Rongeurs

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur induit une migraine par injection d'un neuropeptide, le PACAP-38, puis mesure la sensibilité de la face au moyen de filaments de Von Frey et de jets d'air répétés pendant quatre heures après chaque injection. Il décrit une douleur modérée dont l'animal peut s'écarter faute de contention, et tue tous les rats pour prélever leur cerveau. Le projet vise à mettre au point un modèle de migraine chez mâles et femelles, le porteur affirmant qu'aucune méthode ne peut remplacer l'observation in vivo de l'intégration de la douleur.

Objectifs

L’objectif du projet est de développer un nouveau modèle de migraine en se basant sur les derniers résultats scientifiques. Nous étudierons un nouveau neuropeptide présent dans le système trigémino-vasculaire mais également dans l’hypothalamus et la vascularisation des méninges. Ce composé jouerait un rôle dans l’inflammation neurogène ainsi que la modulation et la sensibilisation des neurones nociceptifs trigémino-vasculaires. Des étude récentes chez l’homme ont montré que l’administration de ce produit induit des crises de migraine chez des patients souffrant de migraine sans aura. Ainsi pour mimer les conditions cliniques, nous souhaitons utiliser l’administration systémique du neuropeptide pour provoquer l’activation du système trigémino-vasculaire chez le rat. Nous évaluerons les effets de ce neuropeptide sur le comportement de l’animal, mais également sur l’excitabilité du complexe trigémino-vasculaire en utilisant des marqueurs d’activation neuronale chez le mâle et la femelle. Nous souhaitons comparer d’une part l’activation des régions du système nerveux central chez les mâles et les femelles pour voir s’il y a des différences entre les mâles et les femelles, mais aussi en fonction des variations hormonales qui ont lieu pendant le cycle sexuel chez la femelle.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra de développer un modèle animal plus proche de la clinique et des dernières études scientifiques. Ceci devrait nous aider par la suite à mieux comprendre les mécanismes de la crise de migraine, caractériser ses spécificités chez le mâle et la femelle et identifier de nouvelles thérapeutiques. En effet, la migraine est plus fréquente chez les femmes que les hommes, mais les études ont été majoritairement réalisées chez les mâles. Pourtant, il est connu qu’il existe des différences d’intégration inhérentes au sexe et au cycle hormonal. Ainsi à moyen terme, identifier les différences ainsi que le rôle des différentes régions cérébrales dans ce nouveau modèle murin de migraine nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. Par ailleurs, on sait que les triptans sont les médicaments spécifiques de la migraine, malheureusement ces molécules ne sont efficaces que chez environ 60% des personnes suggérant que d’autres mécanismes triptan-indépendants sous-tendent la crise de migraine. Ainsi les découvertes récentes chez l’homme montrant que les triptans et les antagonistes du CGRP sont moins efficaces sur les céphalées induites, suggèrent que l’inhibition de la voie du neuropeptide étudié constitue une cible de choix pour développer de nouveaux traitements antimigraineux.

Procédures

Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal et par l’envoi d’un jet d’air toutes les 30 min pendant 4 h après l'injection des molécules en sous cutané (chaque application dure 3 secondes). Les jours entre les injections, la mesure se fait une fois.

Impact sur les animaux

Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Enfin, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey ou les jets d’air avec l’AirPuff induisent un retrait de la face signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure au maximum 3 secondes.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. Il est donc nécessaire de réaliser les observations chez l’animal in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux (logiciel statistique dédié). Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles.

Raffinement

La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur engendrée dans le cadre du modèle. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique ) , nous respectons les recommandations de l'International Association for the Study of Pain. Nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les stimulations mécaniques ne dépassent pas les point limite fixés. Pour améliorer le bien-être des animaux , les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher. La chirurgie et la mise à mort de l'animal sont realisées sous anesthésie generale.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires . C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.

96 rongeurs Arvicanthis vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumis pendant 16 semaines à un régime gras et sucré, ils subissent trois séries de huit microprélèvements sanguins sur animal vigile, que le porteur reconnaît pouvoir provoquer une douleur aiguë et une inflammation, avant un prélèvement sanguin terminal. Tous sont tués pour des analyses moléculaires et biochimiques post-mortem. Le porteur retient ce rongeur diurne pour sa proximité avec le rythme humain et affirme qu'aucune méthode sans animal ne peut caractériser la prise alimentaire, la retombée en chrononutrition humaine restant hypothétique.

