Rongeurs
utilisation de vésicules extracellulaires boostées pour le traitement de l’infarctus du myocarde dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
770 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur provoque chirurgicalement un infarctus du myocarde, avec un taux de décès d'environ 30 % lié à l'opération, avant un suivi par échographie, des injections de vésicules extracellulaires et une mise à mort pour analyser le cœur. Les retombées annoncées, de nouvelles thérapies pour la médecine humaine et vétérinaire, passent d'abord par un test chez le "gros animal". Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne répond à l'objectif et que la souris "mime la clinique humaine".
Objectifs
Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des entités subcellulaires produites par les cellules de manières spontanée ou en réponse à un stimulus. Considérées comme des « nanoparticules biologiques », elles sont depuis peu utilisées par de nombreuses équipes à travers le monde pour régénérer les tissus endommagés dans des pathologies comme l’arthrose, l’AVC, la fistule ou encore l’infarctus du myocarde. Le projet a pour but de tester l’hypothèse de l’intérêt des vésicules extracellulaires produites par diverses méthodes de production à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines, dans un modèle d’infarctus du myocarde chez la souris et pour un potentiel développement thérapeutique chez l’homme. Diverses méthodes de production, purification et modification des vésicules extracellulaires seront testées et validées sur ce modèle murin. La méthode optimale retenue sera ensuite évaluée chez le gros animal pour un futur développement clinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont l’obtention de données permettant de développer de nouvelles thérapies pour la médecine humaine et vétérinaire. Les bénéfices attendus de ce projet sont de déterminer les facteurs influençant l’efficacité des vésicules extracellulaires (tels que la méthode de production, la purification ou encore l’amélioration des vésicules) et de déterminer la meilleure combinaison pour un futur développement clinique. Les animaux utilisés seront pris en charge de manière à limiter au maximum l’effet délétère des procédures expérimentales, en particulier au niveau antalgique.
Procédures
Nous induirons un infarctus du myocarde par technique chirurgicale avec anesthésie, suivi avec échographie cardiaque (non invasif) sous anesthésie puis antalgie post opératoire. La procédure d’euthanasie sous anesthésie permettra la récupération du coeur entrainant la mort de l'animal. - Procédure d’induction d'un infarctus du myocarde par technique chirurgicale avec anesthésie gazeuse (environ 30 minutes) et traitement des douleurs post-opératoires (2 injections par jour pendant 3 jours, environ 30s par injection) - suivi avec échographie cardiaque (non invasif) sous anesthésie (environ 10 minutes 2 fois) - Surveillance du poids (2 fois par semaine pendant 1 mois) - Injection des traitements en intra-veineux ou intra - péritonéal (1 à 3 fois, environ 30 secondes) - injection d’anesthésiques en sous cutané (7 fois, environ 30 secondes) - La procédure d’euthanasie (1 injection intrapéritonéale, moins de 30s, d'un produit induisant le décès) chez un animal auparavant anesthésié par anesthésie gazeuse, permettant la récupération du coeur pour des analyse biologiques (1 fois, environ 10 minutes).
Impact sur les animaux
Il y a un risque de décès pendant l’opération (faible), en post opératoire immédiat (faible) ou à distance (modéré). Les souris auront potentiellement des douleurs post opératoires. L'anesthésie est liée à un risque d'hypothermie, de détresse respiratoire ou d'arret cardiorepiratoire. Les injections des traitements et antalgiques nécessitent la contention des souris et induit des douleur liée à l'introduction de l'aiguille sous la peau - injection d’anesthésiques en sous cutané.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour permettre l'analyse biologique des organes de la souris afin d'évaluer l'effet des traitements sur les tissus.
Remplacement
A ce jour, il n'existe aucun modèle de infarctus du myocarde menant à une insuffisance cardiaque in vitro ou de modélisations informatiques ou autres modèles alternatifs susceptibles de répondre à notre objectif de travail. C'est pourquoi, nous utiliserons, comme modèle animal, la souris C57BL6/Rj qui mime la clinique humaine.
Réduction
Le modèle choisi, et d'autant plus dans les mains expérimentées de la personne réalisant les chirurgies, a une variabilité relativement faible par rapport aux autres modèles existants. Cela permet de limiter le nombre d'animaux par groupe à un maximum de 15 (variabilité beaucoup plus importante chez le gros animal et l'humain). Le calcul du nombre de sujets nécessaire avec un écart type de 30% permettant de détecter un effet de 33% entre deux groupes est de 15 sujets par groupe. La procédure chirurgicale est liée à un taux de décès avant analyse de l'ordre de 30%, ce qui nécessite pour obtenir un groupe de 15 souris par groupe au final un total de 22 souris en moyenne. Les expériences seront accomplies dans un ordre et regroupées pour permettre de limiter la nécessité de réaliser des groupes contrôles pour chaque question scientifique. La nécessité de répliquer l'expérience ne sera qu'optionnelle en cas de puissance insuffisante. Tous les animaux seront utilisés à la fois pour une analyse des paramètres clinique et radiologiques, mais aussi pour les analyses biologiques/histologiques, permettant de ne pas avoir à reproduire les expériences pour le simple fait de récupérer des résultats biologiques/histologiques. Au total, 770 animaux seront utilisés pour les expériences.
Raffinement
Toute modification du comportement des animaux sera surveillée et l'animal euthanasié si nécessaire. Afin de palier au stress et à l'anxiété, les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs frères (6 souris par cage maximum) et l’isolement est à éviter au maximum. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier, morceau de bois, maison et tunnel en carton. Les animaux sont surveillés quotidiennement en post opératoire pendant 3 jours puis quotidiennenment par l'équipe zootechnique et 3 fois par semaine par les expérimentateurs. Les points limites comme l'incapacité à se déplacer, ou la forte perte de poids nous fera mettre à mort l'animal avec la procédure adaptée (euthanasie par injection en IP). Prise en charge per-opératoire : Les souris sont anesthésiées par anesthésie gazeuse. Une fois anesthésiées et endormies, elles reçoivent une injection en sous-cutanée d'anticouleur. La profondeur de l’anesthésie et donc l’absence de sensibilité à la douleur sera évaluée en testant la disparition de certains réflexes. Pendant l’ischémie, un analgésique post-opératoire, sera injectée en sous cutanée à la souris avant la fin de l’intervention. On réalisera une injection d'antalgique local, en intercostal au niveau de la paroi au moment de la fermeture du thorax. Les souris seront réhydratées avec du sérum physiologique. Elles seront sous observation jusqu’à leur réveil complet. Dès leur réveil, les souris seront isolées individuellement dans une cage pendant plusieurs heures, dans un environnement calme et chaud. Le protocole d’analgésie est renouvelé toutes les 12h pendant 3 jours post-opératoires.
Choix des espèces
A ce jour, il n'existe aucun modèle de infarctus du myocarde menant à une insuffisance cardiaque in vitro ou de modélisations informatiques ou autres modèles alternatifs susceptibles de répondre à notre objectif de travail. C'est pourquoi, nous utiliserons, comme modèle animal, la souris C57BL6/Rj qui mime la clinique humaine. En effet, ce rongeur a un système cardiovasculaire proche de celui de l'homme. Actuellement, l'expérimentation animale est la seule et unique approche possible pour rendre cette étude relevante et exploitable pour développer d'éventuelles approches thérapeutiques dans le futur. Les tests chez le rongeur font partie des tests précliniques classiques pour évaluer l’effet thérapeutique d’un produit. Nous utiliserons des souris adultes de plus de 8 semaines ou plus afin de mimer une pathologie qui touche plutôt l’adulte chez l’homme. Nous utiliserons des souris C57BL/6Rj âgées de 8 semaines : à ce stade de développement, tous les organes sont arrivés à maturité. Cela permet de mieux mimer une pathologie qui touche généralement l’adulte.
Approches physiopathologiques et thérapeutiques du syndrome de Sanfilippo B EU 2/3
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Modèles d'une maladie neurodégénérative pédiatrique, elles sont examinées par IRM sous anesthésie, décrite comme non invasive, puis tuées par prélèvement intracardiaque pour mesurer la teneur en fer de leur cerveau, geste que le porteur présente comme la nuisance principale du projet. Les retombées annoncées, valider l'IRM comme mesure remplaçant l'analyse post-mortem, sont censées à terme réduire le nombre d'animaux utilisés. Le porteur affirme que l'usage de l'animal en fin d'étude est "inévitable" pour confirmer les résultats obtenus sur cellules.
