Rongeurs
Etude des conséquences sur le métabolisme et le vieillissement de mutations dans les canaux ioniques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Quatre souris sont recensées dans le tableau des dommages attendus, une sans réveil et trois en souffrance sévère, alors que le résumé annonce par ailleurs 480 animaux. Le porteur décrit l'induction d'une migraine chronique par injections répétées, une douleur qui ne sera soulagée ni par analgésique ni par anesthésique puisque ce sont ses conséquences qui sont étudiées, les animaux étant tués en fin de procédure pour prélèvement des tissus. Il indique surveiller des points limites et euthanasier tout animal atteignant un score de douleur élevé ou perdant du poids. Sur le remplacement, il affirme que les effets métaboliques à long terme et le vieillissement exigent un "organisme vivant" impossible à modéliser in vitro.
Objectifs
La migraine est un trouble neurologique invalidant, d'origine génétique, environnementale et/ou hormonale, avec une prévalence estimée à 15% de la population. Elle se caractérise par des maux de tête sévères, généralement unilatéraux et lancinants qui peuvent être accompagnés de nausées, vomissements et de photophobie. Par ailleurs, la douleur chronique représente un stress pour l'organisme dont les conséquences à long terme sont encore peu connues. Des études cliniques ont corrélé une augmentation de l'incidence des pathologies cardio-vasculaires et des cancers et une diminution de la durée de vie chez des patients qui présentent des niveaux chroniques de douleur. Ce projet vise à étudier les conséquences cellulaires et moléculaires de la douleur migraineuse chronique sur le métabolisme, et en particulier à déterminer si des canaux ioniques potassiques à deux domaines pores (famille des K2P), qui régulent la transmission de la douleur et dont des mutations chez l'homme induisent la migraine, exercent un contrôle sur les paramètres métaboliques impliqués dans le vieillissement. Ce projet nécessitera 480 animaux.
Bénéfices attendus
La migraine est considérée comme l'une des maladies les plus invalidantes au monde, affectant environ 15 % de la population mondiale. Elle se manifeste par une céphalée lancinante unilatérale et s'accompagne de multiples symptômes tels que nausées, vomissements, photophobie, phonophobie ou allodynie cutanée. En parallèle, différentes études cliniques ont permis de corréler une augmentation de l’incidence des pathologies cardio-vasculaires, des cancers et une diminution de la durée de vie, à des niveaux chroniques de douleur chez des patients humains. De plus, les souris déficientes pour TRPV1, un canal ionique impliqué dans la perception de la douleur thermique, sont caractérisées par une meilleure espérance de vie. Enfin, des mutations génétiques chez C. elegans et chez D. melanogaster modifiant la transduction des signaux sensoriels augmentent également la longévité des individus. Il est admis que les crises de migraine commencent par l'activation des neurones sensoriels dans les ganglions trigéminaux (TG). L'hyperexcitabilité des fibres TG innervant les méninges induit la libération de neuropeptides (par exemple la substance P et le peptide CGRP) qui déclenche la vasodilatation des vaisseaux sanguins environnants et une inflammation locale, conduisant à la migraine. De plus, les fibres C exprimant les canaux TREK1, TREK2 et TRESK innervent le le pancréas et leur stimulation induit la sécrétion de CGRP, provoquant l’inflammation et inhibant le relargage d’insuline. Ces données suggèrent fortement que l’activité des canaux ioniques et en particulier de TREK1, TREK2 et TRESK a un impact sur le métabolisme et le niveau général de santé de l’individu. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la migraine et plus généralement de la douleur chronique de manière à limiter son impact sur le métabolisme en collaboration avec la Fédération Hospitalo-Universitaire.
Procédures
Dans chacune des procédures, un phénotype migraineux sera induit chez les animaux à 2 stades de leur vie : à 3 mois et à 12 mois. Ce modèle de migraine classiquement utilisé en études pré-cliniques et cliniques consiste à induire des symptômes chroniques migraineux par injection systémique intra-péritonéale d'un "donneur de NO", l'isosorbide dinitrate (ISDN, Risordan ©, Sanofi) pendant 4 jours, à raison de 1 injection/jour. Chez la souris, une injection quotidienne d'ISDN pendant 4 jours induit une hypersensibilité mécanique douloureuse chronique quantifiée quotidiennement avec un appareil de von Frey dynamique qui consiste à appliquer une rampe croissante de pression sur la paume de la patte arrière avec un filament automatique et à mesurer la pression (en grammes) induisant le retrait volontaire de la patte par la souris qui témoigne d’une douleur mécanique. Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles déterminent un seuil avec possibilité d’échappement. Une allodynie chronique se développe progressivement, mise en évidence par une diminution des valeurs de force nécessaires (seuils) pour induire le retrait réflexe (volontaire) de la patte. L’hypersensibilité douloureuse mécanique (4 tests dans la vie de l'animal) et thermique (4 tests) des souris sera quantifiée par les tests de von Frey et de Hargreaves respectivement sur des groupes de souris indépendants. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline seront mesurés par prélèvement d'une goutte de sang (4 tests) sur des groupes de souris indépendants. Les mesures d'exercice spontané et de motricité seront réalisés 4 fois dans la vie de l'animal, sur 2 groupes de souris indépendants. Chacun de ces tests dure environ 3h excepté la mesure de l'exercice volontaire qui est évaluée après une semaine.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la douleur migraineuse qui sera induite et qui ne pourra être soulagée ni par des analgésiques ni par des anesthésiques puisque ce sont ses conséquences que nous étudierons. Pour cette raison, nous évaluons à un niveau sévère la gravité de nos procédures et nous compenserons par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés. Dès l'entrée en procédure, les animaux seront soumis à un contrôle quotidien par le principal expérimentateur de façon à relever tout changement d'aspect (dos voûté, pelage non entretenu) et de comportement (apathie, souris à l'écart), à mener leur habituation aux différents tests et à réaliser des injections intrapéritonéales si nécessaire. Ce suivi quotidien permettra aussi un contrôle visuel et expérimental (niveau de sensibilité douloureuse) de l'état de l'animal et de ses sites d'injection. Ainsi, tout animal qui présenterait des signes d'infection au site d'injection, de paralysie, de douleur excessive permanente (vocalisations, convulsions), de comportement basal anormal (prostration, apathie..) ou d‘une pathologie quelconque (plaie...) serait euthanasié sur le champ, car nous ne pouvons pas envisager l’emploi d’analgésique ou d’anesthésique dans notre étude des conséquences de la douleur. Un suivi du poids corporel sera également effectué toutes les semaines par pesée. Une perte de poids comprise entre 10 et 15 % du poids de la semaine précédente conduira à une surveillance accrue de l'animal. Celui-ci sera euthanasié si son état ne s'est pas amélioré la semaine suivante. Un suivi tous les 2 jours sera aussi organisé après les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (pendant 6 jours). En plus du suivi par les expérimentateurs, les animaux seront suivis quotidiennement par l’équipe de l’animalerie de l’institut afin de détecter le plus rapidement tout signe de mal-être. Un formulaire permettant l'évaluation de la douleur sera rempli systématiquement. Les animaux seront sacrifiés à un score égal ou supérieur à 3 dans le tableau de l'évaluation de la douleur en annexe.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu de chacune des procédures. Dans le cadre des procédures 1 et 2, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. Dans le cadre des procédures 3 et 4, les animaux seront anesthésiés (procédure sans réveil) et une perfusion intracardiaque sera réalisée afin de prélever des tissus de qualité optimale pour les analyses histologiques post mortem.
Remplacement
Nos études préalables menées sur des neurones en culture et chez les rongeurs ont permis de caractériser le phénotype migraineux des animaux mutants pour les K2P d’intérêt. De plus, les effets métaboliques analysés sur le long terme et le suivi du vieillissement des animaux requièrent un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant. Les pathologies associées au vieillissement (diabète, néoplasmes, etc) sont d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Leur apparition et leur gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro. De plus, nos résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet.
Réduction
Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel GPower). Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique permanente) ne sera pas réalisée. Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’évaluation des données obtenues se fera en appliquant un test statistique paramétrique (student t-test ou ANOVA si plus de deux groupes) ou non paramétrique afin de pouvoir réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables. Pour évaluer le nombre d'animaux utilisés, nous avons utilisé le programme GPower 3.1 : F-tests ANOVA 2 ways : Fixed effects, special, main effects and interactions. Effects size (medium) : 0.25 alpha err prob : 0.05 Power (1-beta err prob) : 0.8. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs.
Raffinement
Notre expertise dans le domaine de la douleur nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et nous porterons une attention particulière à limiter toute forme de stress de nos animaux (habituation en amont de chaque procédure). Aucun des animaux élevés pour ce projet ne présente de phénotype dommageable. En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer la douleur et de mettre en oeuvre des points limites précoces. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi, sans isolement et en accord avec la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle d'étude, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l'humain, et de la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons à notre disposition tous les outils déjà mis au point et validés pour pouvoir étudier les modèles génétiques des canaux ioniques TREK1, TREK2 et TRESK dans la souris. 2 âges seront étudiés: 3 et 12 mois. Ces âges sont choisis de manière à représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes adultes (matures) et individus âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter le phénotype observé dans ces animaux. Chaque animal sera utilisé à 3 et 12 mois pour réduire le nombre total d’animaux, et parce que chaque animal sera son propre contrôle interne.
Effet de deux mutations dans un gène impliqué dans le développement cérébral chez la souris EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris de ce projet sont génétiquement modifiées pour étudier deux mutations d'un gène du développement cérébral, LKB1, et certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies du développement. 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : des femelles gestantes subissent sous anesthésie une chirurgie d'électroporation in utero, puis leurs souriceaux, triés dès la naissance par la fluorescence visible à travers le crâne, sont étudiés au sevrage ou à 90 jours. Après les accouplements, la majorité des mâles se battent et sont alors hébergés seuls. Le porteur présente les tests de comportement social comme "bien établis chez la souris", sans dire si ce projet en fait passer ni lesquels. Toutes les souris sont tuées : les souriceaux pour des prélèvements, les reproducteurs âgés "réformés" faute de replacement, et les femelles opérées, que le porteur dit ne pas soumettre à une nouvelle procédure "pour raison éthique".