Objectifs

Non seulement la quantité et la nature des aliments ingérés impactent la santé, mais le moment auquel sont pris les repas influence également le bien-être des individus. C'est notamment le cas des personnes qui ont des dîners à haute teneur énergétique et des personnes qui ont des habitudes alimentaires erratiques ou nocturnes chez lesquelles on observe une incidence accrue de diabète de type 2, d'obésité et de maladies cardiovasculaires. Au sein du système nerveux central, une région du cerveau appelée l'hypothalamus est impliquée dans le contrôle de la prise alimentaire, de la satiété et dans l'équilibre énergétique. Cette région est également responsable de l'organisation temporelle de toutes les fonctions et comportements biologiques car elle héberge une horloge biologique, les noyaux suprachiasmatiques (NSC) , qui donne le tempo à l'ensemble de l'organisme. Lors d'un régime alimentaire déséquilibré, il devient donc pertinent de pouvoir discriminer si les perturbations métaboliques observées viennent d'un déséquilibre dans les quantités d'aliments ingérés ou si elles s'accompagnent également d'une désorganisation temporelle du rythme de prise alimentaire. Le projet vise donc à étudier la chrononutrition chez Arvicanthis ansorgei, un modèle de rongeur diurne qui présente une organisation temporelle de ses fonctions biologiques similaire à celle de l'homme, comme par exemple un éveil diurne, un sommeil nocturne et une rétine riche en cônes. L'objectif sera sur des animaux nourris avec un régime équilibré 1/ de caractériser le rythme journalier de la prise alimentaire (structure temporelle sur 24h des repas, leur nombre et leur durée) ainsi que de la sécrétion des principales hormones métaboliques (insuline, leptine et corticostérone) equi la contrôlent 2/ de réaliser un phénotypage métabolique complet des animaux (volumes d'oxygène consommé et de CO2 rejeté avec calcul du quotient respiratoire et dela dépense énergétique) afijn ensuite d'évaluer les conséquences chez arvicanthis d'une exposition à un régime déséquilibré (graisse ou glucide) sur tous ces paramètres et in fine d'évaluer si les conséquences métaboliques observées sont uniquement dues au régime alimentaire déséquilibré seul ou combiné à une modification spontanée du rythme circadien de la prise alimentaire.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus pourraient permettre d'envisager chez l'homme des traitements basés sur des protocoles de chrononutrition visant à proposer certains aliments à certains moments de la journée sans rompre l'équilibre énergétique. La mise en évidence qu'un régime déséquilibré riche en graisse ou sucre ne conduit pas au développement d'une obésité et d'un diabète de type 2 sur le modèle animal choici pourrait ouvrir de nouvelles pistes pour de futurs traitements chez l'humain.

Procédures

Lers animaux seront soumis à 3 séries de 8 microprélèvements sanguins (durée de chaque prélèvement = quelques secondes) réalisés sur animal vigile. Chaque série de prélèvements est séparée de la précédente par 8 semaines de récupération. Chaque animal sera soumis à un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie profonde et analgésie (durée quelques minutes). Les animaux seront soumis à 16 semaines de régime alimentaire déséquilibré (gras et sucré).

Impact sur les animaux

Les tests métaboliques réalisés par microprélèvement sanguin pourront induire une douleur aigue et pourraient créer de l'inflammation. L'exposition au régime déséquilibré pendant 16 semaines pourrait induire des perturbations métaboliques pouvant conduire à la mise en place d'une obésit et / ou d'un diabète de type 2.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements post-mortem et analyses moléculaires et biochimiques.

Remplacement

L'objectif du projet étant de caractériser la prise alimentaire (nombre de repas, durée des repas,intervalles entre les repas, quantité de nourriture ingérée), il n'est pas possible d'utiliser des méthodes alternatives. L'animal reste donc le modèle de choix pour mener à bien cette étude.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires au projet (96 animaux sur 5 ans de projet) a été calculé pour permettre d'obtenir des résultats fiables et exploitables statistiquement. Nous avons privilégié une étude longitudinale pour le métabolisme où chaque animal sera son propre contrôle. Les résultats seront analysés par des tests statistiques permettant d'établir l'impact d'un régime déséquilibré sur la prise alimentaire et le métabolisme sur arvicanthis, modèle de rongeur diurne à l'instar de l'humain et établir si arvicanthis pourrait être résistant au diabète et à l'obésité.