Objectifs
Le projet financé est une étude préclinique de thérapie génique intraveineuse pour le syndrome de Sanfilippo B. Ce syndrome est une pathologie neurodégénérative pédiatrique touchant 1 enfant sur 200 000 et pour lequel il n’y a aucune thérapie aujourd’hui. Ce syndrome est dû à la déficience d’une enzyme lysosomale impliquée dans la dégradation d’un glycosaminoglycane, l’héparane sulfate. Cette déficience conduit à l’accumulation de ce substrat qui présente une toxicité majeure pour les cellules du système nerveux central. Nous souhaitons, à travers cette étude, pouvoir proposer un essai clinique par thérapie génique permettant d’apporter l’enzyme déficitaire (N-acétylglucosaminidase). L'objectif de l'exploration par IRM, technique non invasive permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle des tissus, objet de ce projet réalisée dans l'EU 2/3, sera de vérifier s'il est possible de détecter de façon reproductible et fiable des variations de susceptibilités magnétiques caractéristiques de la teneur en fer (Fe) dans différentes régions cérébrales (cortex, striatum, …) des différents groupes expérimentaux sans mise à mort des animaux comme c’est le cas pour les méthodes classiques de mesures post-mortem. L'IRM est un outil important pour le diagnostic in vivo des pathologies ainsi que pour suivre au cours du temps la réponse à différents traitements ou procédures chirurgicales. La durée maximale des acquisitions sera d’une heure par animal.
Bénéfices attendus
Dans le contexte de l’étude physiopathologique, l'objectif de l'exploration par IRM, technique non invasive permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle des tissus, objet de ce projet réalisé dans l'EU 2/3, sera de mesurer des valeurs de susceptibilités magnétiques T2* dans le cerveau des animaux. Ces mesures permettront de comparer la teneur en Fe dans différentes régions cérébrales (cortex, striatum, …) des différents groupes expérimentaux. L’accumulation de fer ou non dans le cerveau est un marqueur de validation de l’efficacité du traitement de nos souris en préclinique. A terme, cette mesure IRM pourrait remplacer les mesures faites post-mortem et devrait donc nous permettre de réduire le nombre d'animaux mis en œuvre pour mesurer la quantité de fer dans les tissus et permettre de suivre l'évolution au cours du temps de la teneur en fer de différents organes d'intérêt dans un même animal renforçant ainsi la valeur statistique des résultats.
Procédures
L'IRM est une procédure d'imagerie in vivo, non invasive et atraumatique. La totalité de la procédure étant menée sous anesthésie volatile (1h maximum), les animaux ne subissent que le stress dû à la préhension avant induction de l'anesthésie. Le réveil post-anesthésique est la seconde étape critique, les animaux restent sous surveillance pendant toute la phase de réveil.
Impact sur les animaux
L'IRM est une technique non invasive d'imagerie qui n'entraine aucune douleur chez les animaux. Les signes vitaux (respiration, fréquence cardiaque et température) sont contrôlés tout au long des manipulations afin de garantir le suivi du bien-être des animaux. La procédure est cependant susceptible d'induire un stress au moment de la préhension des animaux pour les placer dans la cage d'induction de l'anesthésie. Le prélèvement intracardiaque que subiront les animaux au moment de leur mise à mort (sans réveil) est la nuisance la plus importante du projet, elle est cependant indispensable pour réaliser dans des conditions optimales la mesure de teneur en fer intra-tissulaire de référence.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort dans l'EU 1/3 à l'issue des délais 2, 5 ou 9 mois de vie suivant une technique réglementaire qui permettra de pouvoir obtenir des prélèvements de qualité tout en protégeant l'animal de la douleur jusqu'à son dernier souffle.
Remplacement
Une modélisation intégrée est nécessaire pour valider les études in vitro. Les animaux sont utilisés en fin d’étude afin de confirmer des résultats démontrés et des hypothèses formulées à partir des travaux réalisés sur cellules. A ce stade de l’expérimentation, l’utilisation de l’animal est inévitable. Les études sont systématiquement optimisées (quantité de vecteurs, temps de traitement et nombre d’animaux) d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire. Même si le traitement est administré en injection intraveineuse, il est réalisé par un personnel compétent.
Réduction
L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Nous allons utiliser des tests statistiques afin de comparer les groupes. Les tests sont réalisés avec un logiciel de statistique. Nous utiliserons des groupes de 10 souris par expérience et nous répéterons les expériences à 3 âges différents afin de rendre nos résultats comparables à ceux de nos études antérieures. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo. L'IRM étant une technique d'exploration non invasive, elle permet le suivi longitudinal des lots d'animaux mis en œuvre ce qui participe à la réduction globale.
Raffinement
Cette procédure expérimentale a pour objectif d'évaluer la possibilité de remplacer une procédure post-mortem (mesure de la teneur en fer dans les tissus prélevés) par une procédure non invasive, in vivo qui permettra de suivre une même cohorte au cours du temps dans un but de raffinement (suivi du même animal pour s'affranchir de la variabilité interindividuelle et réduction du nombre de lots d'animaux nécessaire pour assurer ce suivi longitudinal selon la procédure classique). Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Nous nous attachons à ne pas laisser un animal seul dans une cage (groupes sociaux de 5 individus maximum par cage). Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Lors des expériences d’imagerie, les animaux sont anesthésiés à l’isoflurane (gaz vecteur O2) dès le début de la procédure pour réduire leur stress et éviter tout mouvement au cours de l’exploration IRM. La cellule d’imagerie dans laquelle est maintenue la souris est thermo régulée. Pendant la phase de réveil, la cage est également placée sur tapis chauffant et reste sous contrôle visuel jusqu’au réveil complet de l’animal. Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur de 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus est un modèle animal adapté aux pathologies de surcharge lysosomale. L’application de la politique de réduction mise en place permet d’optimiser au mieux chaque expérimentation afin de retirer d’un minimum d’animal un maximum d’information. De plus la formation des personnes habilitées à manipuler les animaux et la diffusion par ces personnes de leur savoir dans des conditions appropriées (temps de formation respecté) permet de réaliser nos expérimentations animales dans le respect de l’animal et des conditions optimales du suivi des règles d’hygiène et de sécurité. Il est nécessaire d’utiliser les souris à partir de d'âge de 2 mois afin de pouvoir comparer les résultats avec ceux obtenus dans nos précédentes études et celles décrites dans la littérature.
Génotypage des souris transgéniques réalisées à partir d’une biopsie de tissu lors de l’identification de l’animal.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
10 000 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 8 000 tuées à l'issue faute du bon génotype, 2 000 conservées pour l'élevage. Une biopsie de la queue à quinze jours ou du pavillon de l'oreille à l'âge adulte, inférieure à un millimètre, est réalisée en même temps que l'identification par tatouage ou bague, pour analyser leur ADN. Le porteur reconnaît que la queue remplit de nombreuses fonctions et que son atteinte "entretient un handicap", et que la bague peut être arrachée ou l'oreille mutilée lors de bagarres. Ce prélèvement remplace la section de phalanges pratiquée jusque-là dans l'établissement.
Objectifs
L’établissement est une animalerie d’élevage de souris génétiquement modifiées nécessitant la détermination de la constitution génétique de chaque individu par une amplification précise de séquences d’ADN (génotypage par PCR), qui est généralement réalisée en même temps que leur identification. L’objectif de ce projet est d’utiliser un prélèvement (biopsie) de queue ou du pavillon d’oreille pour obtenir un morceau de tissu de souris transgéniques afin d’effectuer une analyse d’ADN et sélectionner les animaux avec les bonnes séquences d’ADN. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. Ce projet ne concerne que les animaux n’ayant pas de caractère qui altère gravement l’état général de l’animal (phénotype dommageable). Le prélèvement de tissu au niveau de la queue/oreille est considéré comme moins invasive que la coupe des phalanges distales, méthode utilisée jusqu’à présent dans l’établissement. La biopsie sera effectuée en même temps que l’identification des animaux, par tatouage à l’aide d’encre appliquée en intradermique ou par la pose d’une bague numérotée à l’oreille (à lâge adulte uniquement). Ce projet sera mis en place dans l’établissement, suite à l’arrêt de l’identification des animaux par phalangectomie. Il ne concerne pas les lignées à phénotype dommageable, la création de nouvelle lignée et les animaux qui ont été inclus dans une procédure d’élevage dans un projet. Pour les nouveaux projets, tous les animaux transgéniques qui devront être identifiés par une biopsie invasive couplée à une identification seront inclus dans une demande de projet impliquant ces animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la réalisation du génotypage, couplé à l’identification des souris transgéniques à phénotype non dommageable en élevage dans l’EU, dès l’arrêt de la phalangectomie. Le projet est limité à une durée de 1 an ce qui permettra la mise en place d’une technique de prélèvement de tissu de préférence non invasive.
