Rongeurs

31 souris porteuses de tumeurs du côlon vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intratumorale d'un composé, pour douze d'entre elles une prodrogue par voie intraveineuse et un prélèvement de sang à la jugulaire, puis jusqu'à quatre séances d'imagerie sous anesthésie avant la mise à mort et le prélèvement des organes. L'objectif est de vérifier que deux produits se concentrent bien dans la tumeur, une étape de pharmacocinétique préalable au test de leur effet anticancéreux dans d'autres travaux. Le porteur affirme que la biodistribution ne peut pas être prédite in vitro, faute de circulation sanguine et de système excréteur.

Objectifs

L'objectif de cette étude est d'évaluer et de comparer les propriétés pharmacocinétiques des nouveaux agents thérapeutiques dans le domaine de l'oncologie préclinique. Ces agents se composent de deux produits : l’un qui sera administré par voie intratumorale et un second contenant une pro-drogue (chimiothérapie rendue inactive) qui ne sera activé qu’en présence du premier. L’objectif de ce travail est de valider que les produits se localisent bien au niveau tumoral et y restent suffisamment de temps pour exercer leurs actions. Le développement de ces nouveaux agents est nécessaire pour faire progresser le traitement du cancer (i.e. optimiser le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables). Dans un premier temps, les composés seront évalués in vitro pour connaître leurs propriétés de base. Cependant, il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, notamment sa pharmacocinétique, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent. Par conséquent, pour s'assurer que les produits nouvellement développés présentent des propriétés pharmacocinétiques favorables, ils seront d'abord testés in vivo sur de petits rongeurs. Après cette étape, leurs propriétés anticancéreuses pourront être évaluées dans d’autres travaux

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables. Ce projet permettra de réaliser la preuve de concept qu’il est possible d’activer une chimiothérapie au niveau de son site d’action en optimisant son efficacité et limitant ses effets secondaires dans le reste de l’organisme.

Procédures

- Observation des souris (poids, volume tumoral, santé générale) : toutes les souris, sur des animaux vigiles, deux fois par semaine. Durée : quelques secondes par souris - Injection intratumorale d’un composé : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Injection intraveineuse d’une prodrogue inactive : n=12 souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Prélèvement sanguin par veine jugulaire : n=12 souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes. - Imagerie : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, au maximum 4 points d'imagerie sur une période de six jours après l'injection de l'agent d’imagerie. Durée : maximum 60 minutes d’anesthésie - Euthanasie et prélèvement des différents organes : toutes les souris, les souris seront profondément anesthésiées et euthanasiées avant que la procédure n'ait lieu, dernière expérience.

Impact sur les animaux

La croissance de la tumeur pourrait avoir des effets négatifs sur les animaux, comme une gêne des mouvements de l’animal ou des pertes de poids (cachexie). L'évolution de la taille de la tumeur sera donc suivie très régulièrement et l'étude sera terminée arrêtée lorsque les tumeurs auront atteint la taille mentionnée dans les points limites. L’état général de l’animal ainsi que son poids seront aussi suivis et un complément alimentaire sous forme de gel pourrait être fournis pour limiter les nuisances. Les procédures (injection intraveineuse ou intratumorale, prélèvements sanguin et imagerie) sont réalisées sous anesthésie sur lit ou plaque chauffante réduisant la douleur et l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Peu ou pas d'effets indésirables dus à l’injection des différents produits sont attendus : l'injection intratumorale du produit 1 a déjà été réalisée chez l’animal sans effet secondaire, la dose de radioactivité qui y sera ajoutée est très faible et ne causera pas d’effet sur l’animal. Si la molécule de chimiothérapie active peut avoir des effets secondaires se caractérisant surtout par une perte de poids, la prodrogue a été testée chez l’animal et ne possède aucun effet secondaire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, car les organes seront prélevés pour une évaluation ultérieure par des techniques ex vivo. Ces informations visent à renforcer les données d'imagerie.

