Rongeurs

696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses au flanc puis sept à vingt-huit injections dans la tumeur sur trois semaines, la tumeur pouvant croître jusqu'à un volume limite de 2 000 mm3 avec perte de poids et diarrhée possibles, avant la mise à mort et l'analyse. L'objectif est d'évaluer une cible thérapeutique censée renforcer l'immunothérapie du cancer colorectal. Le porteur affirme que ni les modèles mathématiques ni les systèmes in vitro ne reproduisent l'environnement d'une tumeur, et présente l'animal comme "indispensable".

Objectifs

L’immunothérapie a suscité un grand intérêt ces dernières années dans le traitement du cancer. La majorité des patients atteints de cancer colorectal ne tirent qu'un bénéfice limité d'un traitement par l’immunothérapie. L’identification de nouvelles pistes ou cibles pour augmenter la population qui répond à la thérapie et améliorer le potentiel de guérison sont deux objectifs urgents et importants pour optimiser l'efficacité antitumorale. L'objectif de cette recherche est d’évaluer le rôle d’une cible thérapeutique potentielle sur la croissance des tumeurs colorectales et sur des traitements par immunothérapie en combinaison avec une chimiothérapie classique ou d'autres éléments qui peuvent augmenter l’efficacité des traitements du cancer colorectal.

Bénéfices attendus

L'immunothérapie représente une approche révolutionnaire dans le traitement du cancer. Le bénéfice principal de ce projet est l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques optimisant l'efficacité de l’immunothérapie sur le cancer colorectal. Ce projet permet aussi de répondre à des questions fondamentales pour mieux comprendre l’interaction immunitaire entre des cellules cancéreuses et des cellulaires immunitaires.

Procédures

Procédure 1 : L’injection des cellules sur animaux par voie sous-cutanée au niveau du flanc de la souris sera effectuée une fois en quelques secondes pour chaque expérience. L’injection des médicaments par voie intra-tumorale de la souris sera effectuée entre 2 à 9 fois par semaine en quelques secondes selon des traitements pour maximum 3 semaines. Une souris subit entre 7 à 28 injections pendant toute l’expérience (durée totale entre 1 à 4 minutes). Un suivi de croissance tumorale sera effectué tous les 2-3 jours au pied à coulisse en quelque secondes pour maximum 3 semaines. Au total, une souris sera mesurée au maximum 9 fois (durée totale : moins de 1 minute). Les souris seront pesées 2 fois par semaine en quelque secondes pour maximum 3 semaines. Au total, une souris sera pesée au maximum 6 fois (durée totale : moins de 1 minute).

Impact sur les animaux

Les souris vont développer des cancers colorectaux sous cutanés et vont recevoir des traitements par des injections par voie sous-cutanée au niveau du flanc. Ces procédures peuvent provoquer une perte de poids, une baisse d'activité, un pelage ébouriffé et de la diarrhée, etc. Les injections sous-cutanées peuvent induire un certain stress.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des analyses post-mort seront fait sur des tumeurs ou des organes d'intérêt.

Remplacement

Des études réalisées in vitro ont permis de choisir la lignée cellulaire tumorale et un médicalement chimio-thérapeutique efficient pour les manipulations in vivo. Cependant, ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement physiologique auquel est soumis un cancer in vivo. L’emploi du modèle animal est indispensable afin d’évaluer l’influence d’une cible thérapeutique potentielle sur la croissance des tumeurs ou des traitements en présence d’un système immunitaire ainsi que d’un microenvironnement complet.

Réduction

Nous pratiquerons le minimum d'expériences sur le nombre minimal d'animaux pour chaque expérience, qui permettent à la fois d'être assuré de la reproductibilité des phénomènes observés et d’avoir la puissance statistique nécessaire en tenant compte de la variabilité expérimentale du modèle employé. Nous allons effectuer des tests statistiques pour analyser la croissance tumorale. Après chaque expérience, un logiciel spécial sera utilisé pour calculer la taille de l'échantillon d’après les données obtenues pour optimiser le nombre de souris à la puissance statistique nécessaire.