Raffinement

Les mâles arvicanthis sont agressifs entre eux et sont donc maintenus en cage individuelle enrichie (bâton et matériel de nidification). Les animaux sont hébergés dans le même pièce ce qui permet de maintenir les contacts olfactifs, visuels et auditifs entre les congénères. Afin de limiter le stress lié à la préhension, arvicanthis étant un animal diurne particulièrement actif, les animaux sont habitués à la manipulation qui est réalisée avec une serviette ce qui permet de prendre les animaux délicatement par le corps. Les procédures invasives sont réalisées sous anesthésie et analgésie. Des points limites ont été définis permettant d'interrompre la procédure et ainsi soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le moment du repas tout comme la quantité d'aliments ingérés ou leur qualité nutritionnelle concourrent au maintien de l'équilibre énergétique et donc au bien-être des individus. Il est donc important pour notre étude d'utiliser un modèle animal dont la niche temporelle de prise des repas se rapproche de celle de l'homme. Arvicanthis Ansorgei est un rongeur diurne qui présente des caractéristiques similaires à l'homme : rythme veille/sommeil avec un éveil diurne et un sommeil nocturne et une rétine riche en cônes. Il s'avère donc être un modèle pertinent pour étudier les conséquences d'un régime déséquilibré sur les rythmes circadiens (hormones, métabolites et gènes horloges). Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 2 à 4 mois afin de travailler sur des animaux mâtures. Pour limiter les variations entre individus il est important pour l'étude de travailler sur des groupes avec un cerveau intégrant les centres régulateurs du comportement alimenatires (hypothalamus notamment mâture).

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de défenses immunitaires, elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du foie humain, laissent croître une tumeur pendant un à deux mois, puis sont gavées chaque jour pendant dix à vingt jours, avec nécroses tumorales et pertes de poids possibles, avant d'être tuées pour analyse des tumeurs. Le projet teste des sucres issus d'algues marines comme traitement du cancer du foie, retombée que le porteur renvoie au long terme. Il indique avoir d'abord évalué ces molécules in vitro.

Objectifs

Le cancer du foie est le 6ème cancer par ordre de fréquence dans le monde. Parmi les facteurs impliqués dans la propagation de ce cancer on retrouve une protéine appelée héparanase qui dégrade les sucres biologiques entourant les cellules, et favorise ainsi la propagation du cancer. L’inhibition de l’activité de cette protéine, pour contrôler et limiter la propagation des cellules cancéreuses dans le foie, apparaît comme une stratégie de recherche prometteuse. Ainsi, ce projet vise à utiliser des sucres naturels issus d’algues dont le rôle principal est de diminuer l'action de l'héparanase. Notre problématique est d'évaluer une nouvelle stratégie de lutte contre le cancer du foie basée sur l’utilisation de ces potentiels traitements sur des tumeurs humaines ayant été developpées chez des souris. Le but de ce projet est de trouver un traitement original et innovant du cancer du foie, qui pourrait être administré en plus des stratégies thérapeutiques actuelles pour améliorer les chances de survie des patients.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à court terme pour ce projet est la détermination du traitement ayant le plus d'effets sur les tumeurs du cancer du foie. Le bénéfice attendu à moyen terme est l'identification des mécanismes qui ont lieu au sein de la tumeur. Les bénéfices attendus à long terme seraient d'envisager un traitement du cancer du foie par ces traitements naturels à base d'algues marines, mais cela nécessitera alors des expérimentations supplémentaires pour s’assurer de leur potentielle efficacité dans ce cadre.

Procédures

a.Une injection sous la peau de cellules humaines (sous anesthésie). Cette injection devrait prendre quelques secondes par souris. b. Développement d'une tumeur sous la peau après l'injection de cellules humaines du cancer du foie aux souris. Il faudra environ 1,5 à 2 mois pour que la tumeur atteigne une taille adéquate permettant de commencer les traitements. La taille maximale des tumeurs ne devrait pas dépasser un volume de 200mm^3 c. Traitement quotidien (7 jours/7), une fois par jour pendant 10 ou 20 jours par gavage avec une sonde de gavage (volume de gavage : 200 µL). La durée de chaque gavage peut varier, mais en général, cette procédure est assez rapide et peut être effectuée en quelques secondes.

