Rongeurs
Évaluation de l’effet de constructions d’AAV exprimant un anticorps sur la fertilité des souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces femelles reçoivent une injection intramusculaire d'un vecteur AAV puis passent dix séances d'imagerie de bioluminescence et dix prises de sang sous anesthésie, pour mettre au point un médicament vétérinaire stérilisant présenté comme une alternative à la castration chirurgicale des chiens et chats. Le porteur inscrit le projet dans une démarche de "bien-être animal" et affirme que les souris remplacent chiens et chats aux étapes précoces, tout en prévoyant la mort des 750 souris utilisées. Il affirme qu'aucune méthode substitutive ne permet d'identifier une dose efficace et sûre.
Objectifs
Nous souhaitons réaliser des essais d’efficacité et d’innocuité chez la souris en vue de développer un médicament vétérinaire permettant une alternative à la castration chirurgicale des animaux de compagnie. L'enjeu de cette demande d’autorisation de projet s’inscrit dans un contexte de développement d’une solution alternative à une mutilation inutile et s’inscrit dans une démarche globale favorisant le bien-être animal. Outre le fait d’éviter la souffrance animale, la solution développée permettra de prévenir le recours à des euthanasies inutiles effectuées aujourd’hui sur des chiens et chats errants. Dans le respect de la règle des 3R : Afin de limiter au maximum le recours aux animaux durant ce projet, les premiers tests de sélection des candidats médicaments ont été/seront réalisés in vitro en laboratoire. Néanmoins, l'absence de méthodes substitutives à l'utilisation d'animaux permettant d’identifier aux mieux une dose efficace et sécurisée pour les animaux de compagnie font que des essais chez la souris sont justifiées. L’emploi de souris permet de remplacer l’emploi de chiens et de chats à des étapes précoces du développement. Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur réception à leurs morts : condition d'élevage des animaux adaptée, présence d'enrichissement dans les cages, visite quotidienne par du personnel qualifié. Une période d’acclimatation de 2 semaines sera respectée entre la réception des animaux et le début de la procédure. De plus lorsque cela est nécessaire les animaux seront anesthésiés et surveillés. De même, certains prélèvements pourront être effectués sur animal mort. Pour l'ensemble de la procédure, des critères d'arrêt par rapport à la souffrance strictes seront appliqués. Nous demandons pour réaliser l'ensemble de ces essais 750 animaux au total sur une période de 5 ans.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est de trouver une alternative à la castration chirurgicale qui est traumatisante pour les animaux.
Procédures
Injection intramusculaire : une fois pour un temps de 1 min Imagerie de bioluminescence : 10 fois pour un temps de 20 min avec 15 jours à 1 mois d'espacement. Prélévement de sang : 10 fois apour un temps de 1 min avec 15 jours à 1 mois d'espacement.
Impact sur les animaux
L'injection intra-musculaire d'AVV peut provoquer une inflammation en locale. La manipulation des souris et notamment l'imagerie réalisée nécessite des anesthésies gazeuses.
Devenir
Les animaux utilisés présentent un risque modèrés pour l'homme ou pour l'environement.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent pas encore être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiments biologiques mis en œuvre.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire par lot a été défini statistiquement. Il est ici de 15.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, de la douleur et/ou de l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront suivies quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter d’éventuels signes cliniques ou de mal-être. Les animaux sont hébergés dans le respect de la législation. Les conditions d’hébergements sont adaptées au statut sanitaire de ces animaux (cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. ). En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris femelles de 5 semaines (démarrant l’expérimentation à 7 semaines après 2 semaines d’acclimatation). De plus, les femelles sont plus aisément manipulables que les mâles et que nous pouvons nous limiter au genre femelle pour réduire le nombre d’animaux (dans le respect des 3R). Les hormones de reproduction étant similaires chez la souris et chez les animaux de compagnie, cette espèce est adaptée à notre étude. Les souris seront utilisées à l'âge de 7 semaines, âge pour lequel elles sont reconnues comme pubères et fertiles et dont on pourra confirmer l’induction d’une stérilisation biologique et après 2 semaines d’acclimatation.
Correction d’anomalies du développement cortical à l’aide d’ARN messagers dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
1 710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes subissent une ouverture de l'abdomen sous anesthésie pour injecter des ARN messagers dans le cerveau des embryons, et les souriceaux subissent un tatouage des coussinets et une biopsie de la queue, pour tester si ces ARN corrigent des malformations cérébrales d'origine génétique. Le porteur reconnaît que la biopsie provoque une douleur et que la chirurgie peut faire souffrir si l'analgésie est mal conduite. Il affirme que le développement du cortex ne peut être étudié qu'in vivo chez le mammifère.
Objectifs
Notre laboratoire s’intéresse au développement du cortex cérébral. Des anomalies génétiques chez l’homme affectant les processus de prolifération et différentiation cellulaire peuvent aboutir à des malformations du cerveau. Des études nous ont permis de mettre au point des particules d’ARN ayant la faculté d’entrer spécifiquement dans les cellules en division des cerveau embryonnaires. Ce projet vise à déterminer si cette approche est pertinente pour développer une approche thérapeutique. Nous voulons donc tester chez la souris, la capacité des ARNm à compenser la perte de 2 gènes d'intérêt et corriger les anomalies de développement du cerveau qui leur sont associées.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est de déterminer si l’utilisation d’ARN est une bonne approche thérapeutique pour corriger les anomalies cérébrales d’origine génétique.
Procédures
Les souriceaux des lignées subiront un tatouage des coussinets des phalanges et une biopsie à la queue. Les femelles gestantes de la procédure 2 subiront une anesthésie générale de 45 minutes, comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures. Des injections sous cutanées sous anesthésie d'une durée de deux minutes 2 fois par jours pendant 3 jours. Les embryons subiront une injection intra-cérébrale d'une durée de 5 secondes.
Impact sur les animaux
La biopsie à la queue provoque une douleur. Les actes chirurgicaux des procédures peuvent entrainer une souffrance si elle est mal prise en charge par le traitement analgésique. L'étape d’anesthésie peut également provoquer un stress chez l’animal
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques et génétiques.
Remplacement
Les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des cerveaux prélevés sur des embryons. Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. En effet, le développement du cortex des mammifères et de son fonctionnement ultérieur est de mieux en mieux caractérise chez la souris et aucun modelé in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d’animaux nécessaire à l’obtention d’un résultat significatif déterminés par une approche statistique.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social avant et après la procédure. La litière utilisée dans la cage est spécifique pour les animaux opérés et permet de diminuer le risque d'infection de la cicatrice. Lors des actes chirurgicaux, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées par anesthésie gazeuse et reçoivent des injections d'analgésiques en pré- et post-opératoire. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance et la prise en charge analgésique continue pendant 72h. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique supplémentaire ou la mise à mort de l'animal sont envisagées en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle pour mener les études sur le développement du cerveau, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation du projets tels que les modèles génétiquement modifiés. Pour le génotypage et les biopsies, les souriceaux ont entre 7 et 10 jours, âge a quel on peut tatouer les coussinets des phalanges. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. L'expérimentation est menée sur des embryons à E12.5 et E15.5 qui correspondent à la fenêtre d’expression de nos gènes d’intérêt. Les souriceaux à P2 et P10 nous permettent de voir l'effet de notre traitement sur les phénotypes qui apparaissent à ces stades.