Raffinement

Une expérience pilote sera lancée d’abord pour maitriser les techniques et décider le nombre de cellules à injecter à chaque souris en fonction des conditions de l’animalerie de l’institut. Pour réduire le stress et l’angoisse des souris, de l’enrichissement sera ajouté dans chaque cage d’hébergement (coton et maison en carton). Une surveillance sera effectuée 1 à 2 fois par jour par les membres de ce projet ou le cas échéant par le personnel qualifié de l'animalerie afin de détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance de l’animal. La prise de greffe sera surveillée par des observations, des mesures de tumeur avec un pied à coulisse et des pesées régulières (tous les 2/3 jours). Lorsque la tumeur atteindra un volume estimé de 100mm3, la souris subira une injection de véhicule (PBS) ou des médicaments par injection intra-tumorale pour au maximum 3 semaines. Pour limiter au maximum la douleur et la souffrance associée au sepsis sévère et notamment lors de la fin de vie, Les souris seront mises à mort : 1) lorsque la tumeur atteindra la taille limite éthique (2000mm3) selon la formule volume = (Longueur x largeur^2)/2. 2) si la perte de poids dépasse 20% ou si les points limites sont >ou=6. Le poids de la tumeur sera calculé en fonction du volume : poids en kg = volume en m^3 x densité du tissu (1,04 pour colon) x 1000. La perte de poids sera calculée en prenant en compte le poids de la tumeur selon la formule : perte de poids relative = 1 - (poids actuel de la souris - poids de tumeur)/(poids de la souris avant le traitement). Les tumeurs ou certains organes peuvent être prélevés pour des analyses plus avancées.

Choix des espèces

La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins, la disponibilité des lignées cellulaire du cancer colorectal murin, des souches congéniques et transgéniques parfaitement définies faisant la souris un modèle de référence pour étudier des tumeurs consanguines ou des tumeurs se développent dans des animaux avec même contenu génétique et immunocompétents. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 12 semaines après la naissance) possédant un système immunitaire mature.

312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié subit une ablation des ovaires sous anesthésie pour reproduire la ménopause, toutes reçoivent une alimentation alternant régime standard et régime riche en gras, avec mesures de pression, tests de tolérance au glucose et à l'insuline par prélèvements à la queue et IRM, avant la mise à mort pour prélever les organes. L'objectif est d'étudier l'effet des estrogènes sur le développement d'un syndrome métabolique lors de variations cycliques de poids. Le porteur affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'évaluer l'interaction entre les différents organes concernés.

Objectifs

Le surpoids et l’obésité sont des problèmes de santé majeurs. Seules 20% des personnes en surpoids parviennent à une perte de poids durable, avec un risque de cycles répétés de perte et de reprise de poids. Ces variations cycliques du poids sont associées à des modifications de la pression artérielle, du rythme cardiaque et des fonctions rénales, responsables notamment du développement de diabète et de maladies rénales ou cardiovasculaires et induisant une augmentation de la mortalité, en particulier chez les femmes. Le surpoids et l’obésité chez les femmes post-ménopausées constituent des problèmes de santé publics importants. La carence en estrogène renforce le mauvais fonctionnement du métabolisme, prédisposant au développement d’un syndrome métabolique avec notamment le développement d’une obésité, d’une hypertension, d’un diabète de type 2… Récemment il est apparu le concept que notre organisme pourrait garder une mémoire de ces changements que l’on appelle « mémoire métabolique » et pourrait expliquer par exemple la difficulté plus grande de perte de poids après la ménopause. Ce projet a pour but d’évaluer l’impact de variations cycliques de poids sur le développement d’un syndrome métabolique et d’une mémoire métabolique dans des conditions pré et post-ménopauses.