Impact sur les animaux

L'administration des traitements à l'aide d'une sonde métallique dans l'estomac des souris sera effectué tous les jours pendant 10 ou 20 jours (week-ends compris). Ce mode d’administration appelé gavage entraîne une nuisance et un stress de sévérité modérée aux souris, on note aussi une nuisance liée à la croissance des tumeurs. Parmi les effets indésirables possibles on note les effets suivants : Blessures ou nécrose des tumeurs - Perte de poids suite aux manipulations quotidiennes - Risque de propagation de la tumeur dans d'autres parties du corps.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure éxperimentale afin de récuperer les tumeurs et les analyser.

Remplacement

Dans un premier temps, nous avons étudié l'effet de nos molécules thérapeutiques dans un modèle de cellules au laboratoire, les résultats obtenus confirment l'efficacité anti-cancéreuse de notre traitement. Désormais notre objectif est de confirmer les effets observés sur les cellules dans un modèle animal. On voudrait également comprendre les interactions et les mécanisme biologiques qui ont lieu entre les cellules cancereuses et le milieu dans lequels elles baignent avec et sans traitement, notamment sur la création de nouveaux vaisseaux sanguins. Les modèles sur animaux pour étudier le cancer sont les seuls permettant de reconstituer la complexité des tumeurs humaines sur l'animal. Les résultats obtenus sur ces modèles permettent ainsi une réelle extrapolation en médecine humaine

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans cette étude est de 400 souris. Le nombre d'individus par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Une étude sur des cellules a été préalablement faite au sein de notre laboratoire et a démontré un effet anti-cancéreux de 3 sucres issus d'algues marines. Malgré l'importance des trois molécules, seulement deux ont été sélectionnés pour l’étude sur les souris. Toujours dans le but de limiter le nombre d'animaux, nous nous sommes référés aux données bibliographiques pour determiner le nombre de cellules à injecter aux souris. Et dans la mesure du possible, les tissus obtenus à partir d'une souris serviront à plusieurs analyses biologiques à la fois. Par ailleurs, la taille des effectifs a été établie grace à un calcul de puissance statistique, et les résultats obtenus permettront d'établir des analyses statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux proviennent d’un éleveur agréé .Une periode d'acclimatation de 7 jours est prévue suite à leur réception, L’hébergement est assuré en cages enrichies (nid végétal et/ou bûchettes) à raison de 5 animaux par cage conformément à la réglementation mais d'éventuels désagréments observés au cours du projet et inhérents à la promiscuité avec les autres animaux pourront nous conduire à réduire ce nombre. Pour assurer le bien-être des animaux et éviter de les stresser, l'injection de cellules sous la peau se fera sous anesthésie légère. Les animaux seront sous surveillance avec un accès facilité à la nourriture et à l'eau. Une surveillance quotidienne sera exercée pour s’assurer du bon état général des animaux. Le personnel de zootechnie est formé à l’observation des animaux et tout signe de mal-être est immédiatement signalé au responsable du projet qui prendra la décision sur leur devenir, en accord avec le vétérinaire référent si nécessaire. Les souris seront suivies 3 fois par semaine par un score clinique.

Choix des espèces

Nous avons choisi dans notre modèle d'étude des souris sans thymus dites athymiques. Ces souris présentent une immunodéficience qui limite le risque de rejet de la greffe des cellules humaines. Pour maximiser nos chances de prise de greffe nous avons choisi de faire notre étude sur des souris de 7 semaines d'age lors de l'injection de cellules cancéreuses humaines, elles auront au moins 13 semaines lorsqu'on débutera l'administration des traitements. Notre choix est fondé sur les données bibliographiques des études cancérologiques.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage cinq jours sur sept pendant vingt-deux jours et une inflammation cutanée provoquée aux oreilles sous anesthésies répétées, le gavage répété pouvant enflammer la trachée et entraîner une perte de poids. Le projet cherche à comprendre le mécanisme par lequel deux bactéries intestinales réduisent une inflammation de type psoriasis. Le porteur affirme qu'aucun test in vitro n'intègre la réaction immunitaire de la peau et des organes associés.