Effet d’une exposition gestationnelle et pubertaire à des composants du cannabis chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes puis des jeunes reçoivent par voie orale des composants du cannabis pendant dix à trente-cinq jours, pour tester l'hypothèse d'un lien entre cette exposition et le cancer du testicule. Le porteur signale le stress de l'administration orale et un risque de fausse route pouvant conduire à euthanasier l'animal, et met à mort les souris pour prélever le sang et les testicules. Il indique disposer de lignées cellulaires et de cultures d'organes humains mais affirme qu'elles ne remplacent pas l'animal.
Objectifs
Le cancer du testicule constitue le cancer le plus fréquent chez l’homme entre 15 et 40 ans. L’étiologie de ce cancer est encore mal comprise. Les données épidémiologiques convergent pour indiquer que l’exposition à des facteurs environnementaux pendant certaines fenêtres de vulnérabilité, telles que le développement et la puberté, est impliquée dans la tumorisation des cellules germinales testiculaires. Récemment, la consommation de cannabis, substance illicite la plus consommée par les adolescents et les femmes en âge de procréer, a été corrélée au développement de tumeurs du testicule chez de jeunes consommateurs. Il a été établi que le développement de ce type de cancer affecte la fertilité. Dans ce contexte et sur la base de nos résultats préliminaires, nous postulons que les cannabinoïdes (CA), molécules contenues dans le cannabis, favorisent l'apparition du cancer du testicule en perturbant la maturation des cellules souches germinales. Le but de ce projet est donc d’évaluer si une exposition aux principes actifs du cannabis pendant la vie fœtale et/ou la puberté affecte la différenciation et la fonction testiculaire et pourrait ainsi favoriser le développement de tumeurs germinales.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettrait de mettre en exergue les conséquences d'un cumul d'exposition auxquelles les populations les plus vulnérables sont soumises, et ce en comparaisons avec une exposition uniquement gestationnelle ou uniquement pubertaire.
Procédures
Traitement par administration orale repetée (pendant 10 jours ou pendant 35 jours). Ce geste est rapide (10 à 20 secondes par animal).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont le stress induit par l'administration orale des souris gestantes pendant 10 jours ainsi que des souris prépubères pendant 35 jours. La possibilité de fausse route est également un risque induit par ce traitement. Bien que les doses utilisées ici sont des doses utilisées en thérapie humaine, nous ne pouvons exclure un effet néfaste des cannabinoïdes utilisés sur le développement pré- ou postnatale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les organes ainsi que les matrices biologiques à investiguer dans le cadre de notre étude. Il s'agit du sang, des testicules, de l'épidyme et du foie.
Remplacement
Alternativement aux modèles animaux, il existe des lignées de cellules cancéreuses testiculaires humaines. Nous utiliserons ces dernières afin de travailler sur les voies de signalisation spécificiques modulées en présence de CBD et/ou THC. Nous utilisons également des modèles de cultures organotypqiques de testicules adultes et foetaux humain pour investiguer la réponse de l'organe aux traitements. Ces modèles ne permettent pas d'obtenir la réponse de l'organisme, contrairement aux modèles animaux, et notamment de prendre en considération les interactions mère-foetus tout comme l'effet des traitements sur l'axe hypothalamo-hypophysaire, axe régulant la fonction reproductive. Ils restent complémentaires mais ne peuvent se substituer à l'utilisation d'animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental sera de 6 pour nous permettre de mener à bien des études statistiques et de prendre en compte la "réduction" de la règle des 3R.
Raffinement
Pour réduire au maximum le stress des animaux, les traitements seront administrés par voie orale par des personnes expérimentées en présence de musique qui, nous l'avons constaté, a pour effet de relaxer les animaux comme l'expérimentateur. Les animaux seront observé quelques minutes après le traitement pour vérifier l'absence de fausse-route. Si une fausse-route s'avérait constaté, l'animal serait euthanasié. Plusieurs paramètres du bien-être des animaux (mobilité, poids,activité de toilettage) sont particulièrement surveillés pendant la procédure et des points limites adaptés ont été définis.
Choix des espèces
Nous avons choisis la souris Swiss ici pour sa fertilité élevée et sa facilité d'élevage et de traitement. Les animaux seront utilisés du stade embyonnaire jusqu'à 8 mois.
Intérêt de l’association de deux agents pharmacologiques pour contrebalancer les déficits de mémoire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Rendues amnésiques par la scopolamine, elles passent un test de mémoire de travail spatiale et reçoivent des injections de deux agents pharmacologiques, pour vérifier si leur association améliore la mémoire, piste envisagée pour la maladie d'Alzheimer. Le porteur décrit une douleur légère liée aux injections et annonce n'attendre aucune nuisance du test comportemental. À l'issue, les cerveaux des 60 souris sont prélevés, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut évaluer la mémoire.
Objectifs
Plusieurs données de la littérature indiquent que l’inhibition d’une enzyme cérébrale, la phosphodiestérase 7 (PDE7), pourrait s’avérer être une stratégie intéressante pour traiter les troubles de la mémoire induits par la maladie d’Alzheimer. En parallèle, il a également été montré que l’activation de certains récepteurs cérébraux (les récepteurs 5-HT4) engendrait des effets bénéfiques sur la mémoire chez l’animal. Notre hypothèse de recherche est que l’activation des récepteurs 5-HT4, conjuguée à l’inhibition des PDE7, exercerait des effets bénéfiques puissants sur la mémoire. Notre étude vise à démontrer, chez l’animal, la preuve d’intérêt de cette association. Cette étude pilote sera réalisée dans un modèle d’amnésie induite par la scopolamine chez la souris adulte.
Bénéfices attendus
Cette étude pilote permettra de valider la preuve de concept de l’intérêt d’une association de deux agents pharmacologiques pour lutter contre des déficits de mémoire induits chez la souris. Si notre preuve de concept est validée, nous pourrons envisager d’approfondir l’étude de l’efficacité de cette approche dans un modèle animal de la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Les 60 souris seront exposées trois fois à un test comportemental (test de mémoire de travail spatiale) d’une durée de 5 min et n’engendrant aucune nuisance chez l’animal. A chaque session de test, chaque souris recevra 2 ou 3 injections aigües d’agents pharmacologiques. Chaque injection (voie intra-péritonéale et sous-cutanée) nécessite une contention de l’animal et prendra environ une minute par souris. L’ensemble de la procédure durera 1 mois, comprenant 3 sessions de 5 min de test de mémoire séparées de 2 semaines chacune.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, les animaux vont subir des administrations par voies intra-péritonéale et sous-cutanée nécessitant une contention. Un stress physique et une douleur légère dus aux injections sont attendus lors de ces manipulations. Aucune nuisance sur la souris n’est attendue suite à la réalisation de la tâche comportementale (test d’exploration réalisé en situation libre, d’une durée de 5 minute par souris). Enfin, concernant les agents pharmacologiques utilisés, aucun d’entre eux, aux doses envisagées, n’est connu pour induire des nuisances ou effets indésirables chez la souris. Seule la scopolamine est utilisée comme agent amnésiant, et dont les effets délétères sur la mémoire ne sont que transitoires (moins de 24h).