Remplacement

Toutes les molécules qui seront évaluées dans ce projet ont été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types de cellules et/ou de tissus sont impliqués.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, les nouveaux agents seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo. En comparaison avec une étude classique qui nécessite la mise à mort des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie peut être répétée à différents temps et permet de réduire le nombre d’animaux d’autant. Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé en partie sur la base de plans expérimentaux précédents et a été confirmé à l'aide de tests statistiques. Cela donne un total de 24 souris nécessaires, soit 6 souris par groupe. Pour garantir qu'un nombre suffisant d'animaux puisse être inclus (taille homogène des tumeurs), 7 animaux résiduels seront également ajoutés pour un total final de n=31 souris.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection intraveineuse, intratumorale, et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les expériences sont menées, dans une très large majorité sur des animaux pour lesquels le volume de la tumeur n’excède pas 1000-1200 mm3 (plus rarement, il est toutefois possible d’inclure des animaux dont le volume de la tumeur est supérieur à 1000-1200 mm3, mais sans dépassement de point limite). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 à 10 individus en fonction de la taille des cages et le nombre d’animaux par groupes mais l’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Les souris sont l’espèce de référence pour les études en oncologie. Les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. D’autre part, de nombreux modèles de cancers sont en place et très bien caractérisés chez la souris par l’établissement producteur permettant d’éviter une mise en place de modèle qui nécessiterait beaucoup plus d’animaux. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines minimum à la date de début d’étude d’imagerie) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.

1 310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent chaque matin pendant six jours une injection d'alcool, et le cerveau de leur descendance est examiné par imagerie sous anesthésie sans analgésie, à trois semaines puis à six mois, avant la mort pour prélèvement du cerveau. Le porteur décrit un stress modéré et passager chez les mères et reconnaît que les nuisances fines chez les petits ne sont pas connues. Il vise à comprendre les effets de l'alcoolisation fœtale et affirme qu'un cerveau entier et en fonctionnement ne se reproduit ni in vitro ni in silico.

Objectifs

L'exposition prénatale à l'alcool (éthanol-EtOH) peut modifier les trajectoires de développement du cerveau et des déficits cognitifs, de la mémoire et du comportement. Ces symptômes induits par la consommation d'alcool de la mère pendant la grossesse sont regroupés sous le terme de troubles du spectre de l'alcoolisation fœtale (TSAF). Les TSAF sont la principale cause de retard mental non génétique dans le monde occidental. En France, 7 000 à 10 000 enfants naissent chaque année avec un TSAF, repésentant un coût sociétal estimé à 10 milliards d'euros par an. Bien que des efforts considérables aient été faits pour mieux comprendre les effets de l'exposition à l'alcool sur le développement, des questions restent en suspens. Ce projet à pour objectif de mieux comprendre les effets de l'alcool sur le développement et le fonctionnement du cerveau.

Bénéfices attendus

En comprenant mieux les effets de l'alcool sur le développement du cerveau, ce projet pourriat permettre d'envisager des traitements à plus long terme chez les enfants souffrants de troubles du spectre de l'alcoolisation fœtale .

Procédures

L'alcoolisation des mères gestantes est réalisé en fin de gestation. Pratiquement, une injection sous cutanée d'éthanol ou de solution saline (contrôle) est administrée chaque matin à des femelles gestantes pendant 6 jours de suite. Celle-ci est réalisée sous la peau dans la base du cou durant une seconde, chez des animaux vigiles. la durée de l'acte est de moins d'une minute. Le volume d’alcool injecté est quotidiennement calculé selon le poids de chaque souris gestante. Afin de mieux comprendre l'impact de l'alcool sur les développement et la physiologie du cerveau, le cerveau des souriceaux issues des mères alcoolisées sont étudiés, sous anesthésie, par une technique d'imagerie biomédicale non invasive d'une durée de 1H30 maximum. Nous ne pouvons pas réaliser l'injection d'une molécule d’analgésie car cela interfère avec les paramètres d’imagerie. Cette procédure d'imagerie est réalisée qu'une seule fois aux stades P21 et 6 mois.

Impact sur les animaux

L'injection d'alcool chez les mères par une simple piqure provoque un stress modéré et passager. Les effets de l'acool sont égalements passsagers et ne durent qu'une dizaine de minutes. L'etude du cerveau par imagerie biomédicale chez les souriceaux et réalisé sous anesthésie générale et n'induit donc aucun effet indésirable chez les animaux. Concernant les souriceaux issus de mères alcoolisées, aucun effet indésirable (stress, perte de poids, alimentation) n'est percevable ou mesurable. Aux doses utilisées, les nuisances subtiles ne sont pas connues. C’est au niveau du cerveau que nous nous attendons éventuellement à des modifications très fines qui pourraient être révélées par imagerie.

