Rongeurs

320 souris mdx, modèle de la myopathie de Duchenne, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à quinze séances de microlésions musculaires sur quatorze jours et jusqu'à dix-huit anesthésies, ainsi que des injections, pour provoquer une fibrose et tester une molécule stabilisant les vaisseaux. Le porteur affirme que le muscle lésé étant petit, la locomotion et le comportement ne sont pas affectés, la contention répétée restant une source de stress. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité d'analyser tissus et cellules, les cultures cellulaires ne suffisant pas selon lui.

Objectifs

Les myopathies dégénératives comme la myopathie de Duchenne induisent des lésions permanentes des fibres musculaires qui épuisent les capacités de régénération du muscle, entraînent une inflammation chronique et l'installation d'une fibrose conduisant à la perte de fonction de l'organe, et finalement à la mort de l'individu. Le projet vise à utiliser un modèle permettant l’installation d’une fibrose musculaire afin d’en étudier les mécanismes. Une deuxième procédure vise à étudier l’effet d’une molécule stabilisant les vaisseaux sanguins sur l’évolution de la pathologie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à améliorer les connaissances sur des myopathies dégénératives, et éventuellement, d’identifier de nouveaux processus biologiques comme cibles thérapeutiques potentielles.

Procédures

Contention pendant 6-10 secondes lors de l’anesthésie (18 anesthésies au maximum par individu). Injections intrapéritonéales de 5 secondes (5 au maximum par souris) sous anesthésie gazeuse Innjection intraveineuse de 30-45 secondes (1 au maximum par souris) sous anesthésie gazeuse Microlésions intramusculaires de 8-12 secondes (15 x 14 jours) sous anesthésie gazeuse

Impact sur les animaux

Le protocole de microlésions induit une perte de force du muscle traité uniquement. Ce muscle étant petit et le seul traité de toute la patte, la locomotion et le comportement de l'animal ne sont pas affectés. La contention en vue des anesthésies multiples engendre un stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de préèvement des muscles.

Remplacement

Des analyses in vitro, utilisant des cultures cellulaires sont déjà réalisées afin d’établir une évidence des processus biologiques. Afin de démontrer la pertinence des résultats, l'analyse des tissus ou des cellules de l’animal est indispensable.

Réduction

Le même animal est utilisé pour plusieurs analyses. Les deux pattes de l'animal sont traitées afin de réduire le nombre d'animaux par deux.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans les conditions standard. Ils bénéficient de l’anesthésie générale lors de l'entièreté des manipulations afin d'éviter le stress des injections. Malgré une survenue très peu probable d’évènements indésirables, une surveillance est réalisée pendant toute la procédure et en particulier après les anesthésies, afin de prendre les mesures appropriées selon des points limites définis.

Choix des espèces

La souris mdx est un des modèles disponibles de la myopathie de Duchenne qui mime la plupart des aspects cellulaires et tissulaires de la pathologie. Deux lignées permettant l'analyse d'un gène dans les cellules immunitaires dans cette souris mdx seront utilisées. Les animaux sont utilisés à partir de 8 semaines, c’est-à-dire à l’âge adulte, au stade chronique de la pathologie. Les animaux utilisés sont des mâles car cette pathologie ne touche que les garçons.

1 182 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, cette autorisation ne couvrant que les séances d'IRM, à l'issue desquelles les animaux repartent dans un autre établissement pour la suite du projet. Porteurs de tumeurs cérébrales greffées et irradiés dans le cadre d'autres procédures, ils subissent ici des examens d'IRM répétés sous anesthésie, jusqu'à huit sessions sur un an, pour suivre les effets d'une radiothérapie à mini-faisceaux. Le porteur décrit l'IRM comme non invasive, les effets attendus se limitant à l'anesthésie et à une légère perte de poids. Il présente le suivi longitudinal d'un même animal comme une réduction du nombre d'individus et juge le recours au modèle animal "indispensable".

Objectifs

Le principal défi de la radiothérapie est de parvenir à déposer une dose curative dans la tumeur tout en s’assurant que les tissus sains environnants soient préservés dans leur intégrité. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Le but de ce projet est d’utiliser l’IRM (Imagerie par Résonance Magnétique, technique non invasive et atraumatique utilisée en clinique chez l’homme) chez le modèle rongeur pour étudier le mode de fonctionnement et les conséquences morphologiques de nouveaux modes d’irradiation, et notamment la Radiothérapie avec Mini-Faisceaux (MBRT).