Devenir
A l’issue de l’unique procédure présentée dans ce projet, tous les animaux (n=60 souris) seront mis à mort. Les cerveaux de tous les animaux seront prélevés afin de réaliser des études post-mortem complémentaires.
Remplacement
Ce projet vise à favoriser le développement de nouveaux médicaments susceptibles d’avoir un intérêt dans le cadre de la prévention et/ou le traitement de pathologies telles que la maladie d’Alzheimer. Or la recherche de nouveaux médicaments nécessite (scientifiquement et règlementairement) l’utilisation d’espèces animales. De plus, l’évaluation des performances de mémoire ne peut être réalisée que sur un organisme capable d’effectuer une tâche cognitive (ici un test de mémoire de travail spatiale). Ainsi, aucun remplacement par des modèles in vitro ou in silico (modèles mathématiques, bio-informatique) ne peut être réalisé.
Réduction
Un total de 60 souris sera nécessaire pour cette étude pilote. En faveur d’une réduction du nombre d’animaux utilisé, nous avons choisi d’utiliser à la fois des souris femelles et des souris mâles. Nous avons également choisi de réaliser successivement les trois sessions expérimentales sur les mêmes souris et de poursuivre cette étude comportementale par des mesures post-mortem.
Raffinement
Afin de réduire la douleur, souffrance et angoisse infligées, les animaux seront maintenus dans des conditions d’hébergement optimales et stables : température, cycle de lumière, hygrométrie, enrichissement minimal du milieu d’hébergement (maisonnette, papier kraft), cage de dimension 24cm (l) x 40cm (L) x 18cm (h) apportant une surface au sol de 160 cm² par animal. Ils seront surveillés quotidiennement par un personnel qualifié et une attention particulière sera apportée à l’apparence physique externe des animaux, aux variations éventuelles de poids ainsi qu’aux changements de comportements. Les injections intra-péritonéales et sous-cutanées seront réalisées exclusivement par un personnel qualifié. Afin de diminuer le stress de nos animaux, un protocole de familiarisation des animaux à l’animalerie et à l’expérimentateur sera mis en place sous la forme de handling dès l’arrivée des animaux au sein de notre animalerie. Afin de réduire la douleur et la détresse de nos animaux nous avons choisi un point limite précoce et compatible avec les objectifs scientifiques de notre recherche.
Choix des espèces
Les souris font partie des espèces animales les plus exploitées en recherche biomédicale du fait de leur facilité de reproduction et de la similarité du système nerveux central qu’elles présentent avec l’Homme. Leur comportement est bien décrit et il est possible d’en mesurer les modifications. Les modèles murins possèdent une bonne faculté d’apprentissage justifiant leur utilisation dans l’étude de la mémoire. Des souris de souche C57BL6 adultes (minimum 8 semaines d’âge) seront utilisées dans ce projet, un âge auquel les grandes fonctions physiologiques sont arrivées à maturité.
Etude du rôle des enzymes (OGT, GFAT, PGM3 et OGA) impliquées dans la voie des hexosamines dans la pathogénèse du lupus systémique érythémateux (LSE)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
815 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, pour partie dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et pour partie dans des procédures de souffrance légère. Ces souris développent un lupus reproduisant la maladie humaine et subissent douze prélèvements sanguins, un par mois pendant un an, pour tester un inhibiteur ciblant des enzymes de la voie des hexosamines. Le porteur indique que la maladie auto-immune altère de façon modérée la fonction rénale et met à mort les animaux au motif d'un risque biologique. Il revendique un "besoin" crucial d'explorer le système immunitaire in vivo et affirme qu'aucune méthode alternative ne convient.
Objectifs
Le lupus systémique érythémateux (LES) est une maladie chronique rare qui se manifeste par des symptômes variables pouvant atteindre plusieurs organes (peau, articulations, reins, système nerveux central, séreuses…). La maladie survient dans 90% des cas chez la femme et débute le plus souvent à partir de la puberté. En France, la prévalence de la maladie est de 41 cas sur 100 000 et l’incidence de 3-4 nouveaux cas par an sur 100 000 habitants. Elle est caractérisée par des lésions parfois irréversibles ou mortelles. A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif. A l’heure actuelle, il existe un besoin crucial d’explorer le système immunitaire et plus exactement mieux comprendre les mécanismes moléculaires, cellulaires et environnementaux qui régissent la réponse immunitaire dans le contexte du LES dans le but d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pouvant améliorer la prise en charge des patients. Des données de publications in vitro récentes pointent une cible moléculaire qui pourrait être un acteur essentiel de la maladie. Pour étudier le rôle de cette cible dans la pathologie, un modèle de souris a été développé dans le laboratoire mimant le développement de cette pathologie. En parallèle, nous avons menés des études in vitro pour développer un inhibiteur de cette cible. Nous nous proposons donc maintenant de valider nos études in vitro par une étude in vivo avec cette inhibiteur sur notre modèle de souris mimant le développement du lupus
Bénéfices attendus
Ce projet permet la recherche de cible thérapeutique dans le contexte du lupus érythémateux (25000 cas/an)
Procédures
12 prélévement de sang (1 min de durée) à raison de 1 fois par mois sur 12 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux développe une maladie auto-immune qui altère de manière modérée la fonction rénale
Devenir
Les animaux de ce projet proviennet d'une animalerie de classe de risques A2 et seront euthanasiés car ils présentent un risque biologique.
Remplacement
Remplacer : Des méthodologies de culture cellulaire et de modélisation in vitro ont été mises en place afin de remplacer au possible l’utilisation d’animaux pour répondre à certaines questions spécifiques à ce projet. Cependant seul un modèle in vivo chez la souris récapitulant les éléments de la physiopathologie du lupus et regroupant les multiples acteurs de l’immunité innée/adaptative observés chez l'homme, permettra de vérifier l'hypothèse sur l’implication des enzymes OGT/GFAT/PGM3 et OGA sur le développement du LES.
Réduction
Réduire : Pour nos expériences, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et avoir le nombre de contrôles internes obligatoires, pour prouver l’efficacité des molécules thérapeutiques utilisées.
Raffinement
Raffinement : Afin de respecter la notion de raffinement, et éliminer ou réduire toute douleur, souffrance, angoisse, ou tout dommage durable, susceptible d’être infligé aux animaux, leur bien-être et leur souffrance seront pris en compte quotidiennement de leur naissance à leur mort et évalués par le personnel zootechnique expérimenté. Ainsi, pour chaque procédure impliquant une douleur supérieure à celle d'une piqûre, les animaux seront anesthésiés. De plus, chaque cage (type 2L avec 5 souris par cage) recevra du matériel pour nidifier dans le but de rétablir le répertoire comportemental des souris.