Devenir

Pour l'ensemble des analyses, tous les animaux seront euthanasiés par des procédures adéquates et réalisées par du personnel compétent. Les prélèvements de cerveaux, réalisés après euthanasie des souris, permettront d'étudier de manière approfondie plusieurs mécanismes physiologiques qui sont importants pour le développement du cerveau. L'ensemble des études permettra de mieux comprendre les effets de l'alcoolisation sur la physiologie cérébale de la descendance et de trouver des pistes thérapeutiques pour la protection du cerveau en développement suite à l'alcoolisation maternelle.

Remplacement

Notre étude s’intéresse à des caractéristiques du cerveau en activité, entier et fonctionnel, qu’il est par conséquent impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques).

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique

Raffinement

Les mères et les souriceaux sont hébergés dans des cages enrichies en essuie-tout pour qu’elles puissent y faire leur nid. Une surveillance visuelle quotidienne et un suivi clinique (3 fois par semaine) seront réalisés dans le calme pour limiter au maximum le stress des animaux. Pendant les protocoles nécessaires pour étudier le cerveau, les animaux seront anesthésiés et surveillés. Nous ne pouvons pas réaliser l'injection d'une molécule d’analgésie car cela interfère avec les paramètres d’imagerie. Les animaux sont suivis avec une grille d'évaluation du score clinique. Des points limites prédictifs bien définis permettent d'éviter toute souffrance animale. Si l’un de ces points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.

Choix des espèces

Le modèle souris est modèle de choix pour ces études car il possède beaucoup de caratéristiques communes avec le développement humain. Le cerveau des souris présente également de nombreuses caratéristiques communes avec la physiologie du cerveau humain. Les stades de développement choisis dans cette étude chez la souris à E17/E19 correspondent au stade gestationnel de 20 semaines chez l'humain, à P0 au stade gestationnel de 23 semaines chez l'humain, à P21 à l'âge de 15 ans chez l'humain et à P180 à l'âge de 35 ans chez l'homme. L'étude de l'exposition périnatale à l'alcool sur l'animal nouveau-né et au cours du développement cérébral jusqu'à l'âge adulte est nécessaire pour optimiser la recherche de nouveaux outils thérapeutiques. Les âges de développement choisis dans cette étude chez la souris correspondent à différents stades de développement chez l'homme (foetus, adolescent, adulte).

12 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée des plaies dans le dos pour y implanter sous la peau quatre échantillons d'une matrice d'œsophage d'origine porcine, avant de les tuer à sept ou vingt-huit jours pour analyser la réaction des tissus. Le porteur décrit une chirurgie de quinze à vingt minutes avec traitement antidouleur et des démangeaisons possibles à la plaie. Il teste la tolérance d'un futur substitut d'œsophage et affirme que la réaction immunitaire ne s'apprécie que sur un être vivant.

Objectifs

Les chirurgies pour la reconstruction de l’œsophage suite à l’ablation de l’organe chez des patients atteints de pathologies ou victimes de traumatisme sont reconnues unanimement comme très insatisfaisantes par la communauté médicale. En effet, les complications post-opératoires sont nombreuses. C’est pourquoi, le développement d’une matrice biologique œsophagienne présente de nombreux avantages afin de répondre aux besoins cliniques actuels. La disponibilité des greffons œsophagiens humains étant limitée, le porcin est le modèle animal choisi afin de développer notre matrice. Avant son implantation chez l’homme, cette matrice biologique œsophagienne doit être testée pour vérifier sa capacité à s’intégrer sans être rejetée et sans dégrader son environnement. Ces données doivent être étayées par des données scientifiques qui ne peuvent pas être obtenues in-vitro, c’est-à-dire en dehors de l’organisme vivant. C’est pourquoi, il est nécessaire d’exposer la matrice à un mammifère vivant afin d’évaluer son acceptation dans un environnement physiologique. Il sera possible d’évaluer ces critères selon des méthodes ex-vivo en laboratoires, permettant d’étudier la structure des tissus d’un point de vue microscopique. L’objectif principal de cette étude est de tester l’hypothèse selon laquelle une matrice œsophagienne décellularisée engendre une réaction inflammatoire compatible avec son environnement physiologique.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de montrer que l’utilisation d’une matrice biologique en tant que substitut d’œsophage est acceptable en termes de tolérance en regard de la thérapie actuelle, lourde et source de complications post-opératoires, ayant pour conséquence une mauvaise qualité de vie pour les patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure chirurgicale suivante : - création des plaies cutanées au niveau de la zone dorsale - implantation des matériaux en sous-cutané. Les animaux recevront un nombre de 4 échantillons, espacés de minimum 1 cm, selon les recommandations de la norme ISO 10993-6. Cette norme spécifie les méthodes d'essai pour l'évaluation des effets locaux après une implantation de biomatériaux destinés à être utilisés dans des dispositifs médicaux - fermeture des plaies. Le temps de chirurgie est estimé à 15-20mn par animal. A cela, ajouter le temps d’anesthésie et de réveil de l’animal (ce temps est variable selon les individus). Pour gérer une éventuelle douleur, nous utiliserons un dérivé morphinique, la buprénorphine durant les 48 heures après l’opération. Le groupe 1 sera euthanasié après 7 jours d’implantation, et le groupe 2 sera euthanasié après 28 jours.

