survivantes. Le projet utilise des tissus humains de patients COVID-19 et de sujets non-infectés, ainsi que des modèles cellulaires, et nécessite également l’utilisation de modèles animaux transgéniques afin de déterminer si et comment l'infection et la perte des neurones à GnRH conduit à des altérations pathologiques à long terme. Nous poursuivrons trois objectifs: 1) Déterminer si et comment l'infection par le SARS-CoV-2 module de manière différentielle le paysage de l'expression génétique des neurones à GnRH et d'autres cellules cérébrales infectées pour accélérer l'inflammation hypothalamique, le dysfonctionnement cognitif ou métabolique et la sénescence cérébrale 2) Explorer si l'infection des neurones à GnRH ou la perte d'expression de la GnRH dans le cerveau adulte ou foetal/néonatal a des effets à long terme sur l'axe reproducteur dans des modèles animaux 3) Vérifier si le remplacement de la GnRH de façon physiologique ou l'inversion des voies pathologiques compensera l'expression génique à long terme et les altérations fonctionnelles induites par l'infection du cerveau par le SARS-CoV-2.
Bénéfices attendus
Le projet apportera une meilleure compréhension des répercussions à long terme, jusqu'ici sous-estimées, de la neuroinvasion par le SARS-CoV-2 en termes d'intégrité et de fonction des cellules cérébrales. Il pourrait permettre d’identifier les mécanismes cérébraux qui sous-tendent les symptômes neurologiques de la COVID longue, et proposer des stratégies thérapeutiques viables et fondées sur les preuves pour inverser ou compenser ces mécanismes pathologiques. Les résultats du projet devraient contribuer à réduire le fardeau social, financier et sanitaire imposé par la COVID-19.
Procédures
LES INTERVENTIONS SERONT EFFECTUEES SUR ANIMAL ANESTHESIE ET CHAQUE INTERVENTION EST REALISEE 1 FOIS DANS LA VIE DE L'ANIMAL: - IMPLANTATION DE MINIPOMPE SOUS-CUTANEES AU NIVEAU DE LA PARTIE SUPERIEURE DU DOS, - INFECTION DES SOURIS PAR VOIE NASALE (SOURIS ADULTES GESTANTES OU NON). SEULS LES PRELEVEMENTS SANGUINS SERONT EFFECTUES SUR ANIMAL VIGILE. LES PRELEVEMENTS UNIQUES SERONT EFFECTUES AU NIVEAU DE LA VEINE MANDIBULAIRE 1 FOIS PAR MOIS PENDANT 6 MOIS (SUR L'ANIMAL ADULTE) OU A P12, P23 ET P30 (SUR SOURIS POST-NATALES); LES PRELEVEMENTS FREQUENTS SERONT EFFECTUES DANS LA VEINE LATERALE DE LA QUEUE 1 SEULE FOIS DANS LA VIE DE L'ANIMAL (3µL DE SANG TOUTES LES 6 MINUTES PENDANT 2H).
Impact sur les animaux
TOUTE MANIPULATION DES ANIMAUX PEUT PROVOQUER DU STRESS, DE LA FATIGUE ET DE L'INCONFORT ET DES MESURES DE RAFFINEMENT SERONT MISES EN PLACE POUR LES LIMITER AU MAXIMUM. EN PARTICULIER LES EXPERIENCES DE CHIRURGIE OU DE PRELEVEMENTS DE SANG PEUVENT PROVOQUER DES DOULEURS A COURT-TERME QUI SERONT LIMITEES PAR L'UTILISATION D'UN ANALGESIQUE (GEL DE CHLORHYDRATE DE PRAMOCAÏNE OU TRONOTHANE 1%). SEULS LES ANIMAUX INFECTES PAR LE VIRUS SARS-COV-2 DANS LA PROCEDURE 2 SUBIRONT UNE PERTE DE POIDS CONSEQUENTES ET SERONT SUIVIS DE TRES PRES; ILS SERONT SACRIFIES A 4 JOURS POST-INFECTION POUR LIMITER LA DUREE DE CET ETAT.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés pour chaque procédure sera EUTHANASIE à terme même ceux qui servent de contrôles afin de récupérer le sang et les organes.
