Rongeurs
Dynamique des protéomes des cellules B au cours de l’auto-immunité et des traitements immunothérapeutiques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
Les souris de ce projet développent spontanément un lupus vers six mois, avec des auto-anticorps qui se déposent dans leurs reins et une évolution vers la défaillance rénale sur un an. 1 544 d'entre elles vont être utilisées, 1 124 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 420 dans des procédures d'un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles reçoivent des injections à jours fixes pendant six mois, subissent des prélèvements de sang et des séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse, et près d'un tiers développe une inflammation de la peau aux points d'injection ou de prélèvement. Le porteur qualifie ces procédures d'"indolores" et parle d'un "léger inconfort", alors que la maladie qu'il laisse s'installer conduit ces souris à l'insuffisance rénale.
Objectifs
Ce projet de recherche a pour but d’étudier en détail les changements et adaptations de certaines cellules issues de différents organes pendant l'évolution d’une maladie auto-immune, le lupus érythémateux systémique (LES), et lors de son traitement par immunothérapie. Le LES est une maladie grave où le système immunitaire, permet pour des raisons encore méconnus le développement des anticorps dirigés contre des protéines de l’organisme par des cellules immunitaires appelées lymphocytes B, des « autoanticorps ». Ceux-ci se déposent principalement dans les reins et la peau et peuvent causer des inflammations de la peau et/ou des atteintes rénales. Malgré les traitements existants, de nombreux patients ne répondent pas bien à ces médicaments, et d’autres développement une résistance au traitement après un certain temps, rendant le traitement inefficace. Aujourd’hui, il est encore impossible de prédire quels patients vont développer des complications graves. Et nous commençons seulement à comprendre pourquoi certains traitements cessent de fonctionner. Notre objectif est de répondre à ces questions et de décrypter les mécanismes de la maladie en observant par des méthodes de pointes les caractéristiques des lymphocytes B évolue au fil du temps, et comment elles réagissent réagit aux traitements. Nous anticipons que ce projet permettra d’identifier des marqueurs précoces de la maladie et des échecs thérapeutiques, permettant une prise en charge plus rapide et mieux adaptée.
Bénéfices attendus
Ce projet va conduire à une meilleure compréhension de l’évolution des différentes populations des cellules immunitaires dans le lupus érythémateux systémique (LES) et des effets des immunothérapies sur ces populations. À terme, cette recherche pourrait permettre de : - développer des traitements plus efficaces notamment pour les patients qui ne répondent pas aux médicaments actuels. - réduire les effets secondaires en ciblant plus précisément les cellules responsables de la maladie. - mieux prédire l’évolution de la maladie grâce à des marqueurs biologiques Ainsi, ce projet devrait sur le long terme contribuer à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes en limitant les poussées inflammatoires et les dommages aux organes.
Procédures
Dans toutes les procédures : L’évaluation de souris implique : - Une observation des animaux sans intervention (2 minutes) - Placement de l’animal (2-3 secondes) dans une boite en plastique jusqu’à la miction. - Transfert de l’animal dans une boite d’anesthésie gazeuse (2-3 secondes) - Pesée de l’animal anesthésié (3 secondes) - Prélèvement de sang sur animal anesthésié (15 secondes). - Dans le cadre de la deuxième procédure, les animaux déjà anesthésiés pour l’évaluation de routine vont en plus recevoir des injections à jours 0,14,28 ensuite tous les 28 jours pendant 6 mois (durée de quelques secondes à chaque fois). Expérience impliquant l’imagerie sur animal vivant : - Transfert de l’animal dans une boite pour l’anesthésie (2-3 secondes) - Injection (quelques secondes) - Installation de l’animal dans l’appareil d’imagerie (5-10 secondes avec maintien de l’anesthésie) - Prise d’image 5-10 minutes
Impact sur les animaux
S’agissant d’un modèle spontané de lupus érythémateux systémique (LES), les souris vont développer progressivement la pathologie autour de l’âge de 6 mois. Dans la suite, la maladie touchera essentiellement les reins. La pathologie se développe sur un an cumulant dans une défaillance rénale. Autre que l’implication rénale, une inflammation spontanée de la peau peut se développer dans une partie (30%) de ces souris, surtout au niveau des sites d’injections ou de prélèvements. Celle-ci va être traitée par des analgésiques locaux selon les conseils des vétérinaires. Les manipulations liées à des procédures sont des très courtes durées et induisent qu’un léger inconfort chez les souris. Plus précisément sont prévues des prélèvements de sang sur animal anesthésié (15 secondes) et dans le cadre de la deuxième procédure, des injections sur des animaux déjà anesthésiés (durée de quelques secondes). L’anesthésie peut provoquer quelques secondes d’angoisse aux moments de l’endormissement et du réveil.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes vitaux et pourront donc être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
La pathologie et les thérapies qui vont être étudiées ici résultent de réactions systémiques et impliquent des conséquences au niveau de différents tissus et organes. Ces processus sont complexes, reposant sur les singularités du système immunitaire et des tissus touchés par des dépôts de complexes immuns, processus qui ne peuvent pas être reproduits in vitro. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinent.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé avec l’objectif de réduire ce nombre autant que possible tout en minimisant le « bruit de fond » inhérent à la recherche biologique in vivo. Ce nombre inclut le nombre nécessaire de contrôles et la nécessité de reproduire les résultats. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Cela se traduit par : Un suivi rigoureux tout au long de la vie de l’animal : Les animaux seront évalués régulièrement et avec une fréquence croissante selon leur âge pour des signes évoquant un lupus érythémateux systémique (LES) : Lors de ces évaluations nous observons les souris pour les postures et comportements qui pourraient traduire de la douleur, du stress ou de l’inconfort. Nous utiliserons une grille d’évaluation standardisée pour détecter précocement tout signe de détresse et nous mettrons en place des actions pour minimiser toute forme de souffrance pour l’animal. Nous mesurons leurs poids, et suivons différents paramètres dans le sang et l’urine. Cela nous permet d’établir des points limites précis (nécessitant la mise à mort de l’animal) pour chaque procédure, limitant ainsi au maximum une souffrance inutile des animaux. Des procédures indolores : - Les manipulations sont limitées au strict minimum avec le but de minimiser l’angoisse et le stress ressenti par l’animal. Les animaux seront anesthésiés pour les prélèvements sanguins.
Choix des espèces
L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Même si le système immunitaire des souris n’est pas identique à celui des humains, ces animaux constituent des modèles fiables et largement utilisés pour étudier des maladies complexes comme celle étudiée ici. Leur utilisation permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et l’induction de la résistance aux traitements. Dans ce projet, nous utiliserons uniquement des souris adultes, âgées de 4 à 12 mois. Ce choix est motivé par le fait que la maladie étudiée se développe naturellement avec l’âge chez les souris, comme chez les humains. Les premiers signes immunologiques, l’apparition d’auto-anticorps, n’apparaissent qu’à partir de 4-6 mois. Utiliser des animaux plus jeunes ne permettrait pas d’étudier la maladie, car elle n’est pas encore déclarée. Les mécanismes immunitaires que nous voulons observer ne sont pleinement actifs qu’à l’âge adulte. Les organes cibles (reins) ne présentent des lésions qu’à un stade avancé de la maladie, soit vers 8 à 12 mois. Finalement, les résistances aux traitements se développent avec le temps, qui nécessite un suivi de souris sur plusieurs mois.
Evaluation à long terme des atteintes cérébrales causées par une intoxication aux organophosphorés chez la souris: études de l’état inflammatoire et des modifications fonctionnelles de l’unité neurovasculaire par imagerie (2/2)
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Deux critères déclenchent la mise à mort de l'animal quand ils atteignent leur valeur maximale, la respiration et la perte de poids. 512 souris mâles de neuf semaines vont être intoxiquées par un agent neurotoxique organophosphoré du type sarin ou VX, 248 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 264 dans des procédures d'un niveau sévère, toutes tuées pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la dose sous-létale la plus forte peut provoquer des crises convulsives dans l'heure suivant l'intoxication, et prévoit deux à trois séances d'imagerie cérébrale à un, trois et six mois, dont la durée cumulée peut dépasser deux heures. Le projet évalue un candidat thérapeutique, le Glunomab, associé au traitement actuel des intoxications par agents de guerre et par pesticides organophosphorés.
Objectifs
Les composés organophosphorés (OP) tels que les agents neurotoxiques de guerre (NOP) comme le sarin et le VX, ou certains pesticides organophosphorés (OPP), constituent une menace actuelle pour les populations militaire et civile. Si les intoxications à fortes doses représentent toujours un véritable danger (tentative d’assassinat), l’exposition de manière unique ou répétée à des NOP et des OPP à des doses asymptomatiques (attaque terroriste, terrains de guerre, épandage de pesticides…) est une réalité permanente. Les rapports d’intoxication passive, active ou accidentelle avec des pesticides (300 000 décès annuels dans le monde pour près de 3 millions de cas d’intoxication rapportés) ou lors d’utilisation de gaz neurotoxiques en Syrie témoignent du besoin de développer des traitements neuroprotecteurs plus efficaces. Ce projet multisite, mené sur deux établissements utilisateurs, vise à caractériser les altérations de l’UNV à moyen et long termes (jusqu’à 6 mois) après exposition aux OP et d'évaluer un nouvel acteur thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer les effets d’une intoxication sur l’unité neurovasculaire (UNV). Une meilleure compréhension de ces atteintes nous permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d’améliorer la prise en charge clinique globale à la suite d’une intoxication aux NOPs. De plus un nouvel acteur thérapeutique sera testé : le Glunomab® en association avec le traitement actuel.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : •Intoxication à un agent neurotoxique organophosphoré suivi par une étude comportementale d’observation (durée 1 heure) pour déterminer les signes d’intoxication. L’intoxication et l’étude comportementale ne seront réalisées qu’une seule fois. (Etablissement utilisateur (EU) administration toxique) • Une injection de traitement thérapeutique • Réalisation de 2 à 3 sessions d’imagerie cérébrale à 1 mois, 3 mois et 6 mois après l’intoxication (EU imagerie). Chaque session pourra inclure : une imagerie IRM d’environ 20 minutes, une imagerie ultrasonore de type speckle, d’environ 1 heure, et une imagerie fonctionnelle par ultrasons (fUS) d’environ 1 heure. La durée totale d’examen pourra ainsi varier selon le protocole sélectionné pour l’animal, tout en restant compatible avec son confort et son suivi.