Choix des espèces
Il n’existe pas de méthodes alternatives à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments physiopathologiques observés chez l’homme, peut apporter une réponse quant aux rôles des deux enzymes OGT, GFAT, PGM3 et OGA dans le développement du phénotype lupique. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs ex vivo ou in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité et la diversité des différents facteurs pouvant intervenir dans la réponse immunitaire en action in vivo chez la souris. Les souris seront traitées soit à l’âge de 5 semaines (début de la pathologie avec apparition des auto-anticorps), soit à l’âge de 30 semaines (stade tardif de la pathologie avec apparition de l’auto-immunité systémique).
Rôle des oestrogènes dans le microenvironnement tumoral: angiogenèse et lymphangiogenèse
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
1 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à trois chirurgies, ovariectomie, implantation d'un comprimé d'hormonothérapie, injection de cellules tumorales ou curage ganglionnaire, précédées d'injections de tamoxifène, pour étudier l'effet des œstrogènes sur le microenvironnement d'une tumeur mammaire et sur le lymphœdème. Le porteur qualifie de modérées les douleurs liées aux chirurgies et au développement des tumeurs, et prélève les organes en fin de vie. Il affirme qu'aucune stratégie de remplacement ne permet d'étudier ces processus et que la souris est le seul modèle disponible.
Objectifs
L'hormonothérapie est un des premiers traitements du cancer du sein exprimant le récepteur des oestrogènes (dit ERα-positif) et a permis de réduire largement le nombre de récidives chez les patientes et ainsi d'augmenter la survie chez ces femmes. Or, l'impact de ce traitement sur le micro-environnement de la tumeur, de tumeurs dites ERα-négatives (n'exprimant pas le récepteur des oestrogènes), est encore mal connu, alors qu'une certaine efficacité a été observée dans les premiers essais cliniques . De plus, de nombreuses résistances apparaissent, ainsi que des lymphoedèmes secondaires qu'il reste à mieux comprendre pour mieux le traiter. Le lymphodème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer et qui est souvent associée à ces traitements d'hormonothérapie. Ce projet cherche donc à mieux caractériser l'impact de cette hormonothérapie sur le micro-environnement tumoral dans le cadre du cancer du sein, pour trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce travail est un travail qui étudie les mécanismes d'actions spécifiques du récepteur des oestrogènes ERα dans la réponse à un traitement d'hormonothérapie par les SERMS (Selective Estrogen Receptor Modulators) sur les cellules endothéliales, non seulement sur les cellules endothéliales vasculaires mais aussi sur les cellules endothéliales lymphatiques. Cette étude permettra à terme de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter les cancers ERα négatives , en particulier là où les autres stratégies anti-angiogéniques ont échoué. De plus, cette étude de l'impact d'ERα dans la réponse à l'hormonothérapie sur le réseau lymphatique permettra de mieux comprendre le développement du lymphoedème secondaire à la chirurgie du cancer du sein afin d’améliorer les traitements et la qualité de vie des patientes ayant subi un curage ganglionnaire.
Procédures
Les animaux pourront subir jusqu'à 3 chirurgies (ovariectomie (durée 20 min),implantation petit comprimé pour traitement par l'hormonothérapie (durée 5 min), injection de cellules tumorales (durée 5 min) ou curage ganglionnaire ( durée 30 min)) après 5 injections consécutives de Tamoxifène pour induire la Cre-recombinase sur les animaux transgéniques génétiquement modifiées. Toutes ces procédures sont espacées de 2 à 3 semaines pour laisser à l'animal le temps de récupérer des chirurgies et du stress éventuel occasionné. Tous les prélévements sont effectués en phase terminale, sans réveil.
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes (tumeurs, poumons, pattes, utérus, foie) et réaliser des analyses immunohistochimiques et/ou moléculaires
Remplacement
Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de l'hormonothérapie (anti-oestrogènes) dans le cadre du traitement du cancer du sein. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de la réponse à l'hormonothérapie . De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel l’invalidation génique du récepteur aux oestrogènes a été générée. De plus, c'est le seul modèle où l'on peut avoir un suivi de la croissance tumorale avec formation de métastases.
Étude d’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle des impacts neurobiologiques du stress hypoxique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardés en vie et rendus à leur animalerie d'origine. Ils subissent un stress d'hypoxie et trois séances d'imagerie IRM sous anesthésie légère, pour mesurer les effets d'un déficit d'oxygène sur l'hippocampe et évaluer une plante, Guiera senegalensis, comme antioxydant. Le porteur indique que l'hypoxie pourrait détruire des neurones sans pour autant affecter le bien-être de l'animal, et surveille la respiration pendant l'anesthésie. Il affirme que cette étude comportementale et neurobiologique nécessite des animaux vivants dotés des structures cérébrales voulues.
Objectifs
Les radicaux libres sont connus pour être responsables d’un vieillissement cellulaire. Dans des conditions normales, les radicaux libres sont produits à de faibles concentrations et agissent comme des molécules de signalisation pour les cellules. Dans certaines situations, le nombre de radicaux libres présents dans les cellules est trop important. Ce stress oxydant conduit à un dysfonctionnement cellulaire, voire à la mort cellulaire. Il a été incriminé dans la physiopathologie de nombreuses affections humaines (par exemple la maladie d’Alzheimer). L’hypoxie (un déficit d’apport en oxygène dans les tissus de l’organisme) est l’une des causes de stress oxydant. Au niveau cérébral, l’hypoxie génère des processus inflammatoires qui peuvent se solder par une destruction des neurones au niveau de l’hippocampe, structure très impliquée dans l’apprentissage et la mémoire. L’apnée, c’est-à-dire un arrêt de la respiration pendant au moins 20 secondes, même si elle est volontaire, pourrait participer à la genèse d’un stress oxydant à travers l’hypoxie créée. En Afrique, Guiera senegalensis (Combretaceae) est une plante utilisée en pharmacopée traditionnelle. Ses feuilles possèdent de nombreux composés, notamment les flavonoïdes et les acides polyphenoliques, qui sont des antioxydants naturels. L’objectif général de ce projet est d’évaluer les effets bénéfiques de l’extrait hydroéthanolique des feuilles de Guiera senegalensis dans la gestion du stress oxydant et dans la prévention d’impacts neurobiologiques de l’hypoxie au niveau cérébral.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une information précieuse sur le lien entre hypoxie sous apnée et les corrélats neurobiologiques dans l’hippocampe comme prédicteurs de désordres mnésiques, ainsi que le bénéfice potentiel de Guiera senegalensis dans le traitement des effets hypoxiques des phénomènes d’apnée naturelle. De plus, ce projet permettra d’entrevoir une applicabilité potentielle de cette plante dans des pathologies liées au stress oxydatif. Autrement dit, Guiera senegalensis pourrait offrir un choix alternatif ou complémentaire dans la prévention et le traitement de ces pathologies. Il permettra également de collecter des données pilotes nécessaires pour un projet collaboratif plus large, qui se propose de corréler les données acquises sur ce modèle d’apnée chez le rat avec des données acquises sur des apnéistes humains.
Procédures
Trois séances d’imagerie sont prévues pour caractériser le modèle d’hypoxie cérébrale à 1 jour, 7 jours et 15 jours post-induction. Chaque séance (d’une durée d’environ 1/2 journée) comprendra une session d’acquisition IRM (d’une durée maximale de 2 heures).