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un gène comme relai intracellulaire pour les signaux émis par les cellules du cerveau au cours de la formation des réseaux de neurones du cortex cérébral. Les connaissances antérieures ont démontré l’importance de ce gène pour le développement cérébral. Des domaines de régulation de ce gène ont été identifiés dans des lignées de cellules, et ont conduit à l’identification de deux mutations qui perturbent la régulation du gène d’intérêt. Lorsque ces mutations sont introduites chez la souris, elles entrainent des défauts du comportement social rappelant les troubles du spectre autistique. Ce projet a pour objectif d’identifier les défauts de connectivité qui expliquent les défauts de comportement, lors de la mutation de ce gène, chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet répond à une problématique fondamentale qui permettra de mieux comprendre comment se forment les réseaux neuronaux dans le développement normal du cerveau. A terme cette étude permettra de mieux comprendre les causes de troubles du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie (1 injection avant l’opération, et jusqu’à 2 injections après opération), appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, le temps total de l’anesthésie est estimé à 5 minutes.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée des animaux et leur contention peut entraîner un stress modéré qui néanmoins s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Suite aux accouplements, il est observé chez la majorité des mâles un comportement de bagarre nécessitant leur hébergement en cage individuelle. Certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies développementales. Des animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie, pouvant entrainer du stress et de la douleur pendant la phase de réveil et la phase post-opératoire, malgré l’utilisation d’antalgiques.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement. Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.
Remplacement
Les études préliminaires à ce projet ont été conduites in vitro, ce qui permet de ne tester chez l’animal que les approches qui ont montré un potentiel résultat . Il est à présent nécessaire d’observer le développement cérébral in vivo pour aller plus loin dans l'analyse des conséquences de la mutation du gène d'intérêt et le lien avec les perturbations du comportement social retrouvées chez les animaux mutants. Ces projections dépendent de l’architecture cérébrale et des interactions cellule-cellule, qui sont reproduites de façon imparfaite in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d'expériences similaires pour tenir compte d'aléas non contrôlables tels que la variabilité entre les expériences, ou le génotype des portées. Certains animaux devront être exclus de l’analyse a posteriori pour des raisons techniques, ce qui est compris dans le calcul du nombre d'animaux. Les groupes expérimentaux seront faits séquentiellement, afin de pouvoir arrêter l'étude en cours si le résultat est négatif. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne continuer inutilement la procédure sur un animal qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. L’enrichissement sera contrôlé et strictement identique entre tous les animaux (nidation, cache, objet en boit pour jouer/mâcher…). Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort. Afin de prévenir toute souffrance inutile, des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures réalisées ont été définis. Un arbre décisionnel, à la disposition des expérimentateurs et des zootechniciens, permettra le cas échéant de décider de l’arrêt des souffrances au moyen de critères prédéfinis, sous le contrôle de la SBEA de l’établissement. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information. Ce projet se déroule sur deux établissements utilisateurs. Le transport des animaux est rapide et sera réalisé dans des conditions minimisant le stress lié au transport et à l'arrivée dans un nouvel environnement.
Choix des espèces
Le choix d'un modèle rongeur (souris) est justifié par le fait que la souris a un cerveau dont la structure est proche du cerveau humain. Le développement embryonnaire est rapide et le développement postnatal est court, ce qui permet d''obtenir rapidement les résultats de l'étude. Enfin, les tests de comportement social pertinents pour l'étude des troubles autistiques sont bien établis chez la souris, ce qui nous assure que le projet permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les reproducteurs (mâles et femelles) seront des adultes entre 8 et 30 semaines, au pic de leur fertilité. Les souriceaux seront utilisés soit au moment du sevrage (J21), correspondant à l’âge où la connectivité corticale est établie, pour déterminer un effet sur la formation des projections axonales, soit à J90, âge où les connexions sont matures, pour déterminer un effet des mutations de LKB1 sur la sélection des contacts synaptiques liés à la plasticité cérébrale. Cet âge correspond également à l’âge où nous observons des anomalies du comportement social.
Etude et vectorisation de nouvelles molécules à visée anti-fibrotique
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Toute souris qui perd 20 % de son poids est sortie de l'étude et tuée par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. 220 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère, toutes mises à mort à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Une administration par la trachée, sous anesthésie, déclenche chez une partie d'entre elles une fibrose pulmonaire suivie par cinq séances de microscanner, et les souris traitées reçoivent sept injections intrapéritonéales et une ou trois administrations des composés, par la veine ou par la trachée, avec une gêne respiratoire et des douleurs attendues. Le porteur affirme que la fibrose "ne peut se concevoir que sur organisme entier" et que "le recours à l'animal reste une étape indispensable", et prévoit aussi d'évaluer les composés sur des cellules pulmonaires de patients "pour valider ce médicament dans un contexte humain".
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique fibrosante associée à un déclin progressif de la fonction pulmonaire et a une durée médiane de survie inférieure à 5 ans après le diagnostic. Il n'existe pas de traitement curatif et les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la fibrose pulmonaire sont encore peu connus. Dans ce projet, nous proposons d’optimiser l'administration de nouveaux composés anti-fibrose et de tester leur efficacité dans des modèles murins de fibrose pulmonaire. Le développement de la fibrose sera suivi de manière non invasive par imagerie. Seuls les composés validés sur cellules seront évaluées chez l'animal. Les composés porteront un marqueur fluorescent afin de suivre leur comportement dans l’organisme en temps réel et de façon non-invasive par imagerie de fluorescence. L’efficacité des composés sera evaluée pour le traitement de la fibrose. De plus, l'efficacité, la spécificité et le mécanisme d'action des composés dans les différentes populations cellulaires du poumon atteint de fibrose seront évalués sur les poumons. Les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le processus de fibrose, et le recours à l’animal reste une étape indispensable pour démontrer le potentiel traitement anti-fibrose d’un candidat médicament. Ces composés seront également évalués dans des cellules pulmonaires primaires provenant de patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique pour valider ce médicament dans un contexte humain.
Bénéfices attendus
La fibrose est un processus complexe mettant en jeu de nombreux types cellulaires. Les options de traitement pour la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) sont limitées avec seulement deux médicaments approuvés, le nintedanib et la pirfénidone, qui ralentissent la progression de la fibrose pulmonaire mais sont incapables d'inverser ou même d'arrêter la maladie. Ce projet permettra d'optimiser l'administration de composés anti-fibrose pour augmenter l'efficacité de traitement. Il pourra également ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour d'autres types de fibrose, comme la fibrose rénale, hépatique ou musculaire.
Procédures
Dans le cadre de l'administration des composés, les animaux subiront soit une injection intraveineuse (1 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse), soit une administration par voie intratrachéale (1 fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse). Dans le cadre de la cinétique sanguine, les animaux auront des prélèvements sanguins répétés dans la veine caudale (5 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse). Dans le cadre de la détermination de la biodistribution des composés, les animaux subiront une injection intrapéritonéale (1 à 2 fois, 1 minute) et une anesthésie gazeuse le temps de l'imagerie de bioluminescence (1 à 2 fois, 5 minutes). Dans le cadre des procédures d’imagerie de fluorescence, les animaux seront simplement anesthésiés au gaz pendant l'imagerie (6 fois, 5 minutes). Dans le cadre du développement de la fibrose, les animaux subiront une administration par voie intratrachéale (1 fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse), puis les animaux seront simplement anesthésiés au gaz pendant l'imagerie µCT (5 fois, 10 minutes). Dans le cadre des procédures d'efficacité thérapeutiques, les animaux avec fibrose subiront des injections intrapéritonéales (7 fois, 1 minute), et soit des injections intraveineuses (1 ou 3 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse), soit des administrations par voie intratrachéale (1 ou fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse).
Impact sur les animaux
Dans cette étude, les nuisances ou effets indésirables attendus sont : douleurs et conséquences de l'administration intratrachéale pour déclencher la fibrose, des injections intrapéritonéales et intraveineuses, stress de la contention et des anesthésies répétées (pour l'imagerie et les traitements), gène respiratoire et/ou douleurs induites par la présence de fibrose.
Devenir
Les animaux issus des procédures seront mis à mort, afin de prélever leurs organes, les imager et les conserver pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Les paramètres de biodistribution sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques. De plus, les processus biologiques à l’origine du développement de la fibrose sont mal connus. La fibrose étant un processus dynamique mettant en jeu de nombreux types cellulaires, son étude ne peut se concevoir que sur organisme entier. Les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le processus de fibrose, et le recours à l’animal reste une étape indispensable pour démontrer le potentiel anti-fibrose d’un candidat médicament. Les rongeurs constituent un modèle de choix pour l’étude de la fibrose, on retrouve de nombreuses similitudes avec la pathologie humaine et nous disposons d’une grande variété d’outils moléculaires pour mener à bien nos expérimentations. Le consensus actuel est que l'utilisation du modèle murin de fibrose par instillation de bléomycine par voie oropharyngée représente le modèle animal le mieux caractérisé disponible pour les tests précliniques.