Impact sur les animaux
Lors des expériences d’intoxication : -Pour l’un des axes de ce projet de recherche, les animaux seront exposés à une dose sous-létale de toxique entrainant une intoxication de faible sévérité . En revanche, pour l’autre axe, qui implique l’utilisation d’une dose sous-létale plus importante de toxique, le développement de symptômes plus sévères peut survenir, notamment des crises convulsives périphériques. Ces effets post-intoxication apparaissent dans la première heure post-intoxication, et la surveillance des animaux sera prolongée jusqu’à 6 heures post-intoxication pour s’assurer de leur récupération.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever leurs organes et d’y étudier ex vivo certains paramètres et de les confronter aux données en imagerie.
Remplacement
Il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant d’étudier de manière intégrée la réponse du système nerveux central et périphérique à un neurotoxique. Par ailleurs, l’étude de l’unité neurovasculaire (UNV) et sa fonctionnalité suite à une intoxication aux organophosphorés ne peut être envisagée qu’«in vivo». Il n’existe actuellement aucune culture reproduisant l’ensemble des éléments de l’UNV : cellules endothéliales, pieds astrocytaires, microglie et macrophages péri-vasculaires.
Réduction
Afin de limiter au maximum l'utilisation des animaux tout en garantissant une qualité scientifique suffisante, deux plans expérimentaux distincts ont été établis. Le premier vise à étudier les effets de l’intoxication aux agents organophosphorés. Le second a pour objectif d’évaluer l’efficacité des traitements utilisés, seuls ou combinés. Dans ces deux volets, les chercheurs analyseront plusieurs paramètres liés au fonctionnement cérébral, notamment le flux sanguin cérébral, l’activité cérébrale et des marqueurs d’activation vasculaire. Les analyses statistiques appropriées seront réalisées afin de comparer les groupes et de déterminer si les différences observées sont significatives. Les effectifs animaux ont été calculés de manière à utiliser le minimum d’individus tout en obtenant des résultats fiables. Les animaux seront hébergés par petits groupes afin de garantir leur bien-être, et le plan expérimental a été conçu pour limiter strictement le nombre total d’animaux nécessaires. Cette stratégie permet d’obtenir des conclusions solides tout en respectant la règle des 3R.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en conditions standards d’animalerie, 4 individus par cage avec accès sans restriction à la nourriture et à la boisson. Ils bénéficieront d’un milieu enrichi (matériel de nidification, tunnel). L’isolement des animaux sera limité au maximum afin de minimiser leur angoisse. Pendant la 1ère heure suivant l’intoxication, les animaux seront placés seuls afin de suivre l’évaluation de l’intensité de l’intoxication, puis ils seront remis en cage avec leurs congénères. Une surveillance journalière des souris sera effectué pendant une semaine à la suite de l’intoxication, et un indice sera calculé suivant une grille d’évaluation pré-établie (ex : changements du rythme respiratoire, changement du comportement, réponses comportementales aux stimuli externes). L’indice cumulatif (addition des valeurs de chaque critère) indiquera une souffrance/détresse croissante. Deux critères « vitaux » atteignant la valeur maximum entraineront la mise à mort de l’animal : « respiration » et « perte de poids » : ils sont considérés comme des points limites. En fonction de l’indice cumulatif, différentes prises en charge seront réalisées : augmentation de la fréquence de surveillance (2-3 fois par jour), apport de complément alimentaire (gel hydratant…), injection de glucose et/ou injection de buprénorphine. Une attente de 15 jours entre l’intoxication et le transport ainsi qu’une période d’acclimatation de 15 jours à l’arrivée du site d’imagerie sont prévues avant toute expérience afin de réduire les nuisances aux animaux. Pendant le transport, les animaux seront maintenus dans leur groupe de cage (n=4), avec ajout de nourriture, hydrogel et matériel de nidification supplémentaires. Seuls les animaux en bonne santé seront envoyés. Le transport sera organisé par un transporteur agrée. Tous les examens d’imagerie sont réalisés sous anesthésies générales par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal. Une surveillance journalière des souris sera effectuée à la suite des examens d’imagerie afin de suivre l’évolution du poids et la cicatrisation des sutures.
Choix des espèces
Les expériences seront réalisées sur des souris Swiss mâles âgées de 9 semaines, pesant entre 38 et 43 g. Cette souche est largement utilisée dans les modèles d’intoxication aux agents neurotoxiques, notamment pour son profil comportemental stable et reproductible. Elle permet également d’explorer différents volets expérimentaux, dont l’analyse du comportement et l’activité cérébrale. Le choix d’animaux jeunes adultes assure une bonne comparabilité avec les travaux antérieurement menés sur des modèles similaires. Utiliser le même stade de développement permet une continuité scientifique et facilite l’évaluation de l’effet des traitements en conditions contrôlées. Cette souche est aussi reconnue pour sa sensibilité à l’altération du fonctionnement de l’unité neurovasculaire (interaction entre neurones, vaisseaux sanguins et cellules de soutien du cerveau), un aspect pertinent pour l’étude des conséquences cérébrales de l’exposition aux agents organophosphorés.
Détermination préliminaire des profils pharmacocinétiques, toxicocinétiques de substances actives à propriétés phytosanitaire chez le rat
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Pour constituer les dossiers réglementaires d'homologation de substances phytosanitaires, à raison d'une cinquantaine d'études par an sur cinq ans, 17 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, 3 456 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 13 824 dans des procédures d'un niveau modéré. Tous subissent une chirurgie d'environ une heure pour implanter un cathéter dans une veine jugulaire, puis reçoivent les substances par la bouche jusqu'à trois fois par jour pendant quatorze jours, par injection, sur la peau ou par inhalation pendant une à quatre heures. Certains passent jusqu'à vingt-trois heures en cage à métabolisme et jusqu'à quatre heures en chambre d'inhalation, parfois sous anesthésie. Le porteur écrit qu'"aucune altération de l'état de santé des animaux n'est attendue avec les procédures prévues", après avoir classé 13 824 d'entre eux en souffrance modérée.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre comment certains produits utilisés pour protéger les plantes (comme les pesticides ou produits phytosanitaires) se comportent dans le corps d’un humain. Ce projet cherche à savoir comment ces substances peuvent entrer dans l’organisme de l’homme (par ingestion, contact avec la peau ou inhalation), combien de temps elles y restent, et comment elles sont transformées. L’objectif est d’estimer de manière réaliste l’exposition humaine, que ce soit par l’alimentation (via des résidus dans les aliments) ou dans un cadre professionnel (par exemple pour les personnes qui manipulent ces produits). Avant d’être étudiées chez le rat, les substances sont d’abord testées et sélectionnées en laboratoire (sans animal). Seules celles qui respectent les exigences réglementaires en matière de sécurité pour l’humain et l’environnement sont ensuite retenues. Le projet prévoit environ 50 études par an. Sur une durée de cinq ans, cela représentera environ 17 280 rats, répartis entre trois types de procédures expérimentales.
Bénéfices attendus
À court terme, ces études permettent de mesurer de façon réaliste la quantité de ces substances à laquelle les humains peuvent être exposés, que ce soit par l’alimentation ou par contact avec la peau ou l’air. Elles servent aussi à fixer des limites de sécurité, par exemple la quantité maximale de résidus autorisée dans les aliments, avec une large marge de sécurité pour protéger la santé. Ces travaux permettent également d’identifier les substances ou leurs dérivés qui pourraient être dangereux, notamment ceux qui s’accumulent dans le corps ou restent longtemps dans l’environnement. Cela aide à éviter d’autoriser des produits pouvant provoquer des maladies graves comme des cancers ou des troubles du système nerveux
Procédures
Dans ce projet, les gestes réalisés sur les rats sont simples et de courte durée. Les animaux sont régulièrement pesés, ce qui prend seulement quelques secondes, afin de suivre leur état de santé. Les substances étudiées peuvent être administrées de différentes façons : • par la bouche (comme prendre un médicament), soit une seule fois ou de façon répétée avec un maximum de 3 fois par jour pendant 14 jours. La manipulation dure 30s. • par injection dans la circulation sanguine, soit une seule fois ou de façon répétée avec un maximum de 6 fois par jour sur 24h ou au plus 3 fois par jour pendant 3 jours. La manipulation dure au maximum 2 min. • par application sur la peau, soit une seule fois ou de façon répétée avec un maximum de 6 fois par jour sur 24h ou au plus 3 fois par jour pendant 3 jours. La manipulation dure au maximum 30s • par application sous la peau, en une seule fois. La manipulation dure 30s • par inhalation sous forme d’air ou de fines gouttelettes en une seule fois. La manipulation peut durer entre une heure sur un animal vigile et quatre heures sur un animal anesthésié. Tous les rats subiront une chirurgie d’environ 60 min pour implanter un cathéter dans une des veines jugulaires sous une anesthésie à base d’un produit anesthésiant halogéné afin soit de réaliser des administrations répétées par voies intraveineuses ou des prélèvements de sang répétés lorsque les animaux ont été administrés par la bouche, par la peau ou par inhalation. La température corporelle sera contrôlée et ajustée tout au long de la chirurgie. La durée des études va de deux à quatre semaines. Des prélèvements de sang nécessitent une manipulation courte sur un animal vigile d’environ 2 min. Le sang collecté permet d’analyser comment le produit s’absorbe, circule et se distribue dans l’organisme ou les organes. Ces prélèvements sont réalisés en petites quantités, avec des limites strictes pour prévenir toute anémie et privilégier un temps de récupération entre chaque prélèvement. Certains prélèvements sont réalisés sous anesthésie en fin d’étude. Les urines et les selles peuvent aussi être collectées ponctuellement sur 23h après administration dans des cages adaptées pour compléter les analyses.
Impact sur les animaux
Aucune altération de l’état de santé des animaux n’est attendue avec les procédures prévues. Toutefois, en raison du caractère exploratoire des études, des effets imprévus peuvent survenir (perte de poids, variations de la température corporelle, modifications du comportement). Certains animaux pourront être hébergés temporairement en cage à métabolisme (au maximum 23h) ou dans une chambre à inhalation (au maximum 4h), ce qui peut générer un stress léger ou un inconfort transitoire. Les animaux dans la chambre à inhalation pourront être anesthésiés le temps du traitement. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique régulier à l’aide d’une grille de scoring. Des points limites humanitaires sont définis afin d’interrompre l’expérimentation et de mettre en œuvre une prise en charge adaptée, y compris l’euthanasie si nécessaire, afin d’éviter toute souffrance inutile.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir collecter les matrices biologiques ou organes pour évaluer la distribution dans un organisme vivant des substances actives phytosanitaires.