Impact sur les animaux

L’expérimentation implique la réalisation de la plaie , la pose de la matrice dans la poche, refermée avec une suture. La réaction à la chirurgie pourra provoquer des démangeaisons au niveau de la plaie cutanée.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux sont réveillés et suivis cliniquement. Les animaux sont euthanasiés à 7 jours (Groupe 1) et 28 jours (Groupe 2) pour explanter la peau en vue des analyses de la réaction inflammatoire et de la cicatrisation.

Remplacement

Des tests in-vitro, c’est-à-dire en dehors de l’organisme vivant, ont été réalisés préalablement sur les matrices biologiques d’origine porcine, selon la norme ISO 10993-5 concernant l’évaluation biologique des dispositifs médicaux. Néanmoins, en raison des interactions complexes entre l'hôte et la matrice, ces systèmes ne peuvent pas reproduire de façon fidèle les conditions d’intégration ou de rejet de la matrice. La confirmation de la bonne intégration de la matrice étant indispensable avant son implantation chez l’homme, il est donc nécessaire de disposer de modèles animaux pour évaluer la réaction immunitaire qui ne peut être appréciée que sur l’être vivant, disposant d’un système immunitaire compétent Cette évaluation est faite sur des échantillons biologiques extraits de l’animal, après sa mise à mort.

Réduction

Cette étude comportera 12 rats (dont 2 en cas de mort prématurée lors du déroulé de l’étude) répartis en 2 groupes, G1 (7 jours d’implantation) et G2 (28 jours d’implantation). Chaque rat recevra 4 échantillons, ce qui fera n=12 échantillons/temps pour chaque condition selon les recommandations de la norme ISO 10993-6. En effet, la norme précise l’utilisation d’au moins trois animaux pour chaque matrice et suffisamment de sites pour obtenir un total de 10 échantillons d'essai et de 10 échantillons de contrôle pour chaque matrice et chaque période d'implantation. Le nombre de rats fixé comprend des animaux supplémentaires dans le but de conserver un nombre d’animaux et d’échantillons suffisant à l’issue du protocole, dans le cas d’éventuelles complications. Cela permettra à l'étude de s'aligner sur l'approche 3R (replace, reduce, refine) de l'expérimentation animale, réduisant ainsi le nombre d'animaux et le nombre de procédures d'expérimentation animale, en tenant compte de la recommandation ISO 10993-6.