Réduction
Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de composés à tester in vivo. Les modèles utilisés dans ce projet utilisent des procédures couramment décrites, et qui ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et valides. Les nombres de souris indiqués par condition sont nécessaires pour une analyse statistique fiable, évitant de refaire l’expérience. Le nombre des groupes sera ajusté en fonction des premiers résultats de biodistribution. La mise en place du modèle murin de référence pour la fibrose sera effectuée dans une étude pilote qui permettra de déterminer les doses optimales de bléomycine (dépendante de chaque lot de bléomycine) à administrer pour l’induction de la fibrose pulmonaire et la durée du suivi par imagerie non invasive afin d’observer une résolution totale. Cette étude nous permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux dans les procédures suivantes. De plus, seuls le meilleur composé et la meilleure voie d’administration seront testés dans des modèles de fibrose, ce qui permettra aussi de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques en expérimentation animale. Les animaux seront maintenus dans des cages ventilées. Les animaux seront hébergés par fratries afin de limiter les bagarres. Les conditions standards de luminosité, hygrométrie et température seront appliquées. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, enrichi avec des tunnels en carton et morceaux de papier pour y faire un nid. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La gravité des procédures est légère pour les biodistributions, cinétiques sanguines et traitements. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. Des points limites pertinents seront déterminés et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. La mise à mort sera faite sous anesthésie générale. Nous réaliserons une étude pilote afin d’optimiser et calibrer finement le modèle de fibrose et permettre un suivi non-invasif par imagerie. Les animaux seront anesthésiés afin de réduire le stress et la douleur. Un suivi quotidien accru des animaux sera effectué au cours de l’établissement de la fibrose. Les paramètres observés seront la prostration, la diminution de la mobilité, la forte baisse de température et la perte de poids. Tout animal présentant une perte de poids de 20% par rapport aux pesées précédentes sera sorti de l’étude et euthanasié par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Les modèles animaux permettent d’avancer dans la mise au point de nouvelles thérapies et procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Les rongeurs constituent un modèle de choix pour l’étude de la fibrose tissulaire, on retrouve en effet de nombreuses similitudes avec la pathologie humaine. Plus particulièrement, nous utiliserons des souris de 8 semaines mâles en raison de leur sensibilité notamment aux atteintes pulmonaires induites par la bléomycine. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes, de taille et de poids suffisants pour être facilement manipulables.
Immuno-virothérapie du cancer du foie 1/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
Greffées de cellules tumorales du foie sous la peau ou, après une incision de l'abdomen, directement dans le foie, 882 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Certaines passent ensuite sept anesthésies en six semaines pour des échographies ou de l'imagerie par bioluminescence, et une partie des lots reçoit trois injections d'un vaccin à ARNm dans le péritoine, trois injections d'un virus oncolytique dans la tumeur ou le foie, ou les deux. Le projet doit établir une preuve de concept pour cette association contre le carcinome hépatocellulaire. Sur la douleur des souris, le porteur invoque des "données cliniques chez l'homme" selon lesquelles les tumeurs intrahépatiques "ne sont pas douloureuses", et écrit aussi que le niveau de nuisance "dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur".
Objectifs
Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale ciblant un antigène associé aux tumeurs hépatiques : l’alpha-fœtoprotéine, avec l’action de virus oncolytiques (virus capable d’éliminer préférentiellement les cellules cancéreuses) dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm codant l’alpha-fœtoprotéine, qui est l’antigène candidat reconnu le plus prometteur pour les vaccins cancer du foie. L’ARNm utilisé comportera les modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’ARNm sera associé à des NanoParticules Lipidiques pour servir de vaccin à des groupes de souris, porteuses de tumeurs du foie. L’effet protecteur et curatif de la vaccination ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus oncolytique seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les essais de vaccination contre les antigènes associés aux tumeurs du carcinome hépatocellulaire reposent essentiellement sur l’utilisation de peptides ou de protéines recombinantes. Des avancées récentes dans l’utilisation d’ARNm modifié dans la composition de vaccins, notamment par le développement de vecteurs de nano particules lipidiques, ouvrent de nouvelles perspectives vaccinales. La récente démonstration pour les mélanomes de l’efficacité de l’association de l’immunothérapie des points de contrôle immunitaire avec la vaccination par des nanoparticules lipidiques chargées avec des ARNm codant des antigènes associés aux tumeurs des mélanomes ouvre la voie à de nouvelles thérapies pour d’autres cancers. L’originalité du projet repose sur la combinaison de l’action de virus oncolytiques provoquant la destruction de la tumeur ouvrant ainsi l’accès aux cellules tumorales pour les réponses immunitaires spécifiques induites par le vaccin ARN. La combinaison de thérapies impliquant différents mécanismes d’action anti-tumoraux apportera 1) la spécificité antigénique initiale grâce à la vaccination favorisant l’infiltration lymphocytaire intra-tumorale, et 2) la lyse tumorale amplifiée grâce aux virus oncolytiques favorisant ultérieurement la réponse immunitaire.
Procédures
La moitié des lots de souris subira une anesthésie gazeuse d'environ 5 minutes puis une injection sous-cutanée de 30 secondes. L'autre moitié des lots subira une anesthésie gazeuse d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre., puis une injection (30 secondes) dans le foie. Certains animaux subiront ensuite 7 anesthésies gazeuses d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie par bioluminescence, sur une durée totale de 6 semaines. Parmi les lots décrits précédemment, certains lots subiront en plus trois injections intrapéritonéales et/ou 3 injections intratumorales ou intrahépatiques (30 secondes pour chaque injection) entre J+3 et J+17 post greffe. Les animaux traités avec le virus oncolytique subiront 3 anesthésies gazeuses rapides (inférieures à 5 minutes) suivies à chaque fois d’une injection intrahépatique/tumorale per cutanée.
Impact sur les animaux
La greffe de tumeur en sous-cutané est un geste rapide et peu douloureux pour l'animal (piqure d’aiguille dans le flanc) et sera réalisé sous anesthésie générale. Pour cette procédure, un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal et une douleur légère au point d'injection. La taille des tumeurs sera mesurée tous les deux ou trois jours à l’aide d’un pied à coulisse digital. Un stress lors de la préhension de l'animal pourrait survenir. La greffe de tumeur en intrahépatique implique une anesthésie générale de l’animal. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. Ensuite, l’animal endormi subira une laparotomie mineure. Une douleur au niveau de la suture pourrait apparaître et sera prise en charge par une analgésie adaptée. Les données cliniques chez l’homme montrent que les tumeurs intrahépatiques ne sont pas douloureuses. Les effets indésirables particuliers en réponse aux traitements seront quasiment absents. En effet, la stratégie vaccinale par nanoparticules lipidique (NPL) et l’utilisation de virus oncolytiques (VO) ont déjà été validées dans des protocoles précédents et ces traitements n'ont pas engendré d'effets indésirables notoires lors de leur mise en œuvre. L’administration des traitements engendrera une douleur légère au point d’injection (intrapéritonéal pour les NPL, ou intra-tumoral pour les VO). Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur. Les compétences des manipulateurs et des points limites adaptés permettent de limiter et prendre en charge efficacement douleur et stress. Enfin, le suivi longitudinal de la taille des tumeurs en greffes orthotopiques sera réalisé sur animal anesthésié sur une courte période (quelques minutes) par échographie et bioluminescence. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. La suite de la procédure est non invasive, non douloureuse. Pour la bioluminescence, une injection IP est réalisée pourra engendrer une douleur légère au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses biochimiques et moléculaires ultérieures.
Remplacement
Le foie est un organe très complexe du point de vue tissulaire et comporte une haute diversité cellulaire. En effet, les hépatocytes, principale composante cellulaire du foie, sont des cellules épithéliales donc polarisées. Les cultures in vitro en 2D ne peuvent reproduire cette polarisation, limitant ainsi les modèles de remplacement à des cultures d'organoïdes ou d'organe sur puce. Ces modèles reproduisent bien les fonctions métaboliques des hépatocytes et permettent des études de toxicité des molécules à visée thérapeutique (ils seront d'ailleurs utilisés en amont de ce projet dans ce but). De nombreuses autres cellules participent à l'homéostasie du tissu hépatique, notamment les cellules immunitaires (macrophages, lymphocytes...). A ce jour, quelques modèles in vitro proposent de reproduire une partie cette complexité cellulaire. Notre projet étant une investigation thérapeutique reposant sur l'immunité de l'organisme et impliquant la communication entre différents compartiments tissulaires (cellules tumorales, microenvironnement tissulaire, système immunitaire de la souris), nous ne pouvons remplacer ce modèle animal par aucune méthode alternative actuelle, même les plus complexes.
Réduction
Les formules moléculaires des nanoparticules lipidiques et des virus oncolytiques seront analysées et présélectionnées par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleures formules moléculaires contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans l’expérimentation animale et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seules les formules présentant un intérêt entreront dans les traitements chez la souris. Un suivi longitudinal de la taille des tumeurs de chaque animal sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance tumorale par sacrifice des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (taille de la tumeur) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.
Raffinement
Le raffinement du protocole prendra en compte le suivi de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse (greffe ectopique) ou d'une imagerie non invasive (échographie, bioluminescence, pour les greffes orthotopiques) afin de s'assurer qu'elles restent inférieures à la taille classiquement utilisée comme point limite en cancérologie chez la souris. Afin de raffiner notre approche in vivo, nous nous basons sur des études précédentes qui montrent une excellente tolérance des complexes Lipidots-ARNm et sur une étude qui montre que la prise de greffe est influencée par le moment de la journée où elle est pratiquée. Nous choisirons donc le moment de la journée le plus favorable à la greffe. De plus, les animaux seront toujours hébergés en groupes avec un enrichissement du milieu. Un suivi quotidien des animaux sera effectué. L’utilisation d’analgésique sera réalisée si nécessaire et suivant les procédures décrites dans ce projet afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur comptétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.
Choix des espèces
Le développement de tumeur par greffe syngénique chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Nous disposons de différentes cellules issues de tumeurs du foie chez ces souris, qui pourront donc être greffées dans des souris immunocompétentes (modèle syngénique) et présentant des différences de réponses inflammatoires intéressantes pour ce projet. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.