Remplacement
Des tests sur cellules permettent de faire un premier tri des substances, en étudiant leur absorption et leur transformation. Cependant, ces méthodes ne suffisent pas à comprendre entièrement leur comportement dans un organisme vivant et ne sont pas encore pleinement reconnues pour les produits phytosanitaires. À ce jour, l’étude chez l’animal reste nécessaire pour évaluer de manière globale leur devenir dans l’organisme et s’assurer de leur sécurité pour l’humain, les animaux et l’environnement, conformément à la réglementation européenne.
Réduction
Les substances sont d’abord largement testées en laboratoire (sur ordinateur et sur cellules) pour prévoir leur comportement dans l’organisme. Cela permet de ne garder que les plus pertinentes et de réduire fortement le nombre d’animaux utilisés. Grâce à des techniques d’analyse très sensibles, de très petites quantités de sang sont suffisantes. On peut ainsi effectuer plusieurs prélèvements sur un même animal et obtenir toutes les informations nécessaires, tout en limitant leur nombre. Le nombre d’animaux est donc réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables : en général au minimum 3 animaux pour les études de base et au maximum 8 pour certaines analyses spécifiques. Le nombre d’animaux utilisés sur cinq ans est estimé à 17280.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages adaptées, avec des éléments d’enrichissement pour leur confort et leur permettre de faire leur nid. Ils sont observés chaque jour pour vérifier leur état de santé. L’environnement et les animaux sont régulièrement contrôlés pour garantir de bonnes conditions sanitaires par des analyses ciblées et appropriées. Si un animal présente un problème, il reçoit des soins adaptés ou est euthanasié si nécessaire, selon des règles précises. Des mesures sont aussi prévues pour réagir rapidement en cas d’événement inattendu. Des critères d’arrêt anticipé sont définis ainsi pour éviter toute souffrance inutile. Tous les gestes pouvant être douloureux ou les situations très contraignantes pour l’animal sont réalisés sous anesthésie, et les manipulations sont limitées au strict nécessaire. Pour limiter les risques, en cas de dose potentiellement toxique, un seul animal est testé en premier. Si des effets indésirables apparaissent, les autres animaux ne sont pas exposés. Enfin, toutes les procédures sont réalisées par du personnel qualifié et formé, avec des formations régulières pour améliorer les pratiques et le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le rat (Rattus norvegicus) a été retenu comme espèce d’étude pour les investigations de pharmacocinétique des composés agrochimiques en raison de sa forte acceptabilité réglementaire et de sa pertinence scientifique. Il constitue l’espèce de référence recommandée par les lignes directrices internationales, notamment celles de l’OCDE, pour les études de toxicocinétique, et est largement utilisé dans les études de toxicité réglementaires. Ce choix garantit la cohérence entre les données pharmacocinétiques et toxicologiques du dossier. Sur le plan scientifique, le rat présente une physiologie et un métabolisme bien caractérisés, permettant une évaluation fiable de l’absorption, de la distribution, du métabolisme et de l’excrétion. Il permet également l’identification des métabolites majeurs circulants et l’établissement de relations robustes entre dose administrée et exposition systémique. Les données obtenues sont largement utilisées pour l’extrapolation inter-espèces et la modélisation pharmacocinétique dans le cadre de l’évaluation du risque humain. D’un point de vue technique et éthique, le rat est adapté aux prélèvements sériés et aux études de bilan de masse, tout en permettant l’optimisation des designs expérimentaux conformément au principe des 3R. Il assure ainsi la production de données fiables et exploitables sur le plan réglementaire. Le stade adulte (à partir de 7 semaines) est utilisé par défaut pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques. Toutefois, des animaux plus jeunes (15 jours) peuvent être utilisés afin d’évaluer l’exposition spécifique chez le nouveau-né.
Analyse des niveaux de corticostérone ou de son action sur les gènes, selon l’alimentation
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Opérées du cerveau sous anesthésie générale pour implanter une canule ou une fibre optique dans l'hippocampe, 210 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau et leur tissu adipeux. L'intervention dure environ une heure, et le porteur signale des crises d'épilepsie rares ainsi que la possibilité que l'animal décolle son implant en se frottant. Chaque souris subit ensuite deux stress de cinq minutes et un test de mémoire, après un régime riche en gras et en sucre administré dès l'adolescence, avec ou sans restriction horaire. Au titre de la réduction, le porteur indique récupérer pour ses mises au point des souris "produites mais non utilisées", issues de croisements transgéniques n'ayant pas donné le génotype voulu.
Objectifs
La consommation de régime alimentaire obésogène (riche en gras et en sucre) pendant la période d’adolescence est associée à des troubles de mémoire. Ceux-ci peuvent être prévenus si l’alimentation obésogène est restreinte dans le temps (chrononutrition). Nos travaux précédents montrent que le régime obésogène entraine une modification de la régulation des hormones glucocorticoïdes (corticostérone chez la souris) qui est restaurée par la chrononutrition. Or ces hormones sont connues pour être fortement impliquées dans les processus de mémoire. Leur altération pourrait expliquer les troubles de mémoire associés à la consommation d’alimentation obésogène. L’objectif principal de ce projet est de mesurer le rôle des hormones glucocorticoïdes in vivo, en temps réel et au cours du temps dans différents contextes d’alimentation (obésogène vs contrôle, avec ou sans chrononutrition) en une utilisant une approche nouvelle basée sur la fibre optique. Nous pensons qu’avec cette technologie nous pourrons plus finement comprendre le rôle de ces hormones dans les troubles de mémoire et leur prévention par la chrononutrition.
Bénéfices attendus
L’achèvement des expériences proposées devrait fournir des preuves de concept pour de nouvelles approches thérapeutiques potentielles utilisant l’alimentation limitée dans le temps(chrononutrition) pour traiter les troubles de la mémoire (et éventuellement des troubles émotionnels) induits par l’obésité. Le projet fournira également de nouvelles connaissances sur les actions des hormones glucocorticoïdes sur le cerveau, ce qui pourrait aider à traiter les pathologies associées à un excès de ces hormones.
Procédures
Chaque animal (210 au total) subit une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. La chirurgie dure environ 1h et la récupération post-opératoire est d’environ 2 heures. Ensuite, chaque animal subit deux stress modérés de 5 min chacun. Tous les animaux subissent un test de mémoire de 2 fois 10 min. Six animaux recevont deux injections de drogue et 6 animaux recevront une injection de drogue. Les injections durent 3 min chacune.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie du cerveau bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (nuisance modérée). L'implantation de canule ou de fibre optique dans la région du cerveau appelée hippocampe (siège de la mémoire), peut entrainer parfois des crises d'épilepsie (rare et de courte durée). La souris opérée peut parfois décoller la canule implantée ou la fibre optique en la frottant. Cela peut générer un inconfort qui reste modéré car il n’y a pas de plaie ouverte. Certains tests de comportement sont stressants mais ne durent que 5 min. Le régime obésogène utilisé n'entraine pas de diabète pour le temps d'exposition maximale utilisé (12 semaines).
Devenir
les animaux sont mis à mort pour prélèvement d’organes (cerveau, tissu adipeux) en vue d’analyses post mortem
Remplacement
L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal les conséquences comportementales et neurobiologiques de régime obésogène sur la mémoire et les émotions et les effets de la chrononutrition. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude de la mémoire et des émotions reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la deuxième. Pour les mises au point nous utilisons des animaux produits mais non utilisés (par exemple souris récupérées de croisements de souris transgéniques n'ayant pas le génotype désiré) afin de réduire les pertes pour la réalisation des expérimentations. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience. Aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié
Raffinement
A leur arrivée, les animaux ne subissent pas d’expérimentation pendant 2 semaines afin de favoriser leur acclimatation à notre animalerie. Nous les manipulons régulièrement pour qu’ils s’habituent à l’expérimentateur. Lors des chirurgies nous pratiquons une anesthésie générale et une antalgie médicamenteuse. La chirurgie est réalisée dans des conditions d’asepsie et nous pratiquons des soins pré et post-opératoires adaptés. Nous avons mis en place un arbre décisionnel de points d’arrêt précoces où nous intervenons pour réduire le stress et la douleur des animaux si nécessaire.
Choix des espèces
Nous utilisons uniquement des souris car les expériences de comportement sont validées dans cette espèce et les appareillages sont disponibles. Les traitements nutritionnels sont faciles à conduire et divers aliments/régimes alimentaires sont disponibles commercialement. La plupart des expérimentations en neurosciences sont conduites sur des rongeurs (rat ou souris), nos expériences enrichissent le corpus de données en permetttant des compariasons directes avec ce qui es déjà publié. Nous étudions les souris entre 3 et 15 semaines d'âge. Ces âges couvrent la période d'adolescence (3 à 7 semaines) jusqu'à l'état jeune adulte, stades de développement que nous voulons étudier dans notre projet.
Evaluation de l’efficacité de nouveaux traitements antitumoraux sur des modèles souris très immunodéprimés de tumeurs orthotopique du colon et du pancréas.
- Recherche appliquée
- Cancers
1 285 souris très immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant recevoir jusqu'à trois séances d'imagerie sous anesthésie et deux prélèvements sanguins par semaine pendant toute la durée de l'étude. Les cellules tumorales leur sont implantées par chirurgie directement dans le cæcum ou le pancréas, puis les traitements testés sont injectés jusqu'à deux fois par jour pendant sept jours. Le porteur annonce une perte de poids, une prostration, un dos voûté, de la diarrhée et une déshydratation liés au développement des tumeurs, et vise la mise sur le marché de nouveaux médicaments anticancéreux. Trente-deux souris échappent à la mise à mort parce qu'elles n'auront pas reçu de cellules tumorales, et resteront vivantes pour servir à la formation du personnel.
Objectifs
D’après l’OMS, en 2022, le cancer colorectal est le 3ème type de cancer le plus répandu dans le monde et se situe au 2ème rang des types de cancer provoquant le plus grand nombre de décès. Bien qu’il touche principalement les personnes âgées de plus de 50 ans, plusieurs pays signalent une augmentation du nombre de nouveaux cas chez les jeunes adultes. De son côté, le cancer du pancréas est le 12ème type de cancer le plus répandu dans le monde mais se situe au 6ème rang des types de cancer provoquant le plus grand nombre de décès. A ce jour, il existe plusieurs types de traitements contre ces cancers en fonction de l’avancement de la maladie, des caractéristiques de la tumeur et de l’état général. Les traitements principaux reposent sur la chimiothérapie, l'immunothérapie ou la radiothérapie. Cependant, ces traitements ne permettent pas une rémission des cancers dans 100% des cas. Il est donc important de développer de nouvelle génération de traitements anti-cancéreux. Ce projet comporte plusieurs objectifs : 1. Développer de nouveaux modèles tumoraux du colon et du pancréas chez la souris, implantés directement dans les organes cibles (caecum et pancréas). 2. Evaluer l’efficacité et la biodistribution de nouveaux produits anti-cancéreux au niveau de la tumeur ou de différents organes dans les modèles tumoraux développés au cours de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer des nouveaux modèles tumoraux du colon et du pancréas chez la souris afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux innovants et ainsi contribuer à de nouvelles études cliniques voire à la mise sur le marché de nouveaux traitements anti-cancéreux.