Remplacement
Les expériences prévues ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3 R. L’étude des effets physiopathologiques de l’infection par SARS-CoV-2 et de l’efficacité des médicaments nécessitent l’utilisation d’organisme entier, et ne laissent pas la possibilité de remplacer les animaux utilisés par des systèmes cellulaires. En effet, suite à l’infection respiratoire, le système immunitaire s’active et conduit à une inflammation. Celle-ci se traduit par le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires et par la production de facteurs solubles (cytokines, chimiokines etc). Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de cellules et de facteurs solubles qui ne peut pas être reproduite in vitro. Par ailleurs, les effets potentiellement bénéfiques du donneur de NO au cours de l’infection ne peuvent être réellement évalués qu’in vivo. Le modèle souris est pertinent pour ce type d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe sera utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. LE NOMBRE D’ANIMAUX EST BASE SUR UN CALCUL STATISTIQUE QUI PREND EN COMPTE LE PARAMETRE ETUDIE ET DES EXPERIENCES PILOTES. POUR CELA, LA TAILLE MINIMALE DES GROUPES EXPERIMENTAUX A UTILISER A ETE DEFINI ; PUIS LA POSSIBILITE DE COLLECTER PLUSIEURS ECHANTILLONS/TISSUS CHEZ LES MEMES ANIMAUX CHAQUE FOIS QUE POSSIBLE A ETE PRISE EN COMPTE. CETTE UTILISATION MAXIMISE LES DONNEES OBTENUES A PARTIR DE CHAQUE ANIMAL, AFIN DE LIMITER OU D'EVITER L'UTILISATION SUBSEQUENTE D'ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES, ET CE, SANS POUR AUTANT COMPROMETTRE LE BIEN-ETRE ANIMAL.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Les personnes impliquées bénéficient d’une autorisation pour travailler sur des agents pathogènes de groupe 3. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur. EN PARTICULIER, LES ANIMAUX SONT MANIPULES INDIVIDUELLEMENT, ET DANS LE CALME, AFIN DE LIMITER TOUT STRESS DES ANIMAUX NON MANIPULES. LES MANIPULATIONS S'EFFECTUENT A DISTANCE DES AUTRES ANIMAUX. UNE SURVEILLANCE QUOTIDIENNE EST EFFECTUEE AFIN DE S’ASSURER DE L’ETAT DES ANIMAUX.
Choix des espèces
La souris exprimant l’ACE2 humain génétiquement modifiée représente un modèle pertinent pour l’étude des réponses immunes et inflammatoires liées à l’infection par le SARS-CoV-2. AFIN D’ETUDIER LES CONSEQUENCES PATHOPHYSIOLOGIQUES DE LA PERTE DE CES NEURONES LORS DE LA COVID-19, NOUS UTILISERONS UN MODELE DE SOURIS TRANSGENIQUES DANS LESQUELLES L’ACE2 HUMAIN S’EXPRIMERA UNIQUEMENT DANS LES NEURONES A GNRH. L’ETUDE DU ROLE SPECIFIQUE DU CO-RECEPTEUR A LA NEUROPILIN-1 (NRP1) SPECIFIQUEMENT DANS LES NEURONES A GNRH REQUIERT L’UTILISATION DE SOURIS TRANSGENIQUES INFECTEES DE MANIERE GLOBALE PAR LE SARS-COV-2 ET QUI N’ONT PAS LE RECEPTEUR NRP1 DANS LES NEURONES A GNRH. CES SOURIS ONT UNE ESPERANCE DE VIE COURTE (7 A 12 JOURS POST-INFECTION) MAIS SONT INDISPENSABLES POUR DETERMINER LE ROLE DU CO-RECEPTEUR NRP1 DANS LA PERTE DE L’EXPRESSION DE LA GNRH. NOTRE TROISIEME OBJECTIF ETANT D’ETABLIR L’IMPACT DE L’INFECTION IN UTERO OU NEONATALE SUR LA MINIPUBERTE ET A LONG TERME SUR L’AXE REPRODUCTEUR, IL NECESSITE L’UTILISATION DE SOURIS FEMELLES GESTANTES INFECTEES PAR LE SARS-COV-2 ET D’ETUDIER LES EFFETS SUR LA DESCENDANCE A PLUS OU MOINS LONG-TERME.