Immuno-virothérapie du cancer du foie 3/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
882 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour le prélèvement de leurs organes. Elles reçoivent sous anesthésie une greffe de cellules de tumeur du foie, sous la peau ou directement dans le foie après une incision de l'abdomen, puis, selon les lots, des injections de traitement, et pour certaines sept anesthésies en six semaines pour suivre la tumeur par imagerie. Mené dans trois établissements, le projet teste l'association d'un vaccin à ARNm contre l'alpha-fœtoprotéine et de virus censés éliminer de préférence les cellules cancéreuses. Pour décrire la douleur des souris greffées dans le foie, le porteur invoque des "données cliniques chez l'homme" selon lesquelles les tumeurs intrahépatiques "ne sont pas douloureuses", tout en écrivant que la nuisance "peut augmenter avec la taille de la tumeur".
Objectifs
Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale ciblant un antigène associé aux tumeurs hépatiques : l’alpha-fœtoprotéine, avec l’action de virus oncolytiques (virus capable d’éliminer préférentiellement les cellules cancéreuses) dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm codant l’alpha-fœtoprotéine, qui est l’antigène candidat reconnu le plus prometteur pour les vaccins cancer du foie. L’ARNm utilisé comportera les modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’ARNm sera associé à des NanoParticules Lipidiques pour servir de vaccin à des groupes de souris, porteuses de tumeurs du foie. L’effet protecteur et curatif de la vaccination ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus oncolytique seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les essais de vaccination contre les antigènes associés aux tumeurs du carcinome hépatocellulaire reposent essentiellement sur l’utilisation de peptides ou de protéines recombinantes. Des avancées récentes dans l’utilisation d’ARNm modifié dans la composition de vaccins, notamment par le développement de vecteurs de nano particules lipidiques, ouvrent de nouvelles perspectives vaccinales. La récente démonstration pour les mélanomes de l’efficacité de l’association de l’immunothérapie des points de contrôle immunitaire avec la vaccination par des nanoparticules lipidiques chargées avec des ARNm codant des antigènes associés aux tumeurs des mélanomes ouvre la voie à de nouvelles thérapies pour d’autres cancers. L’originalité du projet repose sur la combinaison de l’action de virus oncolytiques provoquant la destruction de la tumeur ouvrant ainsi l’accès aux cellules tumorales pour les réponses immunitaires spécifiques induites par le vaccin ARN. La combinaison de thérapies impliquant différents mécanismes d’action anti-tumoraux apportera 1) la spécificité antigénique initiale grâce à la vaccination favorisant l’infiltration lymphocytaire intra-tumorale, et 2) la lyse tumorale amplifiée grâce aux virus oncolytiques favorisant ultérieurement la réponse immunitaire.
Procédures
La moitié des lots de souris subira une anesthésie gazeuse d'environ 5 minutes puis une injection sous-cutanée de 30 secondes. L'autre moitié des lots subira une anesthésie gazeuse d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre., puis 3 injections successives (30 secondes chacune) dans le foie. Certains animaux subiront ensuite 7 anesthésies gazeuses d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie par bioluminescence, sur une durée totale de 6 semaines. Parmi les lots décrits précédemment, certains lots subiront en plus trois injections intrapéritonéales et/ou 3 injections intratumorales ou intrahépatiques (30 secondes pour chaque injection) entre J+3 et J+17 post greffe.
Impact sur les animaux
La greffe de tumeur en sous-cutané est un geste rapide et peu douloureux pour l'animal (piqure d’aiguille dans le flanc) et sera réalisé sous anesthésie générale. Pour cette procédure, un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal et une douleur légère au point d'injection. La taille des tumeurs sera mesurée tous les deux ou trois jours à l’aide d’un pied à coulisse digital. Un stress lors de la préhension de l'animal pourrait survenir. La greffe de tumeur en intrahépatique implique une anesthésie générale de l’animal. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. Ensuite, l’animal endormi subira une laparotomie mineure. Une douleur au niveau de la suture pourrait apparaître et sera prise en charge par une analgésie adaptée. Les données cliniques chez l’homme montrent que les tumeurs intrahépatiques ne sont pas douloureuses. Les effets indésirables particuliers en réponse aux traitements seront quasiment absents. En effet, la stratégie vaccinale par nanoparticules lipidique (NPL) et l’utilisation de virus oncolytiques (VO) ont déjà été validées dans des protocoles précédents et ces traitements n'ont pas engendré d'effets indésirables notoires lors de leur mise en œuvre. L’administration des traitements engendrera une douleur légère au point d’injection (intrapéritonéal pour les NPL, ou intra-tumoral pour les VO). Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur. Les compétences des manipulateurs et des points limites adaptés permettent de limiter et prendre en charge efficacement douleur et stress. Enfin, le suivi longitudinal de la taille des tumeurs en greffes orthotopiques sera réalisé sur animal anesthésié sur une courte période (quelques minutes) par échographie et bioluminescence. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. La suite de la procédure est non invasive, non douloureuse. Pour la bioluminescence, une injection IP est réalisée pourra engendrer une douleur légère au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses biochimiques et moléculaires ultérieures.
Remplacement
Le foie est un organe très complexe du point de vue tissulaire et comporte une haute diversité cellulaire. En effet, les hépatocytes, principale composante cellulaire du foie, sont des cellules épithéliales donc polarisées. Les cultures in vitro en 2D ne peuvent reproduire cette polarisation, limitant ainsi les modèles de remplacement à des cultures d'organoïdes ou d'organe sur puce. Ces modèles reproduisent bien les fonctions métaboliques des hépatocytes et permettent des études de toxicité des molécules à visée thérapeutique (ils seront d'ailleurs utilisés en amont de ce projet dans ce but). De nombreuses autres cellules participent à l'homéostasie du tissu hépatique, notamment les cellules immunitaires (macrophages, lymphocytes...). A ce jour, quelques modèles in vitro proposent de reproduire une partie cette complexité cellulaire. Notre projet étant une investigation thérapeutique reposant sur l'immunité de l'organisme et impliquant la communication entre différents compartiments tissulaires (cellules tumorales, microenvironnement tissulaire, système immunitaire de la souris), nous ne pouvons remplacer ce modèle animal par aucune méthode alternative actuelle, même les plus complexes.
Réduction
Les formules moléculaires des nanoparticules lipidiques et des virus oncolytiques seront analysées et présélectionnées par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleures formules moléculaires contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans l’expérimentation animale et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seules les formules présentant un intérêt entreront dans les traitements chez la souris. Un suivi longitudinal de la taille des tumeurs de chaque animal sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance tumorale par sacrifice des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (taille de la tumeur) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.
Raffinement
Le raffinement du protocole prendra en compte le suivi de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse (greffe ectopique) ou d'une imagerie non invasive (échographie, bioluminescence, pour les greffes orthotopiques) afin de s'assurer qu'elles restent inférieures à la taille classiquement utilisée comme point limite en cancérologie chez la souris. Afin de raffiner notre approche in vivo, nous nous basons sur des études précédentes qui montrent une excellente tolérance des complexes Lipidots-ARNm et sur une étude qui montre que la prise de greffe est influencée par le moment de la journée où elle est pratiquée. Nous choisirons donc le moment de la journée le plus favorable à la greffe. De plus, les animaux seront toujours hébergés en groupes avec un enrichissement du milieu. Un suivi quotidien des animaux sera effectué. L’utilisation d’analgésique sera réalisée si nécessaire et suivant les procédures décrites dans ce projet afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur comptétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.
Choix des espèces
Le développement de tumeur par greffe syngénique chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Nous disposons de différentes cellules issues de tumeurs du foie chez ces souris, qui pourront donc être greffées dans des souris immunocompétentes (modèle syngénique) et présentant des différences de réponses inflammatoires intéressantes pour ce projet. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.
Immuno-virothérapie du cancer du foie 2/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
Anesthésie gazeuse, puis greffe de tumeur du foie sous la peau du flanc pour la moitié des lots, ou incision de l'abdomen et trois injections dans le foie pour l'autre moitié : ainsi commence le protocole pour les 882 souris de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Entre J+3 et J+17, certains lots reçoivent trois injections intrapéritonéales ou intratumorales d'un vaccin à ARNm contre l'alpha-fœtoprotéine ou de virus oncolytiques, et certaines souris subissent sept anesthésies sur six semaines pour des échographies ou de l'imagerie par bioluminescence. Les tumeurs sous la peau sont mesurées au pied à coulisse tous les deux ou trois jours. Toutes les souris sont tuées à l'issue de chaque procédure, et leurs organes prélevés pour des analyses biochimiques et moléculaires.
Objectifs
Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale ciblant un antigène associé aux tumeurs hépatiques : l’alpha-fœtoprotéine, avec l’action de virus oncolytiques (virus capable d’éliminer préférentiellement les cellules cancéreuses) dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm codant l’alpha-fœtoprotéine, qui est l’antigène candidat reconnu le plus prometteur pour les vaccins cancer du foie. L’ARNm utilisé comportera les modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’ARNm sera associé à des NanoParticules Lipidiques pour servir de vaccin à des groupes de souris, porteuses de tumeurs du foie. L’effet protecteur et curatif de la vaccination ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus oncolytique seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les essais de vaccination contre les antigènes associés aux tumeurs du carcinome hépatocellulaire reposent essentiellement sur l’utilisation de peptides ou de protéines recombinantes. Des avancées récentes dans l’utilisation d’ARNm modifié dans la composition de vaccins, notamment par le développement de vecteurs de nano particules lipidiques, ouvrent de nouvelles perspectives vaccinales. La récente démonstration pour les mélanomes de l’efficacité de l’association de l’immunothérapie des points de contrôle immunitaire avec la vaccination par des nanoparticules lipidiques chargées avec des ARNm codant des antigènes associés aux tumeurs des mélanomes ouvre la voie à de nouvelles thérapies pour d’autres cancers. L’originalité du projet repose sur la combinaison de l’action de virus oncolytiques provoquant la destruction de la tumeur ouvrant ainsi l’accès aux cellules tumorales pour les réponses immunitaires spécifiques induites par le vaccin ARN. La combinaison de thérapies impliquant différents mécanismes d’action anti-tumoraux apportera 1) la spécificité antigénique initiale grâce à la vaccination favorisant l’infiltration lymphocytaire intra-tumorale, et 2) la lyse tumorale amplifiée grâce aux virus oncolytiques favorisant ultérieurement la réponse immunitaire.