Objectifs

Les maladies inflammatoires cutanées type dermatite atopique, psoriasis et eczema allergique de contact, touchent une trés forte proportion de la population (plus de 20%). Il est largement admis que le microbiote intestinal joue un rôle important dans les maladies allergiques. L’hypothèse de l’axe « intestin-peau » a été proposé et un mécanisme entre eux a été progressivement démontrés. Les probiotiques contribuent à l’amélioration de l’environnement intestinal, l’équilibre des réponses immunitaires et la régulation du métabolisme. La plupart des études suggèrent que les suppléments probiotiques peuvent être une alternative pour la prévention et le traitement notamment de la dermatite atopique. Une premiere expérience a été menée dans divers modèle d'inflammation cutanée (psoriasis, dermatite atopique et eczema allergique de contact). Les résultats de cette premiere étude ont montré, dans le psoriasis, une diminution de la réponse clinique de l'ordre de 30% aprés traitement avec ces bactéries par rapport à des animaux traités uniquement avec le véhicule. Cette nouvelle étude dans le psoriasis aura pour but de mieux comprendre la mécanistique anti inflammatoire de ces bactéries intestinales dans le psoriasis.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser et de comprendre le mécanismes par lequel des bactéries intestinales sont capables de réguler une inflammation cutanée de type psoriasis, et à long terme de permettre le developpement d'un nouveau traitement probiotique chez l'homme pour améliorer cette pathologie.

Procédures

Le traitement à base de bactéries intestinales sera réalisée par gavage sur animaux vigile. Il sera réalisé 5 fois par semaine pendant 22 jours (durée 30sec). L'application du composés servant à induire l' inflammation, sera appliquée sur les oreilles des animaux sous anesthésie pendant 30min. Pour cela, les animaux seront anesthesiés 3 jours consécutifs sur 2 semaines consécutives (6 injections =30sec). Le traitement utilisé en control sera appliqué sur l'oreille des souris 6h aprés l'application du composé utilisé pour généré l'inflammation, et sur des souris anesthésiés pendant 30secondes. La mesure de la réponse clinique (mesure de l'epaisseur de l'oreille) sera réalisée sous anesthésie 5jours/7 pendant 30secondes. les animaux seront pesé une fois par semaine.

Impact sur les animaux

Le gavage répétée 5j/7 et répété sur plusieurs semaines pourrais induire une inflammation de la trachée et donc une perte de poids. Le modèls de psoriasis est bien connus et est utilisé dans l'equipe quotidiennement, celui çi engendre une inflammation legère au niveau de l'oreille qui ne gènent pas la souris et ne gènere pas de grattage. Les souris seront regulierement anesthesiées (5j/7) durant plusieurs semaines ce qui peux génerer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude afin de récuperer les organes ce qui permettra de meiux comprendre les mécanismes anti inflammatoires des deux bactéries testées

Remplacement

Aucun test in vitro ne permet d’intégrer la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés dans leur ensemble dans le cadre de cette pathologie. Celle-ci ne peut donc être conduite qu’in vivo.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Une seule dose de bactérie sera testée, celle çi ayant deja été validé dans une précedente procédure et pour une autre pathologie.

Raffinement

Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédure expérimentale. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceuxci. Dans le cas où des animaux perdrait du poids, des aliments réhydratées seraient disposé dans la cage. Pour les gavages, des sondes gastriques souples reconnus pour etre moins irritante pour les animaux seront utilisés et les gavages seront réalisés par une personne expérimentée ayant déjà réalisé des gavages répétés.

Choix des espèces

L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique telle que l’allergie et autre inflammation cutanée en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris entrent dans les procédures à 7-25 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.

1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis jusqu'à huit injections d'un complexe métallique dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie, avec un suivi par imagerie, le traitement pouvant provoquer des lésions d'organes et des ulcères tumoraux. Le projet évalue la biodistribution et l'efficacité antitumorale de complexes métalliques présentés comme des alternatives aux sels de platine. Le porteur indique avoir écarté in vitro les formulations les moins prometteuses et décrit la souris comme le meilleur modèle.