Procédures
Les animaux subiront un prélèvement de l’extrémité de la queue à l’âge de 15 jours, réalisé en même temps que leur identification par tatouage. Si le prélèvement de tissu doit être réalisé à l’âge adulte, il sera réalisé sur le bord du pavillon de l’oreille dans une partie souple, non cartilagineuse de l’oreille ; dans ce cas, il sera réalisé en même temps que l’identification de l’animal par tatouage ou par la pose d’une bague à l’oreille. La durée du prélèvement sera de quelques secondes et l’identification des animaux par tatouage ou pose d’une bague à l’oreille nécessite moins de 1 minute.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de tissu sera réalisé à l’extrémité de la queue ou à l’oreille, selon l’âge de la souris, et sera inférieure à 1mm afin de limiter les effets indésirables. La queue de la souris a de nombreuses fonctions (régulateur de température, balancier, organe sensitif du toucher…) et son absence entretient un handicap pour les souris. C’est un élément de l’anatomie de la souris sensible, qui contient des os, du cartilage, des vaisseaux sanguins et des nerfs. La coupe de la queue après 28 jours d’âge occasionne un inconfort prolongé en raison de la minéralisation des os de la queue ainsi que le développement de la vascularisation qui est présent à cet âge. Ainsi, à l’âge de 15 jours, une biopsie de moins de 1 mm peut être envisagée sans induire d’effets indésirables importants pour l’animal. Cet âge est choisi car il est compatible avec une identification précoce des souris par tatouage. A l’âge adulte, le prélèvement au niveau du pavillon de l’oreille sera privilégié et toujours limitée à 1mm pour limiter les nuisances. Cette zone est fibro-cartilagineuse et tapissée d’une fine couche de peau. L’incision sera réalisée dans une zone souple non cartilagineuse sur le bord du pavillon de l’oreille. La pose d’une bague numérotée aux oreilles pour identifier de façon définitive la souris peut entrainer une gêne ou un inconfort d’au poids de la bague. En cas de bagarre entre congénères, la bague peut être arrachée ou l’oreille mutilée.
Devenir
Les animaux dont les séquences d’ADN ne sont pas celles attendues seront mis à mort ; les autres animaux d’intérêt seront conservés pour maintenir l’élevage des lignées de souris transgéniques.
Remplacement
L’utilisation de souris transgéniques permet l’étude d’un gène de façon ciblée ou d’une fonction spécifique de l’organisme. Des techniques génétiques permettent de modifier le génome de façon très précise. De plus, la modification du génome peut induire la perte ou l’activation de l’expression d’un gène, et ceci de façon ciblée dans le temps ou dans un organe, constitutivement ou après induction. Ces modèles animaux sont précieux pour réaliser des recherches scientifiques fondamentales ou précliniques et ne peuvent souvent pas être remplacés car les fonctions étudiées mettent en jeu des interactions inter-organes essentielles au bon fonctionnement de l’organisme, impliquant des réponses hormonales, immunitaires et nerveuses.
Réduction
Le nombre d’animaux pour le maintien d’un élevage de souris est maintenu au minimum pour éviter la dérive génétique (environ 10 à 15 souris maximum /lignée âgées de 6 mois au maximum pour garantir leur fertilité). L’élevage de lignées transgéniques est limité et restreint aux lignées utilisées pour la recherche. En cas d’arrêt ou d’interruption de projets, les lignées sont cryoconservées par congélation de sperme ou d’embryons. Il est important de noter que le croisement de lignées transgéniques entraine la production d’animaux de mauvais génotype, c’est-à-dire dont les séquences d’ADN ne correspondent pas à celles ciblées. Certains de ces animaux (mais ne représentant qu’un faible pourcentage) pourront être utilisés pour de la formation aux gestes techniques ou comme animaux « contrôles » d’expérience.
Raffinement
Le prélèvement de tissu à l’extrémité de la queue sera réalisé précocement, à l’âge de 15 jours, avant l’ossification de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, un prélèvement d’un morceau du pavillon de l’oreille sera privilégié, et réalisé si possible sous anesthésie gazeuse. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. Le tatouage à l’encre par injection intradermique n’entraine pas de nuisance. Des techniques alternatives de biopsie non invasives sont en cours d’évaluation et pourront être utilisées lorsque la validation des séquences d’ADN par PCR sera obtenue et si l’absence de contaminations croisées est démontrée.
Choix des espèces
La transgenèse est généralement réalisée chez la souris et l’établissement est un plateau de conservation et d’élevage de différents modèles de souris transgéniques utilisées en recherche fondamentale et préclinique. Le prélèvement caudal sera réalisé à l’âge de 15 jours afin de limiter les nuisances. Le prélèvement effectué sur le pavillon l’oreille sera réalisé à 4 semaines pour éviter l’incision de la queue qui s’est ossifiée à cet âge.
Comparaison entre un entrainement en endurance individualisé d’intensité modérée et un entraînement intense sur la plasticité corticale et hippocampique et les fonctions sensorimotrices et cognitives chez des rats sains adultes vieillissants.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
98 rats Wistar vieillissants, 49 mâles et 49 femelles, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils suivent un entraînement d'endurance sur tapis roulant, des tests sensorimoteurs et cognitifs de force de préhension et de mémoire, et jusqu'à quatre prélèvements sanguins sur huit semaines, avant d'être tués pour prélever cerveau et muscles. Les retombées annoncées, transposer à l'humain les effets de l'entraînement sur le cerveau vieillissant, restent au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut reproduire l'interaction muscle-cerveau sur une telle durée.
Objectifs
Dans ce projet, l’efficacité de programmes d'intensité modérée (Moderate intensity continuous training ou MICT) et de haute intensité (High-intensity interval training ou HIIT) est évaluée sur l’évolution des paramètres physiologiques de la performance d’endurance et de la performance sensorimotrice/cognitive ainsi que sur la plasticité musculaire et cérébrale sur 98 rats Wistar mâles (n=49) et femelles (n=49) adultes vieillissants (12-15 mois). Ce projet implique donc des tests sensorimoteurs/cognitifs, de performance d’endurance sur tapis roulant, 2 prélèvements de sang seront réalisés avant et après les 2e séances des semaines 2, 4 et 8 (après désinfection à l’alcool à 70°) au niveau de la veine caudale latérale de la queue. Ces échantillons seront ensuite conservés pour des analyses moléculaires ultérieures. Cela implique aussi des mesures moléculaires musculaires et cérébrales (hippocampe et cortex) à la fin du protocole après prélèvement des tissus pour quantifier les protéines clefs impliquées dans la neuroplasticité et l’activité métabolique.
Bénéfices attendus
Le projet peut révéler la spécificité de chaque méthode d'entraînement en endurance sur les fonctions cérébrales ainsi que les fonctions cognitives et sensorimotrices chez les individus âgés où des troubles moteurs et cognitifs apparaissent fréquemment. Les protocoles d'endurance seront individualisés à partir de repères physiologiques (voir procédure 1 pour la méthodologie utilisée) afin d'être facilement transférables à l'humain comme cela sera dans ce projet de recherche.
Procédures
Pas de chirurgie avec réveil dans ce projet. 1) Les intensités d'effort sont individualisées pour limiter les vitesses de course excessives et stressantes pour les animaux. 2) Pour le prélèvement du cerveau et muscles, ils subiront d'abord une anesthésie profonde. Après disparition des derniers signes d'éveil (absence de reflexes palpébraux, de l’axe sensori-moteur et absence de mouvements des vibrisses), l’étape suivante consiste à les euthanasier par un surdosage d'anesthésique. 3) Prélèvement de sang à la base de la queue sous anesthésie pour réduire le stress et les mouvements de l'animal (maximum 4 prélèvements de sang sur 8 semaines). Le volume prélevé sera inférieur au 20% du volume sanguin total dans la période de 7 jours, soit 2 ml maximum de sang prélevé pour des rats de 400-550g sur 1 semaine incluant le prélèvement PRE et POST séance (séance 2 des semaines 2, 4 et 8).
Impact sur les animaux
Globalement, le protocole n'induit pas d'effets indésirables importants. De légères blessures possibles peuvent subvenir aux niveaus des pattes. les autres procédures sont réalisés sous anesthésie n'induisant pas d'effets indésirables.
Devenir
Ils seront euthanasiés pour prélever les organes afin de les utiliser pour des analyses moléculaires ultérieures (Western blot et ELISA).
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour étudier l’impact d’un entrainement d'endurance au niveau musculaire et cérébral et qui puisse faire le lien entre ces 2 systèmes. L’utilisation de culture de neurones (in vitro) ne peut pas remplacer l’utilisation des animaux dans ce projet car il n’est pas possible de mimer précisément l’entraînement physique de manière chimique. De plus, la durée de l’entraînement prévue est trop longue (8 semaines) pour pouvoir réaliser la même expérience in vitro. Les neurones en culture primaire ne restent pas exploitables sur cette durée. Il est également nécessaire de tenir compte des contraintes mécaniques imposées aux muscles actifs lors de la course. Ces contraintes contribueraient à la plasticité cérébrale mais le modèle in vitro ne peut pas reproduire ces phénomènes physiologiques d’interaction muscle-cerveau.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux pour chaque groupe, nécessaire à la réalisation d’un test statistique paramétrique, soit un total de 98 rats Wistar, mâles et femelles. Le protocole sera arrêté si l’animal présente des difficultés respiratoires, s’il est prostré ou en retrait, si ses poils sont hérissés.