Procédures
Les tumeurs seront injectées directement dans les organes cibles (caecum et pancréas) via une procédure chirurgicale qui durera au maximum 30 minutes (incluant l’anesthésie, l’injection et la fermeture). Les traitements seront injectés en dose unique ou répétée en respectant les volumes d’injections recommandés selon la voie d’administration. Lors d’injections répétées, la fréquence maximale sera de 2 fois par jours par site d’injection sur une durée limitée à 7 jours ou 1 fois par semaine sur une durée maximale de 15 jours, soit 15 injections. Sur animaux vigiles, les injections seront réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute) et la durée sera d’environ 5 minutes sur des animaux anesthésiés, anesthésie comprise. Des acquisitions d’imagerie pourront être réalisées sur animaux anesthésiés au maximum 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit au maximum 270 acquisitions). Une acquisition dure en moyenne 5 minutes (anesthésie comprise). Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit au maximum 180 prélèvements de sang). Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront manipulés régulièrement pour différentes procédures (injections des cellules tumorales, injections des traitements, suivis cliniques, pesées, prélèvements de sang, imagerie, …) ce qui pourra engendrer un certain niveau de stress. Les animaux pourront également présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration, pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques. Il existe également des risques de déshydratation et de pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies. Les injections des cellules tumorales se faisant via une chirurgie, elles sont susceptibles d’engendrer de la douleur. De plus, des signes cliniques liés au développement des tumeurs peuvent apparaitre : perte de poids, prostration, dos vouté, diarrhée, déshydratation, …). Les prélèvements sanguins présentent également un risque de déshydratation. Pour garantir le bien être des animaux, des points limites clairement définis seront appliqués afin de détecter rapidement tout signe de souffrance et d’assurer une prise en charge immédiate. L’intensité et la durée des signes cliniques pourront varier selon les groupes, en fonction de la croissance tumorale et de l’efficacité des traitements évalués.
Devenir
Le projet visant à évaluer l’efficacité de traitements anticancéreux, l’euthanasie des animaux est indispensable afin de permettre la collecte d’organes, notamment des organes cibles et des éventuelles métastases, et ainsi permettre la réalisation de différentes analyses permettant d’évaluer l’effet des traitements. Une trentaine d’animaux sur l’ensemble du projet qui seront inclus dans les études avec imagerie et qui permettront d’obtenir le niveau de luminescence basal de l’espèce pourront être gardés en vie et réutilisés pour la formation du personnel car ils n’auront pas été injectés avec des cellules tumorales.
Remplacement
Des tests sur les lignées cellulaires tumorales en culture pourront être réalisées en amont de la phase sur animaux afin de valider l’efficacité des traitements anti-cancéreux sur les cellules tumorales cibles. Cependant, la phase sur animaux est à ce jour indispensable car il n’existe pas de modèle de remplacement permettant de mimer de manière fiable un organisme vivant ayant été injecté avec des cellules tumorales. De plus, l’utilisation de souris injectées avec des cellules tumorales humaines ou murines est un modèle de référence pour l’évaluation de l’efficacité et de la biodistribution de traitements anti-cancéreux.
Réduction
Pour pouvoir déterminer de manière fiable si le traitement testé est réellement efficace, plusieurs groupes de souris seront constitués, comprenant chacun au minimum six animaux. A minima 1 groupe d’animaux non traité sera systématiquement inclus afin de servir de référence pour l’évaluation des effets du traitement. Les résultats obtenus dans les différents groupes seront ensuite comparés à l’aide de méthodes statistiques appropriées, permettant d’évaluer de façon objective et scientifiquement valide les effets du traitement.
Raffinement
Dans ce projet, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation minimale de 7 jours afin de s’habituer à leur environnement. Ils seront hébergés en groupe dans des conditions enrichies adaptées à leurs besoins à l’exception des animaux opérés, qui pourront être hébergés individuellement pendant 24 à 48 h afin de permettre la cicatrisation de leurs points de sutures. Leur état de santé sera observé quotidiennement pour détecter rapidement tout signe anormal. En cas de besoin, des mesures de soutien (soins locaux, réchauffement, isolement si nécessaire) seront mises en place, ou une mise à mort humanitaire sera réalisée si l’état de l’animal se dégrade de manière irréversible. Après l’injection des cellules tumorales, les animaux seront pesés régulièrement et feront l’objet d’un suivi clinique à l’aide d’une grille d’évaluation permettant de repérer tout changement, entre autres, dans leur comportement ou leur apparence. Ce suivi permettra d’identifier rapidement les signes de souffrance et de prendre les décisions appropriées pour garantir leur bien être. Si nécessaire, des examens plus approfondis seront réalisés et toute anomalie sera signalée au vétérinaire responsable. Lors des anesthésies, des précautions seront prises pour éviter l’hypothermie et protéger les yeux des animaux, notamment en utilisant un tapis chauffant et un gel oculaire.
Choix des espèces
Les souris constituent un modèle préclinique de référence pour l’étude du processus tumoral car elles permettent d’observer ce processus dans un organisme vivant et d’évaluer de nouveaux traitements de manière intégrée. En effet, les cancers touchent de nombreuses cellules et organes différents. En outre, la culture cellulaire ne permet pas de modéliser les différentes interactions biologiques entre les cellules cancéreuses et les cellules de l’hôtes. Enfin, seuls les modèles animaux permettent de modéliser les risques de métastases et leurs conséquences. Ce modèle est bien établi, largement utilisé et reconnu par la communauté scientifique. L’utilisation de souris présentant un âge, un sexe et un statut sanitaire standardisés garantit des conditions expérimentales homogènes. Cela permet d’obtenir des résultats fiables et comparables entre les groupes, notamment pour analyser la croissance tumorale, les marqueurs biologiques et l’impact du traitement sur la progression cancéreuse, tout en assurant un bon équilibre entre exigences scientifiques, considérations éthiques et faisabilité pratique. Par leur taille et leurs caractéristiques biologiques, les souris sont adaptées aux volumes de traitement, aux prélèvements et aux analyses nécessaires à ce type d’étude. Dans ce projet, des souris âgées d’au moins 5 semaines, correspondant au stade jeune adulte/adulte, seront utilisées afin de limiter les variations physiologiques liées à la croissance. Ce choix permet également d’obtenir des animaux d’environ 20 g, garantissant une meilleure stabilité des mesures expérimentales. Les deux sexes seront inclus afin de prendre en compte la variabilité potentiellement induite par les hormones sexuelles et d’assurer une représentativité optimale des résultats.
Approches innovantes de caractérisations des altérations comportementales et physiologiques dans des modèles murins de la dépression.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Privées de tout enrichissement dans leur cage pour ne pas gêner l'apparition du phénotype recherché, 735 souris subissent un suivi quotidien de 83 à 138 jours, avec des sessions comportementales de 5 à 45 minutes et des sons désagréables dont elles doivent apprendre à s'échapper. 390 sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 345 dans des procédures d'un niveau sévère, 615 d'entre elles passant par une chirurgie du crâne pour implanter une fibre optique, parfois accompagnée d'une manipulation du nerf vague. Le porteur revendique un "progrès éthique significatif" et présente ses procédures comme moins invasives que les équivalents existants, tout en annonçant une modélisation animale des conduites suicidaires, un stress chronique par corticostérone dans l'eau de boisson et des traitements au lithium, à la fluoxétine ou au diazépam. Toutes les souris sont tuées en fin d'expérience pour prélever leur cerveau, leur foie et leur intestin.
Objectifs
Ce projet a pour but de développer de nouvelles approches d’étude des comportements aversifs par échappement Pavlovien (c’est à dire ne requérant que les réflexes d’approche ou d'évitement) ou opérant (requérant ici une action volontaire) de sons désagréables mais non douloureux dans le suivi des symptômes anxieux et dépressifs (avec ou sans conduites suicidaires) et enfin de caractériser la pertinence du suivi non invasif de l’activité autonomique dans l’évaluation des altérations émotionnelles.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront des avancées majeures sur les plans fondamental, éthique et appliqué. Grâce au développement d’épreuves comportementales adaptées, le projet approfondira la compréhension des mécanismes cérébraux de l’axe intestin-cerveau impliqués dans l’anxiété et la dépression, ainsi que les processus cognitifs en situation aversive. Un volet crucial concerne la modélisation animale des conduites suicidaires, un outil qui fait actuellement défaut pour l'étude des mécanismes biologiques sous-jacents. Sur le plan méthodologique, l'approche longitudinale proposée constitue un progrès éthique significatif : en suivant les mêmes individus (profils anxio-dépressifs et capacités cognitives), nous réduisons considérablement le nombre d'animaux requis tout en minimisant leur stress par rapport aux méthodes conventionnelles. Enfin, d’un point de vue translationnel, ce projet évalue le microbiote intestinal comme levier thérapeutique contre les troubles liés au sevrage alcoolique. À plus long terme, ces recherches ouvriront la voie à des stratégies innovantes pour traiter la dépression résistante et améliorer la prévention du risque suicidaire.
Procédures
L'ensemble des animaux de cette étude sera soumis à un suivi expérimental longitudinal s'étendant sur une période de 83 à 138 jours, incluant des épreuves comportementales ou physiologique quotidiennes et divers traitements pharmacologiques temporaire. Le suivi phénotypique repose sur des sessions comportementales journalières de 5 à 45 minutes, durée optimisée pour garantir la robustesse des données, complétées dans certains cas par une évaluation de l'activité du système nerveux autonome sur des périodes de 5 minutes. En fonction des objectifs expérimentaux, l'activité neuronale sera ponctuellement mesurée par photométrie de fibre lors de deux à trois sessions stratégiques réalisées avant et après les traitements. Une chirurgie stéréotaxique unique, avec ou sans manipulation du nerf vague, sera pratiquée sur 615 individus pour permettre l'implantation de dispositifs de neuro-ingénierie. Les protocoles d'administration incluent des traitements chroniques par voie orale via l'eau de boisson, tels qu'une antibiothérapie de 15 jours ou une supplémentation en corticostérone, lithium ou fluoxétine sur 28 jours. Des interventions plus aiguës seront également pratiquées, comprenant des injections intra-péritonéales répétées de diazépam sur 4 jours ou de PCPA sur 7 jours, ainsi que deux gavages du microbiote de patients alcooliques espacés d'une semaine.