Procédures
La moitié des lots de souris subira une anesthésie gazeuse d'environ 5 minutes puis une injection sous-cutanée de 30 secondes. L'autre moitié des lots subira une anesthésie gazeuse d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre., puis 3 injections successives (30 secondes chacune) dans le foie. Certains animaux subiront ensuite 7 anesthésies gazeuses d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie par bioluminescence, sur une durée totale de 6 semaines. Parmi les lots décrits précédemment, certains lots subiront en plus trois injections intrapéritonéales et/ou 3 injections intratumorales ou intrahépatiques (30 secondes pour chaque injection) entre J+3 et J+17 post greffe.
Impact sur les animaux
La greffe de tumeur en sous-cutané est un geste rapide et peu douloureux pour l'animal (piqure d’aiguille dans le flanc) et sera réalisé sous anesthésie générale. Pour cette procédure, un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal et une douleur légère au point d'injection. La taille des tumeurs sera mesurée tous les deux ou trois jours à l’aide d’un pied à coulisse digital. Un stress lors de la préhension de l'animal pourrait survenir. La greffe de tumeur en intrahépatique implique une anesthésie générale de l’animal. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. Ensuite, l’animal endormi subira une laparotomie mineure. Une douleur au niveau de la suture pourrait apparaître et sera prise en charge par une analgésie adaptée. Les données cliniques chez l’homme montrent que les tumeurs intrahépatiques ne sont pas douloureuses. Les effets indésirables particuliers en réponse aux traitements seront quasiment absents. En effet, la stratégie vaccinale par nanoparticules lipidique (NPL) et l’utilisation de virus oncolytiques (VO) ont déjà été validées dans des protocoles précédents et ces traitements n'ont pas engendré d'effets indésirables notoires lors de leur mise en œuvre. L’administration des traitements engendrera une douleur légère au point d’injection (intrapéritonéal pour les NPL, ou intra-tumoral pour les VO). Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur. Les compétences des manipulateurs et des points limites adaptés permettent de limiter et prendre en charge efficacement douleur et stress. Enfin, le suivi longitudinal de la taille des tumeurs en greffes orthotopiques sera réalisé sur animal anesthésié sur une courte période (quelques minutes) par échographie et bioluminescence. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. La suite de la procédure est non invasive, non douloureuse. Pour la bioluminescence, une injection IP est réalisée pourra engendrer une douleur légère au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses biochimiques et moléculaires ultérieures.
Remplacement
Le foie est un organe très complexe du point de vue tissulaire et comporte une haute diversité cellulaire. En effet, les hépatocytes, principale composante cellulaire du foie, sont des cellules épithéliales donc polarisées. Les cultures in vitro en 2D ne peuvent reproduire cette polarisation, limitant ainsi les modèles de remplacement à des cultures d'organoïdes ou d'organe sur puce. Ces modèles reproduisent bien les fonctions métaboliques des hépatocytes et permettent des études de toxicité des molécules à visée thérapeutique (ils seront d'ailleurs utilisés en amont de ce projet dans ce but). De nombreuses autres cellules participent à l'homéostasie du tissu hépatique, notamment les cellules immunitaires (macrophages, lymphocytes...). A ce jour, quelques modèles in vitro proposent de reproduire une partie cette complexité cellulaire. Notre projet étant une investigation thérapeutique reposant sur l'immunité de l'organisme et impliquant la communication entre différents compartiments tissulaires (cellules tumorales, microenvironnement tissulaire, système immunitaire de la souris), nous ne pouvons remplacer ce modèle animal par aucune méthode alternative actuelle, même les plus complexes.
Réduction
Les formules moléculaires des nanoparticules lipidiques et des virus oncolytiques seront analysées et présélectionnées par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleures formules moléculaires contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans l’expérimentation animale et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seules les formules présentant un intérêt entreront dans les traitements chez la souris. Un suivi longitudinal de la taille des tumeurs de chaque animal sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance tumorale par sacrifice des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (taille de la tumeur) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.
Raffinement
Le raffinement du protocole prendra en compte le suivi de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse (greffe ectopique) ou d'une imagerie non invasive (échographie, bioluminescence, pour les greffes orthotopiques) afin de s'assurer qu'elles restent inférieures à la taille classiquement utilisée comme point limite en cancérologie chez la souris. Afin de raffiner notre approche in vivo, nous nous basons sur des études précédentes qui montrent une excellente tolérance des complexes Lipidots-ARNm et sur une étude qui montre que la prise de greffe est influencée par le moment de la journée où elle est pratiquée. Nous choisirons donc le moment de la journée le plus favorable à la greffe. De plus, les animaux seront toujours hébergés en groupes avec un enrichissement du milieu. Un suivi quotidien des animaux sera effectué. L’utilisation d’analgésique sera réalisée si nécessaire et suivant les procédures décrites dans ce projet afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur comptétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.
Choix des espèces
Le développement de tumeur par greffe syngénique chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Nous disposons de différentes cellules issues de tumeurs du foie chez ces souris, qui pourront donc être greffées dans des souris immunocompétentes (modèle syngénique) et présentant des différences de réponses inflammatoires intéressantes pour ce projet. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.
Thérapie génique des tumeurs solides : CRISPR/Cas9 et photothérapie dynamique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sous la peau puis des séances d'imagerie deux fois par semaine pendant quatre semaines, avant mise à mort pour analyse des tumeurs. Le porteur décrit des brûlures cutanées légères liées à l'éclairage, une gêne ou une ulcération de la tumeur et une douleur à l'injection, pour une preuve de concept d'une photothérapie anticancéreuse. Sur le remplacement, il affirme que le test chez l'animal est "nécessaire" et que le rôle du microenvironnement tumoral impose le "modèle animal".
Objectifs
L'objectif est de montrer l'efficacité de la photothérapie dynamique dans le carde du traitemen de tumeurs solide.
Bénéfices attendus
Preuve de concept de l'efficacité de la thérapie par la lumière dans le traitement anti cancéreux.
Procédures
Injection des cellules en sous cutané : sur animal anesthésié, une seule fois, durée 1 minute. Imagerie optique : nécessite une injection IP sur souris vigile au préalable, puis imagerie sur souris anesthésiée (5 minutes), 2 fois par semaine pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
Légères brulures cutanées liées à l'éclairage. Gêne et/ou ulcération de la tumeur. Douleur au moment de l'injection dans le péritoine. Stress.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de l'étude afin de réaliser une étude histologique des tumeurs.
Remplacement
L'objectif étant de développer des thérapies applicables chez l'homme, le test de faisabilité chez l'animal en amont est nécessaire. De plus dans ce projet nous souhaitons tester notre approche thérapeutique dans un contexte tumoral sachant que le microenvironnement joue un rôle primordial, le modèle animal est nécessaire.
Réduction
L'imagerie optique permet de faire un suivi au cours du temps sur un même animal. Cette méthode permet donc de diminuer le nombre d'animaux au final.
Raffinement
Les lieux d'hébergement et d'expérimentation sont différents. Le transfert des animaux d'un lieu à l'autre se fera dans une cage de transport dédiée munie d'un couvercle filtrant. La cage contient litière, nourriture, eau et est transportée dans un sac à l'abri des regards extérieurs. Le trajet dure quelques minutes. Les souris sont hébergées en groupes avec un enrichissement du milieu (maison en carton, coton). Toutes les procédures sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l'anesthésie les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter l'hyporthermie. Les animaux sont quotidiennement suivis par l’expérimentateur et en cas de signes de souffrance un analgésique sera administré. Si la souffrance persiste, l’expérience sera stoppée.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris car la taille de l'animal est adaptée à l'imagerie optique. Nous utiliserons des souris immunodéprimées NSG car nous injecterons des cellules d'origine humaine. Les souris seront utilisées à un âge adulte compris entre 8 et 12 semaines car à cet âge là les animaux sont facilement manipulables rendant la contention aisée.
Carbamylation et stockage tissulaire du Sodium chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
26 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit du cyanate de sodium dans l'eau de boisson et subit des séances d'IRM une à deux fois par semaine de la dixième à la vingt-et-unième semaine, huit autres subissant une ablation partielle du rein pour reproduire une insuffisance rénale chronique, avant mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur affirme étudier le lien entre le stockage du sel sous la peau et une modification des protéines de ce tissu, au bénéfice d'une meilleure compréhension de l'insuffisance rénale chronique renvoyée à un horizon lointain. Sur le remplacement, il indique que l'IRM humaine ne serait pas assez sensible et que le phénomène ne peut pas s'analyser in vitro, concluant à la contrainte d'utiliser la souris.
Objectifs
Le corps humain est composé de 60% de liquide. Classiquement on considère que c’est la différence entre les entrées de sel (alimentation, boisson) et les sorties de sodium (urines, sueur, selles) qui permet de maintenir à l’équilibre les différents compartiments liquidiens. Cette vision classique fait donc un lien simple entre le stock en sodium et le stock en liquide, où un bilan positif en sodium s’accompagne d’une augmentation du volume liquidien en dehors des cellules. Cependant, différentes études ont mis en évidence que l’augmentation du stock en sel n’entraine pas systématiquement d’augmenation du stock de liquide. Ces constations ont conduit à la mise en évidence de zones de stockage de sel au niveau cutané et musculaire . Les voies de régulation de ces stocks sont semblent être modifiés dans différentes maladies. Les objectifs de notre projet visent à étudier le lien entre le stockage du sel sous la peau et la carbamylation des protéines de ce tissu . Nous faisons l’hypothèse que la carbamylation de ces protéines modifie le stockage du sodium dans ce tissu. . Le CDP le plus caractéristique est l'homocitrulline. Les protéines carbamylées s’accumulent dans la peau et les muscles avec l’âge, cette accumulation s’intensifie dans certaines conditions pathologiques comme la maladie rénale chronique.