Raffinement
Les méthodes utilisées sont soit non invasives, soit très peu invasives (prise de sang) soit sans réveil. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les rats afin d’assurer le bien-être de l'animal. Ce qui est prévu : L’environnement des cages sera enrichi et renouvelé toutes les semaines par la présence d'objets afin de réduire l'ennui des animaux (igloos cartonnés, des tunnels en Carton 5 mm et en polycarbonate ainsi que des mini-rouleaux de papier). Les mêmes expérimentateurs restent en contact avec les animaux tous les jours afin qu'ils s'habituent à eux. Les animaux sont familiarisés avec les dispositifs expérimentaux avant le début du protocole pour réduire le stress éventuel. Pour le protocole de la ponction de la veine caudale latérale (gauche ou droite) est réalisé sous anesthésie générale (gazeuse). Pour le prélèvement du cerveau et muscles, les rats reçoivent un antalgique 30 min avant la procédure et sont ensuite anesthésiés profondément. Après disparition des derniers signes d'éveil (absence de reflexes palpébraux, de l’axe sensori-moteur et absence de mouvements des vibrisses), l’étape suivante consiste à les euthanasier avec un surdosage d’anesthésique. Cette procédure n'induira pas de perte de poids de plus de 20%. Ils devraient même en prendre régulièrement. Dans le cas contraire, ils seront euthanasiés. le porteur du projet prendra cette décision.
Choix des espèces
Les répercussions musculaires et métaboliques à l'exercice montrent des similitudes entre un rat et un homme (par exemple, présence d'un seuil lactique, biogenèse mitochondriale, gains de masse musculaire) comme en témoignent de nombreuses publications. Il permet, en outre, à partir de tests comportementaux (sensibilité mécanique, force de préhension, mémorisation à court terme…) et immunohistologique, de vérifier l'efficacité de nouvelles stratégies d'entrainement. Les rats sains vieillissants seront inclus à partir de 12 mois (12-15 mois). Le taux de survie est plus important comparé aux rats âgés de 20 mois. De plus, ces animaux sont davantage susceptibles de courir sur le tapis roulant que des rats plus lourds. Ce modèle de rats vieillissants est fréquemment utilisé dans la littérature pour étudier les effets du vieillissement sur le cerveau.
Etude de pousse tumorale et efficacité d’agent anti cancéreux sur 6 modèles de cancer du sein humain greffées en sous cutané chez la souris immunodéprimée
- Recherche appliquée
- Cancers
624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dépourvues de système immunitaire, elles reçoivent une greffe de l'un des six modèles de cancer du sein triple négatif, puis des injections de molécules et un suivi de la tumeur, avec mise à mort au plus tard soixante jours après le début. Les retombées annoncées, de nouvelles thérapies contre un cancer de mauvais pronostic, sont présentées comme "nécessaires" à de futurs essais cliniques. Le porteur affirme que la sensibilité des tumeurs aux traitements dépend du microenvironnement et impose de travailler sur un "organisme entier".
Objectifs
Ce projet vise à étudier 6 nouveaux modèles de cancers du sein triple négatif (catégorie de cancer à mauvais pronostic). Le cancer du sein désigne un ensemble de tumeurs malades. En l’absence de traitements cette catégorie de cancer présente une forte agressivité et a de mauvais pronostics. Ce cancer représente environ 15% de l’ensemble des cancers du sein et touche préférentiellement les femmes jeunes, entre les âges de 40 et 50 ans. L’incidence annuelle est de l’ordre de 14/100 000 femmes, soit environ 40 000 nouveaux cas par an en France. Que ce soit dans les formes localisées ou déjà propagées le pronostic est significativement plus sévère que dans les autres formes de cancers du sein. Il s’agit donc d’un véritable problème de santé publique pour lequel de nouveaux traitements sont nécessaires. Le présent projet vise à évaluer de nouvelles thérapies dans des modèles. Il se déroulera en deux temps. Tout d’abord seront établies les conditions optimales de prise tumorale des 6 lignées cellulaires sur une souche de souris dépourvue de système immunitaire, puis souhaitera évaluer l’efficacité de nouvelles molécules .
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont la démonstration que de nouveaux principes thérapeutiques soient actifs dans le traitement du cancer du sein triple négatif. Ces résultats sont nécessaires afin de procéder à l’évaluation ultérieure de ces molécules dans le cadre d’études cliniques précoces chez l’homme.
Procédures
Implantation de tumeur en sous-cutané ou orthotopique mammaire (ressemble à de la sous cutanée) (une fois au début de l'expérimentation, quelques minutes) - injection intraveineux de composés thérapeutiques non toxiques (quelques minutes), pour un maximum de 3 injections espacées de 7 jours - mesures tumorales au pieds à coulisse 3x/semaine (quelques secondes)
Impact sur les animaux
- Injection de cellules tumorales en sous cutané entrainant un stress lors de la contention, et une douleur lors de l'injection : quelques minutes, - injection de cellules tumorales en orthotopique mammaire ressemble à de la sous cutanée) entrainant un stress lors de la contention, et une douleur lors de l'injection : quelques minutes, - Pousse tumorale : nuisance possible si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite, gêne et éventuellement douleur au niveau de la tumeur - pesées et suivi tumoral : stress lors de la contention (quelques minutes) il n'y a aucun effet secondaire attendu pour les traitements.
Devenir
Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 60 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai. Nous devrons récupérer les tumeurs pour analyses.
Remplacement
La sensibilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement du microenvironnement. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour cette raison nous devons effectuer les études d’efficacité sur la souris. In vitro au préalable, les molécules ont été testé sur ces mêmes lignées pour connaitre et valider la dose optimale. La voie d’administration de chaque drogue a fait l’objet d’une étude de toxicité et pharmacocinétique afin de déterminer la meilleure méthode d’injection de chaque composé.
Réduction
Les expériences seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable, i.e. 8 animaux par groupe. Le nombre de souris a été défini et établi via des outils statistiques. Les études sur les différents modèles tumoraux seront réalisées en séquentiel, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Avant la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs ont une très bonne expérience et détectent très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Leur état général sera aussi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation. Tous les animaux seront mis à mort au plus tard 60 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Les animaux feront l’objet d’un suivi très soutenu le jour J de l’injection. Par ailleurs, le personnel animalier inspecte quotidiennement les animaux et renseignent une grille de suivi basé sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos vouté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite.
Choix des espèces
Nous souhaitons travailler avec des animaux présentant un système immunitaire fortement déprimé pour éviter le phénomène de rejet. L'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter ce phénomène La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif. En effet la souris immunodéprimée est reconnue pour l’implantation de cellules humaines. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux (rats) et il est préférable d’avoir recours aux modèles murins. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale
Babesia microti: infection expérimentale et production de matériel parasitaire
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
150 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont infectées par le parasite Babesia microti, subissent des prélèvements de sang à la queue tous les trois jours, puis sont tuées par exsanguination une fois la parasitémie cible atteinte, jusqu'à 50 % des globules rouges parasités. L'objet du projet est de produire du sang parasité servant de contrôle positif pour un test de diagnostic. Le porteur affirme que le parasite n'est pas cultivable in vitro et que l'infection expérimentale reste le "seul moyen" d'en produire.
Objectifs
Afin d'obtenir des molécules parasitaire (protéines, antigènes, ADN...) il est nécessaire de recourir à l'infection expérimentale d'animaux tels que la gerbille de Mongolie, le parasite B. microti n'étant pas cultivable in vitro. L'objectif est d'obtenir la quantité nécessaire et suffisante de matériel, essentiellement sous forme de sang parasité pour extraction d'ADN, pour disposer d'un contrôle positif utilisable sur 1 année complète.
Bénéfices attendus
Le diagnostic des babésioses, humaines ou vétérinaire, repose sur la technique de la PCR (amplification spécifique de l'ADN). Un contrôle positif est nécessaire à la validation des résultats, ce contrôle positif consiste à l'utilisation de sang de gerbille parasité par B. microti.
Procédures
Deux injections intra péritonéales (200 µl) seront réalisées (inoculation du parasite à partir de sang parasité à J1), et surdose d'anesthésique lorsque la parasitémie atteint sa valeur cible. Environ 5 prélèvements de sang (1 goutte, soit 50 µl) au niveau de l'extrémité de la queue seront réalisés pour la réalisation d'un frottis sanguin et une mesure d'hématocrite (1 prélèvement tous les 3j). Un prélèvement de sang à la queue, réalisé sans contention particulière, dure environ 20 s, est quasiment indolore et ne provoque pas de stress ni de réactions particulières.
Impact sur les animaux
Les animaux reçoivent deux injections intrapéritonéales au cours de la procédure: une première injection pour l'inoculation des parasites, la deuxième lors de l'euthanasie. Ces deux injections peuvent entraîner une légère inflammation au point d'injection. Les prélèvements réalisés à la queue peuvent également causer une irritation modérée, leurs réalisations ne nécessitent pas la mise en place d'une contention particulière. Le saignement à la queue est stoppé très rapidement et l'application d'un désinfectant au niveau de la queue limite l'inflammation potentielle. Le développement du parasite dans le sang, au moins jusqu'à une parasitémie de 50%, n'induit pas d'effets notables sur le comportement des animaux.
Devenir
Le prélèvement de sang parasité par exsanguination implique l'euthanasie des animaux à la fin de la procèdure.
Remplacement
Il n'y a actuellement pas de méthodes alternatives à l'infection expérimentale pour propager les parasites B. microti. De plus, l'infection expérimentale reste une méthode de réference pour l'isolement de souches parasitaires issues de prélèvement cliniques. Contrairement à d'autres espèces de Babesia telles que B. divergens (cultivable en hématies humaines venant de l'EFS) ou de B. canis (cultivable en hématies canines venant d'une société d'élevage privée), B. microti ne peut pas être cultivées à long terme sur hématies in vitro (quelle que soit l'espèce de mammifère considérée). La production de matériel biologique ne peut être réalisée par des molécules de synthèse ni simulation informatique, ce qui contraint à l'infection expérimentale.