Impact sur les animaux
Le projet, impliquant un total de 735 souris, présente des degrés de sévérité allant de léger à sévère selon la nature des interventions. Afin de ne pas interférer avec le développement des phénotypes anxio-dépressifs recherchés, tous les animaux ne bénéficieront d'aucun enrichissement environnemental. Une partie de la cohorte est dédiée à la modélisation des troubles affectifs. Les animaux témoins sont soumis à des injections intra-péritonéales et à des tests comportementaux dont le stress transitoire, lié à la manipulation est classé en sévérité légère. Les animaux expérimentaux subissent, en complément, un protocole de stress chronique par supplémentation de corticostérone dans l’eau de boisson. Ce traitement, visant l'induction d'un phénotype anxio-dépressif stable, porte le degré de nuisance à modéré. Pour l'étude des circuits neuronaux, des groupes d'animaux subissent une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale afin d'injecter des rapporteurs calciques et d'implanter des fibres optiques. Le suivi par photométrie de fibre impose un couplage physique à un câble optique lors des tests, pouvant induire une gêne motrice. En raison du caractère invasif de la chirurgie et des contraintes liées aux enregistrements longitudinaux, ces interventions sont classées en nuisances modérées. Dans certains protocoles, l'ajout d'une étape de punition par chocs électriques de faible intensité — bien qu'évitables par l'animal — renforce cet état de stress, maintenant la classification en sévérité modérée. Les procédures liées à la consommation volontaire d'alcool atteignent un degré de nuisances sévères en raison du cumul de plusieurs facteurs de stress chroniques. Aux stress des tests comportementaux, de la chirurgie stéréotaxique, des enregistrements de photométrie et gavage ; s’ajoute l’isolement social. Les animaux sont logés individuellement pendant cinq semaines. Ce mode d'hébergement individuel est choisi pour faciliter l'auto-administration d'éthanol et exacerber les phénotypes anxio-dépressifs au sevrage.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées en fin d'expérience pour collecter et analyser ultérieurement leurs cerveaux et/ou organes périphériques (foie, intestin).
Remplacement
L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. Le modèle animal reste le seul recours pour comprendre les mécanismes neuronaux intégrés tels que ceux sous tendant les altérations émotionnelles, cognitives et physiologiques dans l’anxiété, la dépression avec ou sans conduites suicidaires et le mésusage d’alcool et qui ne peuvent être modélisés in vitro ou in silico à ce jour.
Réduction
Le projet s’inscrit dans une approche de réduction et de raffinement des procédures d’évaluation des comportements de type anxieux et dépressif. Il se propose de vérifier la stabilité des comportements d’échappement Pavlovien ou opérant au cours de tests répétés. Une telle configuration permet l’utilisation des mêmes animaux pour l’évaluation de différentes stratégies thérapeutiques qui nécessiterait autrement l'utilisation d’un plus grand nombre d’animaux avec les outils actuels. Le nombre d’animaux pour chaque expérience a été choisi de manière à concilier la réduction du nombre d’animaux utilisés, tout en conservant un pouvoir statistique suffisant pour une interprétation raisonnable des données. Les études de traitements pharmacologiques sur le comportement et les activités physiologiques au niveau central et autonomique sera fait entre groupes et au sein du même groupe ce qui ne peut se faire d’après nos propres expériences et de la littérature qu’avec des analyses statistiques sur des populations d’un minimum de 15 souris par groupe.
Raffinement
Les évaluations émotionnelles, autonomiques et cognitives dans ce projet sont beaucoup moins invasives que les procédures équivalentes qui existent à ce jour. La plupart des procédures présentées ici remplacent les stimulations aversives par choc électrique par des stimulations sonores désagréables mais non douloureuses. Les évaluations autonomiques sur animal éveillé utiliseront un système non invasif récemment mis au point, remplaçant les enregistrements par capteur à demeure implanté sous anesthésie par des enregistrements par contact des pattes sur une grille, permettant ainsi de se dispenser de chirurgie d’implantation. De plus, en comparant l'état général du bien-être des souris avec les enregistrements non invasifs de leur activité autonomique, ce projet permettra d'évaluer la pertinence de cette dernière comme indice précoce d'une détérioration du bien-être animal Pour évaluer le bien-être des animaux, le suivi clinique quotidien sera évalué par un score de 0 à 2 pour chacune des 5 composantes suivantes : apparence (qualité du poil, propreté des yeux et du nez), posture et mobilité, comportement dans la cage d’hébergement et signes cliniques comme présenté dans l’annexe 1. Lorsque le total des différents scores sera supérieur à 8, il sera considéré que les animaux ont atteint un point limite et seront sacrifiés pour mettre fin à leur souffrance. La décision est prise par le responsable du projet en accord avec la structure chargée du bien-être de l'établissement utilisateur où sont hébergés les animaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris adulte comme modèle biologique repose sur les fortes homologies anatomiques et fonctionnelles du système nerveux central entre les rongeurs et l'Humain. Ces similitudes, conservées au cours de l'évolution des mammifères, concernent tant la diversité des populations cellulaires cérébrales que les processus moléculaires sous-jacents aux fonctions supérieures. Le modèle murin constitue ainsi un outil translationnel de référence pour l'étude des mécanismes cellulaires et le développement de stratégies pharmacologiques ciblant les altérations émotionnelles, cognitives et décisionnelles. Le choix de la souris adulte est ici impératif, ce stade de maturité étant le seul à garantir l’expression complète et stable du répertoire comportemental complexe (anxiété, dépression, processus décisionnels). L’utilisation exclusive d’animaux adultes permet ainsi d’étudier des mécanismes physiopathologiques pleinement établis.
Étude du dérèglement du système immunitaire dans les maladies du sang
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris de ce projet reçoivent des cellules modifiées en laboratoire qui déclenchent chez elles une maladie de la moelle osseuse, avec anémie, grosse rate, baisse d'activité et perte de poids progressive. 2 190 souris vont être exploitées, 930 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 1 260 dans des procédures d'un niveau modéré. Une irradiation prépare la prise de greffe, un morceau d'oreille est prélevé pour le génotypage, un prélèvement sanguin suit l'évolution de la maladie, et les animaux immunodéprimés sont maintenus en cages individuelles ventilées. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'étude de cette maladie du sang exige un "organisme entier", et toutes les souris sont tuées au terme du projet, une partie seulement après avoir servi à ses étapes ultérieures.
Objectifs
La myélofibrose (MF) est une maladie chronique de la moelle osseuse caractérisée par une cicatrisation progressive de la moelle, un dysfonctionnement des cellules souches sanguines et une prolifération anormale de certains types de cellules sanguines. Cette étude utilise un modèle murin de MF afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans la maladie. Nous nous intéressons en particulier à l’influence de certaines protéines liées à l’inflammation sur le développement de la MF. Les résultats de cette recherche pourraient permettre d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ralentir l’évolution de la maladie et améliorer la prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
La myélofibrose (MF) est une maladie grave de la moelle osseuse qui réduit fortement l’espérance de vie des patients. Les traitements actuels ne permettent pas de stopper complètement la progression de la maladie ni de restaurer la production normale de cellules sanguines, et certains patients peuvent développer une leucémie incurable. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes qui participent à la progression de la MF en ciblant plus particulièrement l’inflammation et un déséquilibre dans le métabolisme des protéines, l’objectif étant de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la production de cellules sanguines normales. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de limiter la progression de la MF, améliorer les symptômes des patients, et ouvrir la voie à des traitements plus efficaces, voire potentiellement curatifs.
Procédures
Les souris recevront une irradiation unique de courte durée, d’intensité modérée, afin de permettre la prise de greffe des cellules transplantées. Elles recevront ensuite une injection unique de cellules. Un prélèvement sanguin sera réalisé au cours de l’expérimentation afin d’évaluer l’évolution de la maladie.Prélèvement de sang : 5 s
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent être observés chez les animaux. Les principaux effets attendus sont les suivants : • Stress léger et douleur mineure liés aux manipulations : la contention, les injections et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress transitoire et une gêne modérée et de courte durée. • Gêne locale liée au prélèvement de biopsie pour génotypage : un petit prélèvement de tissu (oreille) réalisé afin de déterminer le profil génétique des animaux peut occasionner une douleur légère et transitoire ainsi qu’un stress bref. • Développement progressif d’une maladie expérimentale du sang: les souris recevant des cellules modifiées en laboratoire peuvent présenter une altération de l’état général, une splénomégalie, une diminution des globules rouges (anémie), une réduction de l’activité ou une perte de poids progressive, caractéristiques de ce modèle expérimental.
Devenir
À l’issue de la première étape du projet, une partie des animaux sera maintenue en vie afin de poursuivre les travaux expérimentaux ultérieurs. Les autres animaux seront mis à mort conformément à la réglementation en vigueur. À la fin des étapes suivantes du projet, les animaux seront mis à mort afin de permettre l’analyse des organes et des cellules nécessaires à l’étude de la maladie sanguine modélisée dans ce projet.
Remplacement
Remplacer: certaines expériences préliminaires ont été réalisées sur des cellules en culture lorsque cela était possible. Cependant, l’étude de cette maladie du sang nécessite un organisme entier afin de comprendre son évolution et ses effets sur différents organes.
Réduction
Réduire: le nombre d’animaux a été strictement calculé afin d’obtenir des résultats fiables tout en évitant l’utilisation d’animaux supplémentaires. Lorsque cela est possible, plusieurs analyses seront réalisées à partir des mêmes animaux.
Raffinement
Raffiner: les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien par du personnel qualifié. Des mesures de soutien seront mises en place si nécessaire (hydratation complémentaire, enrichissement alimentaire). Des critères d’arrêt précis permettront d’éviter toute souffrance prolongée, et les animaux seront hébergés dans des conditions adaptées à leurs besoins physiologiques et comportementaux.Les animaux immunodéprimés seront hébergés dans des cages individuelles ventilées, permettant de maintenir un environnement contrôlé et filtré. Ce système limite leur exposition aux agents pathogènes présents dans l’environnement et contribue ainsi à leur protection et à leur bien-être tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car sa similitude génétique et physiologique avec l’Homme permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et d’en tirer des conclusions pertinentes pour la santé humaine. De plus, de nombreux outils expérimentaux, comme les anticorps ou les techniques d’imagerie, sont disponibles pour travailler avec les souris. Le modèle de souris que nous utilisons est bien caractérisé dans la littérature ainsi que dans notre centre de recherche. Il est particulièrement adapté à l’étude de la myélofibrose, car il reproduit de manière fiable les principales caractéristiques de la maladie, comme la fibrose de la moelle osseuse, les anomalies de la production sanguine et l’inflammation. Les souris mâles et femelles seront utilisées à partir de 12 semaines, soit l’âge adulte, lorsque leur système immunitaire est pleinement développé.