Impact sur les animaux
Le modèle d'hypoxie pourrait induire des lésions cellulaires et des processus inflammatoires qui pourraient se solder par une destruction de certains neurones au niveau de l'hippocampe, mais cela ne devrait pas affecter le bien-être de l'animal. L’examen IRM étant une modalité de neuroimagerie totalement non-invasive et non-irradiante, les potentiels effets indésirables sont liés au fait que l’examen est réalisé sous anesthésie légère. Pour éviter tout risque d’arrêt respiratoire, la fréquence respiratoire est surveillée en permanence tout au long de l’examen. Il est également possible d’observer une légère perte de poids le lendemain de l’examen, suite au stress potentiellement induit par la combinaison transport (~10min)/examen (~2h) entre les deux bâtiments d’expérimentation se faisant face.
Devenir
Après l’examen IRM les animaux seront gardés en vie et retourneront en hébergement dans leur animalerie d’origine.
Remplacement
L’évaluation comportementale et neurobiologique en réponse à un stress hypoxique induit par apnée, nécessite l’utilisation des animaux vivants possédant les structures cérébrales requises. L'analyse cellulaire des différentes structures cérébrales ne peut être réalisée in silico ou en cellule isolée, ni même chez les invertébrés.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible grâce à l’étude de plusieurs paramètres chez le même animal et de façon longitudinale avec des approches non-invasives comme l’IRM. Les analyses statistiques seront celles classiquement utilisées dans la littérature.
Raffinement
Que ce soit durant leur transport ou lors de l’examen IRM, une grande attention est apportée au bien-être des animaux, et tout est mis en œuvre pour éviter les sources potentielles de stress. Transports : Les animaux sont transportés dans leur boîte habituelle (enrichie), avec leurs partenaires habituels et manipulés par les personnes assurant leur suivi quotidien. Les boîtes sont protégées du froid ou du chaud éventuel. Manipulations/anesthésie avant/après examen IRM : Ces actes sont réalisés par les personnes qualifiées assurant le suivi quotidien des animaux. Examen IRM : Il est réalisé sous anesthésie, dans un berceau chauffé uniquement dédié à ces animaux, avec contrôle de la respiration et de la température. Lors d’une acquisition IRM, si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal est mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. En dehors des sessions d’examen IRM, les animaux seront hébergés par groupe (2 à 4) avec de l’enrichissement autant que possible (tunnel transparent de couleur rouge, bâton à ronger, papier à déchiqueter). Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance (mise en place de points limites) et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec la Structure bien être animale et les conseils vétérinaires.
Choix des espèces
La littérature concernant le stress hypoxique est majoritairement basée sur des études chez le rat, fournissant une base de connaissances solide. De plus, la littérature sur les expériences d’apnée est plus importante chez le rat. Ce modèle animal est donc le plus approprié à la fois pour les études comportementales, biochimiques, immunohistochimiques et de neuroimagerie par IRM. Des rats nouvellement sevrés (~23-26 jours) seront utilisés en accord avec les données de la littérature concernant la période adaptée à un bon apprentissage de la nage chez les rats.
Le rat Goto Kakizaki un modèle d’étude du syndrome des ovaires polykystiques
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
312 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Ces rattes Goto-Kakizaki, présentées comme un modèle spontané du syndrome des ovaires polykystiques, subissent des frottis vaginaux, des injections d'un anticorps pendant la gestation et des prélèvements sanguins répétés, y compris des tests de tolérance au glucose, pour étudier le développement du syndrome et tester un traitement. Le porteur affirme n'attendre aucune souffrance des injections et met à mort tous les animaux pour analyser leurs tissus. Il affirme qu'aucun système in vitro ou in silico ne peut remplacer l'animal.
Objectifs
Le Syndrome des Ovaires polykystiques (SOPK) est la principale cause d’infertilité féminine et elle est associée à de nombreuses comorbidités telles que le diabète et les maladies cardiovasculaires. Les hommes apparentés aux femmes ayant ce syndrome présentent des taux d’androgènes élevés et des désordres métaboliques. Il s’agit de plus d’une maladie à fort caractère transmissible par les mères à leurs filles et fils, sans qu’aucun diagnostic puisse être établi précocément puisque l'origine de ce syndrome reste méconnu. Or nous avons mis en évidence récemment que les rattes Goto-Kakizaki, modèle de diabète de type 2 très connu, constituent le premier modèle rongeur spontané du syndrome des ovaires polykystiques. Notre projet est d'utiliser ce modèle de rattes GK afin de mieux comprendre l'éthiologie de ce syndrome en analysant le développement de ce syndrome dès le stade foetal. De plus, nous avons développé un anticorps bloquant les effets de l'hormone Anti-Müllérienne (AMH) qui est suspectée d'induire une hyperandrogénie et une anovulation chez les patientes présentant un syndrome des ovaires polykystiques. Nous proposons donc de traiter des rattes GK avec cet anticorps pendant la gestation pour comprendre le rôle de l'AMH dans le développement du phénotype et à l'âge adulte à des fins thérapeutiques pour normaliser les taux circulants d'androgènes et pour induire une ovulation.
Bénéfices attendus
Pouvoir analyser et comprendre les altérations developpementales chez la descendance de mères SOPK afin d'améliorer par la suite la possibilité de prise en charge des patientes SOPK au cours de la grossesse. Actuellement les patientes SOPK sont traitées de manière symptomatique : soit pour traiter leur infertilité, soit pour traiter l'hyperandrogénie, soit pour traiter les troubles du métabolisme en particulier le diabète. Le traitement que nous proposons de tester permettrait: - d'une part de corriger l'infertilité chez les 25% de patientes SOPK résistantes aux traitements actuels et d'éviter le risque d'hyperstimulation ovarienne induit par les traitements utilisés en PMA (procréation médicalement assistée) - d'autre part de corriger l'hyperandrogénie - d'autre part d'améliorer les anomalies métaboliques.
Procédures
Les animaux subiront des prélèvements de sang de 100 microlitres (environ 5 minutes par prélèvement). Pour l'ipGTT des prélèvements de sang de 30 microlitres (environ 1 minute par prélèvement) aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes sont réalisés. Pour l’ipITT, une goutte de sang (10 microlitres, moins d'une minute par prélèvement) sera prélevée pour lecture de la glycémie sur lecteur Accuchek aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes. Les 2 tests seront séparés d’au moins 3 jours pour permettre la récupération.
Impact sur les animaux
Pour le suivi du cycle ovarien par la méthode des frottis vaginaux ainsi que pour l'injection en sous cutanée, les femelles sont préalablement habituées à la contention par les expérimentateurs habilités. Pour les prélèvements sanguins qui seront nécessaires (100 microlitres/rat une fois par semaine sur 3 semaines pour les gestantes et les traitées et sur 5 semaines consécutives pour le lot étudié entre 4 et 8 semaines) le volume de sang prélevé à chaque prise de sang sera toujours en dessous du volume maximal autorisé (5% du volume sanguin total).
Devenir
Toutes les procédures conduiront à la mort des animaux afin d'effectuer les analyses histologiques de différents tissus.