Bénéfices attendus

La radiothérapie avec mini-faisceaux (MBRT) étant une technique novatrice, il est primordial de très bien comprendre les mécanismes microscopiques et macroscopiques intervenant lors de son utilisation, pour pouvoir optimiser les conditions d’utilisation : pour ce faire, la réaction de différentes lignées de cellules cancéreuses plus ou moins agressives doit être étudiées et ce, avec différentes géométries et puissances de faisceaux. Par le suivi IRM des animaux implantés (différentes lignées cancéreuses) et irradiés (différentes conditions d’irradiations), nous espérons pouvoir établir les meilleures conditions de MBRT en vue d’applications futures en clinique.

Procédures

Pour les sessions d’ IRM (objet de la présente DAP) permettant de suivre les effets de la radiothérapie, les animaux recevront une anesthésie gazeuse. Ce suivi sera d’un an maximum et comportera une session IRM à plusieurs moments après irradiation (2, 7, 14, 21, 30, 40 jours, 3 et 6 mois après irradiation). Chaque session IRM n’excédera pas 1 heure.

Impact sur les animaux

L’examen IRM étant une modalité de neuroimagerie totalement non-invasive et non-irradiante, les potentiels effets indésirables sont liés au fait que l’examen est réalisé sous anesthésie générale légère. Afin de vérifier que cette dernière n’a pas d’effet néfaste sur la respiration du sujet anesthésié, la fréquence respiratoire est surveillée en permanence tout au long de l’examen. Il est également possible d’observer une légère perte de poids le lendemain de l’examen, suite au stress potentiellement induit par la combinaison transport/examen entre les deux animaleries.

Devenir

Après l’examen IRM, tous les animaux retourneront dans l’autre établissement utilisateur pour continuer le projet (utilisation continue).

Remplacement

Nous désirons valider un potentiel nouveau mode de traitement par radiothérapie dans le cadre du cancer du cerveau. Pour évaluer l’efficacité de la technique, nous allons étudier la préservation des tissus sains environnants de la tumeur et contrôler la croissance des tumeurs irradiées. Les mécanismes biologiques activés impliquent très probablement des effets vasculaires et immunologiques. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux. En effet, une culture in vitro de tissus ne permettrait pas d’apprécier l’effet des traitements, ni un modèle in silico.

Réduction

L’IRM permettant un suivi longitudinal des animaux, et chaque animal étant observé à 8 stades différents, nous utiliserons 8 fois moins d’animaux que par une méthode classique d’histologie. Le nombre d’animaux (1182 rats au total) a été statistiquement défini pour permettre l’obtention de résultats fiables avec le moins d’animaux possible. Une analyse de puissance a été effectuée comme décrite et validée par le projet précédent.