Réduction
Le nombre d'animaux est déterminé par le volume de sang parasité nécessaire pour l'utilisation du matériel mais aussi pour assurer le renouvellement des stocks congelés, permettant un maintien à long terme de nos capacités de production. Ainsi, nous avons besoin de 30 ml de sang parasité/an. A raison de 2 ml de sang total prélevable par animal, nous avons besoin de 30 gerbilles/an (soit 150 animaux sur 5 ans). L'objectif étant la production de sang parasité, l'approche statistique est sans objet.
Raffinement
Le prélèvement rétro-orbital, utilisé pour la mesure d'hématocrite (sur tube capillaire hépariné) est désormais remplacé par l'utilisation d'un lecteur d'hématocrite avec bandelettes. Ce lecteur utilise 2 µl de sang, qui sera prélevé à la queue dans le même prélèvement que celui nécessaire à la détermination de la parasitémie. Ceci permet donc d'éliminer totalement le prélèvement rétro-orbital de la procédure, ce qui permet de réduire fortement la perte sanguine des animaux, la douleur éventuellement générée et les risques d'infection. A noter que le parasite ne peut survivre ou se développer en dehors de la circulation sanguine de l'animal, et ne peut etre transmis que lors d'une injection expérimentale ou une morsure de tique infectée, ce qui empêche toute contamination de la zone d'hébergement. L'extrémité de la queue, à la suite du prélèvemnet, est désinfectée et le saignement stoppé par une légère pression avec un papier absorbant, ce qui empêche l'écoulement de sang parasité en dehors de la zone d'expérimentation et contribue à la non-contamination de la zone d'hébergement. Le point limite principal est l'hématocrite, et la mise en évidence de signes de souffrances. Lorsque l'hématocrite mesuré est inférieur ou égal à 20% (ou lorsque l'animal présente des signes de souffrance tels que déterminés sur la grille d'évaluation), l'euthanasie de l'animal est décidée et le sang parasité récupéré.
Choix des espèces
Babesia microti est un parasite transmis lors du repas sanguin de tiques infectées sur un hôte sensible. Les gerbilles de Mongolie sont sensible à l'infection par B. microti, et en l'absence de système de culture in vitro du parasite, l'infection expérimentale reste le seul moyen de produire du matériel parasitaire (ADN, protéines...).
Immunorégulation de la greffe de moelle osseuse par les cellules humaines NKT invariantes EU2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dépourvues de système immunitaire, elles reçoivent une irradiation corporelle totale puis une greffe de cellules humaines, développant à partir de trois à quatre semaines une réaction du greffon contre l'hôte avec perte de poids et altération de l'état général. Les retombées annoncées, améliorer la greffe de moelle osseuse contre la leucémie, sont présentées comme "indispensables" à de futurs essais cliniques. Le porteur reconnaît poursuivre des expériences in vitro mais affirme que l'efficacité des cellules "ne peut pas être déterminée in vitro".
Objectifs
Ce projet de recherche concerne les lymphocytes NKT invariantes (iNKT), qui sont des cellules importantes dans notre système immunitaire qui ont la capacité de réguler les réponses immunitaires et de tuer les cellules cancéreuses. Lorsqu'une personne subit une greffe de moelle osseuse pour traiter une leucémie, les cellules du donneur peuvent attaquer les tissus sains du receveur, causant des dommages graves appelés "réaction du greffon contre l'hôte" (GVH). L'ajout d'iNKT au greffon pourrait aider à réguler la réponse immunitaire pour éviter les problèmes de santé associés à la GVH tout en maintenant l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Pour cela, il est important d'étudier comment les iNKT régulent la réponse immunitaire pour éviter les problèmes de santé et déterminer la quantité d'iNKT nécessaire pour obtenir un effet bénéfique. Il est également essentiel de vérifier que l'ajout d'iNKT n'empêchera pas l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Pour atteindre ces objectifs, des modèles animaux seront utilisés pour étudier les effets de différentes quantités et sous-types d'iNKT sur la réponse immunitaire. Les interactions entre les iNKT et d'autres types de cellules immunitaires seront également examinées pour mieux comprendre leur rôle dans la régulation de la réponse immunitaire. Enfin, il sera étudié si l'ajout d'iNKT au greffon empêchera l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Les résultats de cette étude pourraient améliorer les traitements de greffe de moelle osseuse et réduire les risques associés à la GVH, tout en maintenant l'effet anti-leucémique de la greffe.
Bénéfices attendus
Dans le contexte de la greffe de moelle osseuse, les cellules humaines intégrées dans le greffon détruisent les cellules leucémiques du receveur mais peuvent également reconnaitre et attaquer les tissus sains du receveur (réaction du greffon contre l'hôte appelée GVH). La GVH est responsable de la mortalité de 20% des patients greffés. Par ailleurs, l’effet anti-leucémique ne se développe pas chez tous les patients et le taux de rechute de la leucémie survient chez environ 30% des patients greffés. Ce projet vise à valider un sous type particulier de cellules humaines (les iNKT) qui favorisera l’effet anti-leucémique, avec un moindre effet sur les tissus sains. L’utilisation de ces cellules pourrait par conséquent améliorer le devenir des patients greffés. Les résultats de ce projet pré-clinique sont indispensables à la poursuite du développement de ce traitement innovant en vue de mettre en place des études cliniques chez l’homme.
Procédures
Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 264 souris pendant 40 secondes par carrousel (6 à 8 souris). -Une injection intraveineuse (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 216 souris, et trois injections pour 48 souris, pendant 1 minute par injection. -Une injection intra-péritonéale (IP) sur animal vigile, au maximum 4 fois pendant 8 semaines sur 76 souris, pendant 1 minute par injections. -Un prélèvement de sang sur animal vigile sur 188 animaux, et cela à 21, 28 et 35 jours après la greffe de cellules humaines, pendant 2 minutes par prélèvement..
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress modéré lors de la procédure de radiothérapie à faible dose préalable à l’injection dans la veine caudale des cellules humaines. Ils développeront des signes cliniques de GVH à partir de 3 à 4 semaines après la greffe. Ces signes cliniques sont une perte de poids (-20% par rapport au poids pré-greffe) avec ou sans diarrhée et des signes de fatigue et d’altération de l’état général : voussure, perte de brillance du pelage, hérissement des poils, inflammation des yeux et diminution de l’activité dans les cas sévères. Ces signes sont gradés par le même expérimentateur selon le score de GVH. Le niveau de souffrance sera modéré. Dans les expériences où seront injectées des cellules leucémiques, les animaux présenteront à partir de 3 semaines après l’injection des signes de croissance tumorale avec prise de poids et développement de masses abdominales qui pourront altérer leur état général (augmentation du score clinique utilisé pour grader le degré de GVH). Le niveau de souffrance sera modéré.
Devenir
Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines plus ou moins avec des cellules leucémiques, une GVH ou une progression tumorale vont pouvoir se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ou en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences in vitro pour valider la fonctionnalité des cellules humaines de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé in vitro, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques : ainsi, l’expérimentation s’arrêtera dès l’obtention d’une différence significative entre les groupes (minimum 8 souris totales par groupe), et ne sera pas poursuivie en l’absence de différence statistiquement significative observée à 12 souris receveuses par groupe. Par ailleurs, les différentes étapes du projet seront conditionnées par les résultats obtenus dans les précédentes. Ainsi, au maximum 264 souris seront utilisées.
Raffinement
Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton), dans un portoir ventilé, dans un secteur spécifique pour les animaux immunodéprimés en animalerie EOPS avec contrôle de la température, de l'humidité, du cycle jour. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évalution sera utilisé. Des points limites sont mise en place.
Choix des espèces
La souris NSG permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines car cette souris, ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans la greffe de moelle osseuse. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur la GVH et l’effet anti-leumique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 15 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.
Étude de l’effet d’une combinaison thérapeutique d’un anti-angiogénique et d’un inhibiteur de point de contrôle immunitaire sur un modèle de cancer colorectal orthotopique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur ouvre l'abdomen pour injecter des cellules tumorales dans le caecum, avant un traitement par voie intrapéritonéale, l'intervention pouvant provoquer douleurs, perte de poids et infection. Les retombées annoncées, confirmer chez l'humain l'intérêt d'une bithérapie déjà employée en clinique, restent à démontrer. Le porteur affirme que le cancer implique des interactions "possibles seulement dans un organisme vivant" et que les expériences in vitro "ne suffisent pas".