Caractérisation de l’évolution temporelle des déficits de plasticité synaptique et de l’inflammation dans l’hippocampe après un AVC chez la souris adulte
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale pour provoquer un accident vasculaire cérébral, puis une seconde chirurgie terminale, sans réveil, dont leur cerveau est prélevé. L'hypothèse testée porte sur la propagation de l'inflammation vers l'hippocampe et les troubles de mémoire tardifs, les retombées annoncées pour la santé humaine restant renvoyées à de futures recherches sur des traitements. Le porteur décrit un infarctus cortical limité qui "ne s'accompagne typiquement pas des symptômes majeurs, rendant le modèle facilement utilisable tout en limitant la souffrance animale", et classe pourtant l'ensemble de ces 1 040 souris en souffrance modérée.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral (AVC) résulte d'une interruption du flux sanguin dans une zone du cerveau, provoquant la mort cellulaire ainsi qu’une réaction inflammatoire dans cette région cérébrale. Les dommages induits produisent des symptômes qui se manifestent à court terme, tels que des déficits moteurs ou des difficultés à parler. Cependant, les dommages initialement induits par l’AVC dans une zone spécifique pourraient se propager dans d’autres aires cérébrales induisant ainsi de nouveaux symptômes. En fait, 70 % des survivants d'un AVC développent des troubles tels que des déficits de mémoire, des difficultés à intégrer de nouvelles informations ou à s’adapter à de nouvelles situations. Ces symptômes se manifestent tardivement, de quelques semaines à quelques mois après l’AVC, ce qui offre la possibilité d’intervenir avec un traitement. Une bonne compréhension des mécanismes qui sous-tendent les troubles de mémoire se manifestant après l’AVC est donc nécessaire pour le développement de stratégies permettant d’éviter leur survenue. Nous émettons donc l’hypothèse que la propagation de l’inflammation de la zone initialement affectée par l’AVC aux autres régions du cerveau pourrait être à l’origine de l’altération des certaines fonctions importantes pour la mémoire et l’apprentissage. Dans cette étude, nous testons cette hypothèse en induisant un AVC limité à une région précise du cerveau d’un modèle de souris afin d’étudier l’évolution des conséquences. Nous pourrons ainsi établir des liens entre les différentes modifications observées dans le cerveau, notamment dans des régions qui ne sont pas touchées directement par la lésion, afin d’identifier les mécanismes qui pourraient sous-tendre l’apparition des troubles de mémoire.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à caractériser et comprendre les phénomènes après AVC au-delà de la zone initialement affectée. Cette compréhension est nécessaire afin d’établir de solides bases pour de futures recherches sur l’établissement de nouveaux traitements pour prévenir certains troubles de mémoire tardifs et pourrait avoir des répercussions positives et importantes pour la recherche préclinique. Les bénéfices attendus sont donc au profit de la santé humaine.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une chirurgie pour induire l’AVC sous anesthésie générale (environ 45 minutes). Ensuite, toutes les expériences prévoient une chirurgie terminale sans réveil.
Impact sur les animaux
La méthode utilisée induit un infarctus cortical limité et ne s’accompagne typiquement pas des symptômes majeurs, rendant le modèle facilement utilisable tout en limitant la souffrance animale. Cependant, suite à la chirurgie, une perte de poids due à des douleurs post opératoires pourrait être observée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récolter les cerveaux afin d'étudier les mécanismes sous-jacents la mémoire ou l'inflammation
Remplacement
Il n’existe pas encore, à ce jour, de modèle alternatif à l’induction d’AVC chez la souris suffisant pour reproduire les mécanismes complexes présents dans la pathologie humaine, impliquant notamment des structures sophistiquées comme la vascularisation cérébrale
Réduction
Le déroulement des expériences est organisé afin de limiter au maximum le nombre d’animaux : certaines séries d’expériences seront effectuées sur la base de données obtenues dans des expériences précédentes. Le nombre de souris a été évalué sur la base de travaux précédents et à l’aide de tests statistiques, en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (au cours de la chirurgie, pendant la préparation des échantillons).
Raffinement
Chaque étape du projet est étudiée de manière à limiter au maximum la souffrance ou l’inconfort des animaux. Une analgésie et anesthésie appropriées sont réalisées sur les animaux, ainsi qu’une asepsie du site opératoire. Pour prévenir l’hypothermie pendant la chirurgie, l’animal est réchauffé. Suite à la chirurgie, une surveillance post-opératoire est mise en place, avec des critères d’arrêt des souffrances, soins conservatoires et un arbre décisionnel établi. Dans des études précédentes, le nombre d’animaux qui ont montré des signes souffrance dus à l’induction de l’AVC était très limité (moins de 3%).
Choix des espèces
Le modèle envisagé a déjà été induit chez la souris et il a été démontré que les AVC s’accompagnaient de modifications dans des structures du cerveau pas initialement lésées, mais connecté à la région lésée. Ce modèle permet de produire des tranches de cerveau pour réaliser des études afin d’explorer des modifications dans d’autres régions du cerveau pas encore étudiées. Nous utiliserons des souris âgées de 16-24 semaines. Cette tranche d’âge permet d’étudier les conséquences d’un AVC chez un animal adulte. Nous utilisons des animaux adultes puisque, pour étudier les conséquences d’un AVC, les circuits neuronaux et vasculaires doivent être complètement développés.
Etude fonctionnelle des amétropies liées à l’albinisme oculocutané dans le modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Treize anesthésies générales par animal, dont neuf pour nettoyer un dispositif optique posé sur l'œil : 320 souris albinos génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour la moitié et modéré pour l'autre. Une partie subit une chirurgie de quarante-cinq minutes installant ce système destiné à provoquer une myopie, puis des contentions manuelles répétées chaque semaine pendant six semaines. Le porteur signale des pertes de poids, des infections, des douleurs postopératoires, un assèchement oculaire lié au port prolongé du cadre à lunettes, et des détresses sociales pour les animaux hébergés seuls. L'enjeu déclaré consiste à comprendre pourquoi certaines personnes atteintes d'albinisme deviennent myopes et d'autres hypermétropes, et toutes les souris sont tuées pour récupérer leurs yeux, le porteur indiquant que leur modification génétique interdit toute réutilisation.
Objectifs
L’albinisme oculocutané (OCA) est une maladie d’origine génétique caractérisée par une perte des capacités visuelles. Les personnes atteintes d’OCA développent de nombreuses altérations visuelles handicapantes incluant différentes formes d’amétropies (atteinte de la géométrie de l’œil, causant un déplacement anormal du point focal) et d’intensité variable : l’astigmatisme (jusqu'à 90 pourcent des patients), l’hypermétropie (variable entre 36 et 77 pourcent des patients), et plus rare, la myopie. Cependant, les raisons précises pour lesquelles certains patients atteints d’OCA vont développer une hypermétropie ou une myopie malgré des causes génétiques similaires restent inconnues. Ce projet aura donc pour but d’étudier les différentes formes d’amétropies et leurs mécanismes biologiques associés, dans le modèle murin.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est d’aboutir à une meilleure caractérisation de la survenue de soit l’une ou l’autre forme d’amétropie (myopie ou hypermétropie) au cours d’un albinisme oculocutané. Définir l’existence de ces deux différentes formes d’amétropies dans le modèle souris est un prérequis important pour le développement de futures études mécanistiques et thérapeutiques. A terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait permettre une meilleure prise en charge des patients, plus précoce et personnalisée, et améliorer leur confort visuel.
Procédures
Certains animaux auront des mesures de myopie (d’une durée de 10 minutes par animal) induisant une contention manuelle régulière et répétée une fois par semaine pendant au maximum 6 semaines, soit 7 fois au total. Tous les animaux auront 3 examens d’imagerie au total (d’une durée de 30 minutes), nécessitant une anesthésie générale de l’animal. Les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire (plusieurs injections). Certains animaux subiront une chirurgie permettant d’installer un système optique afin d’induire la myopie. Cette technique nécessite une anesthésie générale (d’une durée de 45 minutes). Par la suite ces animaux auront jusqu’à 3 anesthésies par semaine (d’une durée de 5 minutes par animal) pendant 3 semaines pour le nettoyage de ce système et des yeux des animaux, soit 9 anesthésies générales. Ces animaux subiront donc au total 13 anesthésies générales (1 de chirurgie, 9 de nettoyage et 3 d’examens d’imagerie). A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des contentions manuelles répétées et relativement longues pouvant entrainer un stress chez l’animal. Certains des animaux seront soumis à de la chirurgie. Les techniques chirurgicales peuvent mener à des pertes de poids, des infections, douleurs post-opératoire, perte de sang. Ces mêmes animaux subiront des anesthésies générales répétées par pouvant causer un risque léger d’hypothermie, d’insuffisance respiratoire et arrêt cardiaque. Port du cadre à lunettes : le port prolongé de l’appareil peut induire une gêne et un assèchement oculaire. Certains animaux seront placés en hébergement individuel, ce qui peut entraîner des détresses sociales.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire car il s'agit d'animaux génétiquement modifiés ne pouvant être réutilisés pour d'autres projets ou pour l'accouplement. De plus les yeux des animaux seront récupérés pour analyses post-mortem.
Remplacement
L’induction et l’étude de la myopie ainsi que la caractérisation phénotypique nécessite un œil complet, en 3D, avec sa rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, cristallin, iris, humeur aqueuse). Aucune méthode alternative ex vivo ne permet d’obtenir ce matériel.