Raffinement

Que ce soit durant leur transport sur le lieu de l’examen IRM, ou lors de l’examen lui-même, une grande attention est apportée au bien-être des animaux, et tout est mis en œuvre pour éviter les sources potentielles de stress. Transports : Les animaux sont transportés dans leur boîte habituelle (enrichie), avec leurs partenaires habituels et manipulés par les personnes assurant leur suivi quotidien. Les boîtes sont protégées du froid ou du chaud éventuel. Manipulations/anesthésie avant/après examen IRM : Ces actes sont réalisés par les personnes qualifiées assurant le suivi quotidien des animaux. Examen IRM : Il est réalisé sous anesthésie, dans un berceau chauffé uniquement dédié à ces animaux, avec contrôle de la respiration et de la température. Manipulations après examen IRM : Le réveil naturel de l’animal se fait au calme en cage individuelle sur un matelas chauffant. Lors de l’examen IRM, si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal est mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. Par ailleurs, le temps de l’examen IRM a été réduit à son minimum. En dehors des sessions d’examen IRM, une grille de scoring et des points limites ont été définis pour suivre le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiations proposées dans le cadre des procédures expérimentales que celle des souris. De nombreux articles ont déjà été déposés avec le modèle « rat », nous poursuivons donc nos études avec ce modèle. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'ablation chirurgicale d'un ou plusieurs dépôts de graisse (lipectomie) sous anesthésie et deux prises de sang, pour étudier le rôle du tissu adipeux dans le vieillissement musculaire. Le porteur fixe comme point limite une perte de poids rapide de 20 %, seuil déclenchant la mise à mort des animaux qui se dégradent. Il qualifie le recours à l'animal d'"indispensable" pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Ainsi, le tissu adipeux blanc (TA), dont les fonctions endocrines vis-à-vis du muscle squelettique sont déjà établies, est très précocement affecté au cours du vieillissement. Il subit un remodelage important avec l’âge et il a récemment été montré qu’un vieillissement accéléré spécifique à l’adipocyte (type cellulaire majoritaire du tissu adipeux) pouvait mener à une perte de fonction musculaire in vivo, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, très peu d’attention a été portée jusqu’ici aux métabolites, petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence que ce sont plus d’une centaine de métabolites qui sont différentiellement produits par le TA avec l’âge. Compte tenu de leur rôle crucial - sur le métabolisme lui-même mais aussi sur des processus plus généraux tels que la sénescence ou le stress oxydant - une dérégulation des métabolites de l’axe TA-muscle avec l’âge pourrait participer au développement du processus sarcopénique. Dans ce contexte, l’objectif du projet proposé est de démontrer que le tissu adipeux blanc (TA) participe au maintien du métabolome (ensemble des métabolites) circulant et musculaire chez un sujet jeune et que la dérégulation de ce tissu au cours du vieillissement contribue à l’altération profonde du métabolome circulant et musculaire rapportée avec l’âge. Dans ce but, nous réaliserons des lipectomies (résection des dépôts adipeux situés au niveau souscutané et viscéral) chez des animaux jeunes et âgées afin d'étudier l’implication de ce tissu dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de caractériser l’implication du tissu adipeux blanc (TA) dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement. Le vieillissement du TA ayant un impact négatif sur le fonctionnement musculaire, l’identification d’un pool de métabolites dérégulés avec l’âge appartenant à l’axe TA-muscle devrait nous permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques d’intérêt à exploiter pour lutter contre la sarcopénie liée à l’âge.

Procédures

Les souris seront soumises à des prises de sang à la veine de la queue (2 fois au total), leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive grâce à un système RMN et elles subiront une chirurgie (30 minutes d’intervention environ) sous anesthésie et traitement analgésique afin de leur retirer un ou plusieurs dépôts adipeux.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - stress des animaux au moment de leur réception (une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée) - perte de poids et douleur à court terme consécutives à la chirurgie (une administration d’analgésique sera effectuée lors de la chirurgie et un suivi post-opératoire quotidien sera mis en place pour s’assurer de la bonne récupération des animaux) - isolement/individualisation des animaux en cas d'agressivité (enrichissement des cages)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.

Remplacement

Notre projet consiste à étudier la communication entre différents tissus (tissu adipeux et muscles squelettiques) via de petites molécules organiques, les métabolites. Bien qu'un volet de notre projet ait déjà été réalisé sur des cellules cultivées, aucune technique de remplacement du modèle animal n’existe à ce jour. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme entier impliquant des échanges de métabolites entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.

Réduction

Au regard de la bibliographie, 10 souris par condition sont classiquement utilisées pour des études de métabolomique sur tissus de rongeurs. Les tissus prélevés seront utilisés non seulement pour étudier le métabolome au sein des tissus mais aussi pour des analyses d'expression de gènes, de protéines et des analyses biochimiques (mesures d’activités enzymatiques). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré aux animaux afin d’éviter la perte de poids et les douleurs. Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours pendant 7 jours suite à la chirurgie puis 2 fois par semaine par la suite, ce qui permettra de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Les points limites sont : perte de poids rapide (20% en quelques jours), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté, comme indiquant un état de souffrance. De plus le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage. Nous enrichirons également l’environnement de toutes les souris de façon à favoriser leur bien-être.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). De plus, c’est un modèle pour lequel nous avons une expertise depuis de nombreuses années dans l'équipe. Pour cette étude, nous utiliserons des souris C57BL/6J de différents âges (3-6 mois pour les souris « jeunes » et 18-24 mois pour les souris « âgées ») afin de caractériser la contribution du TA dans la régulation du métabolome circulant et musculaire au cours du vieillissement.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une restriction alimentaire destinée à les motiver, des tests d'impulsivité de choix, des injections intrapéritonéales deux fois par semaine et des prélèvements sanguins sur animal vigile, pour évaluer trois candidats médicaments. Le porteur décrit un design où chaque rat est son propre témoin et teste les trois composés, présenté comme une réduction du nombre d'animaux. Il rattache le projet à une phase préclinique, une entrée en clinique restant conditionnée à des résultats positifs.