Remplacement
Cette étude ne peut être réalisée que sur des animaux vivants et l'avantage du rat GK réside dans le fait que c'est un modèle de diabète de type 2 sans manipulation génétique et mimant certains aspects du syndrome SOPK humain. Ainsi sur le plan scientifique il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est réduit au minimum grace à l'utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux sont habitués à la manipulation de sorte à réduire le stress. Les prélèvements sanguins représentent moins de 5% du volume sanguin total et sont suffisamment espacés dans le temps pour ne pas induire une détresse chez l'animal. Les injections d'anticorps ne gènèrent pas de souffrance pour l'animal. Cependant, les animaux seront suivi toutes les 48h durant le traitement et si des signes de mal-être apparaissent tels que, prostration,poils hirsute et perte de poids, les animaux seront isolés et gardés en observation. Si la perte de poids est supérieure à 15% du poids de l'animal il sera eutahanasié.
Choix des espèces
Le rat GK est le seul model rongeur disponible developpant spontanémant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK). Le rat une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour permettre des mesures physiologiques pratiques. Les stades foetal (18,5 jpc), post natal(5 jours), pubertère et adulte ont été choisis puisque l'environnement maternel SOPK est fortement suspecté de contribuer au dévéloppement de ce phénotype qui apparait progressivement depuis le stade foetal.
Thérapie pour la myopathie à agrégats tubulaires en utilisant des AAV dans le modèle souris – «TransTAM»
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
285 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Ces souris porteuses d'une mutation reproduisant la myopathie à agrégats tubulaires subissent des tests de force et de saignement répétés et des injections d'un vecteur AAV, pour tester une thérapie génique censée corriger les atteintes musculaires. Le porteur décrit des tests de force et d'activité locomotrice et une mesure de production musculaire réalisée sous anesthésie sans réveil, suivie de la mise à mort. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité du muscle ni les effets sur l'"organisme entier".
Objectifs
La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, des crampes, et des myalgies. La majorité des patients montrent des anomalies de la peau, des os, des plaquettes, et de la rate. La présentation complète de ces signes multi-systémiques est appelé syndrome de Stormorken (STRMK). TAM et STRMK forment un spectre de la même maladie. Afin de corréler les dysfonctions cellulaires avec le développement de la maladie, nous avons généré et caractérisé un modèle murin portant la mutation TAM/STRMK la plus commune. Les souris présentent les principaux signes cliniques des patients. A ce jour, aucun traitement n’est disponible. Nous avons l’intention d'inverser les symptomes des souris TAM/STRMK par une régulation négative d'un gène important pour la maladie, afin de fournir une approche translationnelle pour les essais thérapeutiques prospectifs chez les patients. Nous avons effectué des injections intramusculaires de souris TAM/STRMK et déterminé un effet positif sur la fonction musculaire. Ces résultats préliminaires nous encouragent à tester la même approche sous une forme systémique, afin de pouvoir à la fois prévenir et inverser le phénotype multisystémique des souris TAM/STRMK.
Bénéfices attendus
Il est attendu que cette étude apportera la première preuve de concept pour un traitement efficace de TAM/STRMK. En effet, nos résultats préliminaires ont montré un effet bénéfique suite à l'administration du traitement dans le muscle, et il reste à démontrer que cette approche est également efficace par injection systémique et capable d’améliorer les phénotypes des plaquettes, de la peau, de la rate, et des os. De manière importante, la thérapie est conservée entre la souris et l’homme et pourra être utilisée chez les patients TAM/STRMK dans des tests cliniques ultérieurs.
Procédures
Des tests de comportement seront réalisés une fois par mois chez l’animal vivant à partir de 4 ou 16 semaines selon la cohorte jusqu’à 4 ou 8 mois d’âge. Le test de comportament permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour, avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque test. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test de comportament permettant de mesurer la force musculaire des pattes antérieures de l’animal dure 10 secondes, et sera répeté 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes. Le test permettant mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 12h. Le test de saignement est utilisé pour évaluer la coagulation sanguine et la capacité de l'organisme à former un caillot en cas de lésion vasculaire. Il sera réalisé une fois, et il durera au maximum 10 minutes. Les mesures de force musculaire seront réalisées pendant 10 minutes. La mesure de la production de force du muscle est une procédure sans réveil, qui durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera mis à mort. Le test pour l'obtention du sang sera répeté 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. Des injections intraveineuses seront réalisées pour administrer le traitement. Entre l'anesthésie et l'injection, la procédure prendra environ 2 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les souris sont plus petites que les souris sauvages et manifestent des problemes dans le muscle, la rate, la peau, les plaquettes et l'os, démontrant que notre modèle murin est un outil approprié pour étudier le développement de la maladie. Pour la deuxième lignée de souris, une caractérisation complète sera bientôt effectuée pour confirmer un phénotype dommageable. Les tests de comportament peuvent induire du stress sur l'animal. Ces tests dureront le moins de temps possible pour que les tests soient significatifs, de sorte que l'animal souffre le moins possible.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour préléver les muscles nécessaires aux analyses moleculaires.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.
Réduction
Pour la partie expérimentale, les tests phénotypiques réalisés de manière non invasive offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui permet de s’affranchir de générer une cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. L’organisation de nos procédures vise à utiliser le plus possible de tissus différents provenant de la même souris afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un maximum d’un test par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Ainsi, nos précédentes études montrent que 15 souris au maximum par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, de la couleur de la peau, ainsi que l'évaluation de la présence d'une poche de lait seront évalués tous les 2 à 3 jours. Après le sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante. La qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 heures jour/nuit sera respecté. Les animaux auront accès à de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. L'environment sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. En cas de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l'aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo, ce qui limite le développement de la douleur. Afin de réduire le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée avant le début du suivi longitudinal pour chaque test. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué.
Choix des espèces
Les souris sont nécessaires pour ces expériences afin de nous permettre de comprendre les propriétés physiologiques des différents muscles et organes après une modification génétique. Le modèle murin nous permet d'étudier l'amélioration potentielle du phénotype musculaire, ainsi que du phénotype observé sur d'autres organes, dans ce modèle de maladie murine multisystémique. Nous devons réaliser des expériences physiologiques in vivo chez la souris. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur des espèces évoluant plus éloignées de l'homme, car la structure musculaire diffère davantage. C'est pourquoi nous proposons d'utiliser des lignées de souris disponibles dans nos laboratoires pour réaliser ces techniques. Les tissus de souris peuvent ensuite être utilisés pour d'autres analyses, maximisant ainsi les résultats obtenus par souris et réduisant le nombre total d'animaux utilisés. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Stim1R304W/+, caractérisé par une faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît à l'âge de 2 mois et s'accentue avec l'âge, présentant un phénotype modéré à l'âge de 9 mois. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, à partir de 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu'à 4 mois, puis à partir de 16 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement de la maladie), afin d'observer le développement des souris après le traitement.