Réduction
Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour le projet en nous basant sur les données de la littérature scientifique. Certaines procédures nécessitent l’utilisation d’imagerie sur différents temps, qui sera réalisé de manière longitudinale de sorte de réduire le nombre d’animaux utilisés. Aucune étude n’a montré d’influence claire du sexe sur l’albinisme et la myopie, les animaux mâles et femelles seront donc utilisés indistinctement. Nous utiliserons comme témoins des animaux contrôles hétérozygotes pour le gène d’intérêt. Le nombre d’animaux indiqué dans chaque procédure a été estimé sur la base d’expériences similaires effectuées dans notre équipe et en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe), des contraintes techniques, des contraintes de contrôles. Nombre total d’animaux nécessaires : 320 animaux
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront sevrés à 21 jours après la naissance, puis placés dans des cages (5 maximum/cage) avec de l’enrichissement. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. De la gelée post-opératoire sera mise à disposition si nécessaire, notamment en post-opératoire. Seul le personnel qualifié sera habilité à gérer l’hébergement des animaux. Des points limites précoces et prédictifs ont été définis et les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et par l’expérimentateur habilité. Un système d’étiquettes assurera le suivi du bien-être des animaux, et les informations concernant les animaux seront mutualisées sur le logiciel de gestion de l’animalerie. Pour éviter toute souffrance, les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire. La durée et dose des traitements seront réalisées par du personnel habilité selon les protocoles préétablis, validés par la Structure chargée du Bien-Etre Animal et maitrisés par l’équipe.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle souris car nous avons besoin de modèles génétiques particuliers pour l’albinisme qui n’existent que dans cette espèce. De plus, la myopie et les méthodes d’induction de myopie sur cette espèce sont bien renseignées et validées par la communauté scientifique. Pour étudier le développement de l’œil, certaines mesures effectuées ne commencent à être fiables qu’à partir de 3 semaines d’âge, lorsque l’animal est sevré ; avant cela, l’œil est trop petit. En général, le développement réfractaire des souris se termine autour de 6 semaines. Pour nous assurer d’avoir dépassé la période critique du développement, nous poursuivrons la mesure jusqu’à 9 semaines d’âge. L’induction de la myopie est plus efficace si elle débute entre 3 et 4 semaines d’âge car l’œil y est encore en phase de croissance critique.
Effets de l’aromathérapie sur le stress lié au transport chez la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Transportées pendant deux heures avec ou sans diffusion d'une odeur présentée comme apaisante, 36 souris passent ensuite dix minutes en champ ouvert puis cinq minutes dans un labyrinthe en croix surélevée, trois fois au total, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le projet mesure le stress provoqué par le transport et vérifie si les animaux retrouvent un état stable après la semaine d'acclimatation habituelle, durée que le porteur décrit comme admise sans vérification réelle. Les bénéfices annoncés joignent l'amélioration du bien-être des animaux non-humains transportés et une meilleure fiabilité des résultats scientifiques. Aucune souris n'est tuée dans ce projet, leur état de santé restant intact, ce qui permet de les réutiliser ensuite dans d'autres protocoles.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment le transport influence le stress chez les souris utilisées en recherche, et de déterminer si l’utilisation d’odeurs apaisantes peut réduire ce stress. Le transport est une étape fréquente mais potentiellement stressante pour les animaux. Il peut modifier leur comportement (activité, exploration, anxiété) ainsi que leur état physique (poids, indicateurs biologiques du stress). Ces effets peuvent durer dans le temps et influencer les résultats des expériences. Pourtant, cette phase reste encore peu étudiée, et on considère souvent, sans réelle vérification, que les animaux retrouvent un état normal une semaine après leur arrivée au laboratoire (durée généralement utilisée). Le projet a donc plusieurs objectifs : - mesurer les effets du transport sur le comportement et l’état émotionnel des souris ; - identifier les paramètres les plus affectés par ce stress ; - tester si une odeur décrite comme apaisante utilisée pendant le transport permet de limiter ces effets. Un suivi dans le temps permettra également de vérifier combien de temps est réellement nécessaire pour que les animaux retrouvent un état stable après le transport. À terme, ce projet vise à améliorer le bien-être des animaux et à proposer des solutions simples pour réduire le stress lié au transport, permettant in fine, d’améliorer la fiabilité des résultats scientifiques.
Bénéfices attendus
En comparant des animaux de différents groupes (déjà présents au laboratoire (non transportées), transportées dans des conditions classiques, transportées avec une odeur supposée apaisante). Ce projet permettra de mieux comprendre l’impact réel du transport, de déterminer le temps nécessaire pour que les animaux retrouvent un état normal (et peut-être raccourcir ou allonger la durée conseillée pour l’acclimatation des animaux), de vérifier si l’odeur réduit le stress et/ou accélère la récupération. À terme, ces résultats pourraient améliorer les conditions de transport et le bien-être des animaux, tout en rendant les résultats scientifiques plus fiables et plus homogènes.
Procédures
Les interventions sont simples et non invasives. Elles comprennent des manipulations douces, le transport (avec ou sans odeur), la collecte d’excréments et des tests comportementaux. Le transport dure environ 2 heures. Les tests comportementaux sont réalisés trois fois : • test d’activité et d’exploration en openfield (10 minutes) ; • test d’anxiété en labyrinthe en croix surélevée (5 minutes). La durée totale des tests est d’environ 15 minutes par session. Un suivi quotidien est également réalisé (observation de l’état général et pesée), pour une durée d’environ 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets attendus sont limités et principalement liés au stress du transport et des tests comportementaux, notamment les premiers qui seront réalisés juste après le transport. Le transport peut provoquer un inconfort temporaire (bruit, vibrations, manipulation), entraînant une augmentation passagère de l’anxiété ou de l’activité (nuisance légère). Les tests comportementaux peuvent générer un léger stress lié à un environnement nouveau, mais ils ne provoquent ni douleur ni blessure (nuisance légère). L’odeur utilisée pourrait être désagréable pour certains animaux, mais les quantités seront adaptées pour éviter tout effet nocif (nuisance légère).
Devenir
Les animaux ne subissent aucune procédure invasive ni douloureuse. Leur état de santé n’est pas altéré, ce qui permet leur réutilisation dans d’autres projets, conformément à la réglementation.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est nécessaire car le projet étudie des comportements et des réactions au stress dans une situation réelle (le transport). Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits par des méthodes alternatives comme des cultures de cellules ou des modèles informatiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au strict minimum nécessaire. Chaque animal est suivi dans le temps, ce qui permet de recueillir plusieurs données sur le même individu et d’avoir des données répétées à analyser, tout en évitant d’utiliser des lots d’animaux différents . Les méthodes d’analyse choisies permettent d’exploiter au mieux les données et contribuent à limiter le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Les procédures sont non invasives et conçues pour limiter le stress. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé et les tests sont courts et adaptés aux animaux. Le projet vise lui-même à améliorer les conditions de transport, ce qui constitue une démarche de raffinement.
Choix des espèces
La souris est une espèce couramment utilisée en recherche, notamment pour l’étude du stress et du comportement. Son comportement est bien connu et les tests utilisés sont adaptés à cette espèce. Elle est également souvent transportée dans le cadre des pratiques habituelles en laboratoire, ce qui en fait un modèle pertinent pour étudier l’impact du transport. Les animaux utilisés sont adultes afin d’éviter les effets liés au développement, qui pourraient influencer les résultats.
Rôle de DICER dans l’homéostasie du muscle squelettique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Gavées quotidiennement pendant sept jours, injectées dans l'abdomen, soumises à un test de force d'agrippement, 360 souris privées de micro-ARN dans leurs fibres musculaires vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 240 d'entre elles et modéré pour 120. Le porteur conclut que ces interventions restent "transitoires et réversibles, sans conséquence durable sur la santé des animaux", tout en indiquant que ces souris présentent une faiblesse musculaire et qu'une alimentation en gel sera ajoutée dans la cage de celles qui n'accèdent plus normalement à la nourriture. Deux traitements aux glucocorticoïdes, prednisone par gavage et dexaméthasone par injection, servent à mesurer la part de l'inflammation dans les atteintes musculaires. Toutes sont tuées à l'issue, pour prélever leurs muscles et d'autres tissus.
Objectifs
Les micro-ARN (ou miARN) sont de très petites molécules présentes dans nos cellules, qui jouent un rôle important pour contrôler le fonctionnement des gènes. Ils agissent un peu comme des interrupteurs qui ajustent la production de protéines selon les besoins de la cellule. On sait déjà qu’ils sont essentiels pour la formation des muscles pendant le développement de l’embryon, mais on connaît encore mal leur rôle une fois que le muscle est formé, notamment chez l’adulte. Dans ce projet, nous utilisons un modèle de souris dans lequel les micro-ARN sont supprimés uniquement dans les fibres musculaires, grâce à la désactivation d’un gène appelé Dicer, nécessaire à leur fabrication. Cela nous permettra d’observer comment les muscles réagissent lorsqu’ils ne peuvent plus produire ces petites molécules : leur structure, leur force, et leur capacité à bien fonctionner au quotidien. L’objectif est de mieux comprendre comment les micro-ARN participent à l’équilibre et à la santé du muscle. À plus long terme, ces recherches pourraient aider à développer de nouvelles pistes pour prévenir ou traiter certaines maladies qui provoquent la faiblesse ou la dégénérescence musculaire.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mieux comprendre le rôle des micro-ARN, de petites molécules qui aident les cellules à fonctionner correctement, dans la santé du muscle après la naissance. Nous nous intéressons plus particulièrement à leur influence sur la structure des fibres musculaires et sur la régulation de l’inflammation au sein du muscle. Pour cela, nous étudierons des souris chez lesquelles ces micro-ARN sont absents dans les fibres musculaires. En observant ces souris à différents âges (4 semaines, 2 mois et 8 mois), nous pourrons suivre l’évolution des éventuelles altérations du muscle et identifier les périodes où ces petites molécules jouent un rôle clé. Grâce à des analyses précises des tissus et des protéines musculaires, nous chercherons à comprendre quels mécanismes sont touchés par la perte des micro-ARN. Nous testerons également deux traitements anti-inflammatoires à base de glucocorticoïdes (prednisone par gavage et dexaméthasone par injection intrapéritonéale) afin d’évaluer dans quelle mesure l’inflammation contribue aux altérations musculaires observées. En résumé, ce projet permettra de mieux comprendre comment le muscle adulte garde son équilibre et se protège au fil du temps. Ces connaissances pourraient, à terme, aider à développer de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter certaines maladies musculaires liées à la dégénérescence ou à une inflammation chronique.