Objectifs

La prise de décision fait partie intégrante de notre quotidien. Un déficit connu de la prise de décision se traduit par des troubles de l'impulsivité. Cette dernière se traduit par une impossibilité à retarder le début d'une action, qui commencera donc de manière prématurée, c'est alors une impulsivité d'action. Il existe également une autre forme d'impulsivité, appelée impulsivité de choix. Il existe différentes tâches comportementales pour étudier cette forme d'impulsivité. Dans ces tâches, les animaux doivent choisir entre 2 ou plusieurs options ayant des rapports coûts/bénéfices différents. Dans ce projet, nous souhaitons tester l'effet potentiel modulateur de 3 candidats médicaments sur l'impulsivité de choix chez le rat.

Bénéfices attendus

Le projet s'intégrè dans la phase pré-clinique du développement de candidat médicaments. En cas de résultats positifs, le ou les candidats médicaments retenus pourront, à terme, entrer dans des études cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tests comportementaux ainsi qu'a des injections intrapéritonéales 2 fois par semaine. Les tests comportementaux seront rapides et se dérouleront pendant 4 semaines. A la suite des injections des candidats médicaments, les animaux, vigiles, seront également soumis à un prélèvement sanguin. De plus, à la fin de chaque protocole, les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Le traitement bi hebdomadaire des animaux par injection intrapéritonéale peut induire un stress, particulièrement lors des 1ères administrations. Ces injections peuvent également indurie une légère douleur. De plus, les tests comportementaux peuvent induire une nuisance chez les animaux, notamment à cause de la restriction alimentaire afin d'augmenter leur motivation à réaliser la tâche. Enfin les prélèvements sanguins, bien que réalisés par du personnel compétent et entrainé, pourront aussi entrainer une douleur légère chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de collecter le cerveau pour des analyses histologiques.

Remplacement

Les processus physiopathologiques de l'impulsivité impliquent l'interaction de différentes structures cérébrales. Les composés médicaments sont supposés agir sur des structures cérébrales précises. Ce degrè de compléxité et la validation du site d'action ne peuvent être atteints qu'avec un modèle animal. Le rat possèdant un système cérébral complexe, présentant des similitudes avec le système nerveux humain, en particulier dans le domaine de la prise de décision et de l'impulsivité, est donc un bon modèle pour notre sujet d'étude. De plus, les 1ères phases de validation des composés, de leur non toxicité ont été réalisées au sein du laboratoire de notre partenaire.

Réduction

En se basant sur la littérature scientifique et sur l'expertise de notre équipe en terme d'études comportementales, le nombre de rats (n=24 par expérience, n=8 par sous-groupe) a été optimisé afin d'avoir un groupe d'animaux suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, le design expérimental choisi permet de réduire le nombre d'animaux utilisés puisque chaque rat sera son propre contrôle et testera les 3 candidats médicaments. Les 3 sous-groupes correspondent chacun à un ordre d'administration des candidats médicaments différents, afin d'éviter tout biais d'ordre. De plus, nous avons choisi de réaliser des tests statistiques de type régression linéaire multiple pour nos sorties comportementales de type temps de réaction, temps de mouvement (variable réponse numérique continu) ,ou de type modèle linéaire généralisé pour les paramètres comportementaux type nombre d'appui sur le levier, de réponses prématurées, d'entrée dans la mangeoire (variable réponse de type comptage) afin d'avoir une puissance statistique plus important et donc de pouvoir réduire notre nombre d'animaux.