Raffinement

- Un personnel qualifié sera mobilisé autour des animaux avant, après et pendant les interventions. Le chirurgien est chevronné. - Tous les individus seront acclimatés à leur environnement 7 jours avant l’intervention. Cela permet de réduire le stress des animaux le jour de l’implantation. - Les conditions expérimentales ne provoquent pas de contraintes pouvant affecter le bien-être des animaux : pas de diminution de la qualité de l’environnement de l’animal, pas de diminution de la socialisation, accès normal à l’eau et à l’aliment et respect des comportements normaux. - L’hébergement est réalisé en cages ventilées. Ces cages sont stérilisées. L’environnement de l’animal est adapté. S’il y a nécessité d’isoler les animaux, ce que nous éviterons au maximum, l’environnement des animaux sera enrichi (maison). - Pendant l'opération, les cages seront amenées les unes après les autres dans la salle de chirurgie qui est séparée de la zone d'hébergement des animaux afin d'éviter toute source de stress par contact visuel, olfactif et sonore des animaux opérés et des animaux à opérer. - Des protocoles précis de prémédications permettant la diminution de la douleur, l’anesthésie de l’animal et de sa mise à mort sont mis en place. Un traitement anti-douleur avant, pendant et après l’opération est mise en place à l’aide d’une injection de buprénorphine sous la peau de l’animal. - Pour gérer une éventuelle douleur, nous utiliserons un dérivé morphinique en sous cutané, durant les 48 heures après l’opération.

Choix des espèces

Cette étude ne peut en effet être réalisée directement chez le patient mais permet d’évaluer la capacité de l’étude à être transposable à une implantation chez l’homme car elle est réalisée chez le mammifère. L’utilisation du rat permet de répondre à un certain nombre de questions et d’être prédictif des résultats chez l’homme En effet, le modèle animal cherche à répliquer l’environnement biologique ainsi que la réponse biologique. Les réactions immunitaires et inflammatoires du rat sont similaires et transposables à l’homme. Ces données sont validées dans la littérature faisant du rat l’espèce de choix pour cette étude. Les rats seront âgés de 10 semaines et pèseront environ 250gr. Tous les rats auront le même âge pour une meilleure comparaison des résultats mais également pour que la taille de la plaie soit proportionnelle à la taille des rats. Des rats âgés de 10 semaines sont choisis afin qu'ils aient atteint une taille adulte pour diminuer les risques à la suite de l’anesthésie et pour faciliter l'intervention chirurgicale. De plus, le stade de développement devra permettre une cicatrisation optimale grâce à la qualité des tissus.

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont immobilisés par contention lors de neuf séances de deux heures pour provoquer un stress censé reproduire le syndrome du côlon irritable, avec deux prises de sang, avant d'être tués pour analyse des tissus. Le porteur attend un transit accéléré, des selles molles et une inflammation intestinale légère. Il cherche à valider ce modèle pour évaluer ensuite des compléments alimentaires à base d'extraits végétaux et de probiotiques destinés aux patients.

Objectifs

Le syndrome de l'intestin irritable (IBS) est une maladie complexe qui affecte le système nerveux et le microbiote intestinal. Ses mécanismes ne sont pas encore complètement compris. Les patients souffrent de douleurs abdominales et de troubles digestifs tels que la diarrhée et/ou la constipation, souvent associés à des problèmes psychologiques tels que l'anxiété et la dépression. Le stress et certains aliments peuvent déclencher l'IBS, c'est pourquoi les premières recommandations médicales pour le traitement incluent une gestion améliorée du stress, de l'exercice physique et des changements alimentaires. Dans cette perspective, l'utilisation de compléments alimentaires contenant des extraits végétaux et des probiotiques peut aider à maintenir une santé intestinale équilibrée et prévenir les symptômes de l'IBS chez les patients. Pour tester l'efficacité de ces produits, il est nécessaire d'utiliser des modèles animaux, tels que le rat. Cependant, il n'existe pas actuellement de modèle animal reconnu par la communauté scientifique comme référence pour évaluer le syndrome du côlon irritable, et les modèles utilisés dans la littérature sont très variés. L'objectif de ce projet est de développer et de valider un modèle de syndrome du côlon irritable chez le rat en induisant un stress modéré par une restriction physique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier et à valider un modèle de syndrome du côlon irritable chez le rat, afin d'évaluer l'efficacité des produits de santé destinés aux patients. Si les résultats démontrent l'efficacité de l'une ou plusieurs des combinaisons d'extraits végétaux et de probiotiques, des études précliniques (chez l’animal) pourront être suivies par des études cliniques (chez l’homme), offrant ainsi aux patients des solutions complémentaires pour lutter contre l'IBS. Ce projet revêt donc une importance pour répondre aux besoins non satisfaits des patients souffrant du syndrome du côlon irritable et améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Restriction physique : 9 sessions 2h maximum Contention pour évaluation de la composition corporelle par EchoMRI : 2 sessions de 30 secondes (début et fin d'étude). Prélèvement de sang à la pointe de la queue (200µl) : un prélèvement en début et un en fin d'étude

Impact sur les animaux

Les animaux devraient ressentir un stress modéré se traduisant par une accélération du transit intestinal, des fécès molles ainsi qu’une inflammation intestinale légère visible en histologie. Aucun effet indésirable sévère n’est attendu avec ce modèle. Les points limites établis dans la procédure n’ont aucune raison d’être atteints.