Crises épileptiques induites par un stimulus externe
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2220
10 620 rongeurs, 8 400 souris et 2 220 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit un candidat médicament puis une stimulation électrique ou sonore déclenchant une crise d'épilepsie, certains après implantation d'une canule dans le cerveau sous anesthésie, pour tester des molécules antiépileptiques. Le porteur indique que la crise tonico-clonique provoquée peut aller jusqu'à l'arrêt respiratoire, les animaux étant tués juste après la convulsion ou en fin de test car les procédures ne permettent pas de les maintenir en vie dans de bonnes conditions. Il reconnaît des alternatives in vitro pour présélectionner les molécules mais affirme la nécessité du modèle animal pour l'étape finale.
Objectifs
L'objectif du projet consiste à évaluer de nouveaux candidats médicaments pour lutter contre les épilepsies généralisées ou partielles. A l'heure actuelle, il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients épileptiques. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour améliorer la qualité et l'espérance de vie des patients. Les crises généralisées correspondent à des décharges électriques anormales au niveau cérébral (les 2 hémisphères sont touchés), qui se traduisent par des convulsions tonico-cloniques. Les convulsions cloniques sont des secousses musculaires incontrôlées alors que les convulsions toniques correspondent à un raidissement et une contraction soudaine des muscles du corps et des membres inférieures et supérieurs accompagnés d'un arrêt respiratoire temporaire ou définitif. Des symptômes précurseurs sont parfois observés avant l'apparition d'une convulsion généralisée comme une hypersalivation ou une respiration bruyante. Les crises partielles sont liées à une décharge électrique anormale dans une région cérébrale spécifique. Les symptômes de la crise dépendent de la zone atteinte. Des fourmillements, picotements, sensation ou encore secousses musculaires incontrôlées au niveau d'un membre peuvent être observés chez l'Homme. Des mouvements de la tête ou des yeux ou encore des signes émotionnels (peur, rire..) peuvent également faire partie des symptômes. Le projet consiste en l'utilisation de tests basés sur l’induction de crises épileptiques par le moyen de stimulation électrique ou sonore permettant de tester l'innocuité et/ou l'efficacité de substances pharmacologiques en développement.
Bénéfices attendus
Les modèles de crises généralisées et partielles induits par une stimulation sont recommandés pour identifier et tester l’efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. A l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30% des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou les traitements sont inefficaces (résistance aux traitements). En plus du développement de nouveaux antiépileptiques, un des enjeux majeurs de la recherche sur l’épilepsie est de découvrir des traitements prophylactiques contre cette pathologie, c’est-à-dire des traitements ayant un effet antiépileptogène. Il n’en existe aucun à ce jour alors qu'il est possible d’identifier les personnes présentant un risque de développer une épilepsie.
Procédures
Pour chaque procédure décrite, les candidats médicaments seront administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. Si applicable, l'implantation d'un guide canule est réalisée sous anesthésie générale sur environ 60 minutes. Dans chacune des procédures décrites, le rongeur sera exposé à un stimulus, d'un durée maximale de 60 secondes chez la souris et de 3 secondes chez le rat. Des prélèvements sanguins peuvent également être envisagés avant le test (à minima 24 heures avant la stimulation, durée de l'ordre de la minute) pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les tests modélisant des crises induisent un stress physique chez les rongeurs, également retrouvé chez les patients lors de la survenue d'une crise épileptique (avec l'apparition de mouvements involontaires saccadés ou un raidissement des membres/du corps). Des symptômes annonciateurs peuvent être également observés chez l'homme comme la nervosité, l'irritabilité ou une hypersalivation. Chez l'animal, ce stress est principalement lié à la stimulation appliquée sur une très courte durée et qui conduit à l'apparition de symptômes convulsifs. La survenue de crises tonico-cloniques peut conduire à la mort des patients épileptiques et peut donc dans certains cas provoquer une certaine souffrance chez l'animal. Des points limites prédictifs limitent cet impact. Lorsque les animaux sont implantés avec un guide canule, ils sont mis en cage de réveil et maintenus isolés pendant environ 7 jours à partir de la chirurgie afin de protéger le guide canule de leurs congénères. Le prélèvement de sang au cours d'une expérience peut également conduire à un léger stress chez l'animal vigile.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés immédiatement après la stimulation si une convulsion tonique est observée ou à la fin du test en l'absence de convulsion tonique car ces procédures ne permettent pas le maintien en vie des animaux dans de bonnes conditions.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives in silico ou in vitro permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude et en fonction des analyses statistiques réalisées dépendant de la nature des données : variables dichotomiques, données paramétriques ou non paramétriques. Il est possible de tester plusieurs composés et doses dans une même expérience. Ceci permet de limiter le nombre d'animaux contrôles et le nombre d'animaux testés avec une substance connue.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Une solution anesthésiante sera appliquée. Les animaux seront anesthésiés et/ou euthanasiés, immédiatement après l'apparition d'une convulsion tonique. Pour les études incluant une chirurgie pour administrer le composé par voie intracérébrale, une analgésie est assurée par l’administration d'un analgésique systémique et l'utilisation d'un analgésique local. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué pendant la chirurgie pour éviter le dessèchement de l'oeil.
Choix des espèces
Les modèles de convulsions induites par une stimulation externe sont largement décrits dans la littérature chez le rongeur (souris et rat). Les procédures décrites dans ce projet sont recommandées pour évaluer de nouveaux candidats médicaments (efficacité) et/ou l'innocuité d'un composé dans le cadre de l'épilepsie. Les rongeurs utilisés sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique .
Conséquences de l’obésité maternelle sur le développement neuronal et comportemental de la descendance
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, dont 520 en souffrance sévère. Les femelles sont rendues obèses par un régime riche en graisses, puis leur descendance subit des tests comportementaux et des analyses neuronales, pour étudier l'effet de l'obésité maternelle sur le cerveau des petits. Le porteur mentionne des tests comportementaux évaluant les capacités cognitives, mnésiques, émotionnelles et sociales sans en préciser le détail, et décrit comme atteinte une dégradation du comportement maternel. Les rubriques sur les dommages et le raffinement restent brèves au regard des 520 souris classées en souffrance sévère.
Objectifs
Le projet a pour but d'étudier et comprendre les conséquences neuronales et comportementales à long terme de l'obésité maternelle sur le développement du cerveau de la descendance
Bénéfices attendus
L'obésité maternelle est un facteur aggravant dans la survenue de maladies neurologiques et neuropsychiatriques. Nous espérons identifier des mécanismes moléculaires et cellulaires altérés par l'obséite materenlle dans l'espoir de développer des stratégies thérapeutiques et/ou préventives pour limiter les conséquences à long terme et sur la survenue de maladies neurologiques.
Procédures
Les animaux seront soumis a différent tests comportementaux dans le but d’évaluer l’impact de l’obésité maternelle induit par un régime alimentaire riche en graisse sur leurs capacités cognitive, mnésique, émotionnelle et sociale. Ces tests comportementaux seront réalisés entre le 8ieme et 10ieme jour de vie postnatale (un test) et entre le 2ieme et 4ieme mois de vie (4 tests). Des analyses neuronales, visant à étudier l’activité neuronale et l’évolution de différents marqueurs moléculaires, seront réalisées en parallèles des analyses comportementales aux mêmes âges
Impact sur les animaux
L’un des dommages de cette étude sera la prise de poids des femelles soumises à un régime alimentaire riche en graisse pour induire une obésité chronique. L’obésité chronique induit une dégradation du comportement maternelle avec une perte d’attention et d’intérêt pour la descendance.