Bénéfices attendus

A terme ce projet permettra d’identifier les mécanismes responsables des complications observées chez la femme ménopausée en réponse à des variations cycliques de poids et ouvrira des perspectives pour la mise en place de traitements ciblés.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une intervention chirurgicale d’une durée de 30 minutes environ. Pour la moitié des animaux au cours de cette intervention les ovaires seront retirés, pour l’autre moitié l’intervention sera la même mais les ovaires ne seront pas retirés. Les animaux recevront une alimentation standard ou une alternance d’alimentation standard et d’alimentation riche en gras. Pour cette intervention chirurgicale, deux injections sous-cutanées d’analgésiques (d’une durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, une en préopératoire (1h avant la chirurgie) et une en post-opératoires (24 heures après la chirurgie). Des mesures de pression artérielle sur souris vigile seront réalisées à la fin de chaque phase de chaque cycle uniquement pour un lot d’animaux (celui soumis à trois cycles de variations cycliques de régime alimentaire). Ces mesures, réalisées sur animal vigil dure environ 15 minutes. Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline. La réalisation de ces tests nécessite que les animaux soient à jeun pour une durée de 6 heures. Durant cette période ils auront accès à l’eau en continu. Une injection intra-péritonéale de glucose ou d’insuline sera réalisée (d’une durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection). Une petite incision sera réalisée au niveau de la queue afin de collecter le sang à différents temps après l’injection (15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 60 minutes, 90 minutes et 120 minutes). Chaque collecte de sang prend moins de 10 secondes. Une IRM non invasive sera réalisée, sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 20 minutes. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie profonde. L’injection du mélange anesthésique durera moins de 30 secondes. Le prélèvement de sang dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Il peut exister une douleur post-opératoire qui sera soulagée par des anti-douleurs ; un inconfort au point d’injection lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline ; un stress lié à la mesure de la pression artérielle.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes qui seront analysés par différentes approches.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable pour mener à bien ce projet. Il n’existe pas de modèle alternatif nous permettant d’évaluer l’interaction entre différents organes ou tissus comme le cœur, la glande surrénale et le tissu adipeux en réponse à des variations de l’apport en gras dans l’alimentation dans un contexte pré et post-ménopause.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste, L’ensemble du protocole a été conçu pour minimiser le nombre d’animaux, en tenant compte de l’exigence et des contraintes des tests statistiques utilisés. Notre habitude des actes expérimentaux envisagés nous permet de connaître le nombre d’animaux requis pour atteindre la puissance statistique nécessaire pour mettre en évidence une différence entre les groupes. Nous utiliserons des approches statistiques adaptée à la comparaison de quatre groupes de petite taille.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l’utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés pour les procédures et l’établissement de points limites adéquats. Les animaux seront élevés en cage enrichies avec eau et nourriture ad libitum dans l’animalerie où les conditions d’hébergement et d’élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris (hébergement dans des cages de 2 à 5 maximum ; enrichissement des cages avec des maisonnettes, des batônnets en bois et du coton ; nourriture et eau ad libitum, température contrôlée…). Une stratégie antalgique pré et post-opératoire sera mise en place. En pré-opératoire un anti-inflammatoire non stéroïdien (sera injecté 1h avant le début de la chirurgie. En post-opératoire les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil complet et recevront une nouvelle injection d’anti-inflammatoire non-stéroïdien 24h après la chirurgie. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les expérimentateurs confirmés pendant les 8 jours suivant la chirurgie, puis par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier l’effet de modifications de l’apport en gras dans l’alimentation. C’est également un modèle de choix qui est couramment utilisé pour étudier les effets de modifications hormonales telles que l’absence d’œstrogène, reproduisant des conditions post-ménopauses. Les animaux utilisés auront 8 semaines au début de la procédure. Il s’agit de jeunes adultes ayant atteint une maturité sexuelle. A la fin de l’expérimentation qui peut durer jusque 33 semaines, certains des animaux auront 41 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des animaux jeunes au début du protocole afin d’essayer de s’affranchir au maximum de l’effet vieillissement des animaux. Nous pourrons ainsi étudier indépendamment de l’effet vieillissement l’effet de la présence ou non des œstrogènes.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie et après une injection d'analgésique, elles reçoivent des cellules à l'interface de l'os et du muscle du fémur, dont la surface est grattée pour favoriser la prise de la tumeur, puis leur patte est mesurée au pied à coulisse avant une mise à mort au CO2. L'objectif est de vérifier si un type de cellules embryonnaires est à l'origine du sarcome d'Ewing, un cancer osseux de l'enfant. Le porteur affirme que la greffe dans des souris au système immunitaire actif reste un standard "indispensable" pour valider la transformation tumorale.