Objectifs
Ces dernières années, l’immunothérapie a suscité un engouement dans le monde de la cancérologie. Cette dernière consiste à mobiliser le système immunitaire des patients pour cibler et éliminer les cellules tumorales. Cette approche a montré des effets puissants et durables mais seulement sur un faible pourcentage de patients. L’une des raisons pouvant expliquer ces résultats pourrait être un manque d’infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs. De manière à rétablir un infiltrat lymphocytaire dans la tumeur, il est possible de cibler l’angiogenèse. L’angiogenèse correspond à la formation de nouveau vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants et est nécessaire pour assurer le transport des nutriments et de l’oxygène dans la tumeur. Au sein des tumeurs, l’angiogenèse induit un environnement immunosuppresseur et perturbe également la migration des cellules immunitaires car les vaisseaux sanguins sont anormaux. De ce fait, il est intéressant de cibler l’angiogenèse afin de normaliser les vaisseaux sanguins et de favoriser la réponse immunitaire antitumorale en réduisant l’environnement immunosuppresseur. La combinaison thérapeutique des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICI) et des anti-angiogéniques a fait l’objet de nombreux essais cliniques et son efficacité est approuvée dans le traitement de plusieurs cancers solides. En dépit d’une réelle avancée ces dernières années, une compréhension plus approfondie des mécanismes d’action de cette bithérapie est nécessaire pour permettre de mieux cibler les patients répondeurs et apporter des réponses quant à son efficacité. Au laboratoire, nous avons montré que cette bithérapie améliore, in vivo, les réponses anti-tumorales dans différents modèles de cancer hétérotopique chez la souris. Cependant ces observations ont été réalisé sur des modèles de cancer colorectaux injectés en sous cutané et ne nous permettent pas de confirmer totalement l’intérêt de la bithérapie chez l’Homme. En effet, les modèles hétérotopiques ne permettent pas d’analyser les interactions entre la tumeur et l’environnement spécifique du côlon. Dans ce contexte, afin de confirmer l’intérêt de la bithérapie chez l’Homme nous souhaitons développer une approche d’induction de cancer colorectal orthotopique : les cellules tumorales seront injectées directement dans le caecum.
Bénéfices attendus
Le but de ce travail est d’explorer l’effet de la combinaison αPD-1 et αVEGR-2 dans un modèle de cancer colorectal orthotopique pour confirmer son intérêt chez l’Homme. En effet, les modèles hétérotopiques ne permettent pas d’analyser les interactions entre la tumeur et l’environnement spécifique du côlon. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients et confirmer que ce traitement pourrait être utilisé chez des patients. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients afin d'augmenter leur chance de survie.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale : ouverture de la cavité abdominale, injection de cellules tumorales dans le caecum, fermeture de la cavité abdominale. Par la suite, les souris seront traitées en intrapéritonéale. 14 jours après les traitements, les souris seront mises à mort.
Impact sur les animaux
L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris et d’injecter des cellules tumorales dans le caecum. Cette intervention chirurgicale pourrait entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par l’intervention chirurgicale. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences car ils sont porteurs de tumeurs et ne pourront pas être ré-utilisés.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur des modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales.
Réduction
Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.
Raffinement
Tout au long de l’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau : si le pli persiste plusieurs secondes, l’animal est fortement déshydraté) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tout le long de l’expérimentation : du soin pré aux post-opératoires. Des antalgiques seront utilisés pour limiter la souffrance de l’animal. Des enrichissements de milieu seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leur nid. De la nourriture sera également mise dans la cage. Pour remédier aux infections qui peuvent être causées par l’intervention chirurgicale, un travail en condition aseptique sera réalisé. Pour cela, des espaces propres et sales seront utilisés. L’espace non-stérile sera utilisé pour les soins pré-opératoires, l’anesthésie, la tonte, les soins post-opératoires. L’espace stérile sera utilisé pour la préparation des consommables utilisés lors de l’acte chirurgical et l’acte chirurgical en lui-même. De plus, les deux premiers jours suivant l’intervention, une désinfection de la cicatrice sera réalisée. A la suite de l’opération, chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés, la fréquence de surveillance sera augmentée. De plus, de la nourriture sera mise dans la cage. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales (traitements) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations.
Choix des espèces
Diverses souches de souris immunocompétentes sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, telles que les souris C57Bl/6 (MC38) et les BALB/c (CT26). Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.
Etude de la fonction vasculaire dépendante des prostaglandines chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Certaines sont dépourvues d'un récepteur vasculaire, subissent une dépilation du dos sous anesthésie puis une mesure du flux sanguin cutané sous une seconde anesthésie de trente à quarante-cinq minutes, avant d'être tuées pour prélever peau et vaisseaux. Les retombées annoncées, des pistes de traitement des troubles microcirculatoires humains, restent lointaines. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire de travailler sur un organisme entier" et qu'"il n'existe à l'heure actuelle aucune autre méthode".
Objectifs
La microcirculation joue un rôle clé dans la survie des tissus en leur fournissant de l'oxygène et des nutriments. Le flux sanguin est régulé par plusieurs substances qui sont libérées par le vaisseau lui-même tel que le monoxyde d’azote, un puissant vasodilatateur. Cependant, un nombre important de données expérimentales suggèrent maintenant un rôle pour d'autres substances vasculaires par l’intermédiaire d’un récepteur. L’évaluation de cette voie vasculaire est peu étudiée mais peut s’évaluer en mesurant la capacité des vaisseaux de la peau (au niveau du dos) à se dilater en réponse à l’application locale d’un faible courant. L’objectif de ce projet est d’étudier cette réponse vasculaire de la peau chez des souris qui sont dépourvues du récepteur vasculaire.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des données de réactivité vasculaire de la peau obtenues sur animaux sains et animaux dépourvus pour le récepteur à la prostacycline. Ces résultats permettront de proposer des pistes de traitement adaptées aux défauts microcirculatoires chez l’homme et la femme.
Procédures
Une dépilation de la peau sur la partie basse du dos sera réalisée sous anesthésie générale induite par un gaz (2 à 3 min) 2 à 3 jours avant la mesure du flux sanguin de la peau. L’étude de la réponse du flux sanguin nécessite une nouvelle anesthésie générale induite par injection pour une durée de 30 à 45 min.
Impact sur les animaux
Une détresse respiratoire peut apparaître suite aux anesthésies. Une irritation cutanée peut apparaitre après dépilation. Une perte d’interaction avec changement de comportement peut apparaître suite à l’isolement d’une souris agressive ou blessée.
Devenir
Mise à mort en fin d’expérimentations et prélèvement des tissus cutané et vasculaires.
Remplacement
Ce projet a pour but de déterminer le rôle du récepteur de la prostacycline dans la fonction vasculaire cutanée. La prostacycline peut être produite par plusieurs cellules présentes dans la peau. Il est nécessaire de travailler sur un organisme entier car il est impossible de reproduire toutes les interactions dans un modèle de peau in-vitro. Des études chez l’homme existent mais aucune drogue n’est suffisamment efficace pour étudier l’effet du récepteur de la prostacycline sur la fonction vasculaire cutanée. Il n’existe à l’heure actuelle aucune autre méthode que celle décrite ici.
Réduction
Le nombre d’animaux total de souris prévues pour ce projet est de 90 afin d’étudier 15 souris par groupe, des 2 sexes. Le nombre d’animaux prévu est maximal. Afin de réduire le nombre d’animaux nous avons prévu d’utiliser des tests statistiques adaptés aux petits groupes pour évaluer les différences intra- ou inter-individuelles pour toutes les mesures. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles.
Raffinement
Les souris auront une période d’acclimatation de 1 semaine après leur arrivée avec suivi du poids 1 fois par semaine. Les cages sont enrichies pour améliorer le confort des animaux. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance.
Choix des espèces
La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste largement utilisée pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède en effet une physiologie cutanée proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les mêmes approches techniques tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. Afin de garder une cohérence avec tous nos projets antérieurs et pour renforcer la compréhension des mécanismes, nous utiliserons les animaux de ce projet à 12-14 semaines d’âge ce qui correspond à la maturité du système vasculaire et très éloigné du phénotype dommageable qui peut apparaitre à 12 mois.
Thérapie pour la myopathie à agrégats tubulaires en utilisant des AAV dans le modèle souris – «TransTAM»
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
465 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers pour 285 d'entre elles et modérés pour 180. Ces souris portent une mutation reproduisant une myopathie humaine rare et subissent des tests répétés de force et d'activité locomotrice, un test de saignement, des injections intraveineuses d'un vecteur de thérapie génique, puis une mesure de force musculaire sous anesthésie terminale avant mise à mort pour prélever les muscles. Les bénéfices annoncés, une première "preuve de concept" transposable aux patients, restent au conditionnel. Le porteur affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité musculaire ni les effets sur l'ensemble de l'organisme.
Objectifs
La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, des crampes, et des myalgies. La majorité des patients montrent des anomalies de la peau, des os, des plaquettes, et de la rate. La présentation complète de ces signes multi-systémiques est appelé syndrome de Stormorken (STRMK). TAM et STRMK forment un spectre de la même maladie. Afin de corréler les dysfonctions cellulaires avec le développement de la maladie, nous avons généré et caractérisé un modèle murin portant la mutation TAM/STRMK la plus commune. Les souris présentent les principaux signes cliniques des patients. A ce jour, aucun traitement n’est disponible. Nous avons l’intention d'inverser les symptomes des souris TAM/STRMK par une régulation négative d'un gène important pour la maladie, afin de fournir une approche translationnelle pour les essais thérapeutiques prospectifs chez les patients. Nous avons effectué des injections intramusculaires de souris TAM/STRMK et déterminé un effet positif sur la fonction musculaire. Ces résultats préliminaires nous encouragent à tester la même approche sous une forme systémique, afin de pouvoir à la fois prévenir et inverser le phénotype multisystémique des souris TAM/STRMK.