Raffinement

Les animaux auront une période d'acclimatation à l'animalerie ainsi qu'aux expérimentateurs (par manipulation quotidienne) avant le début des expérimentations afin de réduire au maximum le stress potentiel. De plus, des stratégies d'analgésie et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (poids) seront mis en place afin de veiller au mieux au bien-être des animaux durant toute la durée du projet. Une grille de score pour le suivi du bien-être des animaux sera utilisée pour surveiller au mieux les animaux et prendre les décision les plus adaptées sans attendre. La souffrance des animaux sera limitée au maximum par une surveillance quotidienne. Dans le cas où les animaux atteindraient des points limites définis ou si le traitement analgésique n'était pas efficace, l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Le rat possède un système cérébral complexe, présentant des similitudes avec le système nerveux humain, en particulier dans le domaine de la prise de décision et de l'impulsivité. De nombreuses études ont déja été menées en neurosciences dans ce domaine là utilisant des modèles rongeurs. De plus, de part l'expertise de notre équipe, nous sommes en mesure de développer un modèle d'impulsivité fiable chez cette espèce. Nous disposons également de tout le matériel nécessaires à la manipulation et aux soins de ce type de rongeur. Nous utiliserons des rats jeunes adultes pour ce projet. Les animaux seront commandés à environ 10 semaines d'âge. Cet age correspond à l'age classiquement utilisé dans les études qui nous interessent et correspond à un stade de développement cérébral permettant de répondre à notre problématique scientifique. Après leur arrivée, les animaux auront 1 semaine d'acclimation. Ainsi, les rats auront 11 semaines au début des tests.

54 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une implantation sous-cutanée de gel sous anesthésie puis jusqu'à 35 séances d'imagerie sous anesthésie en 28 jours, pour suivre la libération d'un anticorps et la dégradation du gel. Le porteur indique que l'accumulation de contentions, d'anesthésies et d'injections entraîne une nuisance globale modérée. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace le modèle animal pour reproduire la complexité de l'environnement sous-cutané, l'objectif restant une preuve de concept à visée de confort des patients.

Objectifs

L'utilisation pharmaceutique de protéines thérapeutiques telles que les anticorps a augmenté au cours des dernières années. Ces actifs sont principalement administrés par voie intraveineuse (i.v.) conduisant fréquemment à une élimination trop rapide. Ceci entraine le besoin d’administrations régulières qui limitent la qualité de vie des patients et augmentent le coût global des traitements. Ces dernières années, l'administration sous-cutanée (SC) a attiré beaucoup d’attention car elle présente de nombreux avantages. Elle est en effet plus pratique, plus rapide, plus économique et plus facile à administrer que l'administration intraveineuse (i.v.). D’autre part, afin de limiter le nombre d’administrations, les efforts se sont tournés vers le développement de formulations permettant la libération prolongée des actifs thérapeutiques. Au cours des dernières décennies, les gels injectables sont apparus comme des matériaux prometteurs offrant une capacité de chargement élevée d'une large gamme d'agents thérapeutiques. Différents gels ont été développés dans la littérature mais certains présentent des limites. Il existe donc toujours un besoin de développer de nouveaux systèmes de délivrance de protéines thérapeutiques. Nous avons récemment formulé une famille de gels qui peut être chargé avec différents actifs thérapeutiques. L’objectif de ce projet est d’établir une preuve de concept de l’intérêt de ces gels pour la délivrance prolongée d’anticorps après administration sous-cutanée. Le but est d’évaluer sur souris saine la biodégradation des gels après implantation ainsi que la libération prolongée de l’anticorps par imagerie en fluorescence.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’établir une preuve de concept de l’intérêt des gels développés et de sélectionner des formulations prometteuses pour une libération contrôlée et prolongée d’un anticorps thérapeutique. L’objectif à long terme de ce projet est de proposer un système de délivrance de protéines thérapeutiques implantable en sous-cutané afin d’améliorer le confort de vie des patients tout en réduisant le coût global des traitements.

Procédures

Contention lors des déplacements (

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir plusieurs gestes tel que des contentions, des anesthésies, des injections sous-cutanées qui vont engendrer des douleurs et du stress et dont l’accumulation entraînera une nuisance globale modérée sur les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour permettre des analyses ex vivo nécessaires.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour remplacer le présent projet. Des études in vitro ont déjà été réalisées mais ne permettent pas de reproduire toutes les conditions représentant la complexité d'un environnement sous-cutané. Le modèle animal est donc nécessaire pour évaluer la libération sous-cutanée des actifs piégés dans les gels ainsi que la biodistribution des gels dans le temps. Ces études auront lieu uniquement sur souris saines.