Bénéfices attendus
En analysant l’effet de la carbamylation des tissus sur le stockage du sel sous la peau, notre projet permettra de poursuivre la caractérisation de ce compartiment de réserve en sel de l’organisme. La carbamylation étant amplifiée au cours de l’insuffisance rénale chronique nous pourrons envisager l’impact de cette modification biochimique sur l’accumulation cutané de sel dans cette pathologique et sa répartition entre peau et muscle, ce qui permettra de mieux comprendre cette maladie au cours de laquelle la gestion du sel de l’organisme est d’une grande importance (problème d’oedèmes, d’oedème aigu du poumon, d’hypertension artérielle).
Procédures
Pour les animaux avec le régine cyanate de sodium, les 6 animaux alimentés en cyanate de Na (0,5 mM) via l’eau de boisson et les 6 animaux alimentés en NaCl (0,5 mM) via l’eau de boisson seront eront imagés une à deux fois par semaine à partir de la 10ème semaine jusque l'euthanasie (semaine 21) Si les résultats obtenus avec le cyanate démontrent une modification des concentrations sodiques tissulaires par IRM (imagerie par resonance magnétique), un protocole d'IRC (insuffisance rénale chronique) sera alors envisagé. Pour cela, 8 animaux seront opérés (néphrectomie subtotale), et 6 animaux seront nécessaires pour les animaux contrôles IRC, donc au total : Les 12 animaux seront imagés une à deux fois par semaine à partir de la 10ème semaine jusque l'euthanasie (semaine 21)
Impact sur les animaux
Les animaux seront sous anesthésie générale (Isoflurane) durant les manipulations, puis euthanasiés en fin de protocole, nous ne pensons pas qu'il y aura des complications ou d'effets secondaires suite au régime sous cyanate de sodium. Par ailleurs, le modèle basé sur l'ajout de cyanate de sodium dans l'eau de boisson des souris a déjà été validé et utilisé précédemment dans d'autres projets de l'équipe. Les souris recevant ce traitement n'ont jamais montré quelconque signe de souffrance ou effet secondaire
Devenir
Les animaux seront euthanasié en fin de procédure afin de recupérer les tissus nous permettant de réaliser des expériences d'immunohistochimie.
Remplacement
Ce projet ne peut pas être remplacé par une étude clinque basée sur l'utilisation de patients insuffisants chroniques car la sensibilité des IRM pour l'imagerie humaines n'est pas assez sensible. Nous étudions un système complexe qui ne permet pas d’analyser le phénomène in vitro également. En effet l’accumulation de sodium tissulaire est régulée par les systèmes immunitaire et lymphatique. Un régime riche en sodium augmente la synthèse, la polymérisation et la sulfatation des glycosaminoglycanes et stimule la croissance des vaisseaux lymphatiques ce qui favorise la clairance du sodium stocké en sous-cutané. L’impact de la carbamylation des protéines de la matrice extra cellulaire sur ce phénomène n’est pas connu.
Réduction
Un calcul de puissance statistique a été effectué pour utiliser le nombre minimal mais suffisant pour observer une une différence significative entre les différents groupes. Nous prévoyons d'utiliser pour cela, au maximum, un nombre de 26 animaux.
Raffinement
Préalablement à la mise en place des expérimentations, les animaux seront hébergés dans des cages à raison de 3 souris par cage au maximum. En cas d'affrontement entre les animaux, le nombre de souris par cage sera réduit en conséquence. L'eau et la nourriture seront mis à disposition ad libitum et la litière changée régulièrement. Afin de limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies de divers équipements d'activité (igloos, tubes en carton, papier...). À leur arrivée dans l’animalerie et avant toute manipulation, les souris subiront une phase d’acclimatation aux conditions d’hébergement du laboratoire durant une période de 10 jours. Le suivi du protocole et de sa réalisation sera effectué par les responsables du projet en concertation avec la structure en charge du bien-être animal et les animaux seront anesthésiés durant toute la durée de l'expérience , de manière à n'induire aucune souffrance. Durant la phase d’anesthésie, si une détérioration irréversible de l'état de l'animal est observée (accélération anormale du rythme cardiaque ou suffocation ou hypothermie importante), alors l'animal sera immédiatement euthanasié. L'utilisation de l’IRM est également à la base de ce projet . Il s'agit d' une technique d’imagerie préclinique non invasive permettant de réaliser un suivi longitudinal du même animal. Concernant les animaux IRC, une injection d'analgesique sera réalisée avant le début de l’intervention pour la néphrectomie et sera répétée après 12h (2x/jours) et appliquée sur une durée de 3 jours).
Choix des espèces
Le modèle de nephrectomie a été développé chez la souris et l'antenne Na de l'IRM également ce qui nous contraint a utilisé uniquement cette espèce. En référence à nos résultats antérieurs, nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines pour réaliser la néphrectomie.
Effet du stress sur un modèle murin de maladie auto-inflammatoire monogénique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris génétiquement modifiées pour porter une mutation de la fièvre méditerranéenne familiale présentent un poids inférieur de 30 à 40 % et une perte de poils, et subissent des prises de température rectales répétées, des prélèvements sanguins et des injections quotidiennes pendant deux semaines. Le porteur ajoute des situations de stress pour amplifier la réponse inflammatoire et prévoit la mise à mort pour analyses immunologiques et histologiques. Il affirme que la réponse au stress n'est pas modélisable hors d'un "organisme entier" et présente les retombées thérapeutiques au conditionnel.
Objectifs
La fièvre méditerranéenne familiale (FMF) est une maladie auto-immunitaire héréditaire, assez fréquente dans certaines régions. Elle est caractérisée par des épisodes récurrents et imprévisibles d’inflammation (réaction de défense immunitaire), qui à long terme peuvent entraîner de graves complications et éventuellement la mort. La solution thérapeutique actuelle est basée sur une administration quotidienne et à vie d'un médicament (qui désassemble certains composants intracellulaires), mais 5 à 10% des patients FMF y sont intolérants ou résistants, d’où l’importance de développer de nouveaux traitements. À ce jour, les mécanismes précis responsables de telles crises inflammatoires chez ces patients demeurent inconnus. Néanmoins plusieurs hypothèses, découlant directement d’observations cliniques (dont le rôle de certaines hormones sexuelles et de molécules du stress), sont maintenant validées en culture cellulaire. En particulier, le stress serait capable d’amplifier l’activation de la réponse inflammatoire impliquée dans la FMF. Reste à comprendre comment ce dialogue a lieu, et montrer en quoi il représente une piste thérapeutique prometteuse. La FMF est due dans la plupart des cas à des modifications génétiques touchant une protéine "récepteur" de l'immunité (la pyrine), dérégulée chez les patients. La majorité de ces mutations affectent un domaine particulier de la pyrine. Il existe des modèles cellulaires pour étudier ces modifications pathologiques dans des cellules en culture, mais leur indispensable analyse à l'échelle de l'organisme est rendue difficile par l’absence de ce domaine particulier chez la Souris. Ceci explique l’intérêt de travailler sur un modèle de Souris génétiquement modifiées pour exprimer ce domaine humain portant des modifications typiques de la FMF. L’objectif de ce projet est d’étudier la modulation des symptômes inflammatoires chez ces souris, par des actions stimulatrices ou inhibitrices sur les signaux de stress, afin de mieux comprendre la régulation des crises inflammatoires et d’en proposer d’éventuels leviers de contrôle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont à la fois scientifiques (progrès des connaissances sur certaines maladies immunitaires génétiques) et cliniques : 1) À court terme : mise en évidence du rôle des signaux de stress dans la FMF, et de nouvelles voies à cibler pour moduler les symptômes. 2) A plus long terme : mieux comprendre l’origine des crises inflammatoires (dont les facteurs environnementaux par exemple certains stress), et possiblement tester des traitements innovants (plus ciblés et moins toxiques, utilisables à des moments précis de l’évolution de la maladie, potentiellement préventifs aussi).
Procédures
Interventions effectuées: 1) Prise de température rectale (durée
Impact sur les animaux
Les gestes techniques prévus dans les procédures sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. D'autre part les souris "modèles" de la maladie présentent un phénotype susceptible d’affecter leur bien-être (poids final 30 à 40% plus faible que les souris "sauvages", perte locale de poils, organes immunitaires plus volumineux); nous prévoyons donc un contrôle continu de leur élevage (croisement entre parents hétérozygotes, non malades) en fonction du déroulé et des résultats des expériences. Enfin certains traitements sont susceptibles d’entrainer des effets secondaires, notamment gastriques. D'où les mesures de raffinement, de suivi et de dosage approprié.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux participant aux procédures d'expérimentation, pour analyses immunologiques et histologiques post-mortem en lien avec les objectifs du projet.
Remplacement
L’analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet (suite aux tests préliminaires déjà réalisés in vitro), et pour s’assurer d’une potentielle relevance clinique. En particulier la réponse au stress n’est pas modélisable en dehors d’un organisme entier, d’où l’intérêt d’y d’étudier la réponse inflammatoire dans différents contextes.
Réduction
De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet (mesures corporelles et exploitations post-mortem). De plus l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec un premier "essai pilote" déterminant. Les nombres d’animaux sont calculés pour permettre des analyses statistiques robustes, en accord avec les objectifs scientifiques et en limitant autant que possible la taille des effectifs.