Objectifs

L'élaboration de nouvelles/meilleures stratégies thérapeutiques pour lutter contre le cancer et les maladies infectieuses semble être aujourd’hui nécessaire. En effet, la plupart des chimiothérapies induisent des effets indésirables importants et certains traitements impliquent un très mauvais pronostic. La mise en place de traitements thérapeutiques alternatifs est donc un enjeu majeur. L'un des médicaments les plus fréquemment utilisés contre le cancer est un complexe de platine. Ce complexe métallique présente plusieurs inconvénients importants dont celui d’induire des effets secondaires graves. La recherche s’oriente donc vers d’autres complexes métalliques actuellement en essai clinique, comme les complexes de ruthénium ou d’osmium, qui sont devenus des acteurs de premier choix en montrant des résultats extrêmement prometteurs. Cependant la chimiothérapie est un traitement médicamenteux qui s’administre par voie générale, ce qui présente deux principaux inconvénients : - une toxicité sur les cellules non cancéreuses ; - une élimination rapide des molécules donc un effet limité dans le temps. Pour pallier ceci, des formulations galéniques peuvent être utilisées afin d’augmenter la durée d’action des chimiothérapies et de réduire les effets secondaires associés, en ciblant plus spécifiquement les cellules cancéreuses. Ce projet propose d’étudier l’effet de nouveaux complexes métalliques (« principes actifs ») ainsi que l’effet de la formulation (« forme gallénique ») de ces complexes sur leur biodistribution et leur efficacité in vivo (effet antitumoral sur modèles de tumeurs pulmonaires, ovariennes, colorectales, cérébrales ou mammaires) en comparaison aux traitements standards actuellement utilisés. Le but étant de tester in vivo ces complexes qui ont été sélectionnés in vitro sur leur spécificité d’action contre les cellules tumorales et leur importante biodistribution. Enfin, ce projet propose également d’étudier les mécanismes immunitaires induits par la mort des cellules traitées par les complexes métalliques et responsables de la réduction des tailles de tumeurs. La recherche de ce projet sera donc centré sur la mort cellulaire par immunologie qui est le mécanisme clef dans l’effet des chimiothérapies sur la réduction des métastases et des tumeurs distales.

Bénéfices attendus

Les traitements chimiothérapiques actuels présentent une totoxicité et une faible spécificité ayant pour concéquence des effets secondaires graves, ce qui limite leur utilisation et entraine de mauvais pronostics. Il est donc indispensable de trouver des complexes métalliques présentant de meilleures totoxicités, ciblées plus spécifiquement vers les cellules cancéreuses, en proposant des formes galéniques innovantes. Le principal bénéfice de ce projet est de proposer de nouveaux complexes métalliques plus performants (haute toxicité préalablement identifiée sur culture cellulaire), ayant un temps de demi-vie rallongé et ciblant plus spécifiquement les cellules cancéreuses et donc qui présentent une efficacité augmentée sur la réduction des croissances tumorales tout en induisant moins d’effets indésirables. L’objectif de cette étude est de déterminer l’activité antitumorale de ces complexes sur des modèles de tumeurs colorectales, mammaires, ovariennes, cérébrales ou pulmonaires, toutes associées à la luciférase (qui permet une bioimagerie non invasive). Enfin, ce projet propose également d’étudier l’immunité induite par la mort cellulaire immunogénique. Cette immunité qui est induite par certains processus de mort cellulaire résultant du traitement chimio-thérapeutique, permet la mise en place d’une mémoire immunitaire in vivo qui entraine un cercle vertueux de mort des cellules tumorales et donc limite les rechutes et les métastases. Ce projet propose donc d’étudier le potentiel d’induction de la mort cellulaire immunogénique par les complexes métalliques étudiés, en utilisant un protocole récent et standardisé de vaccination. Pour résumer, l’étude des nouveaux complexes métalliques et de leur formulation permettrait la mise en place de traitements chimiothérapiques plus efficaces dans la réduction des tumeurs traitées, présentant moins d’effets secondaires indésirables et prévenant les rechutes et métastases.