Objectifs

Les cancers touchent chaque année plus de 2500 enfants en France. On estime qu’un enfant sur 440 sera atteint par un cancer avant l’âge de 15 ans. Malgré des essais cliniques internationaux, leur taux de survie ne s’améliore plus depuis 30 ans. Il est donc indispensable de mieux comprendre les particularités du développement des cancers pour développer des traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet a pour objectif de déterminer si des cancers de l’os observés chez les enfants et les adolescents peuvent dériver d’une population des cellules étant à l’origine de différentes parties du corps (cellules embryonnaires). Cette question est importante, car la réponse aux chimiothérapies peut varier en fonction de la cellule à l’origine des tumeurs. Il a été montré que lorsqu’on exprime des gènes mutés chez les patients atteints par ces cancers de l’os, dans les cellules embryonnaires, celles-ci prolifèrent et expriment des marqueurs de ces cancers. Il faut maintenant vérifier que les cellules embryonnaires transformées donnent des tumeurs dans les os. Ce projet permettra de fournir de nouvelles pistes pour comprendre l’origine de ces cancers et améliorer leur traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de déterminer si un type de cellules embryonnaires peut être à l’origine de certains cancers pédiatriques afin d'améliorer leur prise en charge thérapeutique.

Procédures

L'injection des cellules en interface de l'os et le muscle au niveau du fémur sera effectuée apès une administration de buprénorphine en sous-cutanée 30 min avant intervention. Les animaux seront sous anesthésie pendant l'injection des cellules (max 5 min par animal). Le fémur sera gratté afin de raviver l'os et ainsi d'optimier la prise tumorale. Les animaux en état vigile seront pesée et les pattes seront mésurées par le pied à coulise pour évaluer la prise tumorale.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent présenter une réaction suite à l'injection des cellules ainsi qu'un problème de locomotion ou de mal être animal suite au développement tumoral. Cela n'a pas encore arrivé dans nos projets précédents. Par conséquent, les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux, toutefois les animaux seront surveillés 3x/semaine.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure par CO2.

Remplacement

Le modèle murin proposé est le plus adapté car les cellules utilisées sont issues de la crête neurale de la même souche ce qui fait limiter le rejet de greffe. Par ailleurs, l'utilisation de ce système intégré permet de prendre en compte de nombreux facteurs physiologiques susceptibles d’interagir avec les cellules greffées. Le test de greffe dans des souris avec le système immunitaire reste un standard indispensable pour valider la transformation tumorale, surtout avec les lignées de crêtes neurales utilisées, qui possèdent des capacités de croissance clonale in vitro. Cette croissance clonale in vitro de ces lignées ainsi que des lignées transformées pour le développement du sarcome d'Ewing a été bien établie in vitro avant de passer in vivo.

Réduction

Pour pouvoir détecter statistiquement la meilleure prise tumorale entre les différentes, il faut un minimum de 12 animaux en utilisant les deux sexes par condition. Ces données ont été prises en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité. De plus, une procédure de mise au point est prévue dans cette demande, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet et dans les projets à venir utilisant cette lignée murine et cellulaire. Dans le cas de la prise tumorale, les souris de la première procédure seront également utilisées pour la caractérisation des tumeurs prélevées. En effet, les tumeurs prélevées chez des souris atteignant le point final serviront pour une étude histologique et multi-omique afin de valider le type du sarcome d’Ewing développé chez ces souris.

Raffinement

Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux par cage au maximum. Une période d’acclimatation sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures présentées ci-après. L'administration d’analgésique, d'anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe, de la nourriture humidifiée et eau gélifiée seront ajoutées au fond de la cage si les animaux présentent des difficultés à se déplacer au réveil. Les tumeurs seront collectées pour d'autres analyses ou pour la mise en culture cellulaire.