Procédures
1) Gavage oral : administration quotidienne pendant 7 jours consécutifs et habituation pendant 3 jours en amont (environ 30 secondes à 1 minute par souri). 2) Injection intrapéritonéale (IP) : administration quotidienne pendant 7 jours consécutifs (selon le groupe, 30 secondes maximum par souris). 3) Prélèvement sanguin : effectué une seule fois par animal, au moment prévu après le GRIP test et avant l'euthanasie (environ 30 secondes à 1 minute par souri). 4) GRIP test : réalisé une seule fois par animal, conformément au calendrier expérimental (environ 20 seconds par souris). 5) Contention : utilisée pendant les manipulations nécessaires (gavage, IP, prélèvement sanguin, GRIP test) uniquement pour la durée de l’intervention (environ 10 à 20 secondes par souris).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les différentes interventions expérimentales peuvent entraîner des effets indésirables ou des gênes temporaires pour les animaux. Le gavage oral, peut provoquer un léger stress transitoire, une gêne liée à la contention, ainsi que de petites irritations de l’œsophage et, plus rarement, de brèves complications respiratoires. Une légère perte de poids ou des variations temporaires du comportement alimentaire peuvent également survenir. L’injection intrapéritonéale peut provoquer un inconfort local au point d’injection et un stress léger lors de la manipulation, ainsi que, très rarement, une irritation ou inflammation locale. Le prélèvement sanguin nécessite une immobilisation brève, pouvant entraîner un stress léger et passager, et une gêne locale mineure au point de ponction, sans douleur durable ni lésion significative. Le GRIP test implique également une courte contention et une mobilisation des membres, ce qui peut occasionner un stress transitoire et une fatigue musculaire passagère. Dans l’ensemble, toutes ces interventions entraînent un niveau de contrainte modéré, avec des effets transitoires et réversibles, sans conséquence durable sur la santé des animaux.
Devenir
À l’issue des différentes procédures expérimentales, tous les animaux seront euthanasiés de manière conforme aux recommandations réglementaires (arrêté du 1er février 2013, annexe IV de la directive 2010/63/UE). Cette étape est nécessaire afin de prélever les muscles et autres tissus d’intérêt pour réaliser les analyses moléculaires, histologiques et biochimiques prévues dans le protocole.
Remplacement
Pour comprendre le rôle des micro-ARN dans le bon fonctionnement et l’équilibre du muscle, il est nécessaire d’étudier un organisme vivant dans son ensemble. En effet, le muscle ne fonctionne pas isolément : il dépend de nombreux types de cellules, ainsi que de facteurs hormonaux et physiologiques qui agissent ensemble pour maintenir sa structure et sa force. Aujourd’hui, il n’existe aucun modèle en laboratoire (in vitro) capable de reproduire fidèlement ces interactions complexes entre les cellules du muscle et leur environnement. C’est pourquoi l’utilisation d’un modèle vivant (in vivo) est indispensable pour obtenir des résultats fiables et représentatifs du fonctionnement réel du muscle. La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce type d’étude, car son organisation musculaire et sa fonction contractile sont très similaires à celles de l’être humain. Cela permet de mieux comprendre les mécanismes en jeu chez l’Homme et, à terme, de favoriser le développement de nouvelles approches thérapeutiques contre les maladies musculaires.
Réduction
Les recherches précédentes menées dans notre laboratoire ont permis d’acquérir une solide expérience du modèle utilisé et de la méthodologie expérimentale. Cela nous permet aujourd’hui de réaliser des expériences précises, bien contrôlées et de qualité, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux nécessaires. Chaque expérience sera menée sur un nombre réduit de souris, défini pour garantir à la fois la fiabilité scientifique et le respect du bien-être animal. Pour chaque animal, une patte servira aux analyses moléculaires et l’autre aux observations histologiques, ce qui évite de multiplier les animaux pour différentes analyses. Ce choix garantit donc une utilisation raisonnée et éthique des animaux.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement afin de vérifier leur état général. Bien que les souris utilisées dans ce projet puissent présenter une légère faiblesse musculaire, les études précédentes ont montré qu’elles conservent une bonne mobilité et peuvent se nourrir et s’hydrater normalement. Leur déplacement sera toutefois surveillé régulièrement pour repérer tout signe de difficulté (ralentissement, boitement ou absence de mouvement). Avant le début des traitements, les animaux seront habitués au GRIP test et au gavage pendant une semaine, afin de réduire le stress et faciliter la tolérance à ces manipulations. En cas de gêne, des mesures rapides seront prises pour éviter toute souffrance inutile. Si un animal montre des signes de faiblesse empêchant un accès normal à la nourriture, une alimentation en gel sera ajoutée directement dans la cage pour faciliter la prise alimentaire. En cas de perte de poids ou si un point limite de souffrance est atteint, l’animal sera immédiatement euthanasié de manière rapide et indolore, conformément aux recommandations éthiques. Le traitement médicamenteux administré est habituellement bien toléré et ne provoque pas d’effets indésirables significatifs. Le prélèvement sanguin, réalisé sur une petite veine de la tête, représentera un volume très minime de sang et sera effectué au moment de l’euthanasie afin d’éviter tout stress ou inconfort supplémentaire.
Choix des espèces
Les études réalisées uniquement sur des cellules en culture ne permettent pas de comprendre le rôle des micro-ARN dans la structure et le bon fonctionnement du muscle, ni d’observer les interactions naturelles entre les différentes cellules qui composent le tissu musculaire. Les modèles de muscles reconstitués en laboratoire (appelés muscle-on-chip ou organoïdes) sont encore en développement et ne reproduisent pas fidèlement le comportement des micro-ARN ni la complexité des échanges cellulaires observés dans un organisme vivant. Ces limites rendent difficile l’étude précise des mécanismes biologiques impliqués dans la régulation du muscle. C’est pourquoi nous avons choisi d’utiliser la souris, un modèle reconnu et bien documenté, pour lequel tous les outils génétiques et moléculaires nécessaires à cette étude sont disponibles. La sélection de différents stades – 4 semaines, 2 mois et 8 mois – permet d’observer l’évolution des altérations musculaires au fil du temps : 4 semaines correspond à l’âge post-sevrage, où les premières modifications du muscle peuvent être détectées ; 2 mois représente l’âge jeune adulte, période où la fonction musculaire est stabilisée ; et 8 mois correspond à un âge adulte intermédiaire, permettant d’évaluer l’impact à plus long terme de l’absence de micro-ARN sur la structure et la physiologie du muscle. De plus, la grande similarité entre la souris et l’être humain (environ 99 % des gènes sont communs) permet d’obtenir des résultats pertinents et transposables à la compréhension des maladies musculaires humaines.
Traitement avec de nouvelles molécules inhibitrices sur des modèles de souris xénogreffées avec des cellules leucémiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris utilisées sont immunodéficientes, ce qui permet d'y implanter des cellules leucémiques prélevées sur des patients pour qu'elles développent la maladie. 210 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Après la transplantation, chacune reçoit quatre injections de polychimiothérapie et de molécules inhibitrices sur animal éveillé, puis un prélèvement sanguin trente-cinq jours plus tard. Elles sont tuées pour prélever moelles osseuses et rates et y doser les cellules leucémiques restantes, ou plus tôt si les points limites sont atteints.
Objectifs
La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL) est un cancer du sang. Elle représente environ 1,5 nouveau cas pour 100000 habitants par an, soit environ 1000 nouveaux cas par an en France. Elle se déclare en majorité chez l’enfant de 2 à 5 ans, 75% des malades ont moins de 18 ans. La LAL représente 30% des cancers de l’enfant. Malgré les améliorations du traitement des LAL, les taux de rechute restent élevés (de l’ordre de 20%). Ainsi, pour traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Dans ce projet, nous transplantons des cellules leucémiques issues de patients dans des souris immunodéficientes. Ces souris développent alors la maladie, permettant ainsi de créer des modèles de xénogreffes. Ces modèles sont utilisés pour étudier, en phase préclinique, l’effet thérapeutique de nouvelles molécules anticancéreuses inhibitrices. Comme cela est fréquemment observé après des traitements de polychimiothérapie chez les enfants, des cellules leucémiques résiduelles peuvent persister dans la moelle osseuse. Ce phénomène est également observé dans nos modèles de souris xénogreffées. Dans ce projet, nous étudierons si de nouvelles molécules inhibitrices peuvent renforcer l’efficacité de la polychimiothérapie et permettre l’élimination de ces cellules résistantes.
Bénéfices attendus
En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de leucémies, nous avons identifié de nouveaux composés qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs efficacités, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne donc la découverte de nouvelles molécules inhibitrices et donc de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des Leucémies Aiguës Lymphoblastiques.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à des transplantations de cellules leucémiques. Une seule injection est prévue par souris, durée de 5 minutes par injection. Après la transplantation, des injections de polychimiothérapies et des molécules inhibitrices spécifiquement testées dans ce projet se feront sur animaux vigiles. Quatre injections par souris sont prévues, durée par injection de 5 minutes. Trente-cinq jours après la transplantation, un prélèvement de sang sur animaux vigiles est prévu. Un seul prélèvement par souris, durée du prélèvement de 5 minutes. Après euthanasie des animaux sous anesthésie, des prélèvements post mortem de rates, et de moelles osseuses seront réalisées pour effectuer des analyses.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer des cancers (leucémies), avec une multiplication proliférative des cellules leucémiques lymphoblastiques dans la moelle osseuse, le sang et la rate des animaux. Les injections et prélèvements sur animaux vigiles engendreront du stress et de la douleur au point de piqure.
Devenir
La mise à mort sera effectuée sur les animaux soit en fin de procédure, soit lorsque des points limites auront été atteints. Les animaux seront tous mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever des tissus (les moelles osseuses et les rates) afin de doser la présence des cellules leucémiques.
Remplacement
Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les inhibiteurs chimiques que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testé in vitro sur des méthodes alternatives ; sur des cellules primaires isolées de patients, ainsi que sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que ces molécules qui vont être étudiées in vivo sont fonctionnelles sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.
Réduction
Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche par : la limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour les tests sur la viabilité cellulaire, nous utiliserons des groupes de 7 souris afin de réaliser des tests ANOVA.
Raffinement
Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. Comme il s’agit d’animaux immunodéficients, un couvercle filtrant sera placé sur toutes les cages. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Après le prélèvement de sang et les injections, nous donnons des soins adéquats, la queue de la souris en légèrement pincée pendant 30 secondes pour éviter tout saignement. Les souris pour lesquelles nous avons prélevé le sang ou injecté sont placées dans une nouvelle cage et dans une litière propre. Une surveillance des animaux sera également réalisée par les expérimentateurs tout le long de la procédure (au minimum 2 fois par semaine puis tous les jours après 35 jours). Nous avons établi les points limites de nos procédures expérimentales. Les procédures d’euthanasie appropriées seront appliquées des lors où un des points limites est observé.
Choix des espèces
Pour qu’un nouveau traitement puisse être lancé en étude clinique, il est nécessaire de mener des études précliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules leucémiques provenant de patients que l’on peut transplanter à des souris immunodéficientes. Quelques semaines après l’injection, les cellules leucémiques humaines sont présentes dans la moelle osseuse et la rate des souris qui constituent un modèle d’étude reproduisant la physiopathologie de cette maladie. Ces études ne peuvent se réaliser que dans le modèle murin. L’hématopoïèse et la leucémogenèse des souris (mus musculus) est celle qui se rapproche le plus de l’homme. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules leucémiques.