Développement pharmaceutique d’une nouvelle thérapeutique de la maladie de Menkès (EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
85 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 39 en gravité sévère. Les souriceaux mâles porteurs de la maladie de Menkès, dont l'espérance de vie ne dépasse pas trois à cinq semaines, reçoivent des injections sous-cutanées cinq jours sur sept et subissent sept tests neurocomportementaux jusqu'à J38. L'objectif est de développer un transporteur synthétique de cuivre contre cette maladie génétique mortelle de l'enfant. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro n'est possible puisque l'étude porte sur la survie et le comportement de l'animal malade.
Objectifs
La maladie de Menkès est une maladie rare causée par un déficit d’un transporteur cellulaire du cuivre (ATP7A) au niveau des barrières intestinales, placentaires et hémato-méningées. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir de ces enfants reste extrêmement pauvre causant alors des déficits multi systémiques et un décès dans les premières années de vie. Dans le contexte de cette maladie, l’obstacle du passage au niveau des barrières intestinales et hémato-méningées est responsable de la pathologie. Le développement et l’étude des nanoparticules ont montré qu’elles avaient une capacité de diffusion inter et intracellulaire augmentée grâce à leur faible taille (
Bénéfices attendus
Chez les animaux malades traités avec le Transporteur synthétique de cuivre : 1) Restauration des fonctions altérées 2) Restaurations des fonctions cognitives principales 3) Amélioration de la survie L'objectif de ce projet est de développer un médicament capable de soigner des enfants porteurs de la mutation et qui ont une espérance de vie très réduite.
Procédures
1/ Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’à la mise bas - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J38 pour les mâles descendants et porteurs de la maladie. 2/ Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J38 pour les souris mâles malades.
Impact sur les animaux
Chez les animaux malades non traités avec le TSC : défauts de croissance et difficultés d'alimentation, risque de mort des animaux non traités par rupture/anévrismes aortiques. Chez les animaux malades traités avec le TSC, une toxicité liée au produit peut apparaitre mais cela n'a encore jamais été observé dans les études que nous menons depuis juillet 2020. Des études de recherche de toxicité in vitro sur cellules hépatocytaires ainsi que des études anatomopathologiques sur reins ont été effectués et n’ont montré aucune toxicité.
Devenir
L’ensemble des animaux du protocole (85 animaux) seront gardés en vie après chaque procédure et ce jusqu’à la fin du protocole (fixé à J56 d’âge) afin de suivre l’évolution des animaux malades en réponse au traitement médicamenteux. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traités avec un placebo est compris entre 3 et 5 semaines d’âge. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et tous les organes d'intérêt seront rapidement prélevés et conditionnés afin de réaliser des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie et l’amélioration du comportement de l’animal porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.
Réduction
L’étude complète prévoit la génération de 13 animaux mâles par groupe pour tenir compte du taux de mortalité élevé liée à la pathologie touchant seulement les mâles, mais s’arrêtera dès que les tests comportementaux seront réalisés sur 10 souris par groupe : donc un minimum de 70 (maximum 85) souris de laboratoire, réparties en 7 groupes de 10 mâles dont 2 groupes de 10 souris saines (sauvages) et 5 groupes de 10 souris mutantes (hémizygotes) seront utilisés jusqu’à l’âge de 2 mois. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales (2 procédures seront appliquées : la gestion de la lignée mutante qui présente un phénotype dommageable pour l’animal, l’injection du TSC en sous-cutanée répétée 5 fois par semaine avec 8 tests pour l’étude comportementale) auront lieu dans l’animalerie, dans un environnement sécurisant pour l’animal. Une démarche d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments cliniques sont évalués chez l’animal afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Choix des espèces
La souris ATP7AMoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant l'étude de cette maladie génétique, et il mime parfaitement la pathologie car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. D’autre part, ce choix se justifie par la possibilité de faire le lien avec d’autres modèles transgéniques murins d’autres maladies métaboliques liées à des troubles du métabolisme des oligo-éléments. Nous focaliserons l’étude sur les souriceaux durant la lactation des souris mères et jusqu’au-delà du sevrage, à J56, correspondant à la fin du dernier test comportemental. En effet, durant cette période nous pourrons évaluer l’efficacité du traitement sur l’évolution de l’activité neurocomportementale des animaux en réponse au traitement médicamenteux.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire : modèle d’étude pour l’immunobiologie, les pathologies humaines et l’évaluation de traitements.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
3 260 souris vont être utilisé·es, dont 2 960 réutilisées dans d'autres procédures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent des cellules souches humaines après irradiation, puis des injections, gavages et prélèvements sanguins répétés jusqu'à huit fois, avec un suivi par imagerie. Il s'agit d'une plateforme produisant à la demande des souris "humanisées" pour le système immunitaire, fournies à des laboratoires pour tester vaccins et traitements. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non-humain et affirme qu'il est le "seul modèle d'hématopoïèse humaine expérimentale".