Raffinement
Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Entrainement à la contention (une fois par jour, une semaine avant le début de l'expérience) pour minimiser angoisse et biais secondaire. 2) Anesthésie gazeuse et application locale de collyre lors des prélèvements sanguins rétro-orbitaux. 3) Utilisation de lubrifiant pour les prises de température rectales, et adaptation de la taille de la sonde au gabarit des souris. 4) Minimisation de la fréquence de manipulation (observation et privilège aux mesures les moins intrusives). 5) Mise à disposition de moyens d’hydratation supplémentaires si diarrhées observées en réaction aux inhibiteurs. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux et les expériences menées avec des précautions sur l’âge des souris (
Choix des espèces
Il est ici nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo, Vertébré Mammifère), avec un fonctionnement immunitaire reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain. La souris en est un modèle idéal, permettant aussi un accès aux lignées génétiquement modifiées et phénotypes issus de mutations, indispensables pour l’analyse de maladies génétiques comme ici. Les animaux transgéniques envisagés pour ce projet permettent une bonne modélisation des réponses observées chez les patients. L’âge des animaux sera de 6 semaines en fin de procédure expérimentale, dont les expériences de stress (durée maximale après l’injection du traitement : 9h). Les expériences d’injection des inhibiteurs débuteront à l’âge de 4 semaines (pour avoir maximum 2 semaines de suivi), car le phénotype est précoce chez les souris modèles de la FMF et l’espérance de vie est plus courte. Cette chronologie permettra aussi d’inclure le délai de génotypage des petits.
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments dans le domaine de la douleur chez la souris, à l’aide d’un outil de screening basé sur une batterie de modèles et tests.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
3000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque animal subit un des sept modèles de douleur, aiguë, inflammatoire, neuropathique ou postopératoire, avec chirurgies, injections et prélèvements sanguins, le porteur décrivant des brûlures des pattes ou de la queue, des crampes abdominales et une possible automutilation de la patte opérée. Il précise que les animaux restent douloureux et ne peuvent être replacés, d'où leur mise à mort en fin d'étude. Il s'agit d'une "prestation de service" commerciale d'évaluation de candidats médicaments pour des "clients", la douleur étant délibérément provoquée sur des souris de cinq semaines.
Objectifs
Le développement de médicament passe par de nombreuses étapes. Un médicament peut avoir plusieurs activités. Il est intéressant dès les premiers stades de développement de tester le principe actif dans différentes douleurs afin d’évaluer son efficacité. Ceci va permettre d’orienter le candidat-médicament vers un domaine d’application. Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons proposer un service d'évaluation de la douleur chez la souris. Le but est de tester sur un minimum d’animaux des composés actifs sur des modèles/tests prédictifs de différentes aires de douleurs. Cette offre s’appuie sur une sélection de 7 modèles dans différents types de douleur (douleur aigue, inflammatoire, neuropathique et post-opératoire) et tests comportementaux permettant d’appréhender les multiples composantes de la douleur. Ces études d’efficacité antalgique sont exclusivement réalisées chez la souris offrant des mesures robustes et reproductibles sur la base de modèles parfaitement décrits, calibrés et admis par la communauté scientifique. Compte-tenu de la problématique traitée par le laboratoire et du fait que la caractérisation d’une molécule d’intérêt ne permet pas actuellement de remplacer l’étude de son efficacité chez l’animal vigile, la Direction de l'entreprise expose clairement son engagement de qualité scientifique, de professionnalisme et d’intégrité dans le respect de la Directive Européenne 2010/63/UE, la loi française et le comité régional d'éthique sur l'expérimentation animale. Dans le cadre de ses activités expérimentales de prestation de service, elle est amenée à administrer des candidats médicaments chez la souris. De ce fait, l'entreprise s’engage à respecter les points limites présentés pour chaque procédure et à informer le comité d'éthique a posteriori de tout effet majeur induit par l’administration du candidat médicament portant préjudice au bien-être de l’animal. Le projet est découpé en 6 procédures décrivant les 7 modèles et tests.
Bénéfices attendus
Ce service permettra aux clients, d’évaluer rapidement des candidats médicaments efficaces dans différents types de douleur.
Procédures
Les animaux peuvent recevoir un traitement par voie orale (p.o), intrapéritonéale (i.p), sous cutané (s.c) intraveineuse (i.v), sous-cutané plantaire (s.c.pl), Intramusculaire (i.m). Ces administrations se réalisent sur animal vigil. Des traitements en co-adminsitration peuvent également se réaliser. Ces injections durent entre 30 secondes et 1minute. Pour certaines procédures les souris subissent une chirurgie. La chirurgie du modèle post-opératoire dure entre 5 et 7 minutes. La chirurgie du modèle de neuropathie dure environ 15minutes. Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie. Ces prélèvements sont rapides et durent quelques minutes. Il peut également y avoir des prélèvements répétés, limités à 6 sur une cinétique.
Impact sur les animaux
Dans le domaine de la pharmacologie préclinique de la douleur, l’induction des modèles entraîne inévitablement l’apparition de symptômes douloureux. Les effets attendus sont différentes tyesde douleurs en fonction des modèles : douleur locale, crameps abdominables, brulures au niveau des pattes, de la queue. Pour les chirurgies, les effets indésirables peuvent être un non-réveil suite à l’anesthésie ou une mauvaise cicatrisation de la plaie. Les effets indésirables peuvent être une automutilation de la patte opérée ou une mauvaise cicatrisation. Les animaux peuvent recevoir un traitement par voie orale (p.o), intrapéritonéale (i.p), sous cutané(s.c) intraveineuse (i.v), sous-cutané plantaire (s.c.pl), Intramusculaire (i.m). Pour l’ensemble des tests, des points limites/nuisances associés à la pharmacologie peuvent aussi apparaitre (tremblement, sédation …). Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie (IC, jugulaire, retro-orbital). Le volume de sang total estimé est de 0.7ml/10g pour une souris. En prélèvement unique, 1.2mL de sang peut être prélevé sans réveil de l'animal. Les prélèvements répétés sont limités à 1% de volume de sang total de la souris sur 24h.
Devenir
Une grande partie des modèles utilisés ici sont des modèles stables dans le temps. Les animaux restent donc douloureux. Il n’est donc pas concevable de les replacer. Les autres modèles font mettre en place des processus inflammatoires et donc une réaction immunitaire qui peut interférer avec les autres modèles présents au sein du laboratoire. Il n’est donc pas cohérent de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité de la société.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Selon sa définition par le IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements anti-douleur doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=8 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle et confirmé lors des études subséquentes réalisées par l'entreprise. Cet effectif par groupe a été confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance via BiostaTGV. De plus, cet outil vise à fournir une évaluation rapide des composés testés dans des conditions très calibrées, il est donc réalisé sans les groupes contrôles usuels (groupe recevant le véhicule des composés, groupe recevant une molécule de référence), ce qui permet une réduction du nombre d’animaux et une démarche 3R.
Raffinement
Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation, habituation des animaux aux compartiments de tests). Les tests possèdent des valeurs de maximales afin de limiter le temps d’exposition d’un animal à un stimulus douloureux. De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique, sizzle nest et briquettes en bois à ronger). L’anesthésie et un suivi post-opératoire sont appliqués pour les chirurgies. Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés sont âgés d’environ 5 semaines pour toutes les procédures. Ces âges et gamme de poids correspondent à ceux d’animaux jeunes adultes couramment utilisés dans les différents modèles de douleur sur lesquels les procédures ont été validées dans l’entreprise. De plus, des souris plus âgées pourraient présenter des pathologies supplémentaires et interférer avec le screening de molécules.
Nouvelles stratégies thérapeutiques dans L’accident vasculaire cérébral chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 d'entre elles étant maintenues sous anesthésie sans réveil pour une imagerie de six heures. Chaque animal subit une occlusion d'une artère cérébrale pour provoquer un accident vasculaire cérébral, souvent doublée d'une hyperglycémie induite par injection de glucose, avec administration d'agents thérapeutiques et prélèvements sanguins. Le porteur indique que l'ischémie cérébrale provoque une douleur et une perte de mobilité, et prévoit la mise à mort pour prélever les tissus cérébraux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte de l'efficacité d'un traitement à la phase aiguë d'un AVC associé à une hyperglycémie.
Objectifs
En France, l’accident vasculaire cérébral reste une cause majeure de handicap, de troubles cognitifs et de mortalité. Les seuls traitements disponibles sont soit l’administration d’un médicament permettant de dissoudre le caillot de sang responsable de l’accident vasculaire cérébral, soit un dispositif médical permettant de le retirer chirurgicalement. Ces 2 traitements présentent des limites qui font que seule une minorité de patients peut en bénéficier. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements qui permettraient de traiter un plus grand nombre de patients. Par ailleurs, l’une des principales complications des accidents vasculaires cérébraux et de leurs traitements actuels est la survenue d’une hémorragie cérébrale qui peut aggraver le pronostic des patients. Pour cette raison, lors de l’évaluation de nouveaux traitements des accidents vasculaires cérébraux, il est donc important de s’assurer qu’ils n’entrainent pas de risque hémorragique. Les objectifs de ce projet sont donc d’évaluer l’efficacité mais aussi la sûreté de nouveaux agents thérapeutiques visant à protéger le cerveau au cours des accidents vasculaires cérébraux.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet donnera des résultats concernant l'efficacité thérapeutique et la sûreté de différents candidats médicaments pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux. Il permettra ainsi d’envisager une meilleure prise en charge des patients atteints d’un accident vasculaire cérébral et ainsi une amélioration de la fonction neurologique et de l’état de santé chez ces patients.