Procédures

Pour étudier la biodistribution, les animaux recevront une implantation de tumeur ou une injection de cellules tumorales en sous-cutanée une seule fois. Cette injection est rapide et sans douleur. Puis 4 à 6 jours après cette implantation, les animaux recevront une dose unique de traitement en injection intraveineuse par le sinus rétro-orbital. Cette injection sera réalisée sous anesthésie générale et durera au maximum 6 minutes anesthésie comprise. Pour étudier l'efficacité, les animaux en rémission seront rechallengés par une injection de cellules tumorales en sous-cutanée. Les souris subiront 8 injections en rétro-orbitale de traitement au maximum (injection lundi, mardi, jeudi et vendredi pendant deux semaines). L’injection rétro-orbitale sera réalisée sous anesthésie générale et durera au maximum 6 minutes anesthésie comprise. Pour les souris receveuses de fragments, nous établirons un suivi à différents temps (à partir de J4 (temps minimum requis pour le début de croissance des fragments) et jusqu’à la fin de l’expérience (trois fois par semaine) et une imagerie non invasive de la croissance tumorale sera effectuée par imagerie optique sous anesthésie également 3 fois par semaine. Suivis par bioimagerie : les souris sont anesthésiées à l’isoflurane 5 minutes avant chaque temps d’imagerie puis placées dans l’appareil. L’acquisition de l’image ne dure que 10 minutes, soit une durée d’anesthésie totale de 15 min. Les souris sont ensuite placées en cages thermostatées pour leur phase de réveil (qui représente un risque d’hypothermie chez la souris)10 minutes puis replacées dans leur cage d’origine. Dans le cadre de l'étude de la mort cellulaire immunogénique, les animaux recevront une seule dose de vaccin sous cutané. Ils reçevront une injection de cellules tumorales au minimum et deux injections de cellules tumorales au maximum (pour les animaux en remission). Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé par imagerie de la bioluminescence in vivo sur souris sous anesthésie générale. Les souris sont anesthésiées à l’isoflurane 5 minutes avant chaque temps d’imagerie puis placées dans l’appareil. L’acquisition de l’image ne dure que 10 minutes, soit une durée d’anesthésie totale de 15 min. Les souris sont ensuite placées en cages thermostatées pour leur phase de réveil (évite l’’hypothermie) 10 minutes puis replacées dans leur cage.

Impact sur les animaux

L’injection des chimiothérapies peut entrainer une totoxicité donc des effets indésirables chez la souris. En effet, ces complexes présentent une totoxicité importante, principalement dirigé vers les cellules tumorales, mais les études préalable sur lignées cellulaires ne nous permet pas d’estimer la totoxicité sur l’ensemble des cellules saines. Le traitement peut donc entrainer des lésions dans certains organes engendrant plus ou moins d’effets indésirables en fonction de l’importance des lésions. L’implantation de tumeurs sous-cutanées ou de métastases par injection de cellules tumorales peut provoquer des douleurs (ulcères, lésions).

Devenir

Les études mettent à mort les animaux à la fin de l'expérimentation.

Remplacement

Nous avons préalablement évalué, par des expériences in vitro, la totoxicité et le potentiel dans l’induction de la mort cellulaire immunogénique de plusieurs formulations dans de nombreuses lignées cellulaires pour ne tester chez l’animal que les formulations les plus prometteuses.

Réduction

Les différentes expérimentations ont été consciencieusement pensées et élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Stratégie statistique : Pour les échantillons de faible taille, les tests non paramétriques sont les tests les plus appropriés. Le choix de ce test a été effectué selon anastat.fr. Le nombre d’animaux doit être de 5 souris par groupe pour les expériences qui présentent une faible variabilité comme la biodistribution. Cependant, pour l’étude de l’efficacité ou de la mort cellulaire immunogénique, nous nécessiterons l’utilisation de 10 souris par groupe car les expériences présentent une variabilité importante. Ce nombre est calculé selon notre expérience et en tenant compte de la variabilité inter-individuelle. De plus dans une demarche de réduction, les formulations ne donnant pas une pharmacocinétique favorable ne seront pas evaluées en procédure 2 ou 3.

Raffinement

Nous nous attacherons à réduire au maximum la souffrance des souris. Les procédures d’administration en rétro-orbitale seront réalisées sous anesthésie générale. Nous utiliserons l’imagerie optique, non invasive et non traumatisante, pour évaluer l’efficacité du traitement, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés au minimum. L’implantation des tumeurs, ainsi que l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale (isoflurane). Une grille d'évaluation de la douleur adaptée à ce projet a été élaborée pour surveiller l’état général de l’animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînera la mise a mort anticipée de l'animal. Chez la souris anesthésiée, tout signe de douleur (mouvement soudain, vocalisation) induira un arrêt de l'expérimentation, une analgésie (Buprénorphine) et une nouvelle induction de l’anesthésie dans une boite à l’isoflurane. Une surveillance trois fois par semaine sera assurée après les inductions de tumeurs. Après l’anesthésie, la souris sera placée dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération interventionnelle et post examen d’imagerie. Plus généralement, un animal peut être isolé de ses congénères s’il y a présence de blessures. Les blessures seront le cas échéant désinfectées à la vetedine (en deux étapes, pour une action netoyante puis désinfectante).