Bénéfices attendus
Il est attendu que cette étude apportera la première preuve de concept pour un traitement efficace de TAM/STRMK. En effet, nos résultats préliminaires ont montré un effet bénéfique suite à l'administration du traitement dans le muscle, et il reste à démontrer que cette approche est également efficace par injection systémique et capable d’améliorer les phénotypes des plaquettes, de la peau, de la rate, et des os. De manière importante, la thérapie est conservée entre la souris et l’homme et pourra être utilisée chez les patients TAM/STRMK dans des tests cliniques ultérieurs.
Procédures
Des tests de comportement seront réalisés une fois par mois chez l’animal vivant à partir de 4 ou 16 semaines selon la cohorte jusqu’à 4 ou 8 mois d’âge. Le test de comportament permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour, avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque test. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test de comportament permettant de mesurer la force musculaire des pattes antérieures de l’animal dure 10 secondes, et sera répeté 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes. Le test permettant mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 12h. Le test de saignement est utilisé pour évaluer la coagulation sanguine et la capacité de l'organisme à former un caillot en cas de lésion vasculaire. Il sera réalisé une fois, et il durera au maximum 10 minutes. Les mesures de force musculaire seront réalisées pendant 10 minutes. La mesure de la production de force du muscle est une procédure sans réveil, qui durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera mis à mort. Le test pour l'obtention du sang sera répeté 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. Des injections intraveineuses seront réalisées pour administrer le traitement. Entre l'anesthésie et l'injection, la procédure prendra environ 2 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les souris sont plus petites que les souris sauvages et manifestent des problemes dans le muscle, la rate, la peau, les plaquettes et l'os, démontrant que notre modèle murin est un outil approprié pour étudier le développement de la maladie. Pour la deuxième lignée de souris, une caractérisation complète sera bientôt effectuée pour confirmer un phénotype dommageable. Les tests de comportament peuvent induire du stress sur l'animal. Ces tests dureront le moins de temps possible pour que les tests soient significatifs, de sorte que l'animal souffre le moins possible.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour préléver les muscles nécessaires aux analyses moleculaires.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.
Réduction
Pour la partie expérimentale, les tests phénotypiques réalisés de manière non invasive offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui permet de s’affranchir de générer une cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. L’organisation de nos procédures vise à utiliser le plus possible de tissus différents provenant de la même souris afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un maximum d’un test par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Ainsi, nos précédentes études montrent que 15 souris au maximum par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, de la couleur de la peau, ainsi que l'évaluation de la présence d'une poche de lait seront évalués tous les 2 à 3 jours. Après le sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante. La qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 heures jour/nuit sera respecté. Les animaux auront accès à de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. L'environment sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. En cas de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l'aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo, ce qui limite le développement de la douleur. Afin de réduire le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée avant le début du suivi longitudinal pour chaque test. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué.
Choix des espèces
Les souris sont nécessaires pour ces expériences afin de nous permettre de comprendre les propriétés physiologiques des différents muscles et organes après une modification génétique. Le modèle murin nous permet d'étudier l'amélioration potentielle du phénotype musculaire, ainsi que du phénotype observé sur d'autres organes, dans ce modèle de maladie murine multisystémique. Nous devons réaliser des expériences physiologiques in vivo chez la souris. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur des espèces évoluant plus éloignées de l'homme, car la structure musculaire diffère davantage. C'est pourquoi nous proposons d'utiliser des lignées de souris disponibles dans nos laboratoires pour réaliser ces techniques. Les tissus de souris peuvent ensuite être utilisés pour d'autres analyses, maximisant ainsi les résultats obtenus par souris et réduisant le nombre total d'animaux utilisés. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Stim1R304W/+, caractérisé par une faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît à l'âge de 2 mois et s'accentue avec l'âge, présentant un phénotype modéré à l'âge de 9 mois. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, à partir de 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu'à 4 mois, puis à partir de 16 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement de la maladie), afin d'observer le développement des souris après le traitement.
Évaluation de l’efficacité préclinique d’un traitement de nouvelle génération sur le cancer du pancréas.
- Recherche appliquée
- Cancers
174 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur greffe par chirurgie abdominale une tumeur pancréatique humaine, avec suivi hebdomadaire par IRM et échographie sous anesthésie, injections du traitement et prélèvements sanguins, la tumeur pouvant provoquer douleurs abdominales et perte de poids. Les retombées annoncées pour les patients, un traitement plus efficace du cancer du pancréas, restent au conditionnel. Le porteur affirme que les modèles alternatifs ne reproduisent pas fidèlement la progression tumorale et invoque la "nécessité" de travailler sur un "organisme entier et vivant" avant tout passage chez l'humain.
Objectifs
Nous avons développé un traitement qui cible spécifiquement les cellules tumorales et qui a montré des résultats prometteurs contre les leucémies, cancer du sang. L’objectif est donc d’étendre son utilisation à d’autres cancers, tel que celui du pancréas. Le but de ce projet est de développer un modèle de souris qui récapitule au mieux le développement du cancer de pancréas humain afin d’évaluer dans un premier temps l’efficacité de notre traitement. Dans un deuxième temps, puisque notre traitement uttilise le mécanisme d’absorption du fer pour délivrer sa drogue toxique dans la cellule cancéreuse, ce projet nous aidera à comprendre les mécanismes physiologiques qui participent à la croissance tumorale, qui est fortement dépendante du fer.
Bénéfices attendus
L’incidence du cancer pancréatique est en constante hausse dans le monde, avec une survie sur 5 ans de seulement 8%. La lutte contre celui-ci est aujourd’hui une urgence de la santé publique. Nos résultats pré-cliniques sur le cancer du pancréas sont très prometteurs et nous poussent à étudier ce cancer dans un environnement proche de l’homme. Celui-ci nous permettra d’évaluer l'efficacité du traitement et de récapituler fidèlement la progression tumorale observée chez le patient. Ce projet nous permettra également d'approfondir les connaissances des tumeurs pancréatiques, aujourd’hui peu compris. Enfin, ce projet permettra d’améliorer la prise en charge des patients et de leur offrir un traitement plus efficace.
Procédures
Les animaux serons soumis à une procédure chirurgicale d’une durée de 30 minutes au cours de laquelle une incision abdominale sera pratiquée, le pancréas sera exposé et du tissu cancéreux humain sera placé dans le pancréas de la souris. Avant l’intervention, une dose d’anti-douleur sera administrée pour éviter toute souffrance. La chirurgie se déroule sous anesthésie profonde, et sous une grande surveillance de l’animal (respiration normale, absence de saignement). Les responsables du projet surveilleront quotidiennement les animaux pendant les 3 jours suivant la chirurgie, afin de s’assurer du bien-être de l’animal et que les points de suture sont stables. Pour suivre la croissance tumorale dans le site pancréatique, la souris sera imagée par IRM et échographie une fois par semaine. La procédure d'IRM et d'échographie (bien que non invasive ou douloureuse), se fera également sous anesthésie pour éviter de stresser l'animal et pour le maintenir immobile le temps de la procédure qui dure environ 20 minutes par animal. La moitié des animaux sera ensuite traitée avec le traitement et l'autre moitié sera traitée avec une solution saline et représentera le groupe dit “contrôle”, dans lequel la tumeur suivra son développement normal. Le traitement est administré par voie sanguine, toujours en anesthésiant l'animal pour éviter toute souffrance, et le protocole d'injection est d’une injection tous les quatre jours, sur 12 jours. La technique d'injection est bien maîtrisée par l'opérateur et prend moins d'une minute à réaliser. Pour évaluer l'impact du traitement sur les constantes sanguines, des échantillons de sang seront prélevés à au moins une semaine d'intervalle entre chaque prélèvement. Au moins 3 fois par semaine, les animaux seront contrôlés par les responsables du projet pour détecter tout signe et symptôme de souffrance. En cas de besoin, des anti-douleurs seront administrés, ou en cas de douleur/souffrance intense, les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Le projet consiste à greffer une tumeur de pancréas humaine dans le pancréas d’une souris, pour étudier la réponse à notre traitement anti-cancéreux. Nous sommes conscients des nuisances que cela peut entrainer chez l’animal, particulièrement au niveau de l’acte chirurgical mais aussi au niveau du développement de la tumeur. Ce dernier peut occasionner une gêne, une perte de poids et des douleurs abdominales. Les techniques d’imageries que nous utiliserons (IRM et échographie) et les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse, ce qui peut également induire un stress chez l’animal au moment de l’induction et au réveil. L’acte chirurgical peut éventuellement entrainer une inflammation au niveau du site opératoire.