Choix des espèces

L’utilisation de ce modèle murin est nécessaire pour étudier le potentiel tumoral de ces cellules modifiées car ces dernières sont issues du même modèle murin, permettant de limiter le risque de rejet de greffe par le système immunitaire. Les sarcomes d’Ewing sont des tumeurs pédiatriques rares, pour lesquelles un sexe-ratio garçon/fille légèrement supérieur à 1 a été rapporté. Toutefois, selon les études, le sexe ratio rapporté peut varier. Par conséquent, nous utiliserons des souris mâles et femelles dans cette procédure afin de ne pas introduire de biais lié au sexe. Les greffes seront réalisées sur des souris de 4 semaines pour une réalisation optimale de l’expérience. En effet à cet âge, d'après notre expertise et de la littérature, la prise de greffe est optimale en se rapprochant de l’âge de la survenue du sarcome d’Ewing.

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent deux tests de comportement mesurant la préférence et la reconnaissance sociales, à quatre mois puis à vingt mois après un isolement d'une semaine avant chaque test, puis sont tuées avec ou sans prélèvement d'organes. L'objectif est de savoir si la délétion d'un gène dans les cellules immunitaires du cerveau reproduit des troubles proches de la démence associée à la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur affirme que l'effet sur le comportement ne peut s'observer que chez l'animal et justifie le vieillissement de la cohorte par le lien de la maladie avec l'âge.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Tandis que la plupart des cas de SLA sont sporadiques, certaines formes sont familiales. Certains cas de SLA peuvent aussi être associés à une Démence Fronto-Temporale (DFT), On appelle ce syndrome SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Les formes génétiques de SLA (et SLA-DFT) sont cruciales pour la recherche car elles permettent de modéliser la maladie. Récemment, des mutations dans un nouveau gène ont été impliquées dans la SLA-DFT. Nous étudions le rôle de ce gène dans différents types de cellules du cerveau. Le but est de savoir si la déficience de ce gène peut changer le comportement des souris, en termes de défaut de mémoire ou d'interaction social, ce qui est lié aux symptômes de la DFT dans le syndrome SLA-DFT.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de notre gène d'intérêt, dans différents types de cellules du cerveau. Ceci est cliniquement important car des mutations dans ce gène peuvent causer la sclérose latérale amyotrophique (SLA) avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT) - donc, SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Si nous montrons que la perte de ce gène dans différents types de cellules du cerveau peut induire des anomalies du comportement, cela aiderait à expliquer pourquoi et comment des mutations dans ce gène peuvent causer la SLA-DFT.

Procédures

Des souris d'une lignée transgénique d’intérêt et des souris contrôlés (non-transgéniques), subiront 2 tests de comportement consécutifs, une fois à 4 mois (jeune), et, 16 mois plus tard, une fois à 20 mois (âgées). Le premier test nécessite 25 minutes par souris et le deuxième nécessite 5 minutes par souris. Les deux tests sont faits sur deux jours consécutifs. Ces 2 tests de comportement ne produisent pas de douleurs et sont réalisés sur des animaux vigiles, libres de leurs mouvements. Ces tests permettent d’évaluer la préférence sociale ainsi que la reconnaissance sociale. A la fin de la procédure (des 2 tests de comportement à l'âge vieille et/ou jeune), toutes les souris sont euthanasiées, avec différentes méthodes d’euthanasies réglementaires utilisées selon le type d’analyses à réaliser à posteriori (avec ou sans prélèvement d'organes).

Impact sur les animaux

Pour les tests de comportements : Car l'animal à tester doit être isolé pendant une semaine avant ce type de test, cet isolement pourrait produire un stress. Aussi, avec ce type de test il y a un risque d'agression entre les animaux à testés, et ces tests de comportement peuvent eux-mêmes induire un stress/angoisse chez l'animal. Le vieillissement de la cohorte peut aussi augmenter le risque de pathologies générales liées à l'âge. A l’issue de la période de maintien, les animaux pourront subir deux types d’euthanasies réglementaires dont l’une est précédée d’une anesthésie générale nécessaire pour la réalisation des prélèvements d’organes.

Devenir

Parce qu’il s'agit d'une étude comportementale, les résultats des tests comportementaux sont collectés tout au long de la procédure. Toutes les souris sont donc utilisées pour ces tests de comportement. A la fin de la procédure, toutes les souris sont euthanasiées, avec différentes méthodes d’euthanasies réglementaires utilisées selon le type d’analyses à réaliser à posteriori (avec ou sans prélèvement d'organes).