Objectifs
L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité et/ou leur impact sur le système immunitaire humain.
Bénéfices attendus
Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).
Procédures
irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) ) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) -administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie IVIS (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois)
Impact sur les animaux
Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.
Devenir
Les animaux portant un système immunitaire humain générés dans une procédure pourront être inclus d'autres procédures du même projet (par exemple pour booster certaines cellules humaines, augmenter le nombre de cellules myeloides humaines, valider l’activité d’immuno-modulateurs) ou d'autres projets à la demande des utilisateurs de la plateforme). Les autres souris utilisées pour valider l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort pour analyse des différents organes post-mortem.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.
Réduction
Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).
Raffinement
La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris humanisée présentant un système immunitaire humain (HIS) est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches isolées dans des souriceaux nouveau-nés de moins de 9 jours car les nouveaux nés sont plus permissifs à la greffe dans les premiers jours de vie. Le contrôle qualité par vérification du niveau d’humanisation dans le sang sera réalisé à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines. Ce nombre de semaines correspond au temps minimum nécessaire au développement du système immunitaire humain dans une souris à partir de cellules souches hématopoïétiques. Les souris HIS seront ensuite utilisées entre 12 et 25 semaines de vie. Cet intervalle d’âge correspond à la période pendant laquelle le système immunitaire humain est le plus stable chez la souris.
Etude de molécules dans la prévention des lésions intestinales induites par un médicament immunosuppresseur
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
204 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dont 168 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur microbiote est remplacé par un microbiote humain, elles reçoivent par canule un immunosuppresseur provoquant diarrhées et lésions intestinales, avec des prélèvements de fèces répétés, au besoin par introduction d'une canule dans l'anus. L'objectif est de tester des molécules déjà autorisées comme médicaments pour prévenir cette entéropathie, avec un bénéfice annoncé à moyen terme. Le porteur affirme que seul l'animal permet de reproduire cette atteinte, impossible selon lui à modéliser in vitro.
Objectifs
Lorsqu’un organe vital est défectueux, il est possible de le remplacer par la transplantation d’organe. Cette intervention chirurgicale s’accompagne nécessairement d’une prise d’immunosuppresseur à vie pour le patient, afin de diminuer les risques de rejet de l’organe greffé par le système immunitaire. L’immunosuppresseur le plus utilisé chez les patients transplantés provoque des troubles intestinaux, définis comme entéropathie, tels que des nausées, des diarrhées voire même, dans les cas les plus graves, des ulcères hémorragiques pouvant mettre en jeu leur pronostic vital. Cet immunosuppresseur est aussi utilisé chez des patients présentant des maladies dites auto-immunes ; chez ces individus, les effets indésirables intestinaux sont aussi présents. De récentes recherches mettent en évidence le rôle du microbiote intestinal dans le développement des lésions intestinales associés à la prise d’immunosuppresseur. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes qui colonise notre tube digestif et est indispensable au bon fonctionnement de l’organisme. Les traitements immunosuppresseurs altèrent la composition du microbiote intestinal et favorisent la prolifération de certaines bactéries qui produisent des enzymes spécifiques connues pour transformer l’immunosuppresseur. Différentes études apportent des arguments solides qui incriminent l’immunosuppresseur transformé dans le développement des troubles intestinaux. Dans ce contexte, l’enzyme du microbiote intestinal impliquée dans la transformation de l’immunosuppresseur devient une cible de choix pour prévenir les lésions intestinales