Devenir
Les animaux encore vivants à la fin du projet seront euthanasiés pour évaluer d'éventuels effets toxiques du traitement dans le pancréas, et les autres organes, ou pour évaluer d'éventuelles modifications des valeurs sanguines résultant de l'administration du traitement. Les organes seront collectés et examinés avec des techniques colorimétriques de laboratoire ce qui permettra d'obtenir des résultats utiles pour de futures expériences sur des souris, mais aussi pour prédire d'éventuels effets secondaires chez l'homme une fois que le traitement passera en phase clinique.
Remplacement
Nous avons commencé par tester l’efficacité et la toxicité de notre traitement sur des cellules de cancer de pancréas au sein du laboratoire. Cependant, il devient nécessaire d’étudier l’ensemble du processus tumoral et métastatique, dans un organisme entier et vivant récapitulant au mieux ce qu’il se passe chez l’homme. Malheureusement, les modèles alternatifs aux animaux ne permettent pas aujourd’hui de reproduire fidèlement la progression tumorale observée chez l’homme. Enfin, notre projet offre une alternative thérapeutique pour les patients atteints de cancer du pancréas, ce qui justifie la nécessité de travailler sur un modèle animal avant son application chez l’homme. Nous continuions à explorer de nouvelles méthodes alternatives pour réduire l’utilisation des modèles animaux autant que possible, mais la souris reste aujourd’hui le modèle le plus pertinent pour répondre à nos objectifs scientifiques.
Réduction
Dans le respect de la règle des 3R (remplacement, réduction, raffinement), nous nous sommes engagés à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en optimisant la qualité des résultats. D’une part, avant de commencer nos expériences sur les souris, nous avons évaluer l’efficacité de notre traitement sur des cellules de pancréas en laboratoire. Nos précédents projets portaient sur l’évaluation du même traitement sur des modèles de souris atteints de leucémies. Ainsi nous avons pu optimiser le nombre de souris par groupe suffisant pour obtenir des résultats de qualités et exploitables scientifiquement. A la fin de la procédure expérimentale, nous utiliserons les souris après euthanasie pour des analyses de biologie moléculaire et d’histologie dans le but d'étudier l’impact du traitement sur les tissus et l’expression de notre cible. Ainsi, l'utilisation du modèle animal sera optimisée au maximum pour récupérer toutes les données nécessaires à l’étude, sans avoir à utiliser plus d’animaux pour reproduire l’expérimentation. Enfin, nous utiliserons des techniques non invasives (IRM, échographie) pour observer en temps réel l’évolution tumorale. Ces techniques nous permettent de réduire le nombre d’animaux en évitant une fin de protocole prématurée et par conséquent une reproduction de l’expérimentation.
Raffinement
Pour respecter le bien-être animal, les conditions d'élevage, d'hébergement et de soins seront les plus adaptés possible pour réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable chez les animaux. Puisque les souris utilisées ont un système immunitaire affaibli, elles seront hébergées dans des conditions stériles. Le personnel a été récemment formé pour effectuer la pratique chirurgicale requise et suit régulièrement des cours de mise à jour à cet égard. Avant la procédure chirurgicacle, des anti-douleurs à action prolongée seront administrés et seront anesthésiées le temps de la procédure. Les instruments seront tous stérilisés pour éviter toutes infections. Au réveil, les animaux seront surveillés attentivement pour s’assurer qu’ils ne souffrent pas. Si un animal présente des signes de souffrances, il sera rapidement euthanasié dans le but d'assouvir toutes douleurs. Les sessions d’IRM et d’échographies seront également réalisées sous anesthésie pour minimiser le stress et l’angoisse des animaux, et seront maintenus sur une plaque chauffante à 37°C pour stabiliser leur température corporelle. Les responsables de projet surveilleront les souris 3 fois par semaine pour s’assurer de leur bien-être et qu’ils soient traités avec le plus grand respect et le moins de douleurs possible. Ils seront également suivis par les personnels qualifiés de l’animalerie 1 fois par jour.
Choix des espèces
L'espèce animale choisie est une souris d’un système immunitaire affaibli, permettant de développer le cancer du pancréas humain. Ainsi, l’effet du traitement sur le cancer sera relevant par rapport à ce qu’on pourrait observer chez l’homme. Pour ce projet, il a été choisi d’utiliser des souris adultes donc bien développés (6 à 7 semaines) qui ont la capacité de cicatriser et de se rétablir rapidement après un acte chirurgical. Ce choix est également justifié par le fait que le cancer du pancréas touche plutôt des sujets adultes de plus de 55 ans.
Prevention des allergies à l’aide de probiotiques issus de produits laitiers fermentés
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
420 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une allergie alimentaire ou respiratoire par gavages quotidiens, injections intrapéritonéales, sensibilisations cutanées et instillations nasales, 84 d'entre elles subissant en plus une chirurgie d'implantation d'une puce dans l'abdomen. L'objet réel est de développer des produits laitiers fermentés à propriétés immunomodulatrices pour une "population cible", les personnes allergiques. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de reproduire le système immunitaire in vitro et présente l'expérimentation animale comme un "élément vital" du projet.
Objectifs
Les allergies sont très répandues et ont été classées comme quatrième pathologie en termes de morbidité par l’OMS et leur prévalence est en constante augmentation. Elles constituent ainsi un vrai problème de santé publique. Coûteuses, les allergies altèrent également la qualité de vie des patients. Les mécanismes en œuvre dans le développement des allergies et les causes spécifiques de l’augmentation de leur prévalence ne sont pas totalement connus. L’une des explications possibles de cette prévalence accrue repose sur l’hypothèse hygiéniste, qui postule qu’une exposition insuffisante à des antigènes protecteurs aux premiers stades de la vie augmente le risque d’allergie. La dysbiose intestinale observée dans les allergies favorise la persistance d’un statut pro inflammatoire prédominant à la naissance, et empêche le passage vers une réponse pro tolérogène ainsi que le développement du phénomène de tolérance. De plus, la perte de biodiversité microbienne intestinale est associée à l’augmentation des allergies et d’autres maladies inflammatoires. La colonisation du tube digestif par des microorganismes est essentielle au développement immunitaire et la nature de ces microorganismes module ce développement. Par ailleurs, un rôle immunomodulateur bénéfique a été observé pour des souches sélectionnées de microorganismes qualifiés de probiotiques. Pour ce projet nous avons sélectionné des bactéries sur la base de leurs propriétés immuno modulatrices in vitro. Ce nombre de solutions bactériennes a été défini via ces tests in vitro afin de ne sélectionner que les souches présentant un effet immunomodulateur significatif. Nous allons étudier l’efficacité de ces derniers comme moyen de prévention de l’allergie et de son évolution dans des modèles précliniques d’allergies alimentaire et respiratoire. Nous étudierons également les mécanismes d’action de ces bactéries sur la barrière intestinale et son microbiote ainsi que la réaction immunitaire qui en découle.
Bénéfices attendus
Ces résultats permettront à terme le développement de produits laitiers fermentés (laits fermentés, fromages) ayant des propriétés modulatrices caractérisées particulièrement bénéfique pour des populations à risque de pathologies chronique telles que les allergies. Sans être nécessairement des « novel-food », ces produits laitiers fermentés exploiteront les propriétés « 2-en-1 » des ferments laitiers pour une population cible : les allergiques.
Procédures
Gavages tous les jours pendant 16 ou 25 jours (si procédure allergie alimentaire 16 jours, procédure allergie respiratoire 25 jours). Lors de la récupération des fécès, les souris sont placées dans une cage individuelle le temps de récupérer un nombre suffisant de fèces pour les analyses. 3 piqûres intrapéritonéales et 1 gavage, espacés d'une semaine pour les souris allergie alimentaire. 4 sensibilisation percutanées et 2 challenges par voie nasale pour les souris allergie respiratoire. Anesthésie tous les 7 jours pour l’induction de l’allergie respiratoire pendant 6 semaines. Pour 84 souris, chirurgie pour implantation de la puce anipill: anesthésie par voie gazeuse, ouverture du ventre, suture, et suivi post opératoire.
Impact sur les animaux
Lors des gavages quotidiens, une gêne à l'oesophage peut être ressentie du fait du geste répété. Lors du déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge) par gavage oral, une baisse de température corporelle des animaux est généralement observée. Lors du déclenchement de l’allergie respiratoire (challenge) par dépôt intra-nasal, certaines souris peuvent ressentir une gêne respiratoire suite au deuxième dépôt intra nasal.
Devenir
Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et du microbiote.
Remplacement
Impossible de prendre des mesures de remplacement. Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interaction complexe comme ici avec l’étude des propriétés immunomodulatrices de probiotiques.
Réduction
Nombre d’animaux réduis au minimum pour être statistiquement relevant c’est-à-dire au moins 10 individus par groupes pour faire des analyses statistiques. De plus, 2 protocoles indépendants seront nécessaires pour valider les différentes études et leurs résultats ce qui fait un total de 20 souris par groupes.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 4 ou 5 par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique.
Choix des espèces
Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles de souche Balb/C. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Ainsi, l'expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les femelles Balb/C utilisées auront 4 semaines à réception et auront 5 semaines au début des procédures, ce qui correspond à des souris sevrées ayant un système immunitaire mature et un poids correct permettant l’implantation d’une puce type Anipill.