Devenir
les animaux utilisés pour les analyses comportementales et neuronales, avec ou sans injections en période néonatale, seront euthanasiés.
Remplacement
Seule l'expérimentation chez l'animal permettra de remplir les objectifs de ce projet. Il n'est actuellement pas possible pour les méthodes in vitro (non animales) de reproduire les processus physiologiques complexes de la consommation de nutriments et en particulier l'impact que peut avoir la prise d'un régime alimentaire riche en graisse sur le développement neuronal et comportementale de la descendance. L’organisation et le fonctionnement des réseaux neuronaux et l'obésité maternelle ne peuvent être reproduits dans des modèles de lignées cellulaires ou de cultures neuronales.
Réduction
Des calculs statistiques utilisant les données d'études antérieures ont été utilisés pour calculer le nombre minimum d'animaux requis tout en garantissant l'obtention de résultats statistiquement significatifs. Les tâches proposées permettent d’évaluer les animaux sur plusieurs paramètres (comportementaux et électrophysiologiques ou biochimiques ou histologiques), réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Pour les enregistrements électrophysiologiques, 3 chercheurs seront mobilisés. Pour les analyses biochimiques et histologiques plusieurs protéines et/ou marqueurs moleculaires seront étudiés par échantillons prélevés et par animal. La litière des cages sera changée
Raffinement
La litière des cages sera changée fréquemment (et autant de fois que nécessaire) pour réduire les risques de graissage de la fourrure des animaux et limiter les risques d'irritation de leur peau. La santé et le poids des animaux seront également surveillés de près afin de s'assurer que le régime alimentaire n'a pas d'impact négatif sur eux. Dans le cas improbable où les animaux auraient subi un impact négatif, ils reprendront un régime alimentaire standard pour rongeurs. L'équipe continuera à examiner les dernières découvertes afin d'identifier toute nouvelle possibilité d'affiner l'expérience de ces animaux, tout en atteignant les objectifs de l'étude.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’organisme-modèle le plus utilisé en recherche biomédicale. Elle présente de nombreux intérêts : sa taille, son rythme rapide de reproduction et une gestation courte par rapport à d’autres organismes-modèles. De nombreux animaux transgéniques existent permettant par exemple de déterminer les mécanismes moléculaires impliqués dans différentes pathologies. Enfin, les souris sont susceptibles de contracter certaines maladies humaines telles que certains troubles neurologiques. Les souris sont fréquemment utilisées pour modéliser l'obésité humaine car, comme les humains, elles prennent du poids lorsqu'elles consomment des régimes riches en calories. Elles stockent également les graisses alimentaires dans leur corps de manière similaire et peuvent développer l'obésité . Pour ce projet nous utiliserons des souriceaux de 1 à 2 semaines de vie postnatale, pour étudier les conséquences de l’obésité maternelle sur le développement du cerveau, et des animaux adultes (2 à 4 mois de vie) pour étudier les conséquences à long terme sur les capacité cognitive, sociale et émotionnelle.
Etude de l’impact durable d’un régime appauvri en fibres sur la symbiose hôte-microbiote chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules, elles subissent des gavages, des prises de sang et des collectes de fèces, et un tiers reçoit dans l'eau un produit qui enflamme l'intestin pendant sept jours, provoquant selon le porteur une douleur intestinale croissante et des diarrhées avant la mise à mort. Le projet étudie la rupture de l'équilibre entre l'hôte et son microbiote induite par un régime pauvre en fibres. Le porteur affirme l'impossibilité de modéliser cette dynamique in vitro ou in silico.
Objectifs
Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies non transmissibles (maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète, …), ce qui représente 71% des décès dans le monde. Ces maladies sont associées à des signaux déclencheurs provenant de notre environnement (microorganismes de l’intestin, alimentation) et se caractérisent par une inflammation locale de l’intestin. Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Ces maladies de longue durée résultent de l’association combinée de plusieurs facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux dont la nutrition et l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein de cet organe. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des altérations de la composition du microbiote intestinal chez des patients atteints de maladies non transmissibles. Cette altération de la symbiose hôte-microbiote est caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du système immunitaire de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies non transmissibles, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par la diminution du potentiel fonctionnel du microbiote intestinal et de son hôte. Notre projet consiste à évaluer la mise en place et le maintien à long terme d’une rupture de symbiose hôte-microbiote induite par un régime pauvre en fibres et à déterminer les conséquences de ce changement de régime alimentaire sur la symbiose lors d’un stress inflammatoire aigu. L’objectif final de nos travaux est de caractériser la rupture de symbiose et d’en évaluer les conséquences sur la santé dans un modèle animal afin d’identifier des leviers, à la fois côté hôte et côté microbiote, qui permettraient de retarder, prévenir et/ou traiter sa survenue, son installation et sa persistance chez l’individu.
Bénéfices attendus
Les maladies non-transmissibles, qui sont en constante augmentation, sont une préoccupation majeure de santé publique. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. De nombreux travaux témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal due à un régime alimentaire appauvri en fibres. Notre projet amènera à une meilleure compréhension des mécanismes de la rupture de la symbiose microbiote-hôte en lien avec un régime alimentaire appauvri en fibre s ; compréhension qui permettra d’identifier de nouvelles solutions de dépistage et de traitement.
Procédures
Tous les animaux seront hébergés en cage indivuduelle tout au long de l'expérimentation. Les deux tiers des animaux recevront un régime appauvri en fibres pendant une durée de 4 semaines. Tous les animaux recevront une solution par gavage au minimum 2 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de contention sera de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux auront au minimum 1 et au maximum 3 prises de sang. Le temps de collecte, contention comprise, sera de 30 secondes à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans la procédure. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. Un tiers des animaux recevra dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin pendant sept jours consécutifs en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition à un régime inflammatoire, ce qui pourra entrainer une perte de poids. Les prises de sang engendrent une douleur modérée de courte durée et un stress léger dû à la contention. De même, les gavages seront réalisés par un expérimentateur confirmé à l’aide d’une sonde gastrique et engendreront un stress léger dû à la contention de quelques minutes mais ne causeront pas de douleur. L’absorption du produit inflammatoire entraine une douleur intestinale croissante pendant les 7 jours de traitement occasionnant des diarrhées avant la mise à mort des animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de reproduire/modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte.
Réduction
D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 120 animaux pour le groupe contrôle et 240 animaux pour les groupes expérimentaux sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement composé d'un abri en propylène rouge et d’un Mouse Swing et d'un abri en propylène rouge afin de répondre au mieux à leurs besoins comportementaux naturels et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les cages seront transparentes afin que les animaux gardent un contact visuel avec leurs congénères et n’auront pas de couvercles filtrants afin de maintenir le contact sonore et olfactif. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et mis à mort. Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau hebdomadairement. Nous définissons un point limite sur le poids, l’apparence des animaux et leur comportement.
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris qui sont largement utilisées pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes pauvres en fibres en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement nutritionnel inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc une référence pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.