Réduction

L’emploi d'un système d'imagerie du petit animal permet un suivi dans le temps pour chaque animal et permet ainsi de réduire le nombre d’animal pour le projet. Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe pour maintenir une interaction entre individus dans des cages enrichies. Les souris ont accès librement à la nourriture et à l'eau. Le protocole expérimental prend en compte l’impact sur le stress et la souffrance animale et différents critères ont été établis pour éviter toute souffrance et stress animal. Les imageries , administrations sous-cutanée et la mise à mort sont réalisées sous anesthésie pour réduire le stress. Après administration : suivi quotidien des animaux, avec mesure du poids lors des séances d’imagerie afin de minimiser le stress et la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec des souris pour lesquelles de nombreux protocoles sont bien établis et pour lesquelles, des études concernant l’administration d’hydrogels ou d’anticorps ont été décrites. Les souris utilisées n'auront pas de pelage qui interfèrerait avec les mesures d’imagerie optique in vivo. Seules des souris femelles (9-11 semaine en début de procédure) seront utilisées dans cette étude.

170 souris et 170 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés d'une séance à l'autre puis destinés à d'autres travaux pratiques, dont des procédures sans réveil. Des étudiants novices leur infligent à répétition des contentions, des injections sous-cutanées et des sondages gastriques, chaque animal pouvant être manipulé jusqu'à quatre fois. Le porteur classe ces gestes comme individuellement légers mais reconnaît que leur répétition par des débutants peut les porter à un niveau modéré. Il justifie l'usage d'animaux vivants par la formation réglementaire de futurs techniciens en expérimentation animale, qualification décrite comme recherchée dans son bassin d'emploi.

Objectifs

Durant leurs études, nos étudiants suivent une formation qui qualifie le personnel appliquant des procédures expérimentales aux animaux (niveau II/A), spécifique aux modèles rongeurs. Cette formation réglementaire nous permet de former des techniciens qualifiés en expérimentation animale, qualification très appréciée et recherchée dans notre bassin d’emploi. Le programme de la formation inclut l’acquisition de diverses compétences théoriques et pratiques permettant la manipulation de rongeurs dans le respect de leur bien-être. La réalisation de la contention ainsi que l'exécution de quelques injections figurent parmi les toutes premières compétences à acquérir. Pour y parvenir, les travaux pratiques que nous souhaitons mettre en place permettront une familiarisation progressive des étudiants aux rongeurs et à ces techniques, en multipliant les supports pédagogiques. Les objectifs pédagogiques de ces séances sont multiples: -familiarisation des étudiants avec les rongeurs -sensibilisation au respect du bien-etre animal -apprentissage des règles d'hygiène et de sécurité propres à la pratique de l'expérimentation animale -connaissance du matériel nécessaire aux injections, préparation de ce matériel, notions d'asepsie -acquisition des compétences techniques de préhension, contention, injection sous-cutanée, sondage gastrique, injection intra-péritonéale.

Bénéfices attendus

Au cours d’une procédure expérimentale, le technicien doit être en mesure de limiter le degré de mal-être généréà l’animal, en apportant des réponses adéquates afin de restreindre celui-ci. Ceci nécessite un apprentissage rigoureux et méthode, réalisé durant des séances d'entrainement. Ce projet permettra à nos étudiants et futurs techniciens, par sa progressivité et la multiplicité des supports à nos étudiants, futurs techniciens d'acquérir les compétences de contention et d'injections courantes chez le rat et la souris tout en veillant à respecter leur bien-être.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections répétées. Par séance, chaque animal pourra être soumis à une injection sous-cutanée et un sondage gastrique. Cet animal sera réutilisé au minimum 48-72h après pour la même intervention mais nous veillerons alors à alterner les sites d'injection sous-cutanée. Le plus fréquemment, il s'écoulera au moins une semaine entre deux injections. Il pourra ainsi être réutilisé jusqu'à 4 fois mais, plusieurs promotions d'étudiants étant concernées, les périodes de travaux pratiques seront espacées parfois de plusieurs semaines avant que l'animal soit soumis à une nouvelle injection. Nous veillerons au suivi attentif des animaux et ne les réutiliserons qu'en absence de mal-être. Ainsi un meme animal sera soumis à, 1 injection sous-cutanée et 1 sondage gastrique sur 4h, ceci répété au maximum 3 fois espacées de 48 à 72h minimum courant novembre de chaque année puis 1 injection sous-cutanée et 1 sondage gastrique sur 4h, ceci répété au maximum 1 fois espacée de 48 à 72h minimum courant janvier et enfin 1 injection sous-cutanée et 1 sondage gastrique, ceci répété au maximum 1 fois espacée de 48 à 72h minimum courant mars (que ce soit 1 rat ou 1 souris)