associées. Grâce à une étude exhaustive de la littérature et à des tests réalisés in vitro, nous avons identifié, dans une collection de produits chimiques, des molécules capables de bloquer spécifiquement l’effet de cette enzyme bactérienne. A noter que la collection de produits chimiques utilisée contient des molécules qui sont utilisées en Europe ou aux Etats-Unis comme médicaments pour différentes maladies. Notre objectif est de démontrer que ces molécules identifiées dans la collection empêchent la survenue des lésions intestinales induites par l’immunosuppresseur chez la souris. Chaque espèce ayant un microbiote particulier, nous avons choisi un modèle, décrit dans la littérature et défini comme humanisé, dans lequel le microbiote de la souris sera remplacé par celui de l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à apporter une stratégie thérapeutique pour prévenir, chez les transplantés, l’entéropathie qui est un effet indésirable des médicaments immunosuppresseurs. Lorsque l’entéropathie survient, la seule option est de diminuer la dose ou la fréquence de prise d’immunosuppresseur au risque de perdre le greffon. La stratégie thérapeutique étudiée dans le présent projet permettra d’améliorer la qualité de vie des patients transplantés et également de tous les patients traités par immunosuppresseur, comme les sujets atteints de maladies auto-immunes. De plus, l’enzyme bactérienne responsable de la transformation de l’immunosuppresseur est aussi mise en cause dans la modification de médicaments anticancéreux (irinotécan, régorafenib), d’anti-inflammatoires non stéroïdiens (diclofenac, ibuprofen), de la morphine, et dans leurs effets indésirables intestinaux. Ainsi, le projet permettra aussi de proposer des solutions pour prévenir l’entéropathie médicamenteuse. Si l’étude proposée ici donne les résultats attendus, le bénéfice pour les malades pourrait être obtenu à moyen terme. En effet, notre stratégie consiste à repositionner une molécule déjà approuvée comme un médicament par les autorités sanitaires européennes ou américaines. L’approbation par les autorités sanitaires n’est donnée que si la molécule montre qu’elle ne présente pas de toxicité dans un certain nombre de modèles animaux (phase d’étude préclinique) puis chez des volontaires sains (étude clinique de phase I). Notre projet devrait permettre de proposer de nouvelles solutions thérapeutiques sans passer par les études précliniques et de phase I très chronophages.
Procédures
Les interventions s’étaleront sur une période de 6 à 7 semaines. Les animaux seront manipulés 39 jours dans le cadre des expériences. Ils seront soumis à 3 préhensions pour pesée puis contention pour habituation à la canule pour administration orale, 1 préhension pour pesée puis contention pour habituation à la canule et prélèvement de fèces, 16 préhensions pour pesée puis contention pour administration orale via une canule, 9 préhensions pour pesée puis contention pour administration orale via canule et prélèvement de fèces. Le prélèvement de fèces peut être spontané lors de la contention ; si la défécation n’est pas spontanée, elle sera provoquée en introduisant délicatement, sur moins d’1 mm, 1 canule dans l’anus. Toutes ces manipulations se feront sur les animaux vigiles et s’enchaineront ; l’animal sera manipulé au maximum pendant 10 minutes lors des jours de manipulations. La dernière intervention prendra 15 minutes et consistera en la contention pour prélèvement de fèces et pour administration d’un anesthésique et antalgique sur animal vigile suivie d’un prélèvement de sang et mise à mort pendant que l’animal est anesthésié.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - un stress léger et momentané lié à la contention pour la pesée, pour le prélèvement de fèces, pour l’administration orale de traitement à l’aide d’une canule, et pour l’anesthésie, -une gêne légère et momentanée lors de la défécation provoquée, lors de l’administration orale avec une canule, et lors de l’introduction de l’aiguille pour l’anesthésie et l’antalgie éventuelle, - et dans le cas des animaux traités par l’immunosuppresseur sont une perte de poids modérée, une douleur modérée jusqu’à l’administration d’un antalgique, et potentiellement de la diarrhée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements, notamment du tube digestif, nécessaires à la mise en évidence d’un effet bénéfique des molécules testées.