Remplacement

Avant de réaliser les expériences in vivo que nous proposons dans ce protocole, nous avons mené des études in vitro, pour tester si notre hypothèse est solide. Nous avons utilisé des cultures primaires de cellules microgliales (isolées de cerveaux de souris nouveau nées), avec une délétion du gène d’intérêt, pour tester si les fonctions normales des cellules microgliales sont défectueuses (la prolifération et activation après stimulation, la phagocytose). Nos résultats étant prometteurs, nous nous sommes demandé si cela pourrait entrainer un phénotype comportemental subtil in vivo. Même si on peut modéliser certaines interactions pathologiques entre cellules microgliales et cellules neuronales in vitro, déterminer un effet sur le comportement est seulement possible dans un animal.

Réduction

Nous avons déterminé notre stratégie de croisement afin de produire le moins possible de génotypes non intéressants. Cependant, cette stratégie est nécessaire pour que tous les génotypes étudiés soient générés dans la même portée. Pour les deux tests de comportement, nous avons besoin de 15 souris par génotype (avec 3 génotypes) et par sexe. Il s’agit du nombre minimal de souris nécessaire pour évaluer un modificateur génétique sur le comportement - défini par des consignes internationales de la communauté de la recherche contre la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc, ALS-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Pour tout test de comportement, les deux sexes sont nécessaires. En plus, car la SLA et la SLA-DFT sont liées à l'âge (l’âge est un facteur de risque majeur), nous allons réaliser ces tests sur des souris jeunes (4 mois) et des souris âgées (20 mois). Comme les deux différents tests de comportement ne produisent qu'un stress mineur sur les souris, nous ré-utiliserons les mêmes souris pour ces deux tests consécutifs pour en utiliser le moins d'animaux possible. En plus, afin de réduire le nombre de souris utilisées, nous ferons vieillir la cohorte jeune (4 mois) pendant 16 mois pour obtenir la cohorte âgée (20 mois). Donc, 120 souris transgéniques (sans phénotype) sont nécessaires, plus des souris de contrôles non-transgéniques (90). Le nombre TOTAL d'animaux utilisés : 210

Raffinement

(Hébergement) Pour la stimulation environnementale, nous utilisons toujours des petites maisons en carton, et des fibres en carton, permettant de faire des nids dans chaque cage. Les femelles sont hébergées ensembles (au moins 2 par cage, maximum 6), et les mâles sont hébergés entre fratrie autant que possible avant les expériences, mais peuvent être séparés en cas de bagarre. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. (Présence de points limites) L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent. Toute anomalie pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance (plaies, ulcères, tumeurs, fractures etc.), est considérée comme un point limite, et la souris sera euthanasiée. (Tests de comportements) Une surveillance particulière des animaux testés sera faite durant la semaine suivant les tests comportementaux. Pendant l'isolation nécessaire d'une semaine avant les tests de comportementaux, la stimulation environnementale reste présente (maison et fibres en carton), mais est renforcé en ajoutant aussi des carrés de coton compact (pour faire des nids). En cas de stress trop important suivant un test (souris prostrée, ne se déplaçant plus), l’individu sera euthanasié. Le test sera aussi suspendu en cas de comportement agressif. En cas de blessure, l’individu sera euthanasié. (Euthanasie pour prélèvement d'organes) A la fin de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés. Deux types d’euthanasies réglementaires sont utilisées, dont l’une est précédée d’une anesthésie générale nécessaire pour la réalisation des prélèvements d’organes. Le seul risque dans ce cas (défini comme un point limite), est le réveil pendant la chirurgie, mais c'est très peu probable en vue de l'anesthésie profonde (surdose d'anesthésique).

Choix des espèces

Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale): souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre neurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère. Par conséquent, poissons/mouches/vers ne sont pas de bon modèle pour répondre à nos questions. Les tests comportementaux que nous voulons utiliser sont bien établis chez la souris. Il existe également de solides données dans la littérature qui ont montré que la microglie peut influencer le comportement chez la souris. De plus, des souris ont été utilisées avec succès pour modéliser les phénotypes moteurs de SLA-DFT. Par conséquent, nous pensons que la souris est le bon modèle pour notre question de l'effet de la modulation des microglies sur les défauts de comportements liée à la SLA-DFT. Les souris sont utilisées à l'âge jeune (à 4 mois) et à l'âge vieille (à 20 mois).