Procédures
Pour cette étude, nous utiliserons un modèle d’accident vasculaire cérébral induit par une occlusion transitoire, réalisée sous anesthésie et analgésie, d’une artère cérébrale moyenne chez la souris. La procédure chirurgicale dure environ 20 minutes. Ce modèle sera combiné à une injection de glucose par voie intrapéritonéale pour provoquer une hyperglycémie aiguë 20 min avant le début de la procédure chirurgicale. Les différents agents thérapeutiques testés seront administrés 30 min après l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne. La durée d’injection chez la souris est d’environ 10 secondes. Au total, 1390 souris seront utilisées. 1270 souris dont 1040 seront soumises à une occlusion de l’artère cérébrale pendant une heure avec ou sans hyperglycémie aiguë et 230 souris contrôles sans occlusion de l’artère cérébrale subiront différents examens (dosages biologiques et suivi neurologique) visant à déterminer la sévérité de l’accident vasculaire cérébral. 120 souris subiront également un accident vasculaire cérébral pour étudier les différents acteurs cellulaires impliqués dans la formation du caillot sanguin par imagerie intravitale (au maximum 6 heures). Sur la totalité des souris, des prélèvements sanguins seront réalisés à différents temps (jour 7 avant la chirurgie, 6 heures et 24 heures après l’accident vasculaire cérébral). La durée maximale pour effectuer les prélèvements chez la souris est d’environ de 2 minutes. Toute procédure invasive sera faite sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront mis à mort en fin d'étude et les tissus seront prélevés et stockés pour les analyses biologiques.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lié aux injections de différents agents thérapeutiques et anesthésiques ainsi qu’aux prélèvements sanguins effectués avant et après ischémie cérébrale. L’induction de l’ischémie cérébrale provoque aussi une douleur chez l’animal et un comportement anormal (perte de mobilité). L’hyperglycémie aiguë peut également entraîner une déshydratation chez l’animal.
Devenir
Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques.
Remplacement
Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de l’efficacité d’un traitement thérapeutique à la phase aiguë d’un accident vasculaire cérébral associé à une hyperglycémie. L'effet biologique des molécules utilisées sur leur cible a été démontré in vitro. La démonstration de leur effet bénéfique thérapeutique avant transposition chez l'homme ne peut se faire que dans un modèle animal proche de la physiopathologie humaine. Les modèles murins d'accident vasculaire cérébral permettent de reproduire la physiopathologie de l'occlusion de l’artère cérébrale chez l'homme.
Réduction
Les modèles d’accident vasculaire cérébral développés chez la souris, sont parfaitement connus et maîtrisés par les expérimentateurs. Les groupes ont été conçus de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste de manière à avoir une puissance suffisante pour l’analyse statistique pour toutes les évaluations réalisées dans les différents groupes au cours du temps. Ces calculs ont été possibles grâce aux résultats antérieurs obtenus avec ces modèles animaux.
Raffinement
Le soin et le suivi des animaux seront faits par des personnes compétentes et expérimentés, journalière par l’animalier et bi-hebdomadaire par l’expérimentateur. La douleur sera évaluée par la mise en place de points limites bien définis à l’aide d’une grille de score. le déficit neurologique sera également évalué à l’aide d’une grille de score bien définis.
Choix des espèces
L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés
Imagerie de la neuroinflammation par ultrasons, chez la souris nouveau-né et la jeune souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souriceaux reçoivent une injection de molécule pro-inflammatoire dans le péritoine ou directement dans le cerveau à cinq puis trente jours de vie, avec ouverture de la boîte crânienne par craniotomie et imagerie par ultrasons sous anesthésie. Le porteur décrit un retard de croissance, des troubles comportementaux et moteurs, et un risque de mort par surdosage anesthésique, la mise à mort étant justifiée par les injections et la craniotomie subies. Il présente ce modèle comme applicable à terme au nouveau-né prématuré humain et affirme que ces caractéristiques du cerveau en activité sont impossibles à reproduire hors de l'organisme.
Objectifs
La neuroinflammation est une réaction inflammatoire (réaction de l'organisme aux lésions et infections) qui se produit dans le cerveau. Lorsqu’elle survient peu avant ou après la naissance, la neuroinflammation peut impacter des phases critiques du développement du système nerveux central et avoir des conséquences à long terme sur la santé de l’individu (handicaps moteurs, troubles comportementaux, déficits cognitifs…). Cette étude vise à mieux comprendre l’impact de l’inflammation sur le développement cérébral. Nous nous intéressons ici à trois caractéristiques du cerveau : la connectivité entre différentes régions cérébrales lorsqu'elles sont activées, l’architecture vasculaire et la rigidité. La connectivité analyse l’activation simultanée de plusieurs aires cérébrales structurellement différentes. La neuroinflammation engendre des défaillances de cette connectivité fonctionnelle. L’inflammation modifie également les vaisseaux sanguins de la zone touchée, puisqu’elle se traduit par un afflux important de sang à cet endroit. L’architecture vasculaire à l’échelle des microvaisseaux fera l’objet d’une partie de cette étude. Enfin, la neuroinflammation, de par ses conséquences au niveau vasculaire notamment, pourrait modifier la rigidité du cerveau, et nous chercherons à quantifier cette modification. Les ultrasons biomédicaux, utilisés à des fins d’imagerie diagnostique, sont un moyen parfaitement adapté à l’étude de ces trois caractéristiques. L’essor considérable qu’ils ont connu au cours des dernières années a permis d’augmenter le niveau de détail des images, spatialement et temporellement, et leur sensibilité. Dans notre étude, trois techniques d’imagerie ultrasonore seront utilisées : les ultrasons fonctionnels pour étudier la connectivité fonctionnelle, l’imagerie superrésolution pour cartographier l’architecture cérébrale à l’échelle des microvaisseaux, et l’élastographie pour mesurer la rigidité du cerveau inflammé.
Bénéfices attendus
Ce projet contribue à enrichir les recherches faites sur la neuroinflammation chez le souriceau, en utilisant une méthode jusque-là peu utilisée pour étudier ce sujet : l’imagerie par ultrasons. En particulier, l’étude de l’impact possible de l’inflammation sur la rigidité du cerveau constitue la principale avancée de ce projet. A plus long terme, les données collectées serviront à la recherche sur le nouveau-né humain prématuré. La neuroinflammation est en effet une conséquence de la prématurité des enfants, dans 20 à 40% des cas. Elle est à l’origine de la plupart des lésions dans le cerveau du nourrisson, regroupées sous le terme d’encéphalopathie du prématuré. Mieux comprendre les modifications de vascularisation, de connectivité et de rigidité induites par la neuroinflammation contribuera à élargir les outils pronostiques de la prématurité, afin de pouvoir mettre en place des interventions plus précoces et ouvrir la voie à de nouveaux traitements.
Procédures
- Les animaux recevront une injection (à travers le péritoine, sans anesthésie, 1 min ; ou directement dans le cerveau, avec anesthésie, environ 30 min) d’une molécule pro-inflammatoire, à deux stades de croissance différents (5 jours et 30 jours après la naissance). - Les animaux au 30ème jour après la naissance nécessitent une opération chirurgicale d'ouverture de la boîte crânienne, au cours de laquelle ils seront placés sous anesthésie générale (environ 1h). - Toutes les mesures d’imagerie ultrasonore (imagerie fonctionnelle, élastographie, imagerie superrésolution) sont réalisées sous anesthésie générale (durée variable en fonction des mesures à effectuer : entre 15 min et 1h30). - L'imagerie superrésolution nécessite en plus l'injection de microbulles dans la circulation sanguine, réalisée sous anesthésie, à l'aide d'une seringue très fine, adaptée à la taille de l'animal (environ 2 min).
Impact sur les animaux
- L’administration intra-péritonéale (i.e., dans le péritoine) ou intra-cérébroventriculaire (i.e., directement dans le cerveau) peut créer une infection locale dans la zone d’injection. - L’injection de molécule inflammatoire engendre un retard de croissance chez les animaux concernés, qui se traduit morphologiquement par une taille et un poids inférieurs à la normale. De plus, les animaux injectés sont susceptibles de développer des troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible…) et moteurs. - Une dose mal estimée d’anesthésie au cours des acquisitions en imagerie peut engendrer le réveil des animaux si trop faible, ou leur mort si overdose, ce qui justifie une étape préalable d'ajustement des doses. - La manipulation des animaux au cours des injections, ainsi que l’injection elle-même, sont sources de stress pour les animaux.
Devenir
Pour toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés. Ils auront en effet reçu des injections et/ou subi une craniotomie donc ne pourront pas être maintenus en vie.
Remplacement
Notre étude s’intéresse à des caractéristiques du cerveau en activité, entier et fonctionnel, qu’il est par conséquent impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques).
Réduction
Au total, notre projet nécessitera au maximum 1140 animaux. Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique.
Raffinement
- Des grilles de scoring en fonction de l’âge des animaux seront proposées pour s’assurer du bien être des animaux et déterminer les points limites. Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités et le tonus des animaux. Suite à l’inflammation, on surveillera régulièrement la prise de poids et l’apparition éventuelle de troubles comportementaux (isolement, agressivité) : la molécule inflammatoire sera injectée le matin, puis les animaux seront surveillés 1h, 6h, 10h, 22h et 24h après l’injection (deux personnes se relaieront pour la surveillance). Si l’un de ces points limites est atteint, et/ou à la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés. - Les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. - Pendant les chirurgies nécessaires pour la mise en place des appareils d’imagerie, les animaux seront anesthésiés et surveillés : si l’animal présente une difficulté respiratoire, une variation importante de sa fréquence cardiaque ou une hypothermie importante, la procédure de chirurgie sera interrompue et l’animal euthanasié. - Au cours des acquisitions en imagerie, sous anesthésie générale, les constantes physiologiques suivantes seront mesurées en continu : fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, température.
Choix des espèces
Dans le cas de l’étude de la neuroinflammation, la littérature montre que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; il pourra donc, à plus long terme, être appliqué au cas du nouveau-né humain. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de la neuroinflammation sur certaines caractéristiques du cerveau, à différents stades de croissance : les animaux seront utilisés au cours du développement, à un stade encore immature du cerveau (5 jours après la naissance), et à plus long terme, lorsque le cerveau a atteint sa maturité (30 jours après la naissance).