Remplacement
En amont de ce projet, l’effet bloquant des molécules sur l’enzyme bactérienne responsable de la transformation de l’immunosuppresseur sera validé sur des selles humaines provenant de sujets sains. Une fois ce point vérifié, nous utiliserons l’animal qui, seul, permet de mimer l’entéropathie qui résulte d’une interaction complexe du microbiote intestinal avec le tube digestif et avec le reste de l’organisme, que l’on ne sait pas reproduire actuellement dans des modèles in vitro.
Réduction
La stratégie choisie de repositionner un médicament, si elle est concluante, elle permettra d’éviter les études de toxicité préclinique qui utilise de nombreux animaux. Dans ce projet, nous utiliserons des souris consanguines pour limiter la variabilité génétique inter-individuelle et par conséquent le nombre de souris à utiliser. Ce projet comprend 2 étapes : une étude pilote suivie de l’étude à proprement parler de l’effet des molécules d’intérêt sur l’entéropathie induite par l’immunosuppresseur. L’étude pilote permettra de mettre au point le modèle animal humanisé sur la base d’une revue exhaustive de la littérature et d’une collaboration avec une équipe experte du modèle de souris humanisé pour le microbiote. Cette étude pilote permettra de limiter le nombre d’animaux utilisé dans la seconde étape. Le nombre d’animaux nécessaire par condition expérimentale pour obtenir des résultats significatifs et robustes a été évalué à l’aide d’un test dit de puissance. Dans l’étude pilote nous prévoyons au maximum de tester 6 conditions expérimentales de 6 animaux par lot ; au plus, 36 souris seront donc utilisées. Les conditions expérimentales seront testées deux à deux en parallèle en comparaison à un lot contrôle pour évaluer les deux méthodes d’administration. Si les conditions expérimentales du premier essai sont satisfaisantes, l’étude pilote sera arrêtée avant d’avoir réalisé le deuxième essai. Dans la procédure 2, 14 conditions expérimentales seront nécessaires, de 12 animaux par lot, soit 168 souris seront utilisées. L’efficacité des molécules sera vérifiée en comparant les résultats des différentes conditions à l’aide du test statistique ANOVA suivi d’un test post hoc.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans des conditions d'hébergement contrôlés quotidiennement et en accord avec la réglementation pour respecter leur bien-être, c’est-à-dire : statut sanitaire ; température ; hygrométrie ; lumière ; et état général des animaux. L’hébergement sera réalisé dans une animalerie dont le statut sanitaire est régulièrement contrôlé et adapté à des animaux dont le microbiote est perturbé. Les animaux seront hébergés en groupe ; le groupe restera le même du début à la fin. De l’enrichissement est systématiquement présent dans les cages, la litière est changée régulièrement et la nourriture et l’eau sont en permanence disponibles. Les animaux seront acclimatés à l’environnement de l’animalerie pendant une période de 14 jours ; sur cette période, ils seront aussi habitués à l’expérimentateur et à la préhension et à la contention nécessaires pour certaines interventions. Pendant toute la durée des expériences, tout un panel de paramètres sera évalué quotidiennement pour chaque animal, des points limites gradés seront donc définis, afin de repérer au plus tôt les signes de mal-être de l’animal, qui seront pris en charge immédiatement et adapté pour chaque point limite qui atteint. L’ensemble des expériences seront réalisées par un personnel compétent.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence pour l’étude de l’entéropathie induite par l’immunosuppresseur. Les troubles et les lésions intestinales miment fidèlement les caractéristiques cliniques des patients transplantés. De plus, l’humanisation du microbiote est bien décrite et efficace dans cette espèce. Les animaux seront reçus à l’âge de 2 mois (8 semaines), le protocole expérimental dure 54 jours dont 14 jours d’habituation des animaux à l’environnement de l’animalerie. Nous utiliserons des souris au stade jeune adulte comme décrit dans la littérature à la fois pour le modèle de microbiote humanisé et pour le modèle d’entéropathie induite par l’immunosuppresseur.