1 992 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vecteurs viraux sous anesthésie, subissent un stress de contention d'une heure que le porteur déclare ne pas pouvoir limiter, et passent des tests évaluant leurs capacités motrices et sensorielles avant la mise à mort pour prélever leurs structures cérébrales. L'objectif est de valider in vivo une approche censée protéger les neurones dans la maladie de Huntington, déjà testée sur cellules. Le porteur affirme que la souris est un modèle approprié du fait de sa similitude avec le cerveau humain.

Objectifs

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d'origine génétique (18 000 personnes atteintes en France et environ 300 000 dans le monde). Elle se caractérise par l'apparition de symptômes moteurs et psychiques, conduisant à une dégradation de l'état général des patients (amaigrissement, fonte musculaire, fatigue, douleurs et déformations articulaires, puis inexorablement à la mort). Aujourd'hui, il n'existe pas de traitement efficace pour prévenir ou retarder l'évolution de cette maladie. L'objectif de ce projet est d'étudier in vivo une approche thérapeutique validée in vitro contre la maladie de Huntington. Cette approche thérapeutique vise à protéger les neurones contre des perturbations métaboliques.

Bénéfices attendus

Actuellement, aucun traitement n'est efficace pour prévenir ou retarder la progression de la maladie de Huntington. L'objectif du projet est d'étudier une nouvelle approche thérapeutique axée sur une perturbation métabolique, qui pourrait retarder la progression de la maladie. Un outil a récemment été développé pour tester cette approche sur des cellules et valider son effet bénéfique. Ces résultats prometteurs doivent maintenant être validés sur des animaux en vue de proposer de nouveaux traitements aux patients atteints de cette maladie.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés une seule fois pendant 5 minutes le temps d'injecter les vecteurs viraux (durée de l'injection 30 secondes). Les souris seront soumises à un stress de contention de 1heure pour induire une perturbation métabolique. Les souris participeront également à des tests comportementaux afin d'évaluer leurs capacités motrices et sensorielles impactées par le modèle de la maladie de Huntington. Ces tests dureront de 1 à 30 minutes et ne seront effectués qu'une seule fois.

Impact sur les animaux

Nous pouvons identifier un seul effet indésirable attendu sur les animaux: l'induction du stress de contention d'une heure. Ce stress est modéré et nous ne pouvons pas le limiter. Immédiatement après le stress, les animaux seront soit mises à mort pour des études métaboliques, soit utilisés pour des tests comportementaux. Nous n'attendons pas d'effets indésirables pour les tests comportementaux, ni pour les injections avec les vecteurs viraux.

Devenir

Tous les animaux seront mises à mort à la fin de chaque procédure afin de récupérer les structures cérébrales d'intérêt. Les animaux ne peuvent donc pas être réutilisés.

Remplacement

Nous avons identifié in vitro une approche thérapeutique de la maladie de Huntington qui vise à protéger les neurones des perturbations métaboliques, et nous devons maintenant valider ces résultats in vivo. La souris est un modèle approprié pour l'étude in vivo de l'organisation du cerveau, compte tenu de sa similitude avec celle de l'homme et de l'existence chez cette espèce de données préalables sur le fonctionnement des voies métaboliques.

Réduction

Plusieurs mesures sont appliquées pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.

Raffinement

- Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Ainsi, les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé avec accès ad libitum à l’eau et à la nourriture et présence d’enrichissements dans les cages. Les conditions d'hébergement vont être identiques et homogènes pour tous les groupes (y compris les mettre dans la même pièce). - L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des procedures. Des échelles de cotation de la souffrance basées sur des signes indicatifs de gêne et de douleur seront utilisées afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir les points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal.

Choix des espèces

Compte tenu de la similitude de son anatomie avec celle de l'homme, la souris est un modèle de choix pour l'étude de la maladie de Huntington. L'étude se concentre sur les réseaux matures, ce qui implique le stade adulte des individus. L'objectif du projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique pour retarder la progression de la maladie. Les injections seront effectuées à l'âge de 4 à 8 semaines, un stade précoce avant le développement de la maladie, et après 3 à 4 mois, nous effectuerons des tests comportementaux pour suivre l'évolution de cette pathologie.