Impact sur les animaux

Les actes pratiqués ici sont individuellement d’un degré de sévérité léger mais leur répétition (réutilisation des lots à plusieurs jours/semaines d'inrervalle pour réduire le nombre d'animaux utilisés), leur réalisation par des étudiants novices pourraient les classer dans un degré de sévérité modéré. Les effets indésirables possibles, qui seront recherchés et évalués à l'aide d'une grille de scoring et conduiront à la réalisation d'un traitement antalgique adapté, sont : - une perte de poids (évaluée en % et par jour), - un comportement inadapté (comportement des animaux sans intervention du manipulateur – contractions, boiteries des pattes antérieures, position antalgique, prostration - et en réponse au geste du manipulateur : agressivité ou passivité, retrait après toucher du point d'injection) - une déshydratation (détectée par l’apparence physique telle que yeux plissés, enfoncés, pli de peau moins élastique …), -un aspect physique altéré (aspect du site d'injection, poil hérissé, sale), -une hyperventilation

Devenir

L'ensemble des animaux du projet sera réutilisé dans des TP ayant fait l'objet d'une DAP.

Remplacement

Nous commençons l’apprentissage en visionnant des vidéos afin d'etre en mesure de mentaliser les procédures. Puis nous passons sur support non vivant (modèles plastiques et /ou cadavres de souris congelées le cas échéant, qui sont des souris de réforme euthanasiées au sein de laboratoires pharmaceutiques ou plateformes partenaires). Néanmoins les gestes doivent cependant être pratiqués sur rongeurs vigiles pour ces futurs techniciens en expérimentation animale. Nous utilisons un animal par étudiant lors des TP mais les animaux sont réemployés grace à une rotation espacant les séances et en veillant à leur bon rétablissement.

Réduction

.Nous recourons à une souris et un rat par étudiant, par séance. Nous estimons que l'emploi d'un animal pour 2 étudiants au cours d'une même séance serait préjudiciable à l'animal qui serait alors manipulé 6 fois au cours du TP soit 2 fois plus (pour mémoire un même animal est manipulé 3 fois lors du TP n° 2 : révision contention - injection sous cutanée - sondage gastrique). Par ailleurs il nous faudra former 9 groupes de 16 étudiants, mais nous n’aurons recours qu’à deux lots de 17 souris et 17 rats (dans chaque lot, un animal par étudiant + un animal pour l'enseignant faisant démonstration). La formation de ces 9 groupes n'aura pas lieu en meme temps : 3 groupes seront formés courant novembre, 3 autres groupes seront formés courant janvier et les 3 derniers seront formés courant mars. Ainsi les 2 lots de 17 animaux benéficieront de plusieurs semaines de repos complet à l'animalerie entre chaque formation. Après ces séances, les animaux pourront être réutilisés dans d’autres TP de notre établissement, correspondant à des procédures sans réveil (autres projets autorisés).

Raffinement

Les animaux sont systématiquement amenés en salle de TP une heure avant le début de la séance, afin de s’acclimater à ce nouvel environnement. Des recommandations sont données, rappelées aux étudiants à chaque séance afin que la manipulation ait lieu dans le calme. Après retour à l'animalerie, les zootechniciens surveilleront les animaux et leur bien-être quotidiennement à l’animalerie. Il est important qu’ils soient informés des actes réalisés sur les animaux durant les TP, de façon à connaître les douleurs potentiellement occasionnées. Une grille d’évaluation du bien-être des animaux est couramment employée pour ce type d’acte. Prenant en compte des critères objectifs, elle servira à adapter un traitement antalgique. Si le traitement n’aboutit à aucune amélioration (suite à évaluations plus fréquentes si une douleur a été détectée), l’euthanasie de l’animal sera réalisée après anesthésie (injection létale après anesthésie gazeuse).

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en expérimentation, il est donc logique que nous formions nos étudiants à la manipulation de ces animaux. Les actes de contention, sondage gastriques, sous-cutanées sont fréquemment réalisés chez ces espèces. Nous démarrerons avec de jeunes adultes plus faciles à manipuler pour des étudiants en phase d'apprentissage.