Devenir

A la fin la procédure les animaux seront mis à mort et différents tissus seront prélevés pour permettre de compléteter les analyses et d’identifier des macanismes d’action.

Remplacement

L'inflammation chronique de l'intestin est une maladie complexe et multifactorielle qui reste encore largement mal comprise. Les modèles murins sont utilisés pour étudier cette maladie car ils permettent de comprendre son contexte global à l'échelle de l'organisme, ce qui n'est pas possible avec d'autres modèles in vitro ou ex vivo

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux dans ce projet, une procédure de validation de modèle est mise en place. Cette validation permettra de réduire le nombre de conditions des procédures suivantes visant à évaluer l’efficacité des différentes formulations et des différentes doses. Cela réduit globalement le nombre d’animaux dans le projet. La taille des groupes est choisie de manière à obtenir une puissance statistique suffisante pour les paramètres clés.

Raffinement

Tous les animaux de ce projet suivront une période d’habituation avant de commencer l’étude, ils seront hébergés dans un environnement contrôlé et adapté (cages ventilées, 22°C, 30-70% d’humidité, cycle J/N 12 :12). Les cages seront enrichies à l’aide de matériel de nidification et d’un tube rouge permettant aux animaux de se cacher et aux techniciens de les manipuler. Un contrôle quotidien sera réalisé pour permettre de relever et documenter l’apparition de signes cliniques.

Choix des espèces

Le rat wistar est classiquement utilisé dans la litérature pour la mise en place de ce modèle IBS. Les animaux seront utilisés à l’âge de jeunes adultes (8 semaines). C’est un âge classiquement utilisé dans nos différents projets et sur lesquels nous avons des points de comparaisons.

Greffées de cellules leucémiques humaines par voie intraveineuse ou dans le fémur, les souris reçoivent ensuite, selon les études, des molécules par injection jusqu'à deux fois par semaine ou par gavage quotidien pendant quatre semaines, avec jusqu'à douze prises de sang et trois prélèvements de moelle chacune. 3 000 souris immunodéficientes vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Beaucoup développent une leucémie qui, à un stade avancé, les amaigrit et les affaiblit. Des greffes peuvent aussi se faire sur des souriceaux nouveau-nés, pour étudier les leucémies de l'enfant. Le porteur annonce des points limites et des "critères d'arrêt précoces de souffrance" sans en préciser aucun.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques de l’enfant et de l’adolescent sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Le traitement standard comprend une polychimiothérapie, parfois associée à une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour les patients de haut risque ou en rechute. La greffe de cellules souches hématopoiétiques (CSH) est un traitement lourd, source de séquelles à long terme. Des progrès sont donc nécessaires pour réduire le taux de rechute, améliorer la survie et limiter les séquelles. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies l’enfant à mauvais pronostic. Pour tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, il est essentiel de pouvoir travailler sur les cellules tumorales les plus proches possibles de celles présentes chez les patients afin de prendre en compte la complexité génétique des tumeurs. La xénogreffe dérivée du patient développée après transplantation de la tumeur primaire humaine directement dans divers modèles murins immunodéprimés a été utilisée largement pour modéliser différents types de cancer. En effet, ces tumeurs conservent les caractéristiques histologiques des tumeurs parentales, reflètent mieux l'hétérogénéité de l'échantillon du patient et constituent une plate-forme pour évaluer les médicaments anticancéreux (molécules pharmacologiques et immunothérapies, dans des conditions physiologiques. Le projet a également pour objectif d'identifier des approches alternatives à l’utilisation de modèles animaux pour l’étude des leucémies pédiatriques. Pour cela, nous utiliserons des modèles de cellules pluripotentes induites humaines cultivées in vitro pour caractériser les propriétés tumorales des cellules exprimant les oncogènes des leucémies issues des cellules souches en comparant les cellules obtenues in vitro et in vivo à celles provenant des patients. A terme, l'utilisation de cellues souches pourrait permettre de réduire l’utilisation d’animaux pour réaliser certaines approches exclusivement in vitro. Nous utilisons des outils statistiques permettant de définir le nombre minimal d'animaux à utiliser pour obtenir des conclusions significatives pour chaque approche.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'améliorer les modèles utilisés afin d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette : -D'amplifier des cellules leucémiques de patients afin de réaliser leur analyse moléculaire et définir l'efficacité de réponse à plusieurs molécules pharmacologiques qui seront identifiées par les analyses moléculaires. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -De définir si des cellules souches pluripotentes induites pourraient, à l'avenir, être utilisées à la place des cellules humaines primaires et dans les approches in vitro pour réduire l'utilisation de souris. -De caractériser l'efficacité anti-tumorale d'approches précliniques, incluant certaines immunothérapies . -D'améliorer les modèles développés dans le but de réduire le nombre de souris utilisées et de définir les prérequis pour le replacement de certains modèles murins in vivo par des approches in vitro.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection intra-veineuse sous anesthésie locale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-veineuse de molécules sous anesthésie locale: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-fémorale sous anesthésie générale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal) et chaque injection prend 3 à 5 minutes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être journalier sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang sous anesthésie locale: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle sous anesthésie générale : jusqu'à 3 prélèvements par souris avec une fréquence d'au moins 15 jours. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général. Les interventions répétées de type injection ou prélèvments de sang peuvent éventuellement occasionner rarement des hématomes ou des lésions locales. Les injections intrafémorales ou les prélèvements de moelle dans le fémur peuvent rarement occasionner des douleurs persitantes et des boîteries.