1 530 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 050 réutilisés ensuite dans d'autres projets et 480 tués pour prélèvement d'organes. Une partie subit la pose d'une mini-pompe ou d'un cathéter sous anesthésie, puis reçoit le produit à tester avant l'évaluation neurologique par le test d'Irwin, avec un isolement social pouvant durer jusqu'à trois semaines et une mise à jeun jusqu'à seize heures. L'objectif est d'évaluer les effets secondaires de candidats médicaments sur le système nerveux central avant leur passage chez l'humain. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution suffisante et que l'animal constitue un "passage obligatoire", le rat étant selon lui l'espèce la plus adaptée.

Objectifs

La développement de nouveaux médicaments s'accompagne d'une évaluation de leurs potentiels effets secondaires chez l'animal avant toute administration chez l'homme. Cette évaluation pré-clinique de la sécurité du candidat médicament au niveau du système nerveux central peut être effectuée par le test d'Irwin chez le rat. Le test consiste à effectuer une batterie d'observations fonctionnelles incluant des paramètres neurologiques après administration d'un candidat médicament afin d'évaluer les effets secondaires de ce dernier sur le système nerveux central du rat.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments avec peu d'effets secondaires pour le patient et de traiter diverses maladies dans de nombreuses indications thérapeutiques (par exemple, les cancers, les maladies du système nerveux central). Ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont d'évaluer les éventuels effets secondaires du composé testé avant son passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rat) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive.

Procédures

Avant de réaliser le test d'Irwin et afin de permettre une administration chronique ou sous perfusion sanguine du produit à tester, les animaux pourront être sujets à l'implantation d’une minipompe ou d'un cathéter veineux (environ 35 mins) ou également d'un cathéter artériel (35 mins) pour réaliser des prélèvements sanguins. Cela est fait sous anesthésie générale avec une analgésie morphinique. Ils receveront également un suivi post-opératoire selon les bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux peuvent également recevoir le produit à tester par différentes voies d'administration (-2 minutes) à un volume respectant les recommandations éthiques. Les animaux seront ensuite évalués d'un point de vue neurologique par le test d'Irwin, un test durant 6 minutes et qui consiste en l'évaluation de différents paramètres à différents temps de mesure post-administration. Leur activité locomotrice pourra également être évaluée dans un actimètre (environ 60 minutes). Une observation peut être réalisée avant l'administration et la période d'observation post-administration sera de 24h à 72h. Celle-ci pourra être allongée en fonction de la durée de demi-vie du candidat-médicament. Des prélèvements de sang (environ 1 min) pourront également être effectués en cours d'étude en respectant les recommandations éthiques pour les volumes et la récupération entre les séries de prélèvements.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis a une chirurgie réalisée sous anesthésie qui peut induire un stress à l'endormissement. Les cicatrices de la chirurgie peuvent indurie un inconfort. Les animaux peuvent également être mis en isolement social après la chirurgie et jusqu'à 3 semaines post-chirurgie ce qui peut induire du stress. Le test d'Irwin en lui-même ne provoque pas plus de nuisance pour l'animal qu'un éventuel stress lié à la préhension et au déplacement de ce dernier. L'administration de molécules dont les effets sont connus peuvent induire des effets secondaires modérés et limités par les doses utilisées dans cette procédure. Les animaux peuvent également être mis à jeun pour une période de 16h maximum avec complémentation en glucose ou non ce qui peut induire une sensation de faim chez l'animal.

Devenir

A la fin de l'étude, les animaux pourront être euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organes/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Un certain nombre d'animaux pourra également être réutilisé dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les symptômes comportementaux ou neurologiques. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de la toxicité et de la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé (n=10/groupe) afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les potentiels effets secondaires d'un produit sur le système nerveux central car il s'agit de l'espèce la plus pratique et la plus utilisée et donc charactérisée pour évaluer les effets de médicaments en développement sur le système nerveux central. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement afin de s'affranchir de divers effets liés au développement et à l'âge (par exemple les changements hormonaux).