Choix des espèces

Pour l’étude de la biodistribution, de l’efficacité antitumorale et de la mort cellulaire immunogénique induite par les complexes métalliques, seul un système complexe tel que l’animal peut permettre de répondre à cette question. La souris est le meilleur modèle animal permettant d’étudier la biodistribution, la pharmacocinétique et l’efficacité antitumorale d’un complexe métallique. Ce modèle relativement petit est un ensemble de systèmes biologiques proches de ceux de l’humain, qui permet d’étudier assez précisément les effets antitumlorale mais surtout les effet indésirable potentiels d’une molécule. De plus, un protocole expérimental récent chez la souris permet une étude standardisée de la mort cellulaire immunogénique. Souris BALB/c ou C57BL/6 adultes de 8 semaines donc mature : bonne immunité, pas de tumeur spontanée dans ces lignées syngéniques.

Privées d'enrichissement physique dans leur cage pendant 12 semaines et mises à jeun 12 heures avant l'imagerie ou les tests, les souris reçoivent une injection intrapéritonéale chaque jour pendant 28 jours et passent des séances de TEP sous anesthésie de deux heures au plus. 240 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes. L'objectif est de mesurer l'effet de candidats antidépresseurs sur des souris que le porteur dit "rendues anxio-dépressives". Il classe l'induction de ce phénotype dépressif en "nuisance légère" sans dire comment il l'obtient, et ne nomme pas les tests de cinq minutes censés mesurer la dépression et l'anxiété.

Objectifs

Même si les antidépresseurs actuels sont des traitements efficaces, ces thérapies peuvent encore être améliorées pour réduire en particulier le risque de rechute ou encore la fraction de patients qui demeurent non répondeurs et pour qui le risque de suicide est très important. La compréhension des mécanismes exacts par lequel les antidépresseurs agissent ainsi que le test de nouvelles molécules sont donc d'une importance majeure. L’objectif de ce projet préclinique est de mesurer les effets de différents antidépresseurs (candidat médicaments) par une approche d’imagerie non-invasive, la tomographie par émission de positons (TEP), chez un modèle murin de dépression. En effet, l’imagerie TEP offre la possibilité d’explorer in vivo les mécanismes moléculaires impliqués dans le fonctionnement cérébral qui, associés à des tests comportementaux, permettront de mieux caractériser ces mécanismes, impliqués chez des animaux modèles d'anxiété-dépression.

Bénéfices attendus

Cette étude examinera les mécanismes moléculaires associés à des mesures comportementales impliqués dans le fonctionnement cérébral de type anxiolytic-antidépressif de différents candidats médicaments chez des souris rendues anxio-dépressives. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles informations sur l’intérêt potentiel de l'utilisation de certains candidats médicaments pour le traitement de pathologies de type anxiété et dépression.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont les suivantes : • Réalisation de sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum) • Les rongeurs seront soumis à des tests comportementaux afin de mesurer l'activité motrice qui dure 30 minutes, la dépression qui dure 5 minutes et l’anxiété qui dure 5 minutes. • Mise à jeun 12h avant l’imagerie/test comportemental • Administration quotidienne d’un candidat médicament par injection intrapéritonéale (réalisée en 10 secondes) pendant 28 jours.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Induction d’un phénotype dépressif (considéré comme une nuisance légère) • Administration de médicaments par injection, ce qui induit une douleur suite à la piqure inférieure à 3 secondes. • Absence d’enrichissement physique dans les cages afin de favoriser le modèle d'anxiété-dépression (12 semaines), les enrichissements environnementaux de type sensoriel et social sont maintenus. • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue lors de l’examen d’imagerie. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre. • Stress possiblement induit par les tests de comportement mais tests réalisés sous étroite surveillance et interrompus en cas de stress trop important.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des études histologiques permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances modéliser in vitro ou in silico des pathologies de type anxiété et dépression n’est pas possible. Le recours à l’expérimentation animale est donc indispensable pour étudier ces pathologies et les altérations au niveau cérébral.

Réduction

L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisation des mêmes animaux tout au long de l'expérience. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique.

Raffinement

Les rongeurs seront hébergés par groupe. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins et par les expérimentateurs. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse, complétées par une anesthésie locale. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. En effet, cette espèce a été choisie puisqu'elle permet de modéliser la pathologie dépressive ainsi que d'évaluer les différents effets des médicaments testés. Les animaux seront des adultes âgés de 6-8 semaines au moment de la réception, comme nous sommes intéressés aux effets comportementaux à l'âge adulte.