Devenir

Tous les animaux du projet sont transgéniques et seront donc euthanasiés. De plus, beaucoup développeront des maladies de type leucémie et seront euthanasiés pour analyses post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération/maturation terminale des lignées hématopoïétiques à partir de cellules souches n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches pluripotentes induites), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.

Réduction

De nouvelles lignées de souris immunodéficientes sont développées régulièrement par d'autres laboratoires et certaines sont rapportées comme ayant un taux de greffe des cellules hématopoïétiques humaines supérieur et donc permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces approches. Nous comparerons l'efficacité de ces modèles à celui du modèle de référence pour la prise de greffe de nos échantillons leucémiques afin de sélectionner le modèle qui permettra de réduire le nombre de souris utilisées pour les greffes primaires. Des méthodes statistiques seront utilisées pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaire et suffisant et pour analyser les résultats. Au cours des années passées, nous avons identifié un modèle plus réceptif aux greffes de cellules hématopoïétiques primaires ou issues de cellules souches pluripotentes induites. Nous utilisons donc maintenant régulièrement cette souche qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Nous poursuivrons la comparaison avec de nouvelles souches de souris immunodéficientes qui deviendraient disponibles au cours du projet. Dans le cas où elles montreraient une efficacité, nous serons donc amenés à utiliser de nouvelles lignées et à diminuer le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Afin de réduire l’invasivité des prélèvements, nous introduisons des rapporteurs luminescents dans les cellules humaines utilisées pour les approches précliniques afin de pouvoir suivre la prise de greffe et l’efficacité des traitements par des approches d’imagerie corps entier sans prélèvements (ex: sang ou moelle) permettant une meilleure quantification de l'efficacité globale du traitement.

Choix des espèces

Les souris représentent une espèce relativement facile à élever qui permet l’obtention de résultats rapides du fait de leur temps de génération réduit. Elles possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l’homme. Pour cette étude, nous utilisons des souris immunodéficientes, car ces souris permettent une prise de greffe efficace de cellules humaines, avec un risque de rmaladie du greffon contre l'hôte réduit et peuvent être utilisées pour les approches précliniques. Par le passé, nous avons contribué à des approches précliniques pour un composé qui ont conduit à des phases cliniques. Ces modèles sont également utiles pour le test d'immunothérapies. Nous utiliserons des souris adultes entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, des article récents montrent l’importance d'utiliser des souris receveuses nouveau-nés. Ainsi, nous pourrons transplanter les cellules soit dans des receveurs nouveau-nés ou adultes pour comprendre l'importance de l'âge de l'organisme lors du dévéloppement des leucémies retrouvées chez l'enfant.